CN114317727B - 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的检测试剂、试剂盒及检测方法,以解决现有单一技术仅能检测拷贝数变异或仅能分析热点突变以及基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂或试剂盒可以快速、准确、便宜、高通量地实现区分SMA患者、携带者及正常人的便利性和有效性,同时灵敏度高,特异性强,适用于常见样本比如血液、口腔拭子等。本发明能够快速、低廉、准确、高通量地检测人体血液或者其他组织细胞中SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的型别,对于分型技术而言,是目前性价比最好的方法,便于临床或者健康检测大规模的推行。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种用于人运动神经元存活基因(SMN基因)拷贝数分析的荧光定量检测试剂、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓性肌萎缩症是一种常染色体隐性遗传的神经肌肉病,以脊髓前角α-运动神经元退化变性导致近端肢体和躯干进行性、对称性肌无力和肌萎缩为主要临床特征。95%以上是由位于5号染色体长臂的SMN1缺失或突变所致的5q-SMA。SMA发病率约为1/10000,人群携带率约为1/50。
脊髓性肌萎缩症国际协会根据SMA患者的发病年龄和临床表现将脊髓性肌萎缩症分为4种类型:Ⅰ型(婴儿型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(青年型)、Ⅳ型(成人型)。Ⅰ型患者,发病年龄小于6个月,四肢及躯干严重的软弱无力,大多数患者在两岁前就会因呼吸衰竭或进食问题而死亡。Ⅱ型患者,于出生6~18个月内发病,可以独坐但多数不能站立或独走,预期寿命在20~40岁。Ⅲ型患者,出生18个月后才发病,患者能够独立行走,病情进展缓慢可生存至成年,寿命不缩短或轻微下降。Ⅳ型患者,发病年龄在成年后,发病和进展隐匿,生存寿命与正常人无差异,患者可出现行走困难。
SMA的致病基因SMN1和修饰基因SMN2高度同源,SMN1决定疾病的发生,SMN2影响疾病的严重程度和进展,使得SMA的遗传学诊断不同于绝大数单基因遗传病。SMN1与SMN2之间仅存在5个碱基差异,分布在内含子6到外显子8上。SMN1可以产生全长运动神经元蛋白,其同源基因SMN2由于外显子7上的突变(c.840C>T)导致SMN2基因产生可变剪接体,使产生的SMN蛋白不稳定或无功能,只有约10%的SMN2可以翻译成全长SMN蛋白。
SMN1的突变包括7号和/或8号外显子缺失以及致病的热点突变位点等类型。根据SMN1基因拷贝数的检测,可以实现对SMA患者、携带者及正常人的诊断:当检出SMN1基因纯合缺失时为SMA患者,当检出1个SMN1拷贝数时为SMA携带者,当检出2个SMN1基因拷贝数时为正常人。根据SMN1基因热点突变位点的检测,可评判是否携带致病变异。根据SMN2基因拷贝数的检测,可以评估SMA病情的严重程度、是否需要立即接受治疗等。
2019年我国 上市了疾病修正治疗药物诺西那生钠注射液,也相继发表了脊髓性肌萎缩症多学科管理及遗传学诊断专家共识,标志着SMA在我国进入了一个全新的精准诊治和管理时期。目前,我国一些地区逐渐开始筛查,SMA预防窗口进一步提前。
可用于SMN1/SMN2基因拷贝数定量检测及SMN1基因变异位点检测的技术很多,包括如基因测序法、限制性片段长度多态性法(RFLP法)、变性高效液相色谱法(DHPLC法)以及荷兰MRC公司推出仅用于科学研究的基于多重连接探针扩增法(MLPA法)的SMA检测试剂等。其中,基因测序法为基因分型的金标准,该方法适合高通量多位点的检测,该方法仅可对SMN1基因外显子7、外显子8纯合缺失(即0拷贝)的SMA病例进行检测,无法对SMN1基因缺失突变携带者进行检测;同时,其费时,操作复杂,对操作人员要求高且灵敏度低,容易出现样本间交叉污染且不适合快速临床检测;并且测序获得数据信息量较大,很多信息对患者没有用处,结果判读也需要一些专业知识,费用也相对较高。RFLP技术同基因测序法一样,仅能检测纯合缺失病例,且无法检测SMN1基因变异位点情况。DHPLC法和MLPA法一样,虽然能够实现SMN1和SMN2基因外显子7和外显子8缺失携带者的检测,但这些方法均需要在PCR反应结束后,开管对PCR产物进行后处理,在操作过程中易发生污染,且费时、费力,其所用设备昂贵、不适于普通医疗机构应用。另外,无论是DHPLC法还是MLPA法,对于SMN1和SMN2基因外显子7和外显子8的拷贝数定量结果为半定量,其结果判断存在更多的依据经验而无法形成标准化的结果判定方法。
发明内容
在上述基础上,本发明的技术目的是针对研究脊髓性肌萎缩症(Spinal MuscularAtrophy,SMA)公认的致病基因人运动神经元存活基因(Survival Motor Neuron,SMN)的拷贝数荧光定量检测方法及中国人群人运动神经元存活基因1(SMN1)的2个常见热点突变位点(第1外显子c.22dupA、第5外显子c.683T>A)检测方法存在的问题与不足,提供一种检测快速、简便、经济实用、检测结果准确可靠的人运动神经元存活基因拷贝数荧光定量检测试剂、检测试剂盒及检测方法。
