CN113136418B - 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113136418B
CN113136418B CN202110624753.XA CN202110624753A CN113136418B CN 113136418 B CN113136418 B CN 113136418B CN 202110624753 A CN202110624753 A CN 202110624753A CN 113136418 B CN113136418 B CN 113136418B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
probe
seq
detection
site
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110624753.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113136418A (zh
Inventor
田龙
于超计
王倩玉
李佳
吴文立
魏星
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Huanuo Aomei Gene Biotechnology Co ltd
Beijing Chaoyang Hospital
Original Assignee
Beijing Huanuo Aomei Gene Biotechnology Co ltd
Beijing Chaoyang Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Huanuo Aomei Gene Biotechnology Co ltd, Beijing Chaoyang Hospital filed Critical Beijing Huanuo Aomei Gene Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110624753.XA priority Critical patent/CN113136418B/zh
Publication of CN113136418A publication Critical patent/CN113136418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113136418B publication Critical patent/CN113136418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒。选择AZFa，AZFb和AZFc 3个区域的sY1324、sY127、sY1192、sY85、sY1233、sY254位点及SRY基因同时进行检测，能够鉴别出Y染色体不同缺失类型，增加了AZFc区b2/b3，b1/b3和b2/b4缺失的检出率。试剂盒仅利用核酸扩增反应A和核酸扩增反应B，两个反应结合即可实现检测，突破传统6位点检测法的局限性，提高阳性检出率和准确性，试剂成本低，促使国内自主研发产品达到了国际领先水平。通过荧光定量PCR方法检测，检测效率和灵敏度高，便捷，对检测设备要求低、操作人员技术要求低便于大规模推广。对整个检测过程的样本提取、PCR扩增及人工操作均可以进行质量监控。

Description

一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的 的检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒。
背景技术
不孕不育是一个由多种因素引起的全球健康问题，影响着全球约10％～15％的夫妇。据估计，近一半的不孕不育是由于男性不育和遗传因素，尤其是微缺失。Y染色体微缺失是15％以上男性不育症的主要来源，其引发的原发性无精子和少精子症不仅难以治愈，且可随辅助生殖技术传递给下一代，进而引发新的不育症。
Y染色体微缺失主要指染色体长臂上的无精子因子(azoospermia factor，AZF)区域的缺失。AZF区可分为3个区域，即AZFa，AZFb及AZFc区，每个区域都包含几个调控精子形成的关键基因，这些基因的缺失或突变均可能导致少精或无精。其中，AZFa区域(包含SY86、SY82、SY84、SY1324、SY85等)的缺失几率较低，但其丧失将导致绝对无精子症。AZFb区域(包含SY1123、SY127、SY143、SY133、SY128等)缺失的患者表现为生精阻滞，精子生成被阻滞在精母细胞阶段，导致没有精子生成。AZFc区(包含SY254、SY255、SY1191、SY1192、SY1291等)缺失较为常见，是精子形成障碍的重要原因之一。AZFc的完全缺失涉及b2/b4区域，除b2/b4外，AZFc基因座还有许多部分缺失，包括b1/b3、b2/b3、gr/gr。其中，gr/gr缺失不作为无精少精症危险因素。AZFc区域缺失的患者尚存精子生成能力，因此可以通过辅助生育手段进行治疗，这一治疗会将AZFc区域缺失遗传给男性后代。可见，Y染色体微缺失检测对男性在生殖遗传学方面的临床治疗、提高辅助生殖的疗效和安全性以及开展胚胎植入前的遗传学诊断均具有重要意义。
经过长期探索，欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)和欧洲分子遗传质量协作网(Euro-pean Molecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布了Y染色体微缺失的检测指南。指南建议，临床医生可通过对AZFa，AZFb和AZFc 3个区域的sY84，sY86，sY127，sY134，sY254和sY255共6个序列标签位点进行多重PCR凝胶电泳或者荧光定量PCR(qPCR)检测，进而诊断3个区域微缺失的状况。
目前检测Y染色体微缺失的方法有多种，主要有多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、多重PCR-凝胶电泳法、多重荧光PCR法，多重PCR-毛细管电泳法等。
MLPA法通过探针杂交，连接等多步反应，从而对AZF区进行拷贝数定量，虽然覆盖区域广，结果准确，但其步骤繁琐，耗时长，分析方法复杂；多重PCR-凝胶电泳法检测敏感性不高，通量小，而且凝胶电泳易造成PCR产物污染导致假阳性；多重PCR-毛细管电泳法将PCR产物通过毛细管电泳的方法，对AZF不同区域进行缺失检测，该方法操作专业性强，分析仪器昂贵，不适于医院推广；而多重荧光PCR法操作简单，只需一步实验即可得到结果，具有简便、快速、准确的特点。
