CN103160578B - Egfr基因专用量子点检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种EGFR基因专用量子点检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：EGFR基因特异性DNA探针、人7号染色体着丝粒特异性DNA探针、表面经修饰的量子点水溶液、量子点纳米球粉末、正硅酸乙酯溶液、戊二醛溶液、硅烷化试剂、带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末、1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐和聚丙烯酸。在表面修饰的量子点及量子点纳米球表面连接EGFR基因的特异性探针之后，可以很好地识别EGFR基因及EGFR基因扩增的肿瘤细胞，未连接EGFR探针的量子点及量子点纳米球与EGFR基因及肿瘤细胞不结合或结合很少。本发明提供的检测试剂盒，在EGFR基因检测中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体地说，涉及一种EGFR基因专用量子点检测试剂盒。
背景技术
EGFR是原癌基因c-erb-1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR在多种上皮性肿瘤高表达，其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关，最终导致细胞的转化、增殖，抵抗细胞凋亡、促进细胞生存，与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关。30%-40%非小细胞患者存在EGFR基因扩增，因此现在EGFR检测被广泛用于非小细胞肺癌的预后评价及指导治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种EGFR基因专用量子点检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种EGFR基因专用量子点检测试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：EGFR基因特异性DNA探针、7号染色体着丝粒特异性DNA探针、表面经修饰的量子点水溶液、量子点纳米球粉末、正硅酸乙酯溶液、戊二醛溶液、硅烷化试剂、带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末、1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐和聚丙烯酸；其中，所述EGFR基因特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体短臂7p12-p14（GenBank：NG_007726.3）的DNA片段；所述人7号染色体着丝粒特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1（GenBank:AC019063.4）的DNA片段。
所述表面经修饰的量子点水溶液和量子点纳米球粉末中的量子点是指CdSe、CdTe、CdSe/ZnS（在CdSe表面包覆一层ZnS所形成的核壳结构的量子点）、CdTe/ZnS（在CdTe表面包覆一层ZnS所形成的核壳结构的量子点）、CdTe/CdSe（在CdTe表面包覆一层CdSe所形成的核壳结构的量子点）、InP、InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS（在InGaP表面包覆一层ZnS所形成的核壳结构的量子点）等中的任一种纳米粒子，或任意几种纳米粒子的组合。
所述表面经修饰的量子点水溶液的浓度为1.2μmol/L，用于量子点表面修饰的试剂为巯基乙酸、巯基丙酸、二巯基丁二酸、巯基乙胺、白蛋白、纤维素、聚苯乙烯、聚乙二醇、磷脂、二氧化硅等中的至少一种。
所述量子点纳米球粉末是指量子点包埋于白蛋白、乙基纤维素或聚苯乙烯等聚合物中所形成的粉末，纳米球粒度为50-1000nm。
所述硅烷化试剂任选CH2＝CHSi(OC2H5)3、CH2＝CHSi(OCH3)2、CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3、CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、HSC3H6Si(OCH3)3、H2NC3H6Si(OC2H5)3、H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、CH3Si(OC2H5)3、(CH3)3SiNHSi(CH3)3等中的一种。
所述带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末，其结构式为PE-PEG2000-COOH或PC-PEG2000-COOH，制备方法为：聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合，其中构成所述聚乙二醇衍生化的磷脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸，构成所述聚乙二醇衍生化的磷脂中的磷脂为磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰胆碱（PC）。
所述正硅酸乙酯溶液的浓度为2mol/L。
所述戊二醛溶液的浓度为1.25%。
所述试剂盒中还包括无水乙醇、磷酸盐缓冲液、灭菌双蒸水中的中的至少一种。其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L。
本发明还提供所述试剂盒在检测非小细胞肺癌组织细胞中EGFR基因是否扩增中的应用。
检测EGFR基因需要一个能特异性识别EGFR基因的探针，以及连接在探针上的标记物(如荧光染料或同位素示踪剂)，连接荧光或同位素示踪剂的探针，谓之“检测探针”。探针和靶序列双链DNA变性后杂交，互补的异源单链DNA分子在适宜的温度和离子强度下退火形成稳定的异源双链DNA，通过荧光标记显示出来。本发明检测EGFR基因的原理是利用与荧光染料量子点相连接的对EGFR基因特异的探针（GLP EGFR），杂交到病变组织细胞的7号染色体短臂（7p12-p14）上，然后在荧光显微镜下观察，在组织原位直接显示此基因扩增与否的情况。同时用连接在荧光染料量子点的标记了绿色荧光信号的对7号染色体着丝粒特异的探针（CSP7）作为对照，杂交到7号染色体着丝粒（7p11.1-q11.1）上，这种双探针同标记的方法，进一步保证了观察的准确性。
本发明中的荧光染料选用量子点，量子点是一种直径在1~10纳米之间的半导体纳米微晶，是一种近年来研究较多的新型荧光染料。与传统有机荧光染料相比，量子点的荧光更稳定持久，荧光强度更高，激发光谱更宽，荧光发射光谱更窄。
EGFR探针能特异性地识别EGFR基因，而对其他基因不识别，因此，当连接量子点的EGFR探针与未知细胞（或未知组织）作用后，可通过细胞/或组织中结合荧光量子点的个数来判断EGFR基因是否扩增。可见，EGFR基因探针与量子点连接，可作为检测EGFR基因的特异性生物探针，可以组成试剂盒为研究者提供方便。
本发明的优点在于：
本发明将EGFR基因特异性探针，人7号染色体着丝粒特异性探针与荧光染料量子点及连接试剂组成试剂盒，能特异性地识别EGFR基因和7号染色体着丝粒，而对其他基因不识别，因此，当连接量子点的EGFR探针和连接量子点的着丝粒探针与未知细胞(或未知组织)作用后，可通过细胞/组织中结合的两种荧光量子点的比值来判断EGFR基因是否扩增，在临床上具有实用价值，市场前景广阔。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1EGFR基因专用量子点检测试剂盒
EGFR基因专用量子点检测试剂盒，该试剂盒中装有插片，插片上设有多个供试剂管插入的孔，所述试剂盒中包括12管装有不同材料的试剂管，分别为：
(1)10μg EGFR基因特异性DNA探针，所述EGFR基因特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体短臂7p12-p14（GenBank：NG_007726.3）的DNA片段；即，采用基因工程技术将此段DNA序列克隆至载体上，然后转化大肠杆菌，过夜培养，质粒提取，酶切获得长度为100-750bp的DNA片段。
(2)2mL浓度约为1.2μmoL/L表面修饰有巯基丙酸的红色荧光CdTe/ZnS量子点水溶液，在水溶液中该量子点表面电位为-35~-40meV；
(3)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe/ZnS量子点的牛血清白蛋白(BSA)纳米球粉末(CdTe/ZnS/BSA nanospheres)；
(4)10μg7号染色体着丝粒特异性探针，所述7号染色体着丝粒特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1（GenBank:AC019063.4）的DNA片段；
(5)2mL浓度约为1.2μmoL/L表面修饰有巯基丙酸的绿色荧光CdTe量子点水溶液，在水溶液中该量子点表面电位为-35~-40meV；
(6)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe量子点的牛血清白蛋白(BSA)纳米球粉末(CdTe/BSA nanospheres)；
(7)2mol/L正硅酸乙酯溶液1ml；
(8)1.25%戊二醛溶液1ml。配制方法：取25%戊二醛50ml与pH6.8的PBS溶液1ml混合，即得。
(9)硅烷化试剂(KH550，硅烷化试剂任选CH2＝CHSi(OC2H5)3、CH2＝CHSi(OCH3)2、CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3、CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、HSC3H6Si(OCH3)3、H2NC3H6Si(OC2H5)3、H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、CH3Si(OC2H5)3、(CH3)3SiNHSi(CH3)3中的一种)1ml；
(10)带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂(PE-PEG2000-COOH或PC-PEG2000-COOH)粉末10mg，其中聚乙烯醇分子量约为2000。制备方法为：聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合，其中构成所述聚乙二醇衍生化的磷脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸，磷脂为磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰胆碱（PC）。
(11)1g1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末；
(12)聚丙烯酸粉末50mg；
(13)无水乙醇1ml；
(14)0.1mol/L磷酸盐缓冲液20ml，pH值为7.4；
(15)灭菌双蒸水10ml。
实施例2EGFR基因专用量子点检测试剂盒在EGFR基因检测中的应用
针对实施例1中制备的试剂盒，量取CdTe/ZnS量子点(QDs)水溶液400μL，向其中加入无水乙醇与正硅酸乙酯的混合溶液40μL(无水乙醇占混合溶液总量的25%)，室温下振荡48h后停止振荡，置于4℃冰箱中备用。
向上述硅量子点(QDs/SiO2)水溶液中加入硅烷化试剂溶液(KH550)和戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸盐缓冲溶液，于室温下振荡2h后，获得(QDs/SiO2)-KH550-glutaraldehyde。
将EGFR探针溶解于磷酸盐缓冲液中，(QDs/SiO2)-KH550-glutaraldehyde水溶液(200μL)中加入EGFR探针磷酸盐缓冲液，其中，QDs/SiO2与探针的摩尔比约为1:5，于4℃条件下振荡过夜后，即获得EGFR量子点探针。
7号染色体着丝粒量子点探针的制备方法与EGFR量子点探针的制备方法相同，将制备的EGFR量子点探针和7号染色体着丝粒量子点探针混合后与200μL的不含血清的细胞培养液(RPMI-1640)混合，置于4℃冰箱中备用。
将探针混合物滴于正常人的细胞玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，封片胶封住盖玻片边缘，避免盖玻片与玻片之间产生气泡。玻片置于杂交仪中83℃变性5分钟，42℃杂交16小时。洗片后在荧光显微镜下观察。
对照实验：
按上述相同的方法将未连接EGFR基因探针的量子点((QDs/SiO2)-KH550-glutaraldehyde)与正常人的细胞玻片进行杂交，将未连接7号染色体着丝粒特异探针的量子点与正常人的细胞玻片进行杂交，共培育后荧光显微镜下观察。
结果显示，与EGFR量子点探针和着丝粒量子点探针共培育后的每个细胞均有两个量子点红色荧光和两个量子点绿色信号。可见，本发明提供的量子点试剂盒能很好地特异性识别EGFR基因。
实施例3EGFR基因专用量子点检测试剂盒在EGFR基因检测中的应用
针对实施例1中制备的试剂盒，将5mg的带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂(PE-PEG2000-COOH)溶解于5ml三氯甲烷溶液中(三氯甲烷为常用溶剂，因此可不作为试剂盒的一部分)，取该溶液1ml(剩余4ml于4℃冰箱中保存备用)置于梨形瓶中，旋转蒸发挥去三氯甲烷成薄膜，进一步用氮气吹干薄膜。
向该薄膜中加入CdTe/ZnS量子点(QDs)水溶液1ml，超声波振荡45min，获得QDs-(PE-PEG2000-COOH)。加入1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的磷酸盐缓冲液，30min后，加入EGFR探针，其中，三者间的摩尔比为：QDs-(PE-PEG2000-COOH)∶EDC∶EGFR探针＝1:3.6:3，在4℃反应过夜。
将获得量子点探针混合物与肺癌阳性组织切片进行杂交。作为对照，将未连接EGFR基因探针的量子点(QDs-(PE-PEG2000-COOH)与肺癌阳性组织切片进行杂交，将未连接7号染色体着丝粒特异探针的量子点与肺癌阳性组织切片按上述相同方法进行杂交。
结果显示，连接EGFR探针的量子点几乎与所有肺癌细胞结合，每个细胞中有两个以上的红色荧光，与绿色量子点荧光的比值大于或等于2。而对照实验中，只有少量的红色荧光或绿色荧光。这些结果表明EGFR探针连接的量子点能有效识别EGFR基因及EGFR基因扩增的癌细胞。