首先,本发明提供用于SMN1/SMN2基因外显子7拷贝数分析的荧光定量PCR检测试剂,包括用于扩增SMN1/SMN2基因外显子7的特异性引物1和引物2,以及与扩增产物杂交的特异性探针1和探针2;所述引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;优选的,所述引物1和引物2的反应浓度均为500-900nmol/L,更优选的反应浓度均为700nmol/L;所述探针1和探针2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示;优选的,所述探针1和探针2的反应浓度均为150-250nmol/L,更优选的反应浓度均为200nmol/L。
接着提供用于SMN1/SMN2基因外显子8拷贝数分析的荧光定量PCR检测试剂,包括用于扩增SMN1/SMN2基因外显子8的特异性引物3和引物4,以及与扩增产物杂交的特异性探针3和探针4;所述引物3和引物4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;优选的,所述引物3和引物4的反应浓度均为500-900nmol/L,更优选的反应浓度均为700nmol/L;所述探针3和探针4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示;优选的,所述探针3的反应浓度为250-350nmol/L,更优选的反应浓度为300nmol/L;所述探针4的反应浓度为100-200nmol/L,更优选的反应浓度为150nmol/L。
还提供用于SMN1基因热点突变位点定性检测的荧光定量PCR检测试剂,所述SMN1基因热点突变位点是c.22dupA与c.683T>A,所述检测试剂包括用于扩增c.22dupA位点的特异性引物5和引物6,和用于扩增c.683T>A位点的特异性引物7和引物8;以及与c.22dupA扩增产物杂交的特异性探针5和与c.683T>A扩增产物杂交的特异性探针6;所述引物5、引物6、引物7、引物8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示;优选的,所述引物5、引物6、引物7和引物8的反应浓度均为200-400nmol/L,更优选的反应浓度均为300nmol/L;所述探针5和探针6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ IDNO.16所示;优选的,所述探针5和探针6的反应浓度均为50-150nmol/L,更优选的反应浓度均为100nmol/L。
本发明设计的特异性引物对分别针对SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的特异性序列,能特异地扩增相应的基因组DNA;分别针对SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的扩增产物设计的探针,增加MGB能够十分有效地区分单碱基差异;可以达到灵敏度可达1%,远高于基因测序15%的灵敏度;且检测过程为闭管反应,大大降低了污染及结果偏差的可能性等技术效果。
在使用时,检测试剂可以采用上述三种中的一种制成荧光定量PCR反应体系,最优选推荐采用所有三种试剂高通量同时进行荧光定量PCR反应,且还进一步包括用于扩增内参基因的特异性引物9和引物10,以及与扩增产物杂交的特异性探针7;所述内参基因是GAPDH基因,所述引物9和引物10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示;优选的,所述引物9和引物10的反应浓度均为600nmol/L;所述探针7的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示;优选的,所述探针7的反应浓度为300nmol/L。其中SMN1基因外显子7和外显子8用VIC标记的探针检测,SMN2基因外显子7和外显子8用FAM标记的探针检测,GAPDH基因用ROX标记探针检测,SMN1基因热点突变位点用FAM标记探针检测;对于SMN基因外显子7和外显子8的结果判读,通过RQ值可进行基因拷贝数分析,用于纯合缺失型、杂合缺失型及正常人的区分;对于SMN1基因热点突变位点检测数据分析可用Ct值进行判读。
紧接着,本发明技术为了方便使用,还提供一种用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量PCR检测试剂盒,所述试剂盒包括上述三种检测试剂中的一种或两种或三种的组合形式,可以按需求进行选择,最优选是三种检测试剂同时包含。所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA模板、超纯水等。
本发明采用上述检测试剂或检测试剂盒对SMN基因拷贝数进行分析的荧光定量PCR检测方法,包括步骤:
(1)从全血或口腔拭子中提取到基因组DNA作为模板;
(2)将模板DNA用ddH2O稀释到5 ~ 30ng/μL;