目前已有多种人Y染色体微缺失检测的方法。相关技术中的方法利用多种PCR联合毛细管电泳技术，对Y染色体上15个位点(AZFa区的sY84、sY86、sY182、sY81；AZFb区的sY121、sY134、sY127、sY105；AZFc区的sY255、sY254、sY242、sY154、sY1291、AZFd区的sY145和sY152)进行检测，可判断出AZFa，AZFb，AZFc和AZFd区缺失情况，但其步骤繁杂，检测周期长，对操作人员专业性要求高，所用毛细管电泳分析仪器昂贵，不适用于医院及检验机构普遍性推广。
此外，还有相关技术法利用多重荧光PCR的方法，检测sY84，sY86，sY127，sY134，sY254和sY255共6个序列标签位点，该方法操作简单，省时省力，但其阳性检出率低，该位点组合为欧洲泌尿外科推荐，不完全适用于中国人群。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种Y染色体微缺失的引物的探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物，包括分别用于检测sY1324位点、sY127位点、sY1192位点、RNase P基因、sY85位点、sY1233位点、sY254位点以及SRY基因的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针、第四引物组和第四探针、第五引物组和第五探针、第六引物组和第六探针、第七引物组和第七探针、第八引物组和第八探针；
其中，第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物、第一下游引物及第一探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物、第二下游引物及第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，第三上游引物、第三下游引物及第三探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
第四引物组包括第四上游引物和第四下游引物，第四上游引物、第四下游引物及第四探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
第五引物组包括第五上游引物和第五下游引物，第五上游引物、第五下游引物及第五探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
第六引物组包括第六上游引物和第六下游引物，第六上游引物、第六下游引物及第六探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
第七引物组包括第七上游引物和第七下游引物，第七上游引物、第七下游引物及第七探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；
第八引物组包括第八上游引物和第八下游引物，第八上游引物、第八下游引物及第八探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
所述第一探针的5’端至第八探针的5’端均标记有荧光基团，所述第一探针的3’端至第八探针的3’端均标记有淬灭基团。
上述提供了一种检测Y染色体微缺失的引物及探针组合物，该引物及探针组合物是通过选用AZFa，AZFb和AZFc共3个区域的sY1324、sY127、sY1192、sY85、sY1233、sY254位点和Y染色体性别区决定基因位点(sex-determining region of Y，SRY)同时进行检测，不仅能够鉴别出Y染色体不同缺失类型，尤其增加了AZFc区b2/b3，b1/b3和b2/b4缺失的检出率。
作为优选地，所述荧光基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；所述淬灭基团包括QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
对于上述选用的各荧光基团及淬灭基团包括，但不限于上述的陈列。
一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，所述试剂盒包括核酸扩增反应液A、核酸扩增反应液B、PCR混合液和对照品。
作为优选地，所述试剂盒内的核酸扩增反应液A包括权利要求1中所述的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针、第四引物组和第四探针。
作为优选地，所述试剂盒内的核酸扩增反应液B包括权利要求1中所述的第四引物组和第四探针、第五引物组和第五探针、第六引物组和第六探针、第七引物组和第七探针、第八引物组和第八探针。
作为优选地，所述PCR混合液包含PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶。
作为优选地，所述对照品包括正常对照品和缺失对照品。
作为优选地，所述正常对照品包括含有sY1324位点、sY127位点、sY1192位点、sY85位点、sY1233位点、sY254位点、SRY基因和RNase P基因特异性片段的质粒。
作为优选地，所述缺失对照品包括含有RNase P基因特异性片段的质粒。
一种Y染色体微缺失的非诊断目的的检测方法，采用权利要求4-9中任一所述Y染色体微缺失的试剂盒的应用方式为检测人外周血的步骤。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种检测Y染色体微缺失的引物及探针组合物，该引物及探针组合物是通过选用AZFa，AZFb和AZFc共3个区域的sY1324、sY127、sY1192、sY85、sY1233、sY254位点和Y染色体性别区决定基因位点(sex-determining region of Y，SRY)同时进行检测，不仅能够鉴别出Y染色体不同缺失类型，尤其增加了AZFc区b2/b3，b1/b3和b2/b4缺失的检出率。
该试剂盒仅利用了核酸扩增反应A和核酸扩增反应B，两个反应结合即可完成检测，突破了传统6位点检测方法的局限性，不仅有效地提高阳性检出率和检测的准确性，而且试剂成本低，进一步促使国内自主研发产品达到了国际领先水平。
该试剂盒通过荧光定量PCR的方法检测，检测效率和灵敏度高，试剂成本低，具有便捷性，对操作使用人员技能要求低，且能够有效地防止样本混淆，避免误差，便于大规模推广。
