CN106929601A

CN106929601A - 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN106929601A
Application number: CN201511007550.7A
Authority: CN
Inventors: 吴大治; 夏懿; 吴梅
Original assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: CN106929601B

Abstract

本发明涉及一种利用荧光PCR技术高灵敏检测低危型人乳头瘤病毒（HPV）6,11型核酸的试剂盒。它公开了检测用的特异性扩增引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、对照品以及核酸提取试剂。本发明还提供了用于检测HPV6,11型的试剂盒制备和使用方法。本发明适用于人尖锐湿疣泌尿生殖道分泌物样本中HPV6,11型病毒的定性检测，试剂盒操作简便快速，方便仪器自动化操作，克服了现有技术检测灵敏度低、容易造成漏检误诊等问题。

Description

一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种高灵敏度的人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

HPV根据其基因组核苷酸序列不同，目前已经分离出130多种基因型，不同基因型别引起不同的临床表现。对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，据统计70%～80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染为自限性，超过90％的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌，其中最常见的基因型是6和11型。尖锐湿疣是国家卫生部规定要求监测的八大性传播疾病之一，它的发病率仅次于淋病，由于病情易反复发作，传染性极强，已经成为严重危及人们正常生活的常见性病之一。目前研究表明在尖锐湿疣中有HPV6,11型引起的占90%以上，且两种亚型复合感染情况最常见，曾仁山等报告了采用PCR方法对931例尖锐湿疣组织中的HPV DNA进行检测及分型结果，在931例尖锐湿疣组织中有738例检出HPV DNA阳性，检出率为79.27％，其中HPV6、11型阳性检出者538例，占75.79％。

由于HPV病毒难于培养，目前临床上检测HPV6,11型的常用方法依赖于分子生物学核酸检测方法，包括荧光PCR法（CN101676408A、CN101709335B）、膜杂交固相芯片法（蒋明军等，中华皮肤科杂志，2005,38（5）：262-264）和液相悬浮芯片法（CN1814796A），特别是TaqMan探针荧光PCR法，以其快速、简便、灵敏、特异的优点，在临床机构广泛使用。但值得注意的是，现有检测技术方法或试剂盒中的样本核酸提取方法以碱裂解煮沸法为主，核酸提取物中含有较多的PCR抑制物，容易造成检测结果“假阴性”；同时，试剂盒的HPV6,11型DNA检测灵敏度多在10³ copy/ml，对低浓度样本容易造成漏检，造成临床误诊和治疗延误。

发明内容

本发明提供一种高灵敏的人乳头瘤病毒（HPV）6,11型核酸检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含核酸扩增试剂、对照品以及核酸提取试剂，扩增试剂所用的一对荧光PCR检测引物序列为SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2，荧光探针序列分别为SEQ ID No: 3和SEQ IDNo: 4。试剂盒基于TaqMan探针荧光PCR原理，引物SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2扩增HPV6,11型的同源共有序列，双荧光探针SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 4为识别HPV6,11型的同源共有序列，且探针5’端标记FAM荧光基团，提高了检测灵敏度。试剂盒中的核酸提取试剂基于磁珠法核酸提取原理，能从样本中快速提取HPV DNA，去除PCR抑制物，获得的DNA纯度高，且适合仪器自动化操作，本发明提供的高灵敏HPV6,11型核酸检测试剂盒能克服现有技术检测灵敏度低、造成漏检误诊等问题，适合临床推广使用。

技术方案

通过对GenBank中HPV 6,11型病毒基因序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对设计，按照TaqMan荧光PCR设计的原则，优选了一对HPV6,11型序列同源引物扩增这两种亚型基因片段，同时采用双荧光探针检测扩增片段之间这两种亚型的同源共有序列，试剂盒中的两条引物和两条荧光探针核苷酸序列（5’ -> 3’）如下：

HPV6,11上游引物：AgATgTggCggCCTAg，序列记为SEQ ID NO：1；

HPV6,11下游引物：gTCTAgAACTgCTggCATg，序列记为SEQ ID NO：2；

HPV6,11荧光探针1：CACAgTATATgTgCCTCCTCC，序列记为SEQ ID NO：3；

HPV6,11荧光探针2：gCATCCgTggCAACAAC，序列记为SEQ ID NO：4；

两条荧光探针在序列5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光基团、3’端标记TAMRA（5-Carboxy-tetramethyl-rhodamine）或BHQ-1（Black hole quencher 1）淬灭基团。