(3)采用上述的检测试剂,制备qPCR反应扩增体系,进行SMN基因拷贝数分析和/或热点突变位点分型。所述方法通过比较Ct法对SMN基因外显子7和外显子8进行拷贝数分析,以及对SMN1基因热点突变位点c.22dupA与c.683T>A进行基因定性检测,荧光检测结果包含SMN基因外显子7和外显子8、内标基因GAPDH及SMN1基因变异位点,SMN1基因外显子7和外显子8用VIC标记的探针检测,SMN2基因外显子7和外显子8用FAM标记的探针检测,GAPDH基因用ROX标记探针检测,SMN1基因热点突变位点用FAM标记探针检测;对于SMN基因外显子7和外显子8的结果判读,通过RQ值可进行基因拷贝数分析,用于纯合缺失型、杂合缺失型及正常人的区分;对于SMN1基因热点突变位点检测数据分析可用Ct值进行判读。
根据本发明的一种优选的实施方式,本发明的用于SMN基因拷贝数进行分析的荧光定量PCR检测方法,最优选地,具体包括如下步骤:
(1)从全血或口腔拭子中提取到基因组DNA作为模板;
(2)DNA浓度及纯度的鉴定
采用紫外分光光度计进行鉴定,利用OD260nm/OD280nm比值计算DNA纯度,比值为1.7 ~ 2.0,优选地,将DNA用ddH2O稀释到5 ~ 30ng/μL;
(3)进行基因拷贝数分析及常见热点突变位点分型:
应用多重PCR结合多色TaqMan MGB荧光探针技术,通过比较Ct法(2-ΔΔCt)对SMN基因外显子7和外显子8进行拷贝数分析,以及对SMN1基因热点突变位点c.22dupA与c.683T>A进行基因定性检测;
引物对包括上述三种检测试剂中的特异性引物以及用于内参基因的特异性引物,如SEQ ID No.1 ~ SEQ ID No.10所示,如下表所列:
检测试剂中还包括特异性探针,所述TaqMan MGB探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.11 ~ SEQ ID No.17所示,如下表所列:
进行qPCR反应,包括:
1)qPCR反应液扩增体系
①SMN基因外显子7检测反应体系
②SMN基因外显子8检测反应体系
③SMN1基因变异位点检测反应体系
2)qPCR扩增程序
(4)结果判读:
多重多通道荧光检测结果包含SMN基因外显子7和外显子8、内标基因GAPDH及SMN1基因变异位点,SMN1基因外显子7和外显子8用VIC标记的探针检测,SMN2基因外显子7和外显子8用FAM标记的探针检测,GAPDH基因用ROX标记探针检测,SMN1基因热点突变位点用FAM标记探针检测。
根据设置的基线和阈值,对于SMN基因外显子7和外显子8的数据分析,仪器可实现自动显示待测样本目标基因的相对定量值(RQ值),通过RQ值即可进行基因拷贝数分析,用于纯合缺失型、杂合缺失型及正常人的区分;对于SMN1基因热点突变位点检测数据分析可用Ct值进行判读。
RQ值判读标准如下:
SMN1变异位点检测判读标准如下:
当ROX通道Ct值<38,扩增曲线有明显指数增长期,判定样本检测有效,若FAM通道Ct值<38,扩增曲线有明显指数增长期,判定样本检测存在SMN1基因常见热点突变位点变异;若FAM通道Ct值≥38或无Ct值,扩增曲线为直线或轻微斜线,无有明显指数增长期,判定样本检测不存在SMN1基因常见热点突变位点变异。
当ROX通道Ct值≥38或无Ct值,即ROX通道无扩增曲线,或者扩增曲线为直线或轻微斜线,无明显指数增长期,判定样本检测失败,需重新检测。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明提供了一种用于SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的检测试剂、检测试剂盒以及检测方法,以解决现有单一技术仅能检测拷贝数变异或仅能分析热点突变以及基因分型检测技术中费时、程序繁琐以及易污染等问题。本试剂盒可以快速、准确、便宜、高通量地实现区分SMA患者、携带者及正常人的便利性和有效性,同时灵敏度高,特异性强,适用于常见样本比如血液、口腔拭子等。
本发明能够快速、低廉、准确、高通量地检测人体血液或者其他组织细胞中SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点不同的类型,对于分型技术而言,是目前性价比最好的方法。便于临床或者健康检测大规模的推行。
qPCR工作原理:本发明所用的探针为5’端VIC/FAM/ROX标记、3’端MGB标记的TaqMan 探针,探针两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)。在探针完整时,即在随机状态和无PCR产物杂交状态时,报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收,检测不到荧光的存在。在 qPCR扩增过程中,当特异的PCR产物与TaqMan MGB探针发生杂交反应时,强耐受性DNA聚合酶的5’端外切酶活性把TaqMan MGB探针的碱基逐个剪切,报告基团所释放出的荧光就可以被内置到PCR仪中的荧光计检测到。PCR经过一个循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数扩增的过程,荧光信号的强弱就代表模板DNA拷贝数的多少。因此本发明是个很好的基因分型的工具。
综合实时荧光定量PCR的优点,与直接测序等基因分型的技术相比较,本发明用于SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点基因分型的检测具有如下优势:
1、特异性强:设计的引物对分别针对SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的特异性序列,能特异地扩增相应的基因组DNA;分别针对SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点的扩增产物设计的探针,增加MGB能够十分有效地区分单碱基差异;
2、本发明技术的灵敏度可达1%,远高于基因测序15%的灵敏度;
3、检测过程为闭管反应,大大降低了污染及结果偏差的可能性;
4、操作快速简单,从样本送检至实验室到出具检测结果仅需2.5小时。而直接测序法检测步骤繁琐:送检标本→提取DNA→PCR扩增→验证PCR产物(电泳)→纯化PCR产物→基因测序→结果分析,其经过两个PCR产物的电泳过程,污染几率很大,不适合在医院大规模开展;
5、判读结果明确客观;
6、高通量;
7、安全,整个体系中不包含有毒有害物质,无需PCR产物的后处理,对操作员和环境都无害。
总之,与基因测序等基因分型的技术相比,本发明用于SMN1/SMN2基因拷贝数变异和SMN1常见热点突变位点基因分型有特异性强、灵敏度高,操作简单快速、高通量、判读结果精确等优势。
附图说明
图1为实施例1中用于检测SMN1基因Exon7探针C、Exon8探针G的试剂的扩增曲线;
图2为实施例1中用于检测SMN2基因Exon7探针T、Exon8探针A的试剂的扩增曲线;
图3为实施例1中用于检测SMN1基因位点c.22dupA与c.683T>A的试剂的扩增曲线;
图4为外显子7不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-001-1/XM004-002-1,探针XM004-101-1/XM004-102-1);
图5为外显子7不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-001-2/XM004-002-2,探针XM004-101-2/XM004-102-2);
图6为外显子7不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-001-3/XM004-002-3,探针XM004-101-3/XM004-102-3);
图7为外显子8不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-003-1/XM004-004-1,探针XM004-103-1/XM004-104-1);
图8为外显子8不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-003-2/XM004-004-2,探针XM004-103-2/XM004-104-2);
图9为外显子8不同引物探针组合反应性能对比
(引物XM004-003-3/XM004-004-3,探针XM004-103-3/XM004-104-3);
图10为基因位点c.22dupA不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-005-1/XM004-006-1,探针XM004-106-1);
图11为基因位点c.22dupA不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-005-2/XM004-006-2,探针XM004-106-2);
图12为基因位点c.22dupA不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-005-3/XM004-006-3,探针XM004-106-3);
图13为基因位点c.683T>A不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-007-1/XM004-008-1,探针XM004-108-1);
图14为基因位点c.683T>A不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-007-2/XM004-008-2,探针XM004-108-2);
图15为基因位点c.683T>A不同引物探针组合反应性能
(引物XM004-007-3/XM004-008-3,探针XM004-108-3);
图16为外显子7不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针150nM,FAM探针150nM);
图17为外显子7不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针150nM,FAM探针150nM);
图18为外显子7不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图19为外显子7不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图20为外显子7不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针250nM,FAM探针250nM);