该试剂盒的使用方法及检测流程中对选用的检测设备要求较低，检测设备的成本付出较少，便于购置，进一步提高了检测流程的高效进行。同时由于该试剂盒中包含内参基因、正常对照品和缺失对照品进行全程监控，可完成对待检测样本及核酸扩增检测的整个过程进行质量监控，既能监控待检测样本的获取、PCR扩增过程是否顺利进行，还可以监控是否出现人工操作失误，便于原因排查。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。所用试剂均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：
该Y染色体微缺失的引物探针采用多重实时荧光PCR法检测人Y染色体微缺失核酸的引物探针及试剂盒(50反应/盒)包含组分如表1所示：
表1试剂盒组分
Figure BDA0003101747410000061
Figure BDA0003101747410000071
核酸扩增反应液A：含有针对sY1324位点、sY127位点、sY1192位点和RNase P基因的特异性引物及探针溶液，其上、下游引物核苷酸序列和引物探针序列具体如：SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.12所示。
核酸扩增反应液B：含有针对sY85位点、sY1233位点、sY254位点、SRY基因和RNaseP基因的特异性引物及探针溶液，其上、下游引物核苷酸序列和引物探针序列具体如：SEQID NO.13-SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示。
PCR预混液：购自诺唯赞生物科技股份有限公司，Cat No：Q113。包含PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶。
缺失对照品：含有sY1324位点、sY127位点、sY1192位点、sY85位点、sY1233位点、sY254位点、SRY基因和RNase P基因特异性片段的质粒。
正常对照品：含有RNase P基因特异性片段的质粒。
检测位点及其序列陈列表：
Figure BDA0003101747410000072
Figure BDA0003101747410000081
Figure BDA0003101747410000091
实施例2
采用实施例1制备得到的试剂盒进行Y染色体微缺失核酸实时荧光定量PCR检测的流程：
(1)核酸提取：
获得200μL全血离体样本(使用天隆全自动核酸提取仪(NP968-3S)及配套天隆全血基因组DNA提取试剂盒，提取EDTA抗凝管所采集的全血样本)，获取后用微量紫外分光光度计测定核酸纯度及浓度，其OD260/280在1.6-2.0之间；用灭菌双蒸馏水稀释基因组DNA浓度至20ng/μL备用。
(2)PCR反应体系配制，总反应体积20μL，如表2所示：
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003101747410000092
(3)样本检测：
将缺失对照品、正常对照品、待测样本DNA依序加入反应孔位，加样体积均为5μL。
(4)扩增程序：
在37℃2min(1个循环)；95℃10min(1个循环)；95℃15sec，60℃60sec(信号采集)，共40个循环。本发明使用ABI 7500进行检测。每一循环实时采集CY5、FAM、NED、ROX、VIC荧光信号。
(5)数据分析：
Figure BDA0003101747410000101
Figure BDA0003101747410000111
(6)试剂盒性能：
(1)阳性符合率：采用实施例1所述的试剂盒对阳性企业参考品进行检测，结果均为阳性，阳性符合率100％。如表3所示：
表3阳性符合率参考品
Figure BDA0003101747410000112
(2)阴性符合率：采用实施例1制备得到的试剂盒对阳性企业参考品进行检测，结果均为阴性，阴性符合率为100％。如表4所示：
表4阴性符合率参考品
参考品类型 参考品编号 样本类型
阴性 N1 正常男性血液样本
(3)精密度：采用实施例1所述的试剂盒对1份自建阳性企业参考品进行检测，每个样品重复10次，检测结果Ct值的变异系数(CV％)≤5％。如表5所示：
表5精密度参考品
Figure BDA0003101747410000113
Figure BDA0003101747410000121
(4)最低检出限：采用实施例1所述的试剂盒对10ng/μL的最低检出限企业参考品进行检测，检测结果均为阳性，符合率100％。如表6所示：
表6最低检出限参考品
Figure BDA0003101747410000122
实施例3
采用SALSA MLPA Probemix P360 Y-Chromosome Microdeletions试剂盒(MRC-Holland，未取得我国医疗器械生产许可)、某市售Y染色体微缺失检测试剂盒(已取得我国医疗器械生产许可)及本发明实施例1所述的试剂盒进行15例男性Y染色体微缺失检测。样本来源于北京朝阳医院泌尿男科，符合中国人群的特点。三种试剂盒的Y染微缺失检出结果如表7所示：
表7 15例男性样本在不同Y染微缺失试剂盒中的检出情况
Figure BDA0003101747410000123
Figure BDA0003101747410000131
注：“-”表示检出缺失。
通过对15例样本的检测，MRC-Holland试剂盒阳性检出率为87％，某市售qPCR试剂盒阳性检出率为47％，本发明试剂盒为67％。与某市售qPCR试剂盒相比，本试剂盒增加了AZFc区b2/b3，b1/b3和b2/b4的检出率。与MRC-Holland使用的MLPA方法相比，本发明未检出的20％为AZFc区gr/gr缺失。研究表明，gr/gr缺失不是直接导致男性不育原因，因此本发明不涉及gr/gr鉴别。而且MLPA方法实验繁琐，耗时较长，需用2天才可得到检测结果，本试剂盒操作简单，仅在2小时之内即可快速鉴别出Y染色体AZF a区、AZF b区、AZF c区缺失情况。
上述试剂盒的检测方法仅需操作者将核酸扩增反应液、PCR预混液、DNA模板/对照品混合即可上机检测，检测仪器仅依赖于荧光定量PCR仪器，结果Ct值仪器可自动判读，两个小时即可获得检测数据。对操作人员要求低，便于推广使用。本申请提供的该试剂盒获得的检测数据仅用于作为后续本领域医师进行病症判断的数据参考，并不直接进行病症的诊断。