实施例4EGFR基因专用量子点检测试剂盒在EGFR基因检测中的应用
针对实施例1中制备的试剂盒，称取包埋CdTe/ZnS量子点(QDs)的牛血清白蛋白(BSA)纳米球粉末(QDs-BSA)10mg，分散于1ml灭菌双蒸水中，超声波分散约15min后，向其中加入聚丙烯酸(PAA)粉末，继续超声波分散，约30min后，静置约10min，然后离心，用灭菌双蒸水洗涤沉淀，获得(QDs-BSA)/PAA纳米球，再分散于磷酸盐缓冲液中。
向(QDs-BSA)/PAA溶液中加入1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)的磷酸盐缓冲液，反应30min后，加入EGFR探针，其中，(QDs-BSA)/PAA纳米球与EGFR探针的摩尔比约为1∶1000，4℃反应过夜。然后进行实验。
将获得量子点探针混合物与肺癌阴性组织切片进行杂交。作为对照，将未连接EGFR基因探针的量子点(QDs-(PE-PEG2000-COOH)与肺癌阴性组织切片进行杂交，将未连接7号染色体着丝粒特异探针的量子点与肺癌阴性组织切片按上述相同方法进行杂交。
荧光显微镜下发现，连接EGFR探针的量子点几乎与所有细胞结合，每个细胞中有两个红色荧光和两个绿色荧光，红色与绿色量子点荧光的比值小于2。而对照实验中，只有少量的红色荧光或绿色荧光。这些结果表明EGFR探针连接的量子点能有效识别EGFR基因。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (1)
1.EGFR基因专用量子点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下试剂：
(1)10μg EGFR基因特异性DNA探针，所述EGFR基因特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体短臂7p12-p14的DNA片段；即，采用基因工程技术将此段DNA序列克隆至载体上，然后转化大肠杆菌，过夜培养，质粒提取，酶切获得长度为100-750bp的DNA片段；所述人7号染色体短臂7p12-p14在GenBank中编号为NG_007726.3；
(2)2mL浓度为1.2μmoL/L表面修饰有巯基丙酸的红色荧光CdTe/ZnS量子点水溶液，在水溶液中该量子点表面电位为-35～-40meV；
(3)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe/ZnS量子点的牛血清白蛋白纳米球粉末；
(4)10μg 7号染色体着丝粒特异性探针，所述7号染色体着丝粒特异性DNA探针为特异性结合人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1的DNA片段；所述人7号染色体着丝粒7p11.1-q11.1在GenBank中编号为AC019063.4；
(5)2mL浓度为1.2μmoL/L表面修饰有巯基丙酸的绿色荧光CdTe量子点水溶液，在水溶液中该量子点表面电位为-35～-40meV；
(6)50mg平均粒度为500nm的包埋CdTe量子点的牛血清白蛋白纳米球粉末；
(7)2mol/L正硅酸乙酯溶液1ml；
(8)1.25％戊二醛溶液1ml；配制方法：取25％戊二醛50ml与pH6.8的PBS溶液1ml混合，即得；
(9)硅烷化试剂KH550 1ml；所述硅烷化试剂任选CH2＝CHSi(OC2H5)3、CH2＝CHSi(OCH3)2、CH2＝CHSi(OC2H4OCH3)3、CH2＝C(CH3)COOC3H6Si(OCH3)3、HSC3H6Si(OCH3)3、 H2NC3H6Si(OC2H5)3、H2NC2H4NHC3H6Si(OCH3)3、H2NCONHC3H6Si(OC2H5)3、CH3Si(OC2H5)3、(CH3)3SiNHSi(CH3)3中的一种；
(10)带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末10mg；所述带羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂为PE-PEG2000-COOH或PC-PEG2000-COOH，其中聚乙烯醇分子量为2000；制备方法为：聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合，其中构成所述聚乙二醇衍生化的磷脂中的脂肪酸选自肉豆蔻酸、棕榈酸或硬脂酸，磷脂为磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱；
(11)1g 1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐粉末；
(12)聚丙烯酸粉末50mg；
(13)无水乙醇1ml；
(14)0.1mol/L磷酸盐缓冲液20ml，pH值为7.4；
(15)灭菌双蒸水10ml。
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