图21为外显子7不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针250nM,FAM探针250nM);
图22为外显子8不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针250nM,FAM探针100nM);
图23为外显子8不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针250nM,FAM探针100nM);
图24为外显子8不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图25为外显子8不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图26为外显子8不同探针浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针350nM,FAM探针200nM);
图27为外显子8不同探针浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针350nM,FAM探针200nM);
图28为外显子7不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度500nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图29为外显子7不同引物浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度500nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图30为外显子7不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图31为外显子7不同引物浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图32为外显子7不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度900nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图33为外显子7不同引物浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度900nM,VIC探针200nM,FAM探针200nM);
图34为外显子8不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度500nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图35为外显子8不同引物浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度500nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图36为外显子8不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度700nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图37为外显子8不同引物浓度反应性能对比(正常对照样本)
(引物浓度700nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图38为外显子8不同引物浓度反应性能对比(杂合缺失样本)
(引物浓度900nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图39为外显子8不同引物浓度反应性能对比(纯合缺失样本)
(引物浓度900nM,VIC探针300nM,FAM探针150nM);
图40为c.22dupA&c.683T>A不同引物浓度反应性能对比
(c.22dupA&c.683T>A引物浓度200nM,探针浓度50nM);
图41为c.22dupA&c.683T>A不同引物浓度反应性能对比
(c.22dupA&c.683T>A引物浓度300nM,探针浓度100nM);
图42为c.22dupA&c.683T>A不同引物浓度反应性能对比
(c.22dupA&c.683T>A引物浓度400nM,探针浓度150nM)。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意,为了清楚的目的,附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
实施例1 进行基因分型
收集35例血样,经基因组DNA抽提鉴定其浓度及纯度后应用本发明技术方法对SMN基因外显子7和外显子8、SMN1基因热点突变位点进行基因定性检测:
(1)从全血或口腔拭子中提取到基因组DNA作为模板;
(2)DNA浓度及纯度的鉴定:采用紫外分光光度计进行鉴定,利用OD260nm/OD280nm比值计算DNA纯度,比值为1.7 ~ 2.0,优选地,将DNA用ddH2O稀释到5 ~ 30ng/μL;
(3)进行基因拷贝数分析及常见热点突变位点分型:
应用多重PCR结合多色TaqMan MGB荧光探针技术,通过比较Ct法(2-ΔΔCt)对SMN基因外显子7和外显子8进行拷贝数分析,以及对SMN1基因热点突变位点c.22dupA与c.683T>A进行基因定性检测;
引物对包括上述三种检测试剂中的特异性引物以及用于内参基因的特异性引物,如SEQ ID No.1 ~ SEQ ID No.10所示,如下表所列:
检测试剂中还包括特异性探针,所述TaqMan MGB探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.11 ~ SEQ ID No.17所示,如下表所列:
进行qPCR反应,包括:
1)qPCR反应液扩增体系
①SMN基因外显子7检测反应体系
②SMN基因外显子8检测反应体系
③SMN1基因变异位点检测反应体系
2)qPCR扩增程序
(4)结果判读:
① SMN基因外显子7和外显子8拷贝数检测结果(例数)
②SMN1基因变异位点检测结果,如图1-3所示,
35例血液样本基因组DNA,全部ROX通道Ct值<38,扩增曲线有明显指数增长期,判定样本检测有效,但所有FAM通道Ct值≥38或无Ct值,判定样本检测不存在SMN1基因位点c.22dupA与c.683T>A的变异情况。
结果显示均能准确判定SMN基因拷贝数及SMN1基因热点突变位点情况,且与经MLPA科研试剂验证,完全与本试剂检测结果一致。
实施例2:引物及探针设计优化实验
本发明涉及3种反应液扩增体系(检测试剂),所用靶标基因引物探针是本发明特有的,属于重点研究工作的结果,均是由多组引物探针筛选并对反应体系所用浓度进行优化调整;所用内参基因GAPDH的引物探针是沿用类似项目研究结论,本发明中将其直接与已筛选到的靶标引物探针进行配制反应液。所用内参基因GAPDH引物探针信息如前所述,本实施例是为了证明所述引物探针组合的特异性以及灵敏度,进行复杂的优化设计的过程及结果。
1. 外显子7 最佳引物探针组合筛选
1.1 外显子7引物探针筛选条件
a)引物探针信息
b) PCR扩增体系
c) PCR扩增条件
扩增反应程序的条件如下:
(1)50℃UNG酶处理,5min,
(2)95℃预变性,10min,
(3)95℃变性15s,
(4)60℃延伸1min(采集荧光信号),
(3)-(4)共40 个循环。
1.2 外显子7引物探针组合筛选结果
1.3外显子7引物探针筛选结果:
组合方式1、2、3的结果分别如图4、图5、图6所示。
2.外显子8 最佳引物探针组合筛选
2.1外显子8引物探针筛选条件
a)引物探针信息
b) PCR扩增体系
c) PCR扩增条件
扩增反应程序的条件如下:
(1)50℃UNG酶处理,5min,
(2)95℃预变性,10min,
(3)95℃变性15s,
(4)60℃延伸1min(采集荧光信号),
(3)-(4)共40 个循环。
2.2外显子8引物探针组合筛选结果
2.3外显子8引物探针筛选结果:
组合方式1、2、3的结果分别如图7、图8、图9所示。
3. c.22dupA最佳引物探针组合筛选
3.1 c.22duopA引物探针筛选条件
a) 引物探针信息
b) PCR扩增体系
c) PCR扩增条件
扩增反应程序的条件如下:
(1)50℃UNG酶处理,5min,
(2)95℃预变性,10min,
(3)95℃变性15s,
(4)60℃延伸1min(采集荧光信号),
(3)-(4)共40 个循环。
3.2 c.22dupA引物探针筛选结果
3.3 c.22dupA引物探针筛选结果:
组合方式1、2、3的结果分别如图10、图11、图12所示。
4. c.683T>A最佳引物探针组合筛选
4.1c.683T>A引物探针筛选条件
a) 引物探针信息
b) PCR扩增体系
c) PCR扩增条件
扩增反应程序的条件如下:
(1)50℃UNG酶处理,5min,
(2)95℃预变性,10min,
(3)95℃变性15s,
(4)60℃延伸1min(采集荧光信号),
(3)-(4)共40 个循环。
4.2 c.683T>A引物探针筛选结果
4.2 c.683T>A引物探针筛选结果:
组合方式1、2、3的结果分别如图13、图14、图15所示。
5.外显子7最佳探针浓度优化
参照1.1 外显子7引物探针筛选用条件引入内参基因GAPDH引物探针进行外显子7引物浓度不变对其探针不同浓度的反应液体系配制及检测,确定探针的最佳使用浓度。
5.1 外显子7探针浓度优化结果(引物XM004-001-3与XM004-002-3,探针XM004-101-3与XM004-102-3)
5.2 外显子7探针浓度优化结果
组别1中杂合缺失样本如图16所示,正常对照样本如图17所示。
组别2中杂合缺失样本如图18所示,正常对照样本如图19所示。
组别3中杂合缺失样本如图20所示,正常对照样本如图21所示。
6.外显子8最佳探针浓度优化
参照2.1 外显子8引物探针筛选用条件引入内参基因GAPDH引物探针进行外显子8引物浓度不变对其探针不同浓度的反应液体系配制及检测,确定探针的最佳使用浓度。
6.1 外显子8探针浓度优化结果(引物XM004-003-1与XM004-004-1,探针XM004-103-1与XM004-104-1)
6.2 外显子8探针优化结果
组别1中杂合缺失样本如图22所示,正常对照样本如图23所示。
