CN112725419B - 一种y染色体微缺失检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了Y染色体微缺失检测试剂盒，该试剂盒包括反应液，酶液；所述反应液中包括PCR缓冲液，以及针对Y染色体微缺失位点的引物和探针，所述PCR缓冲液包括有Tris‑HCl缓冲液；所述酶液中包括有热启动DNA聚合酶，以及Tris‑HCl缓冲液；所述Tris‑HCl缓冲液中添加有三(2‑羰基乙基)磷盐酸盐和/或聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚。本发明所述Y染色体微缺失检测试剂盒中，能降低反应管中反应体系气泡产生及由气泡产生而导致的个别扩增曲线骤降；使趋向于形成二聚体巯基化DNA末端硫原子能够有效避免聚化，即使在存在氧气的情况下，也能达到反应效率稳定。因此，本发明所述Y染色体微缺失检测试剂盒具有很好的灵敏度和精密度。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒。
背景技术
研究表明，在世界范围人群中，不孕不育概率在10％-15％，其中，男性因素约占50％。 Y染色体因调控着男性精细胞的生长发育在男性生育中起了重要作用，其染色体结构上或基因数量上的异常均会引起无精症或少精症。Y染色体长臂上的无精子因子区(AZF)的微缺失是目前最常见的与Y染色体异常相关的不孕不育原因之一。
AZF的缺失或突变可能导致精子发生障碍，在Yq11区段或更远区段的丢失或这个区段中间的微小缺失均会导致精子发生过程中不同阶段的生精障碍引起少精子症或无精子症，从而导致不育。目前，比较确定的与不育相关的Y染色体基因微缺失区域有三个，分别是：AZFa、 AZFb、AZFc。据国内外文献报道，在无精症、少弱精子症、重度少精子症中AZF微缺失发生率在8.83％-11.6％。其中AZFa区域缺失0.01％-3.7％；AZFb区域缺失0.02％-12.9％；AZFc 区域缺失53.5％-70.7％；AZFb+AZFc区域缺失0.02％-24.7％；AZFa+AZFb+AZFc区域缺失 0.02％-14.7％。
目前研究普遍认为，AZFa的基因主导精母细胞的增生，其缺失较为少见，整个AZFa区域缺失通常表现为唯支持细胞综合征(SCOS)，睾丸活检不能取得精子，建议人工授精(AID)； AZFb区或AZFb+c区缺失表现为生精阻滞，精子生成被阻滞在精母细胞阶段，患者多为无精子症，建议AID；单独AZFc区缺失是临床上最为常见并引起生精障碍的一个重要原因，临床表现可以为正常精子数目、少精子症或无精子症，一般来说，AZFc缺失患者尚存精子生成能力，因此AZFc缺失者可以通过该辅助生育手段进行治疗，但是会将AZFc缺失遗传给男性后代。对此可以进行睾丸手术取精以获得精子行卵胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)或者进行胚胎植入前遗传学诊断(PGD)选择女孩，以避免遗传缺陷的垂直传播。因此Y染色体微缺失检测对男性遗传咨询、生殖安全和临床男性不育治疗手段的选择具有重要意义。
常规染色体核型分析无法检测这种Y染色体长臂微缺失，Y染色体微缺失目前常用的检测方法有多重PCR凝胶电泳法、荧光定量PCR法、基因芯片法和荧光原位杂交法等。基于RT-PCR方法进行STS位点(序列标记位点-sequence-tagged site)检测，避免了PCR扩增后的分离检测的过程，减少了实验时间和费用。同时，检测和分析过程自动化程度高，减少了人工操作产生的误差和交叉污染，可便捷地实验大规模筛查。在已有的STS位点对Y染色体微缺失检测体系中，体系中的各序列容易存在DNA二聚化，导致反应效率不稳定。而且，更为重要的是，发明人发现，偶尔会出现扩增曲线骤降(使PCR检测曲线出现异常，在多样本或多指标同步检测的情况下，易产生检测结果的误判并对结果的准确性产生影响)的情况，分析可能是反应管内有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。但是常规添加一些消泡剂，又并不能彻底解决这个问题。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒，该试剂盒反应效率稳定、检测稳定，从而具有很好的灵敏度和精密度。
为实现上述目的，解决方案如下。
一种Y染色体微缺失检测试剂盒，包括反应液，酶液，所述反应液中包括Tris-HCl缓冲液，以及针对Y染色体微缺失位点的引物和探针；所述酶液中包括有热启动DNA聚合酶，以及Tris-HCl缓冲液；所述Tris-HCl缓冲液中添加有三(2-羰基乙基)磷盐酸盐和/或聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚。
