CN111778320A - 检测y染色体微缺失的组合物、产品及其应用和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，提供用于检测Y染色体微缺失的组合物，包括序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:24所示的引物和探针。本发明还提供了包含所述组合物的产品和使用所述组合物的方法。本发明的组合物具有操作简便、时间短、污染少以及结果准确等特点。

Description

检测Y染色体微缺失的组合物、产品及其应用和方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测Y染色体微缺失的组合物及产品和应用。
背景技术
Y染色体调控着男性精细胞的生长发育，在男性生育中起了重要作用，因而Y染色体功能损伤很有可能导致多种现象的发生。
Y染色体微缺失是指Y染色体上功能域出现DNA片段或者基因缺失的现象，Y染色体微缺失区域，主要包含AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc和AZFabc区(《2013新版EAA/EMQNY染色体微缺失检测指南解读》)。欧洲男科协会(European Academy of Andrology,EAA)和欧洲分子遗传质控网(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)联合发布的《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》，推荐了多重PCR检测Y染色体AZF区微缺失的6个序列标签位点(sequence-tagged site，STS)(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。
对Y染色体微缺失进行检测，可以为多种状况的分析提供依据。目前，对Y染色体微缺失的检测方法有多种。但是现有的方法例如通过多重PCR检测的方法由于存在多种引物相互干扰，导致检测容易出现灵敏度低、假阳性假阴性高等情况；另外，该方法对结果的分析是通过凝胶电泳法，极容易导致实验室的污染，不适合产业化及商业化的推广；又例如多重PCR扩增结合DHPLC检测的方法对仪器要求非常高，操作繁琐、操作步骤多，难以普及。除了PCR方法以外，对Y染色体微缺失的检测常见的方法还有原位杂交法。但这种方法对操作及仪器要求都极高，而且操作异常繁琐，在实际应用中难以普及，不利于推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测Y染色体微缺失的组合物以及检测方法，以解决现有技术中的上述问题。
第一个方面，本发明提供检测Y染色体微缺失的组合物，所述组合物包括引物和探针，所述组合物用于检测以下位点：ZFX、SRY、SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255；具体地，所述组合物包括：
Figure BDA0002018223390000021
优选地，所述组合物分为两组，组A包括检测ZFX、SY84、SY127、SY254四个位点的引物和探针，组B包括检测SRY、SY86、SY134、SY255四个位点的引物和探针。
在第二个方面，本发明提供一种检测Y染色体微缺失的产品，包括本发明的组合物；所述产品优选为试剂盒。
优选地，所述试剂盒中，检测ZFX、SY84、SY127、SY254四个位点的引物和探针混合为预混液A，检测SRY、SY86、SY134、SY255四个位点的引物和探针混合为预混液B；
进一步优选地，所述预混液A和预混液B还分别包括PCR Mix，所述PCR Mix包括除探针和引物以外的PCR扩增所需原料，如dNTP、DNA聚合酶、缓冲液及MgCl2等。
在第三个方面，提供本发明的组合物在制备检测Y染色体微缺失的产品中的应用。所述产品优选为试剂盒。
在第四个方面，提供本发明的组合物或产品在检测Y染色体微缺失中的应用。
在第五个方面，提供一种检测Y染色体微缺失的方法，包括使用本发明的组合物或试剂盒。
优选地，所述检测方法包括以下PCR程序：
第一阶段：95℃、5分钟，1个循环；第二阶段：95℃、15秒，58℃、30秒，72℃、45秒；40个循环；第三阶段：72℃、5分钟，1个循环；其中，所述步骤还包括信号收集：第二阶段58℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，执行实时PCR。
本发明的组合物中，其引物是针对中国人特有序列设计，具有更高的特异性，避免了假阳性假阴性的出现；且这些引物相互兼容能够在同一PCR扩增体系内进行反应，具有较高的灵敏度和特异性。本发明的引物配合相应的Taqman探针混合进行多重荧光PCR检测；通过检测荧光信号的有无或强弱判断相应的基因位点是否有缺失，灵敏度高，阳性率高。本发明的组合物或产品或方法具有操作简便、时间短、污染少以及结果准确等特点。
附图说明
图1为本发明产品的阳性质控品的检测结果图；
图2为市场在售产品的阳性质控品的检测结果图；
图3为本发明产品的阴性质控品的检测结果图；
图4为市场在售产品的阴性质控品的检测结果图。
图5为Y染色体微缺失凝胶电泳检测图，其中，M：100bp Marker；泳道1、2、3：空白对照扩增产物；泳道4、5、6：阴性对照扩增产物；泳道7、8、9：阳性质控品扩增产物。
图6为样本S5的电泳检测结果，其中泳道AZF-1、AZF-2和AZF-3分别对应预混液A、B和C的扩增检测结果。
图7为样本S6的电泳检测结果，其中泳道AZF-1、AZF-2和AZF-3分别对应预混液A、B和C的扩增检测结果。
图8为样本S43的电泳检测结果，其中泳道AZF-1、AZF-2和AZF-3分别对应预混液A、B和C的扩增检测结果。
图9为样本S44的电泳检测结果，其中泳道AZF-1、AZF-2和AZF-3分别对应预混液A、B和C的扩增检测结果。
图10为样本S45的电泳检测结果，其中泳道AZF-1、AZF-2和AZF-3分别对应预混液A、B和C的扩增检测结果。
具体实施方式
以下将根据具体实施方式说明本发明，但本发明的内容不限于此。
以下实施例中，如无具体说明，使用的试剂或仪器均为本领域常规试剂或仪器，可以通过商购途径获得；使用的方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据说明书的描述可以完成所述实验过程并获得相应的结果。
本发明的思路是基于6个Y染色体微缺失位点(AZFa区2个，AZFb区2个，AZFc区2个)和2个性别质控位点(SRY，ZFX/Y)进行研究，考虑到目前检测方法中，引物的互相干扰对结果产生非常大的影响，因而在引物和整体方法的选取上下功夫。本发明所提供的这些引物相互兼容，能够在同一PCR扩增体系内进行反应，具有较高的灵敏度和较强的特异性。
引物、探针的设计
根据欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网(EAA/EMQN)2013版指南中推荐的引物序列，从人类核酸数据库(NCBI)中检索出sY84(AF440138.1)、sY86(NC000024.10)、sY127(AC009240.6)、sY134(KP687359.1)、sY254(G38349.1)、sY255(G65827.1)、SRY(NM_003140.2)和ZFX(M30608.1)序列片段，再应用Primer Express3.0软件设计引物及探针，原则是扩增子长度适合荧光PCR。为了保证所设计的序列高度特异及有效，按照以下原则设计引物及探针：
①先设计探针，然后设计引物使其尽可能靠近探针；
②对引物探针做互相配对检测，避免出现二聚体和发夹结构；
③探针Tm值在68～70℃之间，而引物的Tm值应在58～60℃之间；
④GC含量在40％～60％之间，避免重复的核苷酸序列；
⑤探针5’端应避免使用G鸟嘌呤；
⑥扩增子长度尽量在100～150bp之间。
按照引物探针设计原则，自行设计引物及探针，然后对每条引物及探针序列通过Blast进行同源比对，保证所涉及的引物和探针保守高度特异，再转交合成公司合成。
经过反复试验，最终确定针对8个位点的合适的引物和探针序列如下所示。
Figure BDA0002018223390000051
Figure BDA0002018223390000061
将检测ZFX、SY84、SY127、SY254四个位点的引物和探针以及PCR Mix制备为预混液A；将检测SRY、SY86、SY134、SY255四个位点的引物和探针以及PCR Mix制备为预混液B，PCRMix组分见下表。
PCR Mix组分 厂家
10*(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>缓冲液 Thermo
dNTPs(每种2.5mM) Takara
TaKaRa Taq热启动DNA聚合酶 Takara
MgCl<sub>2</sub>(25mM) Thermo
反应程序如下：第一阶段：95℃、5分钟，1个循环；第二阶段：95℃、15秒，58℃、30秒，72℃、45秒；40个循环；第三阶段：72℃、5分钟，1个循环；信号收集：在第二阶段的58℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，执行实时PCR，保存文件。
实验例1：
采用阳性质控品和阴性质控品，将本发明产品与一市场在售产品(上海透景生命科技有限公司生产的Y染色体微缺失检测试剂盒(PCR荧光探针法))进行对比，其中，阳性质控品为鉴定为正常男性基因组DNA(各位点未缺失)，阴性质控品为去离子水。本发明产品的使用方法同本说明书介绍方法，市场在售产品的使用按照所述试剂盒的说明书进行。结果如图1-4所示。
将本发明产品与市场在售产品检测的各位点荧光强度值进行比较，结果如表1所示：
表1：本发明产品与市场在售产品各位点试验结果比较
Figure BDA0002018223390000071
从图1～图4的检测线型(S型曲线)以及表1的荧光强度上看，本发明的产品检测效果明显优于市场在售产品的检测效果。
实验例2：
选取在山东大学附属生殖医院进行AZF检测的样本46例(S1-S46)进行验证试验，采用本发明试剂盒和实验例1中使用的市场在售产品试剂盒分别进行检测，两次结果不一致的样本再利用凝胶电泳进行验证。其中本发明试剂盒的使用方法按照本文所述，市场在售产品试剂盒的使用根据试剂盒说明书的内容进行。凝胶电泳方法如下：
将以下引物和PCR Mix(配方同上)分别制备为预混液A(ZFX/SRY/SY86/SY127/SY153引物)、B(ZFX/SRY/SY254/SY134/SY255引物)、C(RBM1/SRY/SY84/SY152引物)：
Figure BDA0002018223390000081
备注：凝胶电泳方法包含RBM1(b区域)、SY152(d区域)、SY153(d区域)三个点，本发明及市售产品不包含三个点。
反应程序如下：第一阶段：95℃、5分钟，1个循环；第二阶段：95℃、15秒，56℃-62℃、30秒，72℃、40秒，10个循环，每个循环递降1℃；第三阶段：95℃、30秒，56℃、30秒，72℃、40秒，25个循环。
取PCR扩增产物10μl与2μl DNA上样缓冲液(6×)混合并反复吹打均匀后加入琼脂糖凝胶(2％)上样孔，设置电压为8V/cm，电泳约30min。结束后，取出凝胶在凝胶成像分析系统或紫外灯下观察结果。
阳性质控品和阴性质控品同实验例1。
结果显示：
1、本发明的产品与市售产品所检测的46个样本的结果一致性为89％(41/46)，有5个样本(S5/S6/S43/S44/S45)不一样。
2、对于本发明产品与市售产品检测结果不一致的5例样本，采用凝胶电泳方法进行验证，结果，本发明产品的检测结果与凝胶电泳结果完全符合。
具体内容见表2～表5。其中，表2为三种检测方式的结果统计，表3为本发明产品试剂盒检测的原始结果，表4为市场在售产品检测的原始结果，表5为正常男性Y染色体微缺失电泳产物对照表，用于与图5～10结合说明所检测样本的微缺失情况，从而可知，本发明产品对这份样本的检测结果与电泳检测结果一致。
由此可见，本发明产品的检测效果明显优于市场在售产品，且本发明产品相对于凝胶电泳，操作过程大大简化(本发明实验过程2h左右，凝胶电泳方法实验过程4-5h)，方便快捷，有利于市场大规模推广。
表2：46例样本三种检测方式的检测结果统计
Figure BDA0002018223390000091
Figure BDA0002018223390000101
表3：本发明产品试剂盒检测的原始结果
Figure BDA0002018223390000111
Figure BDA0002018223390000121
Figure BDA0002018223390000131
Figure BDA0002018223390000141
Figure BDA0002018223390000151
Figure BDA0002018223390000161
表4：市场在售产品检测的原始结果
Figure BDA0002018223390000162
Figure BDA0002018223390000171
Figure BDA0002018223390000181
Figure BDA0002018223390000191
Figure BDA0002018223390000201
Figure BDA0002018223390000211
表5：正常男性Y染色体微缺失电泳检测产物对照表
Figure BDA0002018223390000212

Claims (10)

1.检测Y染色体微缺失的组合物，所述组合物包括引物和探针，所述组合物用于检测以下位点：ZFX、SRY、SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、SY255。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包括序列如SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:24所示的引物或探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物分为两组，组A包括检测ZFX、SY84、SY127、SY254四个位点的引物和探针，组B包括检测SRY、SY86、SY134、SY255四个位点的引物和探针。
4.一种检测Y染色体微缺失的产品，包括权利要求1～3任一项所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的产品，其中，所述产品为试剂盒。
6.根据权利要求5所述的产品，其中，检测ZFX、SY84、SY127、SY254四个位点的引物和探针混合为预混液A，检测SRY、SY86、SY134、SY255四个位点的引物和探针混合为预混液B。
7.根据权利要求6所述的产品，其中，所述预混液A和预混液B还分别包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液及MgCl2。
8.权利要求1～3任一项所述的组合物在制备检测Y染色体微缺失的产品中的应用。
9.权利要求1～3任一项所述的组合物或权利要求4～7任一项所述的产品在检测Y染色体微缺失中的应用。
10.一种检测Y染色体微缺失的方法，包括使用本发明的组合物或试剂盒；
优选地，所述检测方法包括以下PCR程序：
第一阶段：95℃、5分钟，1个循环；第二阶段：95℃、15秒，58℃、30秒，72℃、45秒；40个循环；第三阶段：72℃、5分钟，1个循环；其中，所述步骤还包括信号收集：第二阶段58℃时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，执行实时PCR。
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