组别2中杂合缺失样本如图24所示,正常对照样本如图25所示。
组别3中杂合缺失样本如图26所示,正常对照样本如图27所示。
7.外显子7引物浓度研究
参照5 外显子7最佳探针浓度优化结果,进行外显子7不同引物浓度的反应液体系配制及检测,确定引物的最佳使用浓度。
7.1 外显子7引物浓度优化结果(引物XM004-001-3与XM004-002-3,探针XM004-101-3与XM004-102-3)
7.2 外显子7引物浓度优化结果
组别1中杂合缺失样本如图28所示,正常对照样本如图29所示。
组别2中杂合缺失样本如图30所示,正常对照样本如图31所示。
组别3中杂合缺失样本如图32所示,正常对照样本如图33所示。
8.外显子8引物浓度研究
参照6 外显子8最佳探针浓度优化结果,进行外显子8不同引物浓度的反应液体系配制及检测,确定引物的最佳使用浓度。
8.1外显子8引物浓度优化结果(引物XM004-003-1与XM004-004-1,探针XM004-103-1与XM004-104-1)
8.2 外显子8引物浓度优化结果
组别1中杂合缺失样本如图34所示,正常对照样本如图35所示。
组别2中杂合缺失样本如图36所示,正常对照样本如图37所示。
组别3中杂合缺失样本如图38所示,正常对照样本如图39所示。
9. c.22dupA&c.683T>A引物探针浓度研究
9.1 c.22dupA&c.683T>A引物探针浓度优化条件
a)PCR扩增体系
b)PCR扩增程序
扩增反应程序的条件如下:
(1)50℃UNG酶处理,5min,
(2)95℃预变性,10min,
(3)95℃变性15s,
(4)60℃延伸1min(采集荧光信号),
(3)-(4)共40 个循环。
9.2 c.22dupA&c.683T>A引物探针浓度优化结果
9.2 c.22dupA&c.683T>A引物探针优化结果
组合方式1、2、3的结果分别如图40、图41、图42所示。
综上所述,外显子7检测反应体系中,引物1和引物2的浓度均为500-900nmol/L,优选地使用浓度均为700nmol/L;探针1和探针2的浓度均为150-250nmol/L,优选地使用浓度均为200nmol/L。外显子8检测反应体系中,引物3和引物4的浓度均为500-900nmol/L,优选地使用浓度均为700nmol/L;探针3的浓度为250-350nmol/L,优选地使用浓度为300nmol/L,探针4的浓度为100-200nmol/L,优选地使用浓度为150nmol/L。SMN1基因变异位点检测反应体系中,c.22dupA的引物5和引物6的浓度均为200-400nmol/L,优选地使用浓度均为300nmol/L,探针5的浓度为50-150nmol/L,优选地使用浓度为100nmol/L;c.683T>A的引物7和引物8的浓度均为200-400nmol/L,优选地使用浓度均为300nmol/L,探针6的浓度为50-150nmol/L,优选地使用浓度为100nmol/L。内参基因GAPDH的引物9和引物10的浓度优选地使用600nmol/L,探针7的浓度优选地使用300nmol/L。
虽然已经详细说明了本发明及其优点,但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且,本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解,根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此,所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
序列表
<110> 上海恩元生物科技有限公司
江苏恩华药业股份有限公司
<120> 用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcttgtgaa acaaaatgct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgagcacct tccttctttt 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaagtggaat gggtaactct tcttg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattttctca actgcctcac cacc 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actgttccgc tcccagaagc 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atagggagac tgcactggct gc 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctaaaattc aatggcccac cacc 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcccaaggga tgttctacaa tgaca 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctgctttta actctggtaa agt 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagcactcac catgtagttg a 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cttacagggt ttcagacaa 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccttacaggg ttttagacaa 20
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccaccccagt ctt 13
<210> 14
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccacctcag tctt 14
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgccaccac ttg 13
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccaccccact aactat 16
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tggatattgt tgccatca 18
Claims (7)
1.用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂,其特征在于,包括用于扩增SMN1/SMN2基因外显子7的特异性引物1和引物2,以及与扩增产物杂交的特异性探针1和探针2;所述引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;所述引物1和引物2的反应浓度均为500-900nmol/L;所述探针1和探针2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示;所述探针1和探针2的反应浓度均为150-250nmol/L;
和包括用于扩增SMN1/SMN2基因外显子8的特异性引物3和引物4,以及与扩增产物杂交的特异性探针3和探针4;所述引物3和引物4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示;所述引物3和引物4的反应浓度均为500-900nmol/L;所述探针3和探针4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示;所述探针3的反应浓度为250-350nmol/L;所述探针4的反应浓度为100-200nmol/L;
以及包括用于扩增SMN1基因热点突变c.22dupA位点的特异性引物5和引物6,和用于扩增SMN1基因热点突变c.683T>A位点的特异性引物7和引物8;以及与c.22dupA扩增产物杂交的特异性探针5和与c.683T>A扩增产物杂交的特异性探针6;所述引物5、引物6、引物7、引物8的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示;所述引物5、引物6、引物7和引物8的反应浓度均为200-400nmol/L;所述探针5和探针6的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示;所述探针5和探针6的反应浓度均为50-150nmol/L。
2.根据权利要求1所述的用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂,其特征在于,所述引物1和引物2的反应浓度均为700nmol/L;所述探针1和探针2的反应浓度均为200nmol/L;所述引物3和引物4的反应浓度均为700nmol/L;所述探针3的反应浓度为300nmol/L;所述探针4的反应浓度为150nmol/L;所述引物5、引物6、引物7和引物8的反应浓度均为300nmol/L;所述探针5和探针6的反应浓度均为100nmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的荧光定量检测试剂,其特征在于,还包括用于扩增内参基因的特异性引物9和引物10,以及与扩增产物杂交的特异性探针7;所述内参基因是GAPDH基因,所述引物9和引物10的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示;所述探针7的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
4.根据权利要求3所述的荧光定量检测试剂,其特征在于,所述引物9和引物10的反应浓度均为600nmol/L;所述探针7的反应浓度为300nmol/L。
5.一种用于SMN基因拷贝数分析的荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA聚合酶、DNA模板、超纯水。
7.权利要求1-4中任一项所述的检测试剂或权利要求5或6所述的检测试剂盒在制备用于SMN基因拷贝数分析的产品中的应用。
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