本试剂盒检测靶序列选择HPV6,11型L1基因中两种亚型的保守同源序列，采用的双荧光探针检测扩增片段之间两种亚型的保守同源序列（分别针对正义、反义链），一次PCR反应产生双倍荧光信号，有利于提高试剂盒检测灵敏度。

所述扩增试剂反应体系各成分组成如下：10mM Tris-HCl（pH8.3）、50mM KCl、0.2mM dNTPs（含dATP、dGTP、dCTP、dUTP）、1.5～5 mM MgCl₂、各0.1～0.5μM HPV6,11型引物和荧光探针（SEQ ID NO：1～4）、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶，提取的模板10μl，总反应体积30μl。更具体的，扩增试剂各成分终浓度为：Tris-HCl（pH8.3）10 mM、KCl 50mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl₂ 3.5 mM、一对HPV6,11型引物0.35μM、两条荧光探针各0.2 μM、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U。

所述HPV6,11型荧光PCR试剂盒使用扩增程序如下：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM波长荧光信号。

所述HPV 6,11型荧光PCR试剂盒对照品包括阳性对照、阴性对照各1个，前者采用SEQ ID NO：1和2引物扩增产物序列插入pUC18T载体上的质粒大肠杆菌（简称为HPV6,11型质粒大肠杆菌），浓度为10³copy/ml；阴性对照采用生理盐水。

所述HPV 6,11型荧光PCR试剂盒的核酸提取试剂，它包括裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1、清洗缓冲液W2、洗脱缓冲液这5种组分。其中裂解缓冲液含有50mM Tris-HCl（pH8.0）、5M异硫氰酸胍、15%（v/v）Triton X-100。清洗缓冲液W1含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、30%乙醇。清洗缓冲液W2含有10mM Tris-HCl（pH8.0）、80%乙醇。洗脱缓冲液为10mM Tris-HCl（pH8.0）溶液。磁珠为表面包裹二氧化硅的微纳米磁性颗粒。上述核酸提取试剂在核酸提取仪上能实现样本核酸自动化提取。

通过上述设计获得含有一对优选HPV 6,11型引物和两条荧光探针的扩增试剂、对照品（阳性对照和阴性对照各一个）、以及核酸提取试剂，其中扩增试剂和对照品-20℃保存，核酸提取试剂室温保存。

试剂盒使用时的操作步骤为：取400μl泌尿生殖道分泌物标本漂洗液（可离心浓缩），加入等体积裂解缓冲液、20μl磁珠混合裂解10min；磁吸1min后弃上清，在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W1，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W2，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入50 μl 洗脱缓冲液，混合5min，磁吸1min后取洗脱的核酸10μl加入20μl 核酸扩增试剂检测。

本发明提供了荧光PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。

有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成高灵敏HPV 6,11型核酸荧光PCR检测试剂盒，其主要优点和在用于HPV6,11型检测时的有益效果如下：

（1）设计的HPV 6,11型双荧光探针在一次PCR循环反应中产生双倍荧光信号，提高了试剂盒检测灵敏度。

（2）采用的磁珠法核酸提取试剂处理样本，不仅获得的核酸纯度高，能充分去除PCR抑制物，而且有利于样本核酸的富集，提高了试剂盒检测灵敏度。

（3）扩增体系中的dUTP－UNG酶系统更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性，提高了试剂盒检测的准确度。

（4）试剂盒采用磁珠法原理提取样本核酸，适合仪器自动化操作，节约人力成本，简便快速，可在2小时内报告检测结果。

试剂盒的上述特点，均为采用特异性设计的HPV 6,11型引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起，获得的检测结果可以用于判断HPV6,11型感染病情和评价抗病毒治疗效果提供参考依据，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：HPV 6,11型核酸检测试剂盒引物探针的设计

根据NCBI GenBank数据库中查询的HPV 6,11型基因序列，采用Vector NTI、Oligo等引物设计软件，优选获得的引物探针序列如表1所示，HPV 6,11型引物扩增靶序列为HPV病毒L1基因，设计优选的引物、荧光探针均为这两种亚型病毒的保守同源序列。

表1 设计的HPV 6,11型试剂盒引物探针

以上引物探针委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例2：HPV 6,11型核酸荧光PCR检测试剂盒配制

试剂盒扩增试剂，即PCR反应缓冲液为自行配制，按表2各成分浓度和体积配制32人份试剂盒PCR反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。

表2 试剂盒反应缓冲液配制各组分体积

试剂盒阴性对照采用生理盐水，阳性对照为含HPV6,11型SEQ ID NO：1和2引物扩增片段质粒的大肠杆菌、浓度4.0x10³ copy/ml，阴性对照和阳性对照按照400μl/管分装。

试剂盒核酸提取试剂包括裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1和W2、洗脱缓冲液5个组分，其中裂解缓冲液含有50mM Tris-HCl（pH8.0）、5M异硫氰酸胍、15%（v/v）Triton X-100。清洗缓冲液W1含有10mM Tris-HCl (pH8.0)、30%乙醇。清洗缓冲液W2含有10mM Tris-HCl（pH8.0）、80%乙醇。洗脱缓冲液为10 mM Tris-HCl（pH8.0）溶液。磁珠为表面包裹二氧化硅的微纳米磁性颗粒。使用时试剂盒阴性对照、阳性对照以及样本均采用该提取试剂分离纯化核酸。

通过上述配制的HPV 6,11型核酸检测试剂盒，核酸扩增试剂与对照品要求-20℃保存和运输，核酸提取试剂室温保存和运输。

试剂盒使用时的操作步骤如下：取400μl泌尿生殖道分泌物标本漂洗液（可离心浓缩）或对照品，加入等体积裂解缓冲液、20μl磁珠混合裂解10min；磁吸1min后弃上清，在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W1，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W2，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入50 μl 洗脱缓冲液，混合5min，磁吸1min后取洗脱的核酸10μl加入20μl 核酸扩增试剂做荧光PCR检测。扩增程序为：50℃ 2min、94℃ 5min后按照94℃ 10sec、60℃ 45sec循环扩增45次，循环步骤中60℃时采集FAM通道荧光信号。

实施例3：试剂盒检测灵敏度、特异性的测定

（1）样品模板准备

取试剂盒构建的HPV6,11型质粒大肠杆菌（浓度4x10³ copy/ml），采用生理盐水10倍连续梯度稀释到4x10² copy/ml、4x10¹ copy/ml，吸取上述稀释梯度样本各5份、以及试剂盒阴性对照和阳性对照各1份，每份样品体积400μl，一起采用实施例2中的磁珠法核酸提取试剂在核酸提取仪上进行核酸提取，最后每个样品获得的核酸各50 μl。

同时，采用中国食品药品检定研究院人乳头瘤病毒L1基因分型国家参考品（批号360002-201001）评价试剂盒特异性，该国家参考品由30个经过序列测定的HPV基因亚型参考品组成，包括HPV 6、11、16、18、36、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、83，CP8304基因型，其中高危型14种、中危型3种、其余为低危型，可直接作为模板扩增，无需核酸提取。

（2）荧光PCR检测

将实施例2中试剂盒扩增试剂（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、稀释梯度样品提取的模板、以及中国食品药品检定研究院人乳头瘤病毒L1基因分型参考品各10 μl，每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒循环45次（在60℃采集FAM荧光通道的信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。

（3）结果分析

试剂盒对4x10³ copy/ml、4x10² copy/ml、4x10¹ copy/ml浓度的样品分别重复检测5次结果均为阳性，因此可以确定试剂盒检测灵敏度可以达到4x10¹ copy/ml。同时，试剂盒对人乳头瘤病毒L1基因分型国家参考品30个HPV亚型检测结果中，仅有6、11型为阳性，其余均为阴性，说明试剂盒对HPV国家参考品其它基因亚型无交叉反应，试剂盒检测特异性良好。

实施例4：试剂盒在尖锐湿疣泌尿生殖道标本HPV 6,11型检测中的应用

（1）HPV 6,11型 DNA提取

取临床收集的尖锐湿疣患者泌尿生殖道分泌物标本10个，与试剂盒阴性对照、阳性对照一起采用实施例2中的磁珠法核酸提取试剂在核酸提取仪上进行病毒DNA提取，每个样品取样体积400μl，提取后获得核酸各50 μl。

同时，取上海某科技生物公司在国家食品药品监督管理局注册上市的人乳头瘤病毒（HPV）6型、11型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）作对比试剂，同时提取检测上述10个标本，按照其产品使用说明书操作，每个样品取样体积400μl，加入50 μl核酸抽提液混匀，沸水浴10min后13,000rpm离心取上去进行该试剂盒荧光PCR检测。

（2）荧光PCR检测

将实施例2中试剂盒扩增试剂（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入上述提取的试剂盒阴性对照、阳性对照、以及标本提取的模板各10 μl。每个反应管体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定每个反应管样本类型，按照50℃反应2分钟，然后94℃保温5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒循环45次（在60℃采集FAM荧光通道的信号）的反应程序运行。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。

（3）结果分析

采用本发明试剂盒和对比试剂盒，10个尖锐湿疣泌尿生殖道标本HPV 6,11型荧光PCR检测循环阈值（Ct值）结果如表3所示，可知本发明试剂盒对10个标本检测结果均为HPV6,11型阳性，而对比试剂仅有6个HPV6,11型阳性、4个阴性，且从本发明试剂盒Ct值结果可知这4个对比试剂检测结果阴性样本均为HPV6,11型病毒浓度较低的样本，说明采用本发明技术方案中的HPV6,11型荧光PCR试剂盒对临床标本检测阳性率较高，具有更高的检测灵敏度。

表3试剂盒对临床标本HPV 6,11型的荧光PCR检测结果

注：表中Ct值为undet表示无Ct值，结果为阴性。

核苷酸序列表

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

吴大治, 夏懿, 吴梅

<120> 一种高灵敏人乳头瘤病毒6,11型核酸检测试剂盒

<130> HPV611

<140> CN

<141> 2015-12-30

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A

<220>

<221> SEQ_ID_NO:1

<222> (1)..(16)

<400> 1

agatgtggcg gcctag 16

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A

<220>

<221> SEQ_ID_NO:2

<222> (1)..(19)

<400> 2

gtctagaact gctggcatg 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A

<220>

<221> SEQ_ID_NO:3

<222> (1)..(23)

<223> b=FAM; d=TAMRA or BHQ-1

<400> 3

bcacagtata tgtgcctcct ccd 23

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A

<220>

<221> SEQ_ID_NO:4

<222> (1)..(19)

<220>

<221> SEQ_ID_NO:4

<222> (1)..(19)

<223> b=FAM; d=TAMRA or BHQ-1

<400> 4

bgcatccgtg gcaacaacd

Claims

1.一种高灵敏人乳头瘤病毒（HPV）6,11型核酸检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包含核酸扩增试剂、对照品以及核酸提取试剂，扩增试剂所用的一对荧光PCR检测引物序列为SEQID No：1和SEQ ID No：2，荧光探针序列分别为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒扩增试剂中的荧光探针SEQ ID NO：3和SEQ ID No：4序列5’端标记FAM荧光基团、3’端标记TAMRA或BHQ-1淬灭基团。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒核酸扩增试剂分装加入模板后，反应体系各成分按照以下浓度进行扩增反应：10mM pH8.3的Tris-HCl、50 mM KCl、0.2mMdNTPs、1.5～5 mM MgCl₂、各0.1～0.5μM HPV6,11型引物和荧光探针、1～5 U Taq DNA聚合酶和0.01～1 U UNG酶。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒对照品包括阴性对照和阳性对照，阴性对照为生理盐水，阳性对照为含HPV6,11型扩增片段质粒的大肠杆菌。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒核酸提取试剂包含裂解缓冲液、磁珠、清洗缓冲液W1、清洗缓冲液W2、洗脱缓冲液，其中裂解缓冲液含有50mM pH8.0的Tris-HCl、4～6M异硫氰酸胍、10～30%（v/v）Triton X-100，清洗缓冲液W1含有10mM pH8.0的Tris-HCl、30%乙醇，清洗缓冲液W2含有10mM pH8.0的Tris-HCl、80%乙醇，洗脱缓冲液含有1～10 mM pH8.0的Tris-HCl溶液。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒使用时取400μl样本或对照品，加入等体积裂解缓冲液、20μl磁珠混合裂解10min；磁吸1min后弃上清，在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W1，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入500 μl 清洗缓冲液W2，混合1min；磁吸1min后在磁珠中加入50 μl 洗脱缓冲液，混合5min，磁吸1min后取洗脱的核酸10μl加入20μl 核酸扩增试剂做荧光PCR检测。