本发明提供了一种检测Y染色体微缺失的引物及探针组合物，该引物及探针组合物是通过选用AZFa，AZFb和AZFc共3个区域的sY1324、sY127、sY1192、sY85、sY1233、sY254位点和Y染色体性别区决定基因位点(sex-determining region of Y，SRY)同时进行检测，不仅能够鉴别出Y染色体不同缺失类型，尤其增加了AZFc区b2/b3，b1/b3和b2/b4缺失的检出率。
该试剂盒仅利用了核酸扩增反应A和核酸扩增反应B，两个反应结合即可完成检测，突破了传统6位点检测方法的局限性，不仅有效地提高阳性检出率和检测的准确性，而且试剂成本低，进一步促使国内自主研发产品达到了国际领先水平。
该试剂盒通过荧光定量PCR的方法检测，检测效率和灵敏度高，试剂成本低，具有便捷性，对操作使用人员技能要求低，且能够有效地防止样本混淆，避免误差，便于大规模推广。
该试剂盒的使用方法及检测流程中对选用的检测设备要求较低，检测设备的成本付出较少，便于购置，进一步提高了检测流程的高效进行。同时由于该试剂盒中包含内参基因、正常对照品和缺失对照品进行全程监控，可完成对待检测样本及核酸扩增检测的整个过程进行质量监控，既能监控待检测样本的获取、PCR扩增过程是否顺利进行，还可以监控是否出现人工操作失误，便于原因排查。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本领域的普通技术人员应当理解，在不背离本发明的范围下，可对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，与此同时这些修改或者替换，并不会使相应的技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京朝阳医院 ，北京华诺奥美基因生物科技有限公司
<120> 一种检测Y染色体微缺失的引物及探针组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> sY1324位点上游引物核苷酸序列
<400> 1
gtgctacaaa gtgcccttca ga 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> sY1324位点下游引物核苷酸序列
<400> 2
cctgagcaag aagtatggac tcatt 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> sY1324位点，5'端FAM荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 3
cattcctaat ccctcatccg agtgcg 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> sY127位点上游引物核苷酸序列
<400> 4
gaggctaggc tcacaaacga a 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> sY127位点下游引物核苷酸序列
<400> 5
tctctttttg tgggcatgaa ca 22
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> sY127位点，5'端Cy5荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 6
atagcaccca ctggaatcta ccaaagccc 29
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> sY1192位点上游引物核苷酸序列
<400> 7
ggaagccgga tttgatataa acttat 26
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> sY1192位点下游引物核苷酸序列
<400> 8
ccatctcctg acctcgtgat c 21
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> sY1192位点，5'端ROX荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 9
tggctcagcg ctgtaatctc agcagtt 27
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> RNase P基因上游引物核苷酸序列
<400> 10
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> RNase P基因下游引物核苷酸序列
<400> 11
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> RNase P基因，5'端VIC荧光基团标记，3'端BHQ1淬灭基团标记
<400> 12
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> sY85位点上游引物核苷酸序列
<400> 13
tccccagagt tgttaataca gatg 24
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> sY85位点下游引物核苷酸序列
<400> 14
gctacggttg atggctgttg t 21
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> sY85位点，5'端FAM荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 15
ccagagagag aatagcaaca gaccacgaca 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> sY1233位点上游引物核苷酸序列
<400> 16
agagtgcgcg tcagcagttt 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> sY1233位点下游引物核苷酸序列
<400> 17
gagccgactg aactaagatg ca 22
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> sY1233位点，5'端Cy5荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 18
