CN108048552A - 一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用 - Google Patents

一种用于检测y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用，涉及分子生物学领域。本发明公开的核酸组合包括第一引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；第二引物组：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；第三引物组：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；第四引物组：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；第五引物组：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10以及第六引物组：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。采用该核酸组合检测Y染色体微缺失，具有较高的灵敏度和较强的特异性。

Description

一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用。
背景技术
Y染色体微缺失是指Y染色体上功能域出现DNA片段或者基因缺失的现象，目前主要的缺失类型有：AZFa缺失，AZFb缺失，AZFc缺失及三者间的混合缺失。
不孕不育是指两性备孕了至少一年却无法受孕或者产生后代的现象。目前，在世界范围人群中，不孕不育概率在10％-15％，其中，男性因素占约50％。Y染色体因调控着男性精细胞的生长发育在男性生育中起了重要作用，而Y染色体功能损伤则很有可能导致男性不孕不育现象的发生。
1976年有研究首次将Y染色体微缺失与男性不育联系起来。随着基因定位技术的发展，Vogt于1996年找到了三个具体的无精子症相关区域：AZFa、AZFb、AZFc。在无精子症及不孕不育男性患者中，AZFa缺失频率在0.5-4％，临床表现为无精子生成，病理类型多为唯支持细胞综合征；AZFb缺失频率在1-5％，临床表现为无精子生成，病理类型多为唯支持细胞综合征或者精子发生阻滞；AZFc缺失频率在80％，临床表型多种多样，以无精子症、严重少精子症、精子数进行性下降最为常见，罕见情况下，也可以自然垂直遗传给男性后代。
目前，对Y染色体微缺失的检测方法有多种。但是现有的方法例如通过多重PCR检测的方法由于存在多种引物相互干扰，导致检测容易出现灵敏度低，假阳性假阴性等情况；另外，该方法对结果的分析是通过凝胶电泳法，极容易导致实验室的污染，不合适产业化及商业化的推广；又例如多重PCR扩增结合DHPLC检测的方法对仪器要求非常高，操作繁琐、操作步骤多，难以普及。除了PCR方法以外，对Y染色体微缺失的检测常见的方法还有原位杂交法。但这种方法对操作及仪器要求都极高，而且操作异常繁琐，在实际应用中难以普及，不利于推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，采用该核酸组合检测Y染色体微缺失，具有较高的灵敏度和较强的特异性。
本发明的另一目的在于提供一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，采用该试剂盒检测Y染色体微缺失，不仅具有较高的灵敏度和较强的特异性，还具有操作简便、时间短、污染少以及结果准确等特点。
本发明的另一目的在于提供海藻糖在多重PCR反应中的应用。
本发明是这样实现的：
一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其包括如下引物组中的至少一种：
第一引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
第二引物组：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
第三引物组：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
第四引物组：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
第五引物组：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
以及，第六引物组：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
人Y染色体微缺失通常具有6个常见的基因缺失位点，分别是：sy84、sy86、sy127、sy134、sy254以及sy255。
本发明提供的核酸组合中的引物组中，碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对用于检测sy84基因位点缺失；
碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对用于检测sy86基因位点缺失；
碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对用于检测sy127基因位点缺失；
碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对用于检测sy134基因位点缺失；
碱基序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物对用于检测sy254基因位点缺失；
碱基序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对用于检测sy255基因位点缺失。
上述引物组不仅可以用于简单的通过多重PCR扩增和扩增产物直接凝胶电泳结合的检测方法，例如通过检测扩增产物在凝胶上的条带可以判断出相应的基因位点是否有缺失；也可以将其与相应的Taqman探针混合进行多重荧光PCR检测的方法；通过检测荧光信号的有无或强弱判断相应的基因位点是否有缺失。
