CN101899504B - 用于检测egfr基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂，所述试剂包括用于检测EGFR基因拷贝数的荧光探针RP11-339F13和用于检测7号染色体倍性的荧光探针RP11-144H20；其中，RP11-339F13为覆盖EGFR基因全长的BAC克隆，用罗丹明荧光素标记；RP11-144H20为7号染色体着丝粒特异的BAC克隆，用异硫氰酸荧光素标记。使用本发明试剂可以快速、简便地检测细胞内EGFR基因拷贝数及7号染色体倍性，有助于药物敏感性和预后的判断，对指导于非小细胞肺癌等肿瘤分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的使用具有重要意义。

Description

用于检测EGFR基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂。

背景技术

在我国，无论男性还是女性，肺癌均已成为癌症死亡的主要原因。肺癌高死亡率的主要原因有二个：一是肺癌缺乏有效的早期诊断手段，70％以上的病人在确诊时已属晚期；二是晚期肺癌(尤其是非小细胞肺癌，NSCLC)对化疗的敏感性差，现有的各种化疗方案对NSCLC的总体有效率仅为30％左右。

Gefitinib(即易瑞沙)是一种苯胺喹唑啉化合物，是强有力的选择性酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可阻断表皮生长因子受体诱导的体外肿瘤细胞的生长。期临床试验显示，Gefitinib对标准治疗失败的部分NSCLC有良好疗效。值得注意的是，患者对Gefitinib的治疗反应差别很大，因此，研究肺癌患者不同治疗反应的机制以及筛选能从治疗中获益的患者有重要的临床意义。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)又称HER-1，其基因组定位于人类7号染色体，在多种上皮性肿瘤高表达，其过表达与肿瘤细胞的增殖、活动性、粘连性、侵袭性、凋亡抑制和血管生成相关，最终导致细胞的转化、增殖，抵抗细胞凋亡、促进细胞生存，与肿瘤的发生、发展、临床分期、生存期、预后和对治疗反应相关。

马萨诸塞总医院癌症中心(Massachusetts General Hospital Cancer Center，MGHCC)的Lynch等以及达纳法伯癌症研究所(Dana Farber Cancer Institute，DFCI)的Paez等研究发现有变异EGFR基因的患者表现出对gefitinib更好的治疗反应。但是，Danafarber癌症研究所的Bruce Johnson(首先报道EGFR突变的研究者之一)表示，在临床试验中，从抑制剂治疗中获益的患者超过了仅有EGFR突变的人数。这些新的结果提示，测定EGFR基因拷贝数在选择治疗时可能起着一定的作用。另有研究显示，EGFR基因突变和拷贝数增加两种改变同时存在的患者使用酪氨酸激酶抑制剂的疗效显著，说明对EGFR基因拷贝数和基因突变进行联合检测可能更有助于药物敏感性和预后的判断。因此，在临床上无论是检测EGFR基因突变，还是检测基因拷贝数增加，对于患者用药的选择及预后判断都有着重要的意义，即通过FISH方法检测EGFR基因扩增阳性患者选择使用TKI类药物可取得较好的临床疗效。

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来分子细胞遗传学技术。其基本原理是通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体和基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。FISH技术操作简便，检测快速，结果直观易于观察；具有有效的灵敏度和特异性，能检测到一些常规遗传学分析不能发现基因的变异，而且重复性好。因此，FISH基因已广泛应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学研究等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测EGFR基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测EGFR基因拷贝数的荧光探针RP11-339F13和用于检测7号染色体倍性的荧光探针RP11-144H20；

其中，RP11-339F13为覆盖EGFR基因全长的BAC克隆，用罗丹明荧光素标记，其末端序列如下：

(1)RP11-339F13正向序列(Forward sequence)：

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(2)RP11-339F13反向序列：

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RP11-144H20为7号染色体着丝粒特异的BAC克隆，用异硫氰酸荧光素标记，其末端序列如下：

(3)RP11-144H20正向序列：

gaattcagcagtttggaaacactctttttgtcaattctgcaagtcgacatttgggaggtcattgagctcaaaggtgaaaaagtg

