CN104561357A

CN104561357A - Egfr基因扩增检测探针、试剂盒以及方法

Info

Publication number: CN104561357A
Application number: CN201510050952.9A
Authority: CN
Inventors: 胡文晖; 吴诗扬; 廖传荣; 黄萌
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。本发明所提供的EGFR基因扩增检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中EGFR目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。

Description

EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及EGFR基因扩增检测探针、试剂盒以及方法。

背景技术

EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，属于ErbB受体家族的一种。分子量170KDa，位于细胞膜表面，属于酪氨酸激酶型受体。EGFR被配体激活后启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。研究表明，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，为以EGFR为靶向的肿瘤治疗和针对EGFR信号转导通路的信号转导干预治疗提供了理论基础和实验依据。

目前，针对EGFR所开发的分子靶向药物主要分两类:1)人工合成的单克隆抗体(MAb),与EGFR胞外区结合,阻断依赖于配体的EGFR活化；2)小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI),抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性。上述药物通过不同途径阻断EGFR介导的细胞内信号通路,从而抑制肿瘤生长、转移和血管生成,并促进肿瘤细胞凋亡,提高放化疗敏感性。

大量临床研究指出，有EGFR扩增的非小细胞型肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(erlotinib和gefitinib)的治疗反应性明显提高，患者的疾病进展时间和生存期也明显延长。因此，EGFR基因扩增的检测成为非小细胞型肺癌患者选用EGFR酪氨酸激酶抑制剂进行靶标治疗的关键。此外，存在非小细胞肺癌患者EGFR基因异常的患者对靶向治疗药物Iressa/Tarceva的敏感性更强。检测非小细胞肺癌患者EGFR基因，有助于筛选出Iressa/Tarceva的敏感人群，指导临床用药。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来分子细胞遗传学技术。其基本原理是通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体和基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。FISH技术操作简便，检测快速，结果直观易于观察；具有有效的灵敏度和特异性，能检测到一些常规遗传学分析不能发现基因的变异，而且重复性好。因此，FISH基因已广泛应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学研究等。

发明内容

本发明的目的之一是EGFR基因扩增检测试剂盒，该检测试剂盒可用于高特异性和高准确性检测EGFR基因扩增的情况。

实现上述目的的技术方案如下。

EGFR基因扩增检测试剂盒，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。

在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ IDNO.50中的至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ IDNO.60中的至少五条探针。

在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ IDNO.50中的至少八条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ IDNO.60中的至少八条探针。

在其中一个实施例中，所述第一组探针为SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60。

在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。

在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQID NO.39和SEQ ID NO.40。

本发明的另一目的是提供一种EGFR基因扩增检测探针。

实现上述目的技术方案如下：

EGFR基因扩增检测探针，包括有针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ IDNO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ IDNO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针。

本发明的另一目的是提供一种EGFREGFR基因扩增检测方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种EGFR基因扩增检测方法，包括

待检测样品切片预处理；

利用上述EGFR基因扩增检测试剂盒进行杂交检测；

复染后在显微镜下观察荧光信号。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的EGFR基因扩增检测试剂盒的检测结果与Cytocell公司产品EGFR检测产品的吻合率高达100％。

2.本发明制备的检测EGFR基因扩增的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中EGFR目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。

3.本发明所述试剂盒的操作简单、安全，同时减少了Cot-1DNA试剂、罗丹明抗-地高辛抗体等昂贵试剂的使用，经济高效；

4.与现有技术相比，本发明所述试剂盒的检测方法，无需使用Cot-1DNA对样本基因进行封闭，操作方便，检测速度快，可在12-24小试内完成杂交检测实验。

附图说明

图1为检测结果判定标准示意图，其中，图1示意图中，黑色点表示红色信号点；白色点表示绿色信号点。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。

实施例1

本实施例所述的检测EGFR基因扩增检测探针和试剂盒，其设计如下：

一、设计扩增引物

分别针对EGFR基因和人类7号染色体着丝粒区域设计两组扩增引物，其中第一组为针对EGFR的扩增引物，第二组为针对人类7号染色体着丝粒区域的扩增引物，相应的扩增产物分别组成了第一组探针库和第二组探针库。每组扩增引物得到的扩增产物能作为检测EGFR基因扩增的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中EGFR目标检测片段进行特异性识别杂交。

人工合成如下引物，扩增引物及其相应的扩增产物具体见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。合成后的每条扩增引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

表1扩增引物及扩增产物

二、探针库的构建

提取人类基因组DNA，根据本领域内的文献所描述的技术和条件，如参考《分子克隆实验指导·第三版》(科学出版社)或者按照市售的基因组DNA提取试剂盒产品说明书进行，获得人类基因组总DNA。

配制PCR引物工作液：分别针对EGFR基因和7号染色体着丝粒区域，各取上述扩增引物(1R/1F-20R/20F)的贮存液50ul分别放置于1.5ml微量离心管中，使用10mmol/L Tris Buffe r配制成终浓度各为10pmol/mL的20支扩增引物工作液，用于扩增上述人类基因组总DNA中相应的核苷酸序列片段。分别进行20个PCR体系的扩增，PCR反应体系如下：

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃20s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，回收片段，并做好标记。

将上述回收的扩增产物测序，序列与表1中扩增引物相应扩增产物的序列碱基组成一致。

上述回收的经测序正确的扩增产物可以直接用于FISH探针标记，或分别将所得产物到T载体中，以便保存，其中，本实施例中，PCR扩增产物经测序无误后，克隆到T载体中，包括如下步骤：

取20个灭菌的200ul微量离心管，反应体系10μl：

上述混合液轻轻震荡后，12000rpm，30秒离心，然后置于14℃中保温过夜(12-16h)。连接后的产物转化入TOP10感受态，置于液氮保存，包括以下步骤：

1、将感受态细胞置于冰上融化，以100ul感受态细胞为例。

2、向感受态细胞悬液中加入需转化的T载体连接产物，注意T载体连接产物的体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴放置30分钟。

3、将离心管置于42℃水浴中60-90秒，然后快速转移到冰浴中放置2-3分钟，注意不要摇动离心管。

4、向离心管中加入500ul无菌无抗的LB培养基，37℃180rpm振荡培养1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

5、取适量已转化的感受态细胞涂布含氨苄抗生素的LB平板，37℃倒置培养12-16小时。

6、蓝白斑筛选，选择阳性菌落(应大量选择阳性菌落，以确保所选菌落含有所有的目的片段)，所选菌落置于LB液体培养基进行培养。

7、取步骤6的菌液，添加甘油(甘油体积：菌液体积＝1：4)，然后置于液氮保存。

当再次需要目标片段时，可以分别取步骤7所述菌液于氨苄抗性的LB液体培养基进行培养，采样市售的提取菌体质粒试剂盒提取质粒，然后用酶切的方法处理所提取的质粒，便可得到大量的不含重复序列的目的片段。酶切体系如下：

反应条件：温度37℃，酶切1小时30分钟。

根据实际需要，将酶切得到的目的片段混合，分别制得第一组探针库和第二组探针库，用于后续的探针标记。

三、FISH探针标记

选择Alexa Fluor 594NHS ester(红光)标记第一组探针库；选择Alexa Fluor488NHS ester(绿光)标记第二组探针库。具体步骤如下：

配制硼酸标记缓冲液，取十水合四硼酸钠1.9g溶解于50mL ddH₂O，pH值调至8.5，0.45μm滤器过滤，保存于-25℃至-18℃，备用。

取DMSO、NF水及配制硼酸标记缓冲液平衡至室温，充分涡旋振荡混匀。

取绿色荧光染料和红色荧光染料(规格均为1mg)，10000g，离心2min。小心开盖，每管加入56μL DMSO溶解染料，避光保存。

染料标记方案见下表2：

表2探针标记

标记后的探针经纯化和沉淀，自然风干，把DNA溶解在TE缓冲液中。获得FISH红光探针和绿色探针，避光、-20℃储存。

四、试剂盒的其它组分

1)SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)的配制方法见表3。

表3SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)的配制方法

2)胃蛋白酶缓冲液(0.1N HCl)的配制方法见表4。

表4胃蛋白酶缓冲液(0.1N HCl)的配制方法

3)乙醇溶液(70％和85％)的配制方法见表5。

表5乙醇溶液(70％和85％)的配制方法

4)洗涤缓冲液Ⅰ的配制方法见表6。

表6洗涤缓冲液Ⅰ的配制方法

5)洗涤缓冲液Ⅱ的配制方法见表7。

表7洗涤缓冲液Ⅱ的配制方法

实施例2使用实施例1中EGFR基因扩增检测试剂盒对临床样品的检测：

利用实施例一的EGFR基因扩增检测试剂盒(包括SEQ NO.41-50和SEQNO.51-60共二十条探针)对由医院提供的20份石蜡包埋组织进行，步骤如下。一、样本预处理程：

准备工作：开启烤片机(45℃-60℃)；开启水浴锅(37±1℃)；胃蛋白酶缓冲液置于37±1℃水浴锅预热，使用胃蛋白酶与预热后的胃蛋白酶缓冲液配制浓度为1.0mg/mL的胃蛋白酶工作液，工作液置于37±1℃水浴锅预热(预热至少1h)。

切片脱蜡：室温下将切片浸没在二甲苯中，脱蜡10min，更换新鲜的二甲苯再重复脱蜡两次(共脱蜡3次)。完成二甲苯处理的切片浸没在无水乙醇中5min，更换新鲜的无水乙醇重复一次。无水乙醇处理后风干切片或置于烤片机上2-5min烘干切片。

切片预处理：将盛有超纯水的烧杯置于微波炉中加热，将切片放入沸腾的超纯水中处理25min，取出晾干。

胃蛋白酶处理：将预处理过的切片置于胃蛋白酶工作液中消化5-60min，期间每5min镜检1次(在明场下使用10×物镜观察)，以大部分组织细胞分散为单个细胞为消化完成标准；消化完成后将切片浸没在超纯水中洗涤3min。置于烤片机上2-5min烘干切片。

二、FISH检测

FISH检测包括脱水、杂交、杂交后洗涤与DAPI复染四个步骤。因为探针上的荧光基团见强光容易发生淬灭，所以杂交、杂交后洗涤及DAPI复染三个步骤均需在暗处操作(避光操作)。

准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。

脱水：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水各1min。置于烤片机上2-5min烘干切片。

杂交(避光操作)：在切片样本杂交区域加入10μL EGFR基因扩增检测探针溶液(每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将切片放入已安装湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：85℃变性8min，42℃杂交过夜(14h～18h)。

杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(76±1℃)，将洗涤缓冲液Ⅱ置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于室温的洗涤缓冲液Ⅰ中5min，洗掉盖玻片，再置于76±1℃的洗涤缓冲液Ⅱ中5min，期间可轻轻晃动切片1-3s；

用洗涤缓冲液Ⅰ和洗涤缓冲液Ⅱ分别重复洗涤一次；最后用洗涤冲液Ⅰ再重复洗涤一次，每种洗涤缓冲液重复洗涤时的时间与第一次用该缓冲液洗涤时时间相同。洗涤后将切片直立风干。

DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将切片放至室温后进行观察。

三、结果判定

一种EGFR基因扩增检测试剂盒的结果判断标准为：

观察50个计数细胞，统计每个细胞核中的红色信号数量和绿色信号数量，根据以下标准对样本进行阴阳性判断(样本是否存在EGFR扩增)：

1.样本检测出现以下任一情况判定为EGFR基因扩增阳性(见图1：检测结果判定标准)

1)信号比值≥2.0，(比值＝50个细胞核中红色信号总数/50个细胞核中绿色信号总数)；

2)信号比值＜2.0，且细胞内红色信号数≥4的细胞个数在20个以上(≥20/50)；

3)细胞内红色信号数≥15的细胞个数在5个以上(≥5/50)；

4)观察到具有成簇红色信号的细胞(此时无法对红色信号进行计数)，该样本判定为阳性。

2.样本检测未出现以上情况判定为EGFR基因扩增阴性。

四、结果检测与数据分析

利用本发明的探针对20份样品进行检测，同时利用安必平公司(LBP)试剂盒检测方法对样品进行检测，检测结果见表8和表9。以安必平公司(LBP)的检测与本发明检测结果作对照，计算本发明所提供的检测方法的检测结果吻合率。本方法检测20份样本的EGFR基因扩增检测结果与安必平公司(LBP)的产品检测吻合率达到100％。可见本发明所提供的FISH探针能够准确地检测出EGFR基因扩增，且结果稳定可靠。另外，本发明的所提供的FISH还具有特异性强，信号强的特点。

表8临床样品检测结果(“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果)

表9样本检测结果(“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果)

实施例3引物对数量的选择对样品检测结果的影响

针对EGFR基因和人类7号染色体着丝粒区域构建探针库，分别选择不同数量的针对EGFR基因(第一组)和针对人类7号染色体着丝粒区域(第二组)扩增引物对设置4组试验，以研究不同数量的扩增产物(即，探针)其组成相应的探针库检测效果是否一致，其中试验组1为各选择1对扩增引物对；试验2为各选择3对扩增引物对；试验3为各选择5对扩增引物对；试验4为各选择10对扩增引物对。具体试验安排见表10，探针的合成、探针库的构建、探针标记和实验步骤等如实施1和实施例2所示。

表10不同数量的扩增引物对

使用上述试验组制备得到的探针库，检测样品(样品编号21～40)，并与安必平公司产品的检测结果作为对照。检测结果如下(详见表11-13):

3.表11临床样品检测结果(2-1)

表12临床样品检测结果(2-2)

表13选择不同数量的扩增引物的检测结果

根据表11-13可以看出，针对ERGR基因和人类7号染色体着丝粒区域，分别选择不同数量的第一组和第二组扩增引物对构建探针库，不同数量的扩增产物(即，探针)其组成相应的探针库检测效果一致。其中分别选择5对扩增引物完成探针库的构建，探针库的灵敏度、特异性和稳定性都很好，而使用8至10对扩增引物对，可使探针库的灵敏度、特异性和稳定性达到最好。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括有标记荧光染料的、针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针；所述第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一样。

2.根据权利要求1所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少五条探针。

3.根据权利要求2所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少八条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少八条探针。

4.根据权利要求3所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针为SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50，所述第二组探针为SEQ IDNO.51—SEQ ID NO.60。

5.根据权利要求1-4任一项所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。

6.根据权利要求1-4任一项所述的EGFR基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ IDNO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ IDNO.40。

7.EGFR基因扩增检测探针，其特征在于，包括有针对EGFR基因的第一组探针和针对人类7号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针。

8.根据权利要求7所述的EGFR基因扩增检测探针，其特征在于，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少五条探针。

9.一种EGFR基因扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

待检测样品切片预处理；

利用权利要求1—6任一项所述EGFR基因扩增检测试剂盒进行杂交检测；

复染后在显微镜下观察荧光信号。