这些方法均可以实现对Y染色体微缺失例如sy84、sy86、sy127、sy134、sy254以及sy255等基因位点缺失的检测目的，其均属于本发明的保护范围。
进一步地，在本发明的一些实施例方案中，该核酸组合还包括具有与上述引物组扩增产物碱基互补配对的探针组，上述探针组选自如下探针：
第一探针：SEQ ID NO.13；
第二探针：SEQ ID NO.14；
第三探针：SEQ ID NO.15；
第四探针：SEQ ID NO.16；
第五探针：SEQ ID NO.17；
以及，第六探针：SEQ ID NO.18。
其中，碱基序列如SEQ ID NO.13所示的第一探针用于结合至sy84基因上，其与第一引物组对应，第一探针在sy84基因上结合的区域属于第一引物组的扩增区域；
碱基序列如SEQ ID NO.14所示的第二探针用于结合至sy86基因上，其与第二引物组对应；
碱基序列如SEQ ID NO.15所示的第三探针用于结合至sy127基因上，其与第三引物组对应；
碱基序列如SEQ ID NO.16所示的第四探针用于结合至sy134基因上，其与第四引物组对应；
碱基序列如SEQ ID NO.17所示的第五探针用于结合至sy254基因上，其与第五引物组对应；
碱基序列如SEQ ID NO.18所示的第六探针用于结合至sy255基因上，其与第六引物组对应。
将上述引物组和探针组结合，可通过多重荧光PCR技术例如在探针的5’端标记荧光报告基团和3’端标记荧光淬灭基团，实现对sy84、sy86、sy127、sy134、sy254以及sy255等基因位点缺失的检测目的，不仅具有较高的灵敏度和特异性，且有利于提高检测的便捷性和缩短检测时间。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述探针组中的每个探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述荧光报告基团选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX中的任意一种。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述荧光报告基团选自TAMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任意一种。
一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其包括如上任一项所述的核酸组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括：多重PCR反应稳定剂，上述多重PCR反应稳定剂含有海藻糖。
本发明的研究发现，海藻糖具有稳定多重PCR反应体系的作用，将其在检测Y染色体微缺失中，添加在多重PCR反应体系可以对体系的组分例如DNA聚合酶、引物、探针等进行保护，有助于提高检测结果的灵敏度和准确性。
海藻糖作为稳定剂在多重PCR反应中的应用。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其包括如下步骤中的任意一步骤：
(1)将海藻糖与DNA聚合酶混合对DNA聚合酶进行包被；
(2)将海藻糖与如上任一项所述的核酸组合混合对核酸组合中的核酸分子进行包被。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述海藻糖在包被液中的浓度为0.1-100mM。
需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，海藻糖在包被液中的浓度可以是0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、40mM、60mM、80mM以及100mM等中的任意一者或两者之间的范围。
优选的，上述海藻糖在包被液中的浓度为10mM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述步骤(1)或(2)中进行包被的温度为0-16℃、时间为5-60min。
需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，包被的温度可以是0、2、4、6、8、10、12、14以及16℃等中的任意一者或两者之间的范围；
包被的时间可以是5、10、15、20、30、40、50以及60min等中的任意一者或两者之间的范围。
优选的，在上述步骤(1)或(2)中进行包被的温度为4℃、时间为30min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述步骤(1)中，DNA聚合酶浓度为0.01mg/ml-1mg/ml。
需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，上述步骤(1)中，DNA聚合酶浓度可以是0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8以及1mg/ml等中的任意一者或两者之间的范围。
优选的，DNA聚合酶浓度为0.1mg/ml。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述步骤(2)中，核酸分子的浓度为1-50μM。
需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，在上述步骤(2)中，核酸分子的浓度可以是1、5、10、15、20、30、40以及50μM等中的任意一者或两者之间的范围。
优选的，核酸分子的浓度为5μM。
需要说明的是，核酸分子的浓度为5μM是指各种核酸分子的浓度均为5μM。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在上述步骤(1)中，DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶。
本发明的研究发现，海藻糖具有稳定多重PCR反应体系的作用，将其在检测Y染色体微缺失中，添加在PCR反应体系可以对体系的组分进行保护，有利于提高检测结果的灵敏度和准确性。因此，可将海藻糖作为稳定剂用于多重PCR反应例如多重荧光PCR中，提高检测结果的灵敏度和准确性。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，通过对引物碱基序列的合理优化和配对设计，其在用于PCR检测(例如多重PCR又例如多重荧光PCR)检测Y染色体微缺失例如常见的sy84、sy86、sy127、sy134、sy254以及sy255等基因缺失时具有较高的灵敏度和较强的特异性。
此外，本发明提供的用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，其含有上述的核酸组合，不仅具有较高的灵敏度和较强的特异性，还具有操作简便、时间短、污染少以及结果准确等特点；
此外，本发明的研究发现，海藻糖具有稳定多重PCR反应体系的作用，将其在检测Y染色体微缺失中，添加在PCR反应体系可以对体系的组分进行保护，有利于提高检测结果的灵敏度和准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的添加海藻糖的PCR反应预混液于-20℃冻存7天后的检测结果；
图2为本发明实施例提供的不添加海藻糖的PCR反应预混液于-20℃冻存7天后的检测结果；
图3为本发明实施例提供的新制备的不添加海藻糖的非预混PCR反应液的检测结果；
图4为本发明实施例提供的新制备的添加海藻糖的预混PCR反应液的检测结果；
图5为本发明实施例提供的某市售同类产品的检测结果；
图6为本发明实施例提供的采用实施例2提供的试剂盒检测样品的检测结果；
图7为本发明实施例提供的采用实施例2提供的试剂盒核酸优化组合灵敏度测试结果；
图8为本发明实施例提供的采用实施例2提供的试剂盒核酸优化组合特异性测试结果；
图9为本发明实施例提供的pUC-57载体的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其包括引物组和探针组。
其中，引物组包括：
第一引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，用于检测sy84基因位点缺失；
第二引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对，用于检测sy86基因位点缺失；
第三引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物对，用于检测sy127基因位点缺失；
第四引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物对，用于检测sy134基因位点缺失；
第五引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所述的引物对，用于检测sy254基因位点缺失；
以及，第六引物组，其包括：碱基序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对，用于检测sy255基因位点缺失。
其中，探针组包括：
碱基序列如SEQ ID NO.13所示的第一探针；
基序列如SEQ ID NO.14所示的第二探针；
碱基序列如SEQ ID NO.15所示的第三探针；
碱基序列如SEQ ID NO.16所示的第四探针；
碱基序列如SEQ ID NO.17所示的第五探针；
以及，碱基序列如SEQ ID NO.18所示的第六探针。
其中，第一探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1；
第二探针的5’端标记有VIC，3’端标记有BHQ1；
第三探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1；
第四探针的5’端标记有VIC，3’端标记有BHQ1；
第五探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ1；
第六探针的5’端标记有VIC，3’端标记有BHQ1。
本实施例提供的核酸组合可以通过多重荧光PCR技术用于检测Y染色体微缺失例如sy84、sy86、sy127、sy134、sy254以及sy255基因位点的缺失，其具有较高的灵敏度和特异性。
实施例2
本实施例提供了一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其包括实施例1提供的核酸组合和海藻糖。
本实施例提供的试剂盒不仅具有较高的灵敏度和较强的特异性，还具有操作简便、时间短、污染少以及结果准确等特点。
实验例1
验证实施例1提供的核酸组合的灵敏度和特异性。
方法如下：
按每25μl反应体系含有：dNTP 200μM，Mg2+3mM，热启动DNA聚合酶2U，上游引物、下游引物及其对应的探针浓度分别为200nM、200nM、100nM的量配制反应液，对浓度梯度为105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl、102copies/μl的各位点质粒及各位点阴性样本进行扩增，扩增结果最好的组合如图7和图8。
根据图7和图8的结果可知，实施例1提供的试剂盒能扩增到最低102copies/μl的核酸模板，灵敏度较高(如图7所示)；同时对阴性样本无交叉扩增，不存在假阳性结果的现象，具有较强的特异性(如图8所示)。
实验例2
验证实施例3提供的试剂盒的灵敏度和特异性，方法如下：
1制备PCR反应预混液
1.1取试剂盒中的海藻糖，将其用ddH2O配制成1M海藻糖溶液。
1.2将热启动DNA聚合酶与海藻糖溶液混合，置于4℃条件下30min，对热启动DNA聚合酶进行包被，海藻糖终浓度为10mM；热启动DNA聚合酶浓度为0.1mg/ml。
1.3将引物组的各引物、探针组的各探针与海藻糖溶液混合，置于4℃条件下30min，对引物组中的各引物以及探针组中的各探针进行包被，其中，海藻糖终浓度为10mM；各引物的终浓度均为5μM；各探针的终浓度均为5μM。
1.4按每25μl反应体系含有：dNTP 200μM，Mg2+3mM，海藻糖包被的热启动DNA聚合酶2U，海藻糖包被的各上游引物、下游引物及其对应的探针浓度分别为200nM、200nM、100nM，标准质粒模板(含y84(SEQ ID NO.19)、sy86(SEQ ID NO.20)、sy127(SEQ ID NO.21)、sy134(SEQ ID NO.22)、sy254(SEQ ID NO.23)或sy255(SEQ ID NO.24)基因序列，各质粒浓度为105copies/μl，质粒载体骨架为pUC-57，其结构如图9所示，各基因在载体上的插入位点为MCS；标准质粒模板在后续步骤中加入反应体系中)5μl的比例将dNTP、buffer、Mg2+、海藻糖包被的热启动DNA聚合酶、海藻糖包被的引物和探针混合物混合，按20μl的量分装至八连管中，-20℃保存7天后，取出进行检测。
1.5将分装有PCR反应液的八连管，从-20℃冰箱中取出，解冻，取5μl标准质粒模板(含y84、sy86、sy127、sy134、sy254或sy255基因序列)加入PCR反应管中，上机检测。
1.6 PCR反应程序：95℃3分钟；95℃10秒，58℃30秒(此步读取荧光值)，40个循环。
1.7按上述相同的方法，以水代替海藻糖，制备PCR反应预混液，作为对照组，进行多重荧光PCR反应。结果如图1和图2所示。
根据图1和图2的结果可知，海藻糖对PCR有效组分进行包被后，能很好地对有效组分进行保护，极大提升反应体系的保存性能。
实验例3
按照实验例2基本相同的方法，将由实施例2提供的试剂盒新制备(即不经过-20℃的存放)的含海藻糖的PCR反应预混液与新制备的不添加包被保护剂的非预混PCR反应液进行比对检测。结果如图3和图4。
根据图3和图4的结果可知，海藻糖作为PCR有效组分的包被保护剂，在对体系有效组分进行保护的同时，对实验结果没有明显负面影响。
实验例4
将实施例2提供的试剂盒(冻存两个月)和某市售同类产品(上海透景生命科技股份有限公司的Y染色体微缺失检测试剂盒，医疗器械注册证编号：20153400024；距离出厂日期两个月)操作及检测结果比对：
操作步骤比对如表1；检测结果比对如图5和图6。
表1
操作步骤比对 本发明实施例2的产品 某市售同类产品
1.实验前计算体积 √
2.反应液和酶的混合 √
3.试剂分装 √
4.加入待检样本 √ √
5.上机检测 √ √
需要操作步骤数量统计 2 5
根据表1可看出：本发明实施例2的试剂盒操作简便、时间短、污染少；与某市售同类产品相比，具有更少的操作步骤。
根据图5和图6可看出：本发明实施例2的试剂盒不仅操作简便、时间短、污染少，在冻存两个月后具有更优越的性能。
此外，表明海藻糖具有包被隔离的作用，在常温下保存体系稳定，该试剂盒与市售试剂盒在同一常温条件下相比，性能更好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合及试剂盒和应用
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtaggtttca gtgtttgg 18
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cctggtggct ctacctcctt c 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aagccattac caagtctctg tcct 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctaccaaag cccactgtgt tca 23
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacatctgga acattctact tgaagcg 27
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgaatgacca gcagcccttt 20
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcctcctcca ccacagtttc ag 22
<210> 19
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
aaagctttca gcaaagagaa gggtcctgaa agcaggttcc tgatttcacc ctttacagtt 60
taatacaagg gattttacat acagacatat aagctgatag tcctggtttc cctatttgtt 120
ttaaggtgcc attcctggtg gctctacctc cttcccccag tgcccatatg ggcccttagt 180
ctgctgtagg catgctcagg caagcccttg agcaaattcc cttaatctgc acgaaacatg 240
ggctggagat tcagtgggac cctttcttta gtgtctgcct aatgcaagct ggctaactcc 300
tttcaaaagt tttgtcttgc tgatgaagcc tccaggtagt aggcttcaga gagaatagat 360
<210> 20
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gatgaggaca cagacacaca cagagggaca accctgtgag gacacaggga gaagacagca 60
tctacaaccc aaggagagag gcctcaggag gaaccagccc tggccatagc ttgatctcag 120
acttctagcc tcaaggactg tgagaatcaa ggttgttgtt taaggggccc agtctttggg 180
atttctttgt aacaactctg ggaagccatt accaagtctc tgtcctgcaa agtgagatcc 240