agctctgtag ccagcctctt ctgcgc 26
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> sY254位点上游引物核苷酸序列
<400> 19
ggcccacatc ccattgttc 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> sY254位点下游引物核苷酸序列
<400> 20
ttttgttggt ggaattgatg ct 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> sY254位点，5'端ROX荧光基团标记，3'端MGB淬灭基团标记
<400> 21
tgtatgttaa ggtaaaaatg agg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> SRY基因上游引物核苷酸序列
<400> 22
attcttccag gaggcacaga aa 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> SRY基因下游引物核苷酸序列
<400> 23
ccttccgacg aggtcgatac 20
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> SRY基因，5'端NED荧光基团标记，3'端QSY淬灭基团标记
<400> 24
tacaggccat gcacagagag aaatacccg 29

Claims (8)

1.一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物，其特征在于，包括分别用于检测sY1324位点、sY127位点、sY1192位点、RNase P基因、sY85位点、sY1233位点、sY254位点以及SRY基因的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针、第四引物组和第四探针、第五引物组和第五探针、第六引物组和第六探针、第七引物组和第七探针、第八引物组和第八探针；
其中，第一引物组包括第一上游引物和第一下游引物，第一上游引物、第一下游引物及第一探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
第二引物组包括第二上游引物和第二下游引物，第二上游引物、第二下游引物及第二探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
第三引物组包括第三上游引物和第三下游引物，第三上游引物、第三下游引物及第三探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
第四引物组包括第四上游引物和第四下游引物，第四上游引物、第四下游引物及第四探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示；
第五引物组包括第五上游引物和第五下游引物，第五上游引物、第五下游引物及第五探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
第六引物组包括第六上游引物和第六下游引物，第六上游引物、第六下游引物及第六探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示；
第七引物组包括第七上游引物和第七下游引物，第七上游引物、第七下游引物及第七探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；
第八引物组包括第八上游引物和第八下游引物，第八上游引物、第八下游引物及第八探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示；
所述第一探针至第八探针的5′端均标记有荧光基团，所述第一探针至第八探针的3′端均标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的一种检测Y染色体微缺失的引物及探针的组合物，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、Cy5、ROX、VIC和NED中的任意一种；
所述淬灭基团包括QSY、MGB和BHQ1中的任意一种。
3.一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增反应液A、核酸扩增反应液B、PCR混合液和对照品；
所述试剂盒内的核酸扩增反应液A包括权利要求1中所述的第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针、第三引物组和第三探针、第四引物组和第四探针；
所述试剂盒内的核酸扩增反应液B包括权利要求1中所述的第四引物组和第四探针、第五引物组和第五探针、第六引物组和第六探针、第七引物组和第七探针、第八引物组和第八探针。
4.根据权利要求3所述的一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述PCR混合液包含PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶。
5.根据权利要求3所述的一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述对照品包括正常对照品和缺失对照品。
6.根据权利要求5所述的一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述正常对照品包括含有sY1324位点、sY127位点、sY1192位点、sY85位点、sY1233位点、sY254位点、SRY基因和RNase P基因特异性片段的质粒。
7.根据权利要求5所述的一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述缺失对照品包括含有RNase P基因特异性片段的质粒。
8.一种Y染色体微缺失的非诊断目的的检测方法，其特征在于，采用权利要求4-7中任一所述Y染色体微缺失试剂盒进行检测。