在其中一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液中，每1000μL含有0.8-1.5μL的聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚；更优选，含有1.1-1.3μL的聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚。
在其中一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液中三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的浓度为1.5-2.5mM，更优选地，含有1.9-2.1mM。
在其中一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液中，每1000μL含有85-90μL的聚乙二醇辛基苯基醚和50-55μL的二甲基亚砜。
在其中一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液还含有醋酸钾，所述醋酸钾的浓度为0.40-0.45mol/L。
在其中一些实施例中，所述Y染色体微缺失位点为sY84及sY86，和/或sY127及sY134，和/或sY254及sY255。
在其中一些实施例中，所述反应液有三份，分别包括有针对sY84和sY86，sY127和sY134，sY254和sY255的引物和探针。
在其中一些实施例中，所述针对sY84的引物和探针为：SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.3,所述针对sY86的引物和探针为：SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6,所述针对Sy127的引物和探针为： SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.9,所述针对sy134的引物和探针为：SEQ ID NO.10-SEQID NO.12, 所述针对sy254的引物和探针为：SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.15,所述针对sy255的引物和探针为：SEQ ID NO.16-SEQ ID NO.18。
本发明具有以下优点：
1、本发明所述Y染色体微缺失检测试剂盒中，通过在反应液中和酶液中添加优化组分后的 GT buffer，GT buffer中选择添加有聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚(BAPE)，并选择合适的量将其作为消泡剂应用到反应体系中，最终达到降低反应管中反应体系气泡产生及由气泡产生而导致的个别扩增曲线骤降这种现象。在反应体系中，还采用合适量的TCEP-HCl[三(2-羰基乙基)磷盐酸盐]作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂，这样检测系统中趋向于形成二聚体巯基化DNA末端硫原子能够有效避免聚化，即使在存在氧气的情况下，也能达到反应效率稳定。因此，本发明所述Y染色体微缺失检测试剂盒具有很好的灵敏度和精密度。
2、本发明所述Y染色体微缺失检测试剂盒，针对Y染色体微缺失的三个主要位点检测的反应液分别进行预先混合配制，使试剂盒在实际使用中进一步减少人为反应体系配制而产生的误差的同时获得稳定、客观的检测结果。同时反应体系的组装可在室温下完成，无需在冰上操作，进一步达到使用便利性。
附图说明
图1为实施例3关于不同浓度核酸样本试剂盒灵敏度检测结果，其中，1-8分别表示实验组 1-8。
图2为实施例6中GT Buffer配制中消泡剂添加的相关实验检测结果，其中，1：实验组2；2：实验组4；3：实验组3；4：实验组1；5：实验组5。
图3为实施例6中GT Buffer配制中BAPE添加量的实验检测结果，其中，1：实验组3；2：实验组4；3：实验组1；4：实验组2；5：实验组5。
图4为实施例6中关于GT Buffer配制中TCEP-HCl添加量的实验结果，其中，1：实验组5； 2：实验组6；3：实验组4；4：实验组7；5：实验组3；6：实验组1；7：实验组2。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
实施例1 Y染色体微缺失检测试剂盒
本试剂盒以荧光定量PCR仪为平台，针对人Y染色体上与不孕不育相关的3个DNA区域，设计3套特异性引物和探针组合，一个反应体系中通过两种不同通道检测1个区域上具有代表性意义的2个位点，具体检测缺失位点为：AZFa(sY84，sY86)、AZFb(sY127，sY134)、AZFc(sY254，sY255)。在反应体系中含有不同基因模板的情况下，PCR反应得以进行并释放出不同的荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。辅助诊断为不孕不育患者的病因分析。
本实验采取RT-PCR方法对Y染色体微缺失进行检测。将6种基因分为3组，每组2个STS位点，分别为1-3号管。其中内标分别选择使用X/Y连锁锌指蛋白基因(ZFX/Y)和性别决定基因(SRY-Sy14)，同时，每批检测均有正常女性基因和正常男性基因作为对照。即保证了每管内检测结果的可靠性，也确保了每批实验结果的准确度和可信度。以下QY指本发明的Y染色体荧光PCR平台。
本试剂盒由QY反应液1、QY反应液2、QY反应液3、QY酶液、QY阳性质控品和空白对照组成，具体组成如下：
QY反应液1(360μL/管)主要由GT Buffer(PCR缓冲液)、dNTPs、特异性引物探针、内参引物探针组成；
QY反应液2(360μL/管)主要由PCR缓冲液、dNTPs、特异性引物探针、内参引物探针组成；
| 物料名称 | 用量(μL) |
| GT Buffer | 120 |
| 25mM MgCl2 | 100 |
| dNTP(2.5mM each) | 60 |
| Sy127位点组(引物/探针)(10μM) | 40 |
| Sy134位点组(引物/探针)(10μM) | 10 |
| Sy14位点组(引物/探针)(10μM) | 20 |
| NF水 | 10 |
| 总体积 | 360 |
QY反应液3(360μL/管)主要由PCR缓冲液、dNTPs、特异性引物探针、内参引物探针组成；
| 物料名称 | 用量(μL) |
| GT Buffer | 120 |
| 25mM MgCl2 | 60 |
| dNTP(2.5mM each) | 60 |
| Sy254位点组(引物/探针)(10μM) | 20 |
| Sy255位点组(引物/探针)(10μM) | 10 |
| Sy14位点组(引物/探针)(10μM) | 10 |
| NF水 | 80 |
| 总体积 | 360 |
其中GT Buffer(即Tris-HCl缓冲液，1000μL)具体组成如下：
QY酶液(120μL/管)的具体组成如下表所示：
QY阳性质控品(300μL/管)为sy84、sy86、sy127、sy134、sy254、sy255、sy14(SRY)、ZFX/Y的质粒混合液。其具体组成如下表所示：
试剂盒中的检测引物、探针序列如下所示
实施例2试剂盒检测
1、样本准备
样本DNA提取：参考所购买的商用基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作。
2、试剂配制
1)从冰箱中取出试剂盒，置于室温解冻，待各组分充分融解、混匀，快速离心10秒后于冰上放置。
2)按照如下表2.1配比配制PCR扩增反应液(以配制1人份扩增反应液为例)：
表2.1
3)将配制扩增反应液每种分别混匀，按20μL/孔分装量分别分装至PCR反应管中。
4)将待测样本基因组DNA、QY阳性质控品、空白对照，分别加入已装有3种PCR反应液的反应管中，即每个待测样本分别用此3种PCR反应液进行检测，加入量为5μL/孔。待测样本基因组DNA推荐浓度为5～100ng/μL。
5)盖好PCR反应管盖，记录PCR样本加样情况。
3、PCR扩增：
1)开机。
2)取准备好的PCR反应管，放置在仪器样本槽相应位置，并记录放置顺序。
3)按下表2.2设置仪器相关参数，并开始进行PCR扩增。
表2.2仪器扩增相关参数
(备注：ROX背景校正选项选为“none”)
4、结果分析：荧光定量PCR仪运行结束后，使用配套软件对实验结果进行分析。
5、阳性判断值或者参考区间Ct值确定：
确认未选择校正荧光参照，同时选择QY阳性质控品反应孔、空白对照反应孔和待测样本反应孔，根据实际情况确定扩增曲线升起的拐点处为阈值，得到Ct值。
阳性结果：同一样本反应孔中FAM、VIC通道至少一个通道有典型S型扩增曲线升起，且 Ct≤34。
阴性结果：同一样本反应孔中FAM、VIC通道均无典型的S型扩增曲线升起或Ct>34。
6、结果判定方法如下表2.3所示：
表2.3：结果判定
注：检验结果说明：
A、试剂盒有效性判定：
1)QY阳性质控品：FAM、VIC、ROX通道Ct值≤30，扩增曲线有明显指数增长期。
2)空白对照：FAM、VIC、ROX通道无Ct值或Ct值>34，或者扩增曲线为轻微曲线，且无明显指数增长期。
B、样本有效性判定：各样本反应孔的ROX通道Ct值≤34，扩增曲线有明显指数增长期。
C、样本结果确定：
1)AZFa基因缺失：AZFa扩增反应液的FAM通道、VIC通道中有任意一个通道或两个通道无Ct值或Ct值>34，或者扩增曲线为轻微曲线，且无明显指数增长期。
2)AZFb基因缺失：AZFb扩增反应液的FAM通道、VIC通道中有任意一个通道或两个通道无Ct值或Ct值>34，或者扩增曲线为轻微曲线，且无明显指数增长期。
3)AZFc基因缺失：AZFc扩增反应液的FAM通道、VIC通道中有任意一个通道或两个通道无Ct值或Ct值>34，或者扩增曲线为轻微曲线，且无明显指数增长期。
实施例3试剂盒灵敏度检测
为考察试剂盒在检测实际核酸样本中的检测灵敏度情况，取已知AZFa(sy84)位点缺失的男性血液核酸提取样本，分别将其稀释为100、50、25、10、5、2.5、0.5、0.25ng/μl，并以10mM Tris作为阴性对照，按实施例1所述试剂盒的构成以及实施例2所述的检测方法进行操作并进行结果判读。
表3.1
| 实验组 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 待检样本浓度(ng/μl) | 100 | 50 | 25 | 10 | 5 | 2.5 | 0.5 | 0.25 |
| 反应体系中样本浓度 | 20 | 10 | 5 | 2 | 1 | 0.5 | 0.1 | 0.05 |
表3.2
| 实验组 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| sy84通道Ct值 | 19.50 | 23.14 | 24.96 | 26.78 | 28.31 | 29.76 | 31.51 | 32.27 |
检测结果如图1和表3.2所示，实验组1-8的检测结果Ct值均小于34，且均有S型扩增曲线，无扩增曲线骤降现象，且反应效率稳定，符合本发明实施例2中关于检测结果阳性的判读标准，针对其他缺失位点(AZFa(sY86)、AZFb(sY127，sY134)、AZFc(sY254，sY255))和内参的实验结果与上述结果相似，具体数据省略。
鉴于以上实验结果，因此本发明试剂盒样本检测灵敏度为0.25ng/μl。
实施例4试剂盒检测型特异性分析
型特异性参考品主要反映产品检测对各种突变型的特异性，6支特异性参考品分别为6 个缺失型位点的质粒，见下表4.1，浓度均为0.01ng/μL。本产品要求对6份特异性参考品进行测定，对应缺失型应为阳性，非对应缺失型应为阴性。
表4.1型特异性参考品质粒及浓度
以10mM Tris作为阴性对照，试剂盒中阳性质控品作为阳性对照参考，按实施例2中检验方法进行实验操作和结果判读。
表4.2型特异性检测结果(Ct值)
备注：“--”表示无扩增。
三批产品的型特异性检测结果见上表4.2。三批产品检测结果中，对应缺失型均为阳性，非对应缺失型均为阴性，未出现型别间的交叉反应，产品具有良好的检测特异性。
实施例5试剂盒精密度分析
使用待分析的3批产品分别测定2支精密度参考品，每支精密度参考品进行10次平行实验，检测结果进行批内、批间精密度分析。
本产品对样本首先进行PCR扩增，PCR扩增中样本DNA模板量呈指数趋势增长。参考常规芯片技术对数据分析前常用的数据预处理方法，将检测的突变型磁珠荧光值进行log2对数处理后进行精密度CV值的计算，见公式(2)～(6)。
Xi＝log2荧光值；....................................(2)
以10mM Tris作为阴性对照，产品自带质控品为阳性对照，按实施例2中试剂盒“检验方法”进行实验操作和结果判读。
精密度参考品包含人Y染色体微缺失检测试剂盒(荧光PCR法)检测的各种基因型，包括sy84、sy86、sy127、sy134、sy254、sy255和内参基因sy14、ZFX/Y，设置中阳与弱阳2种不同的浓度(见下表5.1)。
表5.1精密度参考品质粒组成及浓度
表5.2批内精密度检测结果
表5.3批内精密度检测结果
表5.4批内精密度检测结果
表5.5批间精密度检测结果
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三批产品对2支精密度参考品检测结果见上表5.1-5.5所示。检测结果显示，未见扩增曲线骤降情况。经对表中的相关检测数据分别进行批内精密度(CV％)和批间精密度计算。得到三批产品阴性对照与阳性对照符合质量控制要求(CV％<5％)。
实施例6
GT Buffer(Tris-HCl缓冲液)作为反应体系中的主要组分之一，需在试剂盒中的各个反应体系中均有良好的适配性，同时还需在YQ酶液的配制中展现良好的性能。发明人发现，该缓冲液体系中添加的重要组分，TCEP-HCl和BAPE以及其使用量对整个扩增系统的影响较大，特别是BAPE的使用量，对于检测体系中扩增曲线的变化起至关重要的作用。
按照以下表格中的使用量配制GT Buffer，其中消泡剂包括：甘油聚氧丙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)、聚二甲基硅氧烷(二甲硅油)。以检测已知AZFa(sy84)位点缺失的阳性质粒样本为例，除GT Buffer组成不同之外，其他参考本发明实施例2中的检测步骤及结果分析方法进行以下实验。
表6.1
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通过在GT Buffer体系中分别加入消泡剂BAPE、甘油聚氧丙烯醚、聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(PPE)、聚二甲基硅氧烷，形成实验组2-5，并将未加入消泡剂体系作为对照实验组1，检测结果如图2可知，与实验组1的结果曲线4相比，加入消泡剂的实验组2-5的曲线均有一定程度改变，其中实验组5的曲线虽区于圆滑，但其曲线荧光值及CT值分别有明显程度下降和后延，可能由于其与体系内其它组分产生交叉反应所致；实验组2曲线的曲线3 相比曲线2-4相比，在有效改善检测曲线的同时，检测结果的CT值与荧光值分别有不同程度地提前和提高，曲线拐点清楚，整体平行性好。在用量为1μl时，更适合加入所述检测体系 GTBuffer中的是BAPE，而其他的消泡剂，也具有消泡的作用，但是并不适合该检测系统。
对比例1
按照以下表格中的使用量配制GT Buffer，以检测已知AZFa(sy84)位点缺失的阳性质粒样本为例，除GT Buffer中BAPE用量不同之外，其他参考本发明实施例1所述试剂盒以及实施例2中的检测步骤及结果分析方法进行以下实验。
表6.2
| 实验组 | Tris-HCl | BSA | TritonX-100 | 醋酸钾 | DMSO | TCEP-HCl | BAPE |
| 1 | 360.0 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 0 |
| 2 | 359.5 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 0.5 |
| 3 | 359.0 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 1 |
| 4 | 358.5 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 1.5 |
| 5 | 358 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 2 |
将聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚(BAPE)作为消泡剂应用到反应体系中，可进一步减少反应管中反应体系气泡产生及由气泡产生而导致的个别扩增曲线骤降。通过对图3中结果分析可知，采用加入BAPE 0-2μl配制成5组GT Buffer进行反应时，当体系中未加入BAPE时(即实验组1，曲线3)，其扩增曲线后期发生骤降，曲线不够平滑，当体系中BAPE的加入量分别为0.5、2μl时，检测曲线虽有明显改善，但其荧光值存在明显下降，且相较于实验组3-4 即体系中BAPE的加入量分别为1、1.5μl时的检测结果曲线，实验组3-4的检测曲线更佳。最后，经过综合评估，确定1.2μl加入到各所述的GT Buffer中。
对比例2
按照以下表格中的使用量配制GT Buffer，以检测已知AZFa(sy84)位点缺失的阳性质粒样本为例，除GT Buffer中TCEP-HCl用量不同之外，其他组分参见实施例1所述试剂盒的组成，参考本发明实施例2中的检测步骤及结果分析方法进行以下实验。
表6.3
| 实验组 | Tris-HCl | BSA | TritonX-100 | 醋酸钾 | DMSO | TCEP-HCl | BAPE |
| 1 | 398.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 0 | 1.2 |
| 2 | 388.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 10 | 1.2 |
| 3 | 378.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 20 | 1.2 |
| 4 | 368.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 30 | 1.2 |
| 5 | 358.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 40 | 1.2 |
| 6 | 348.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 50 | 1.2 |
| 7 | 338.8 | 40 | 88 | 420 | 52 | 60 | 1.2 |