atggatctgc agccttgaca tcccctggga gctgatgaga aacaatgtgt cttgggccca 300
gacagacctg ctgaagcata gtctgtgtgt cacccatgtg ctgaggga 348
<210> 21
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttcatagagg ctaggctcac aaacgaaaag aaaaagatag cacccactgg aatctaccaa 60
agcccactgt gttcatgccc acaaaaagag aagaaacttt ttcatgagat gctaattata 120
caaaagacaa aggcatttct gtgtcacagc ttgtttcctt atatgggtga gccagatgtt 180
tgtgaaagtt cttgattaaa tgggctggag atttccctgt ctgtgtagcc atgagcatat 240
tttcagttac aacacccctg tgctatttcc cttattactg cctgcagctt gattattttt 300
<210> 22
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
taaactgtta taacaaccac tgccaaaact ttcaagaaaa aattatcatg agtaccaccc 60
aagacaaaac acctactttc cactatttaa actaggaaca tttaatttca tcatgctatg 120
cacttcagaa acttagctag ttcagttttg atttaggtta aaaaaaaaaa aggtttcatt 180
atcatatcct ctttcagtca cagaacgctt caagtagaat gttccagatg ttttaaactt 240
tagtatcaac cccatctatt tatttccttt gacctgtact attcctctaa aagataaacg 300
ttttatggtg aggcagacag ttttgtagtc ttt 333
<210> 23
<211> 416
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctgcagctag ccaaggctgg gtgttaccag aaggcaaaat cgtgccaaac actgtttttg 60
ttggtggaat tgatgctagg gtattgtatt cgtacctcat ttttacctta acatacatca 120
tgaacaatgg gatgtgggcc ctgttacaaa cttaaatttt tttttgtact tcctggaggt 180
ttagaattgc ttttaggttt gacccatagg tactaaaaat atctttgaca aagggctgct 240
ggtcattcgg ggataaatgg gggagaaatt tccacctcat ggtagtaaaa ttgtagtaaa 300
gttgaaattt ttgaatgctg aatttttact ctgacgttca gttcttttcc atagatggat 360
gaaactgaga ttggaagctg ctttggtaga tacggttcag tgaaagaagt gaagat 416
<210> 24
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aaggtgctcg tcatgtgcag ccacgtcctt tggtagttaa tcctcctcct ccaccacagt 60
ttcagaacgt ctggcggaat ccaaacactg aaacctacct gcagccccaa atcacgccga 120
atcctgtaac tcagca 136

Claims (10)

1.一种用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其特征在于，其包括如下引物组中的至少一种：
第一引物组：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
第二引物组：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；
第三引物组：SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；
第四引物组：SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
第五引物组：SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；
以及，第六引物组：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
2.根据权利要求1所述的用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括具有与所述引物组扩增产物碱基互补配对的探针组，所述探针组选自如下探针：
第一探针：SEQ ID NO.13；
第二探针：SEQ ID NO.14；
第三探针：SEQ ID NO.15；
第四探针：SEQ ID NO.16；
第五探针：SEQ ID NO.17；
以及，第六探针：SEQ ID NO.18。
3.根据权利要求2所述的用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其特征在于，所述探针组中的每个探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、TET、ROX、VIC、JOE、CY3、CY5和HEX中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的用于检测Y染色体微缺失的核酸组合，其特征在于，所述荧光报告基团选自TAMRA、DABCYL、ECLIPSE、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的任意一种。
6.一种检测Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1-5任一项所述的核酸组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：多重PCR反应稳定剂，所述多重PCR反应稳定剂含有海藻糖。
8.海藻糖作为稳定剂在多重PCR反应中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其包括如下步骤中的任意一步骤：
(1)将海藻糖与DNA聚合酶混合对DNA聚合酶进行包被；
(2)将海藻糖与权利要求1-5任一项所述的核酸组合混合对核酸组合中的核酸分子进行包被。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述海藻糖在包被液中的浓度为0.1-100mM。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110468198A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 阅尔基因技术（苏州）有限公司 检测人类基因组序列缺失的扩增抗干扰缓冲液、引物组、探针及试剂盒
CN110656167A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 用于y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字pcr的检测方法
CN112574971A (zh) * 2020-12-29 2021-03-30 益善生物技术股份有限公司 Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒
CN112725419A (zh) * 2021-01-18 2021-04-30 益善生物技术股份有限公司 一种y染色体微缺失检测试剂盒
CN113981067A (zh) * 2021-11-04 2022-01-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种无精少精症染色体变异检测试剂盒

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703578A (zh) * 2011-07-06 2012-10-03 郭奇伟 Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒
CN105274192A (zh) * 2014-07-25 2016-01-27 广州华峰生物科技有限公司 一种核酸扩增反应混合物颗粒及其应用
CN106148484A (zh) * 2015-03-27 2016-11-23 上海透景生命科技股份有限公司 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN107841537A (zh) * 2017-09-28 2018-03-27 苏州旷远生物分子技术有限公司 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703578A (zh) * 2011-07-06 2012-10-03 郭奇伟 Y染色体微缺失多重实时荧光pcr检测试剂盒
CN105274192A (zh) * 2014-07-25 2016-01-27 广州华峰生物科技有限公司 一种核酸扩增反应混合物颗粒及其应用
CN106148484A (zh) * 2015-03-27 2016-11-23 上海透景生命科技股份有限公司 一种诊断y染色体微缺失的试剂盒
CN107841537A (zh) * 2017-09-28 2018-03-27 苏州旷远生物分子技术有限公司 一种全预混mthfr和mtrr多重pcr基因多态性检测试剂盒和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAVEL, C; SIFFROI, J. -P: "Y chromosome and spermatogenesis", 《GYNECOLOGIE OBSTETRIQUE & FERTILITE》 *
尤新: "《功能性低聚糖生产和应用》", 31 January 2004, 北京：中国轻工业出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110468198A (zh) * 2019-09-16 2019-11-19 阅尔基因技术（苏州）有限公司 检测人类基因组序列缺失的扩增抗干扰缓冲液、引物组、探针及试剂盒
CN110656167A (zh) * 2019-09-27 2020-01-07 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 用于y染色体微缺失检测的引物组、试剂盒及基于数字pcr的检测方法
CN112574971A (zh) * 2020-12-29 2021-03-30 益善生物技术股份有限公司 Taq DNA聚合酶突变体、PCR反应试剂和试剂盒
CN112725419A (zh) * 2021-01-18 2021-04-30 益善生物技术股份有限公司 一种y染色体微缺失检测试剂盒
CN112725419B (zh) * 2021-01-18 2024-02-13 益善生物技术股份有限公司 一种y染色体微缺失检测试剂盒
CN113981067A (zh) * 2021-11-04 2022-01-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种无精少精症染色体变异检测试剂盒

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