CN202110624753.XA 2021-06-04 2021-06-04 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒 Active CN113136418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110624753.XA CN113136418B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110624753.XA CN113136418B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113136418A CN113136418A (zh) 2021-07-20
CN113136418B true CN113136418B (zh) 2022-03-11

Family

ID=76816066

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110624753.XA Active CN113136418B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113136418B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113981067A (zh) * 2021-11-04 2022-01-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种无精少精症染色体变异检测试剂盒
CN114015787A (zh) * 2021-11-19 2022-02-08 王晴雪 一种检测y染色体微缺失与微重复的探针组合、试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111778320A (zh) * 2019-04-04 2020-10-16 山东源创生殖技术有限公司 检测y染色体微缺失的组合物、产品及其应用和方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111778320A (zh) * 2019-04-04 2020-10-16 山东源创生殖技术有限公司 检测y染色体微缺失的组合物、产品及其应用和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y Choromosomal microdeletion screening in the workup of male infertility and its current status in India;Ramaswamy Suganthi等;《Int J Fertil Steril》;20141231;第257-258页 *
不育男性无精子症因子微缺失的分子与临床特征：5年研究回顾;史轶超等;《中华男科学杂志》;20101231;第314-319页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113136418A (zh) 2021-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111394511B (zh) 2019新型冠状病毒的检测引物组、探针组及检测试剂盒
WO2016188144A1 (zh) 一种具有增强鉴别能力的str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
WO2016188331A1 (zh) 一种人类基因组dna 34个基因座的复合扩增试剂盒
CN104762408B (zh) 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法
WO2022033334A1 (zh) 一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)快速检测试剂盒及其方法
CN109706232B (zh) 用于检测人类alk基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法
WO2016066070A1 (zh) 具有增强鉴别能力的y染色体str基因座荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN113136418B (zh) 一种检测y染色体微缺失的引物及探针的组合物、非诊断目的的检测方法及试剂盒
CN111235272B (zh) 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
CN106755395B (zh) Xi型成骨不全致病基因fkbp10的突变位点及其应用
CN116479132B (zh) 膀胱癌甲基化位点标志物及其应用
CN111020026A (zh) 特异性引物探针组合及其适于血液直接扩增结合荧光pcr法检测叶酸代谢能力基因的应用
CN103725798A (zh) 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法
CN106148484B (zh) 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN110408697A (zh) Npm1基因突变分型检测方法及试剂盒
CN106498028B (zh) Egfr的t790m突变的诊断方法及试剂盒
WO2021239081A1 (zh) 一种能够用于检测npc1l1突变基因分型的试剂、试剂盒及其使用方法、应用
CN116751865A (zh) 一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用
CN110878351A (zh) 用于荧光定量pcr检测mthfr基因多态性的方法
CN114317727B (zh) 用于smn基因拷贝数分析的荧光定量检测试剂及应用
CN115960997A (zh) 基于数字PCR平台检测c-MET基因14号外显子跳跃突变的引物探针组合及试剂盒
CN113186277B (zh) 一种先天性巨结肠的标志物及其应用
CN116254371A (zh) 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用
CN111172248B (zh) 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
CN111909990A (zh) 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant