CN102703578A

CN102703578A - Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒

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Publication number: CN102703578A
Application number: CN2011101894563A
Authority: CN
Inventors: 郭奇伟; 周裕林; 江雨; 左正宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: CN102703578B

Abstract

本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒。该试剂盒利用实时荧光PCR可以检测Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的基因缺失。该试剂盒采用同源加尾引物与通用引物实现稳定高效的多重PCR反应体系，并利用不同荧光基团标记的核酸探针指示目标片段的存在情况，从而实现最快两管同时检测6个AZF缺失热点以及2个内控基因(SRY与ZFX/Y)上的序列。采用本发明所述试剂盒对男性Y染色体微缺失基因进行检测，具有快速、准确、高通量、低成本、无污染等优点。

Description

Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种男性Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。

背景技术

世界范围内约有15％的育龄夫妇受到不孕不育症的困扰，其中男性因素约占50％。研究表明，35％以上是由于遗传学因素导致，主要为克氏综合征和Y染色体微缺失。目前已知，Y染色体上存在着无精子因子(azoospermia factor，AZF)，与精子的生成休戚相关。Y染色体长臂上有三个AZF亚区——AZFa区、AZFb区、AZFc区。这些区域的基因微缺失可引起精子发生障碍、少精、弱精、甚至无精，从而导致男性不育。

近年来，辅助生殖技术获得了高速的发展，卵细胞胞浆内精子注射(intracytoplasmicsperm injection，ICSI)技术给众多不育症患者带来了福音。然而该技术可能将携带异常染色体与突变基因的精子注入到卵细胞内，使卵子受精，从而将携带的遗传缺陷传递给下一代。并且某些类型的Y染色体微缺失患者无法通过自身睾丸取精进行ICSI。因此，临床上一般建议精子浓度小于5×10⁶/mL的男性都要进行Y染色体微缺失的分子诊断。这不仅可以避免遗传缺陷的传递，还可指导ICSI后代的生育。同时对于指导无精症或少精症患者的临床诊断及治疗措施的选择，避免不必要的药物和手术治疗方面更是具有巨大的意义。

目前应用于Y染色体微缺失检测的技术主要有：

1.多重PCR电泳：2004年欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控协作网(EMQN)联合发布了Y染色体微缺失检测指南，其采用多重PCR结合电泳的方法两管同时检测Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的基因缺失。目前该方法已成为Y染色体微缺失检测的行业标准。也有若干基于该项指南的Y染色体微缺失检测试剂盒面世。然而该方法仍然存在诸多不足。首先，该方法为五重PCR，各目的片段的扩增容易互相干扰，从而造成假阳性的结果；其次，电泳的方法容易造成致命的PCR产物污染，导致假阴性的结果；再次，该方法费时(约四个小时)、耗工，不利于大批量样本的检测。

实时荧光PCR：实时荧光PCR具有快速、准确、无污染的特点，因此成为了分子诊断实验室的常规仪器。目前采用实时荧光PCR对Y染色体微缺失进行检测主要有染料法与探针法两种方式。染料法即在反应体系内加入双链DNA嵌入染料如SYBR Green I以指示目标片段的扩增。然而由于染料不具序列特异性，因此只能进行单重PCR，这不仅使得通量变低，而且必须依靠熔解曲线分析区分目标片段与引物二聚体。而目前的探针法同样为单重PCR，不仅降低了通量，而且由于没有内参照，容易造成假阳性的结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种男性Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒。该试剂盒能快速、准确、高通量地对Y染色体微缺失基因进行检测。

本发明的另一目的在于提供一种男性Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测方法。该方法建立在同源加尾引物联合通用引物进行的多重PCR上，提高和平衡了多重PCR各目的片段的反应效率，从而保证了多重PCR反应的稳定性和均一性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，包括引物和荧光探针，其特征在于：所述引物包括用于扩增Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，以及Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的引物，所述的引物通过同源加尾的方式抑制引物二聚体的产生，提高检测灵敏度，从而实现稳定高效的多重PCR反应体系。

所述引物中还包括一通用引物。通过引入通用引物可以提高和平衡多重PCR各个目的片段的扩增效率，从而实现稳定高效的多重PCR反应体系。

同源加尾的特异引物负责扩增目的片段。由于引物二聚体片段长度通常较短，而一旦同源加尾的特异引物自身或相互之间形成引物二聚体，即会产生较稳定的发夹结构，从而抑制引物二聚体的进一步积累，提高了检测的灵敏度。通过引入通用引物，可以提高和平衡多重PCR各个目的片段的扩增效率。同源加尾引物与通用引物二者结合，从而实现稳定高效的多重PCR反应体系。

较佳地，所述试剂盒采用至少两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示至少两个目标片段的存在情况。多种不同荧光基团包括任意发射波长不同的荧光基团的组合。常用的荧光标记基团包括但不局限于目前各种荧光标记物，如ALEX-350，FAM.，HEX，VIC，TET，JOE，ROX，TEXAS RED，CY3，CY5，CY5.5等。常用的淬灭基团包括但不局限于目前各种淬灭剂如DABCYL，BHQ1，BHQ2，BHQ3，TAMRA，ECLIPE等。

更佳地，所述试剂盒采用四种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示四个目标片段的存在情况。

所述用于实时PCR检测试剂盒的荧光探针包括但不局限于TaqMan探针，TaqMan-MGB探针，分子信标，改良分子信标，双链荧光置换探针，LightCycler探针以及双环探针等中的一种或其组合。

一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括了针对2004年欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控协作网(EMQN)联合发布的Y染色体微缺失检测指南中的所有检测位点的引物序列：

特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY84序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

特异性扩增Y染色体AZFa亚区sY86序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY127序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；

特异性扩增Y染色体AZFb亚区sY134序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；

特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY254序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；

特异性扩增Y染色体AZFc亚区sY255序列的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；

特异性扩增男性特有SRY基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；

特异性扩增ZFX/Y基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；

通用引物序列如SEQ ID NO：17所示；

上述所有序列可由其碱基互补序列替换。

所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂：MgCl₂、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、荧光探针和PCR反应缓冲液。

所述的MgCl₂浓度为1.0～5.0mmol/L。

所述的dATP、dCTP、dGTP浓度均为50～400μmol/L，dUTP浓度为10～1000μmol/L。

所述试剂盒的实时荧光PCR检测中每个反应管内包括用于扩增SRY基因的引物、ZFX/Y基因中至少一个基因的引物，通用引物，sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255靶点中至少一个靶点的引物或引物组合，以及相应的荧光探针。

与现有试剂盒及相关技术相比，本发明具有以下突出优点：

1)应用多重实时荧光PCR技术结合荧光探针，可以实时观察实验结果。同时检测更加快速(60分钟)，操作更加简便，且没有PCR产物污染的顾虑，提高了检测的准确性。

2)应用多重实时荧光PCR技术，通过引入SRY基因序列与ZFX/Y基因序列作为内对照，再结合外对照即可以很好地避免假阴性和假阳性结果的产生，提高了检测结果的准确性。

3)通过同源加尾引物联合通用引物，提高了检测的灵敏度(灵敏度达到个位数拷贝，不仅可以应用于外周血样本，同样适用于极其微量的样品，如黏膜脱落细胞、组织切片等)。同时，提高和平衡了多重PCR各个目的片段的扩增效率，从而实现稳定高效的多重PCR反应体系。

4)涵盖了国际公认的6个缺失热点的检测，保证了结果的准确性。

5)最快两管即可完成所有位点的检测，节省了成本的同时又提高了通量。

附图说明

图1为A、B两管反应检测正常已育男性DNA样本作为阳性对照。

图2为A、B两管反应检测含有AZFa亚区缺失的男性DNA样本，其sY86序列缺失，sY84序列未缺失。

图3为A、B两管反应检测含有AZFb亚区缺失的男性DNA样本，其sY127序列与sY134序列均缺失。

图4为A、B两管反应检测含有AZFc亚区缺失的男性DNA样本，其sY254序列与sY255序列均缺失。

图5为A、B两管反应检测含有AZFb亚区与AZFc亚区双重缺失的男性DNA样本，其sY127序列、sY134序列、sY254序列与sY255序列均缺失。

图6为A、B两管反应检测含有AZFa亚区、AZFb亚区与AZFc亚区三重缺失的男性DNA样本，其sY84序列、sY86序列、sY127序列、sY134序列、sY254序列与sY255序列均缺失。

图7为A、B两管反应检测纯水样本作为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒。这些并不脱离本发明描述的基本概念。

实施例1多重实时荧光PCR两管同时检测6个AZF缺失位点

一、材料

1、仪器：

实时荧光PCR仪、移液器、离心机。

2、引物设计：

本发明设计了8对同源加尾引物与一条通用引物用于Y染色体6个微缺失位点的检测，同时本例设计了8条水解探针用以检测相应的目的片段。本例中反应分为A、B两个反应管进行。A管反应所用到引物与探针序列如表1所示，B管反应所用到引物与探针序列如表2所示

表1A管引物与探针列表

表2B管引物与探针列表

3、试剂

1×PCR buffer：10mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol/L KCl；Mg²⁺；热启动酶；UNG酶；dATP、dCTP、dGTP、dUTP。

二、方法

1、样本的选择

正常已育男性样本、AZFa区缺失样本(-sY86)、AZFb区缺失样本(-sY127，-sY134)、AZFc区缺失样本(-sY254，-sY255)、AZFb区c区双重缺失样本(-sY127，-sY134，-sY254，-sY255)、AZFa区b区c区三重缺失样本(-sY84，-sY86，-sY127，-sY134，-sY254，-sY255)。所有样本均已通过2004年欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验质控协作网(EMQN)联合发布的Y染色体微缺失检测指南中方法验证。

2、基因组DNA的提取

用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA。

3、实时荧光PCR扩增与检测

实时荧光PCR反应体系包括1×PCR buffer，3mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dATP、dCTP、dGTP，400μmol/L dUTP，200nmol/L各同源加尾引物，200nmol/L各水解探针，1.6μmol/L通用引物，1U热启动酶，0.3UUNG酶，30ng人基因组DNA。

实时荧光PCR反应在Roche LightCycler 480II仪器上进行，按以下条件进行扩增检测：

第一阶段：95℃3min；

第二阶段：95℃15sec，60℃20sec(荧光采集)，72℃20sec，50个循环；

四个荧光检测频道分别为FAM、HEX、ROX、CY5。

4、结果分析

阴性对照：以纯水作为模板的反应管内，应无任何扩增曲线产生。

阳性对照：以正常男性基因组DNA作为模板的反应管内，四个荧光频道应均有扩增曲线产生。

内对照：以待测男性基因组DNA作为模板的反应管内，SRY序列对应的荧光频道应有扩增曲线产生。

缺失判定：当满足上述三个要求时，无扩增曲线产生的荧光频道指示相应AZF区域的缺失。

从图1可以看出，正常已育男性样本的检测中，四个荧光频道均有扩增曲线产生。

从图2、图3、图4、图5、图6可以看出特定的AZF缺失类型在相应的荧光频道均没有扩增曲线信号的产生。

从图7可以看出采用纯水作为阴性对照时，四个荧光频道均没有扩增曲线信号产生。

Claims

1.一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，包括引物和荧光探针，其特征在于：所述引物包括用于扩增Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，以及Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的引物，所述的引物通过同源加尾的方式抑制引物二聚体的产生，提高检测灵敏度；所述引物中还包括一通用引物。

2.根据权利要求1所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用至少两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示至少两个目标片段的存在情况，所述多种不同荧光基团包括任意发射波长不同的荧光基团的组合。

3.根据权利要求2所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒采用至少四种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内同时指示四个目标片段的存在情况。

4.根据权利要求1或2或3所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于用于实时PCR检测的荧光探针包括TaqMan探针，TaqMan-MGB探针，分子信标，改良分子信标，双链荧光置换探针，LightCycler探针以及双环探针中的一种或其组合。

5.如权利要求1所述的一种Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括：

特异性扩增ZFX/Y基因的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；以及

通用引物序列，如SEQ ID NO：17所示；

上述所有序列可由其碱基互补序列替换。

6.根据权利要求1或2或5所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括实时荧光PCR反应所需试剂：MgCl₂、热启动Taq酶、UNG酶、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、荧光探针和PCR反应缓冲液。

7.根据权利要求1或2或5所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述的MgCl₂浓度为1.0～5.0mmol/L。

8.根据权利要求1或2或5所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述的dATP、dCTP、dGTP浓度均为50～400μmol/L，dUTP浓度为10～1000μmol/L。

9.根据权利要求1或2或5所述的Y染色体微缺失多重实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于所述实时荧光PCR检测中每个反应管内包括用于扩增SRY基因、ZFX/Y基因中至少一个基因的引物，通用引物，sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255靶点中至少一个靶点的引物或引物组合，以及相应的荧光探针。