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(4)RP11-144H20反向序列：

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本发明一方面确定了覆盖EGFR基因全长的BAC克隆，即RP11-339F13，用罗丹明荧光素标记后作为探针；另一方面选用7号染色体着丝粒特异的BAC克隆RP11-144H20来检测染色体倍性，用FITC标记后作为探针。使用本发明试剂可以快速、简便地检测细胞内EGFR基因拷贝数及7号染色体倍性，有助于药物敏感性和预后的判断，对指导于非小细胞肺癌等肿瘤分子靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的使用具有重要意义。

附图说明

图1是EGFR基因(红色)和7号染色体(绿色)着丝粒特异探针在中期分裂相的定位图。

具体实施方式

实施例1：菌体培养

1)原始菌液(人基因组细菌人工染色体(BAC)克隆，购自invitrogen公司)涂平板，37℃培养过夜。

2)挑取单菌落，至5ml LB培养基(胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物0.05g/L，氯化钠10g/L，pH7.0)，37℃，220转/分摇菌过夜。

3)将5ml菌液全部加入400ml LB培养基中扩大培养，37℃，220转/分摇菌过夜。

实施例2：质粒的提取

1)将温育的转化细胞转移至含抗生素氨苄(100μg/ml)LB平板上，当液体被吸收后，倒置平板，37℃培养12～16h。

2)挑取单个菌落，37℃于10ml LB培养基中培养24h。

3)8000rpm离心10～15min，去上清。

4)200μl Solution I(50mM葡萄糖，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris pH8.0)振荡混匀。

5)400μl Solution II(0.2M NaOH，1％SDS，现配现用)振荡7s，冰上静置10min。

6)300μl Solution III(3M醋酸钾，pH4.8)振荡5s，冰上静置10～15min。

7)13000转/分离心10min，上清液转入1.5ml的离心管。

8)加入等体积平衡酚，振荡至乳浊状，1000转/分离心8min。

9)吸上层水相，加等体积的异丙醇，振荡30s，-20℃下沉淀DNA2h以上。

10)12000转/分离心10min，去上清，室温下充分干燥。

11)70％预冷酒精洗涤2～5min，10000转/分离心10min，室温下充分干燥。

12)加入适当的无菌水溶解。

13)加入RNase处理1h。

14)加入等体积的氯仿混匀，10000rpm离心10min。

16)吸上层水相至新的离心管中，2倍体积的无水乙醇沉淀过夜。

17)12000rpm离心15min，去上清液，室温下充分干燥。

18)加入适当体积的TE buffer溶液，室温下溶解30～60min。

19)质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳检测。

实例3：标记探针

采用切口平移(Nick translation)的方法标记，过程如下：

20μl反应体系中含有：dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Fluorophore-labeled dUTP(EGFR基因用Cy3，7号染色体着丝粒用FITC)，各0.2μM，DNase I 0.5U、DNA聚合酶I 2U、0.5～1.0μg质粒DNA。

PCR仪中，15℃下标记1.5-3h后加1μl 0.5M EDTA(pH8.0)终止反应。过程中需取5μl产物用2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，若DNA片段大小在500-600bp，则停止反应；若片段大于该范围，则需增加DNase I的量以及反应的时间，直至符合目标大小。制得RP11-339F13探针和RP11-144H20探针。

实例4：FISH检测

1.预处理程序

1)将载玻片浸入2％3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)丙酮溶液中5分钟，随后在丙酮及蒸馏水中漂洗，自然干燥载玻片(或使用商业化防脱玻片)。

2)从福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌组织中获取多块2-4微米切片，分别置于以上经氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)处理过的载玻片上。

3)将组织切片置于65℃下过夜烘烤或烘烤6小时。

4)将组织切片浸于二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100％乙醇中5分钟。

5)将组织切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％醇中各两分钟复水。将组织切片室温浸入去离子水中3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分。

6)准备一缸蒸馏水并将其置于电磁炉上烧开，将玻片浸入沸水中处理组织切片15分钟。

7)取0.4ml蛋白酶K储存液(20mg/ml)溶于40ml 20XSSC(pH7.0)得到蛋白酶K工作液(200μg/ml)；将组织切片浸泡在蛋白酶K工作液中，37℃下孵育8分钟(看消化情况而定)。

8)组织切片经蛋白酶K消化后，将组织切片玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。

9)自然干燥玻片。

10)按照FISH操作步骤进行FISH实验。

2.FISH操作步骤

2.1探针混合物准备

2.1.1室温下将如下液体加入到微量离心管中。

7μl    杂交缓冲液

1μl    去离子水

2μl    荧光探针

2.1.2离心1-3秒(迷你离心机)。

2.1.3涡旋混匀后再次短暂离心。

2.2探针与样本杂交

2.2.1将10μl的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，避免盖玻片与玻片之间产生气泡。

2.2.2加好探针的载玻片在烤片机上83℃变性5分钟。

2.2.3从烤片机上拿下载玻片，立即用封片胶封边。

2.2.4将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中杂交过夜。

2.3玻片洗涤

2.3.1移去封片胶和盖玻片，立即将玻片置于盛有2×SSC溶液的瓶中，晃动玻片1-3秒，10分钟后取出玻片。

2.3.2将玻片置于盛有2×SSC/0.1％NP-40溶液的瓶中，晃动玻片1-3秒，5分钟后取出玻片。

2.3.3将玻片室温浸泡在70％乙醇中，3分钟后取出玻片。

2.4结果观察

2.4.1暗处自然干燥玻片。

2.4.2将15μl DAPI复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片。暗处放置10-20分钟。

2.4.3在Olympus BX51荧光显微镜下选用合适的滤波片组观察玻片。软件拍摄和分析图片。

实施例5：结果判读

荧光原位杂交信号在正常细胞内显示为2红2绿(2R2G)，在异常细胞显示红色信号数量大于2，绿色信号数量不少于2。

1.正常结果：

荧光原位杂交信号在正常细胞内显示为2红2绿(2R2G)。

2.EGFR基因检测的阳性判断方法如下：

随机观察细胞(至少观察100个细胞)，统计红信号个数和绿信号个数。

1)当红绿信号比值小于2，而有不少于40％的细胞中红色信号个数大于或等于4个时，表示EGFR基因高多体性扩增，为阳性结果；

2)当出现以下三种情况之一时，表示EGFR基因扩增，为阳性结果：

红绿信号比值大于或等于2；不少于10％的细胞中有大于或等于15个红色信号；包含成簇的红色信号。

图1所示为利用本发明试剂中的探针对对正常人外周血培养细胞的中期染色体进行的FISH，EGFR基因(红色)和7号染色体(绿色)着丝粒特异探针在中期分裂相的定位如图所示。

序列表

<110>合肥艾迪康临床检验所有限公司

<120>用于检测EGFR基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>750

<212>DNA

<213>human genomic BAC

<400>1

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<210>3

<211>750

<212>DNA

<213>human genomic BAC

<400>3

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<210>4

<211>750

<212>DNA

<213>human genomic BAC

<400>4

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caggtccata tttccacttg cagactttac aaacagtgtg tttccaaact cctctatgaa    120

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cgtttccaac gaaggcctca atgcggtcca                                     750

Claims (1)

1.用于检测EGFR基因拷贝数和7号染色体倍性的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测EGFR基因拷贝数的荧光探针RP11-339F13和用于检测7号染色体倍性的荧光探针RP11-144H20；

其中，RP11-339F13为覆盖EGFR基因全长的BAC克隆，用罗丹明荧光素标记，其末端序列如下：

(1)RP11-339F13正向序列：

cagagacaggagcggaggcttctcctggtgaccactctgcttaaaaacttcatcagatccgtagtttcagagcccccctgaaccccatcccttacctctaccagttgcaggtgggtctctggggtggggctgccctccccaccagcaccccaagggctaaaaggttgaggggagaacaccatcatttgtacagggggatcctggaagatgaggcctgagaaagccctgcggggcccctcaccttctccctagctgtggccaagagtgtctggccttgcctgcctcaggaccagcccaaagtggaggtgagaggtgagccccagcccccaggggaagggtgatggtggtcttggtctcagcatggttctggtagaggtgggttattttgaagatgatgaaccttaagcctctttctgatcttgctttaaataaatacttctgaacaacagcaacaacagaatagtgttgataggaaagccctccactccaccagaaccacgcggccttctcgtcctcccctcctccacttccttcctaagtcactgctccatgagctcttccacaggagatttacaaaatagaacacaaacaatccagttcccgcctctcactctgaactcctcccaagactcgtggggtgcggcagcccctgggaacacccagcccttcaaggtcaaacacagcccccgcccctcactctggggtaccctgccagaataagccccgacagccatgtggagcagagccttc

(2)RP11-339F13反向序列：

ccgcccggccagccgccccgtccgggagggaggtgggggggtccaaggtaaggaaggccctagagtctaggaagagactggccagtgcattaaccattgtagtgtaatggatttgatgttactttatgctcacaagttggacacacacacagggacccagatcaaattggaggggaaggtcaaagtcagcttcccaaaggaactgaagcttagactgatttttaaaggctgagttaaaataaactgggtaaaaataaagaaggaaagagaaaagcaaatgtaaaatatctgtgcagcatgaagtagcaaaatatattcagagaatgtaagaagctgaaatgagggcctcaactaagcgtgggaatgcagatggtgacatagcaatgctgaggtaggctccccaggaccgaggccggcttgttgcggggagaggggaggggcactctaggatgatctctggcgtaagcagcaggtaacgcggtgccaggacatggctgagttttacataaacatttgttcaagcaaatatgggatcattcactgaaacggagaattcaaagtgaggtctagatttggtggcaagatacaactgattcgaggttaggaaaggagagttggaggaacaggaggaagcggcctctcatctgcaaaccctgagttcctggaacacttgtttgttagggagggaagtgtggcccagccacaatcctttgaacatcttcctcttccatcctctgggttctgcatttc；

RP11-144H20为7号染色体着丝粒特异的BAC克隆，用异硫氰酸荧光素标记，其末端序列如下：

(3)RP11-144H20正向序列：

gaattcagcagtttggaaacactctttttgtcaattctgcaagtcgacatttgggaggtcattgagctcaaaggtgaaaaagtgaatatcccataataaaaagtagaagaaatctattgcattgaggcctatggtgaaagaggaaaaatattcagaaaaaatctagaaagaagctttctgagaaactgctttgtgatgtgtgcattcacctaacagagttaatcctttcagtgaaatcagcagtttgcaaacactgttttcatccattctgtaaaaggacatttgctagttcattaacaccaatggcaaaaaagcaaatatcactggagaaaaactagaaggaatctatctgagaaaccactttttgatgtgtgcattcacctcgcagagttaaacttttattttcatggagcaggttgtaaacactctttttgtagaaactgcaaagggatatttgggagcgcatttaggcttatggtaaaaaggaaatatcttaagttgaaaactagaaacaagctttctgagaaacttctttgtgatgtgcacattcatatcacagagtaaaacctttactttggattcagtagtttggaagccctgttgttgtagaatgtgtgaagggatacttgggagctcattgaggccatccggtaaaaagtgaatatcccaggataaaaactaaaaggaaacaatctgagaaaccactatgtcatgtgtgcattcacctcgcagaattaaaactttcttttc

(4)RP11-144H20反向序列：

ctgagaattcttccgtctagcattcaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaaacaggtccatatttccacttgcagactttacaaacagtgtgtttccaaactcctctatgaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaacgcacacatcacaaagcactttctgagaatgattctgtctggttattatacgaagatatttccttttctgcaattgtcctcaaatcgcttgaaatctccacctgaaaatgccacagcaagagtgtttcaaatctgctctctctaaagcaaggttcaactctgtgagttgaatacacacaacacaaaaaagttcctgagaactcttcttagtctagcatgaaaggaagaaaccccgtttgcaacgaagccctcaaagaggtccaaatatccacttgcagacataacaagcagagtgtttctaaactgctctaagaaaagaaaggttaaactctgtgagttgaaggcacacatcacaaagtagtttctgagaatgattctgtctagtttttatttgaagatatttccttttctactgttggcatcaaatcgcttgaaatctccacttgcaaattccacaaaaagagtgtttcaaatctgctctgtgtaaagggacgttccactctgtgagttgaatacacacagcacaaagaagttactgagaattcttctgtctagcatgaaatgaagaaatcccgtttccaacgaaggcctcaatgcggtcca。