TCEP-HCl[三(2-羰基乙基)磷盐酸盐]作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化 DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下，使得反应效率下降。TCEP-HCl的加入可有效降低DNA二聚化，稳定反应效率。结果参见图4。通过对图4中结果分析可知，通过取新鲜配置好的TCEP-HCl工作液(50mM)0-60μl加入配制成7组 GTBuffer进行反应，但不添加TCEP-HCl或者其低浓度时对PCR反应甚至有抑制，反应效率不高，而随着浓度的升高效果逐渐好转，当TCEP-HCl工作液(50mM)的添加量超过40μl 时，反应曲线又呈下降趋势，并非添加的量越多越好，而添加的量过少，其也不能达到相应的扩增效果。在本申请所述Y染色体微缺失检测试剂盒中，效果较好的为添加40μl左右。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种Y染色体微缺失检测试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtcctggttt ccctatttg 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctacagca gactaag 17
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagtctttgg gatttctttg 20
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 18
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 19
<212> DNA
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<400> 22
cactcatcac attcaatgg 19
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctaccaataa gaagataagt ttac 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttctctgcc ttgctggtca 20
Claims (7)
1.一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，包括反应液，酶液；
所述反应液中包括Tris-HCl缓冲液，以及针对Y染色体微缺失位点的引物和探针；
所述酶液中包括有热启动DNA聚合酶，以及Tris-HCl缓冲液；
每1000μL所述Tris-HCl缓冲液中添加有1.9-2.1mM三（2-羰基乙基）磷盐酸盐和1.1-1.3μL聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚；
所述反应液有三份，分别包括有针对sY84和sY86，sY127和sY134，sY254和sY255的引物和探针。
2.根据权利要求1所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液，每1000μL含有1.2μL的聚氧乙烯聚氧丙醇胺醚。
3.根据权利要求1所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中三（2-羰基乙基）磷盐酸盐的浓度为2mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中，每1000μL含有85-90μL的聚乙二醇辛基苯基醚和50-55μL的二甲基亚砜。
5.根据权利要求1-3任一项所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液还含有醋酸钾，所述醋酸钾的浓度为0.40-0.45 mol/L。
6.根据权利要求1-3任一项所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述Y染色体微缺失位点为sY84及sY86，和/或sY127及sY134，和/或sY254及sY255。
7.根据权利要求6所述的Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，针对sY84的引物和探针为：SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.3, 针对sY86的引物和探针为：SEQ ID NO.4- SEQ IDNO.6, 针对Sy127的引物和探针为：SEQ ID NO.7- SEQ ID NO.9, 针对sy134的引物和探针为：SEQ ID NO.10- SEQ ID NO.12, 针对sy254的引物和探针为：SEQ ID NO.13- SEQ IDNO.15, 针对sy255的引物和探针为：SEQ ID NO.16- SEQ ID NO.18。
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