CN104774918A - 基于实时荧光pcr的il28b基因多态性检测试剂盒 - Google Patents
基于实时荧光pcr的il28b基因多态性检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒，包括IL28B rs8099917型PCR反应液、IL28B rs12979860型PCR反应液；所述IL28Brs8099917型PCR反应液和IL28B rs12979860型PCR反应液包括组分及含量如下：DNA聚合酶0.5～1u，dNTPs 200～800umol/L，MgCl21～1.8mmol/L，引物10～100pmol，探针10～100pmol，缓冲液24ul。本发明采用实时荧光PCR-探针技术，通过设计特异性的引物及荧光探针来检测IL28B突变，更简单、更快捷、更精确。
Description
技术领域
本发明涉及基因表型的测定，特别涉及一种基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒。
背景技术
我国是肝炎大国，其中丙型肝炎尚无有效疫苗预防感染。目前仅有一种治疗方案：干扰素联合利巴韦林抗病毒。我国丙型肝炎主要为基因1型，基因1型治疗有效率只有39.8～40.9％左右(N Engl J Med 2009,361:580-593.)。标准的联合治疗方案价格昂贵、疗程长、疗效难预测，临床上需要一个制定个体化治疗方案的可靠依据。
研究表明，人体上位于19号染色体的IL28B基因参与对丙肝病毒的免疫反应，IL28(白细胞介素28B)基因的两个多态性位点(rs12979860和rs8099917)与丙型肝炎病毒患者的病毒清除有显著相关性，即与丙肝患者标准化治疗方案(聚乙二醇干扰素联合利巴韦林)的抗病毒治疗效果密切相关。多态性rs8099917结果表明，患者T等位基因的纯合子的(T/T基因型)的多态性比杂合的抗病毒治疗病人(T/G基因型)或病人G等位基因的纯合子的(G/G基因型)有更好的疗效；多态性rs12979860结果表明，纯合子的病人C等位基因(C/C基因型)的多态性相比，杂合的病人(C/T基因型)或患者T等位基因的纯合子的(T/T基因型)显著反应更好的抗病毒疗法。
目前，IL28多态性检测技术方法有基因测序方法、基因芯片方法和实时PCR(染料法)，其中，基因测序法虽特异性、准确度和灵敏度高，但实验时间需要4～5小时，同时试剂成本、仪器成本均比较高；基因芯片法特异性和灵敏度高，准确度一般，但试剂成本高、配套仪器昂贵，测试耗时4～5小时；PCR(染料法)的试剂、仪器成本低，检测耗时1.5～2小时，灵敏度高，但是准确性和特异性一般。
本发明采用实时荧光PCR(探针法)技术，通过设计特异性的引物及荧光探针来检测IL28B(rs8099917)和IL28B(rs12979860)的突变。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，通过基于包含IL28B基因多态性的rs8099917和rs12979860的特定 区域设计探针、使用该探针，通过检测基于与靶标核酸形成特异性扩增的信号检测突变，从而实现本发明。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种IL28B SNP荧光检测探针，探针序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
第二方面，本发明提供一种IL28B SNP荧光检测探针的用途，所述用途具体指用于检测IL28B rs8099917、IL28B rs12979860位点的突变。
第三方面，本发明提供一种基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，包括IL28B rs8099917型PCR反应液、IL28B rs12979860型PCR反应液；
所述IL28B rs8099917型PCR反应液包括组分及含量如下：
IL28B rs12979860型PCR反应液包括组分及含量如下：
优选地，IL28B rs8099917型PCR反应液中，所述探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
优选地，IL28B rs8099917型PCR反应液中，所述引物序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，IL28B rs12979860型PCR反应液中，所述探针序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选地，IL28B rs12979860型PCR反应液中，所述引物序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述探针的荧光染料包括FAM、JOE等。
优选地，所述缓冲液包括Tris-Cl缓冲液。
第四方面，本发明提供一种基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒的使用方法，所述使用方法具体包括：提取DNA，加入到基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒的反应液中，利用实时荧光PCR仪进行检测，通过荧光扩增曲线来判读位点突变类型。
本发明通过基因库中寻找rs8099917和rs12979860的基因序列，并由NCBI-BLAST中分别选取一对引物，确定包含突变位点的扩增片段。在扩增片段中设计包含突变位点的特异性荧光探针，并在NCBI-BLAST中判断其特异性。
本发明是基于荧光探针-PCR发实现结果检测的。相对于染料法有更好的特异性，结果更准确；相对于芯片法，荧光探针法操作更简便、时间更短，由于是闭管操作，能更好的消除假阳性污染的可能。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)探针特异性强，检测灵敏度高，准确性好；
(2)方法操作简便，保持特异性、灵敏度、准确性的情况下，可在更短的时间(仅需1.5～2小时)内得出结果；
(3)为临床提供了有效的数据支持，为患者节省了不必要的医药支出，使医疗资源的利用率提高，产生良好的社会效益与经济效益。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明检测试剂盒的纯合子型实验结果图；
图2为本发明检测试剂盒的杂合子型实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括IL28B rs8099917型PCR反应液的组分及含量如下：
所述探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述引物序列如SEQ ID NO.5。
1.DNA提取：用商品化的全血DNA抽提试剂盒，抽提DNA20～50ng用于扩增样使用。
2.PCR试剂准备
2.1提取前取出本发明试剂盒IL28B rs8099917型PCR反应液常温下解冻。解冻后，上下颠倒几次试剂管使其均匀混合。
2.2将IL28B rs8099917型PCR反应液分装备用。
3.加样
每个PCR反应管加1μL相应的DNA提取、阴性质控品。盖紧管盖，4000rmp离心数秒后转移至扩增区检测。
4.PCR扩增
4.1荧光染料选择
4.2扩增程序设定
4.3样本参数界面，按照样本对应顺序设置阴性质控、基因型别的阳性质控、待检样本的序号等信息。
4.4设置完成，保存文件，运行程序。
5.结果分析
扩增反应结束后保存结果，根据仪器SOP操作进行软件设置和分析，记录未知样本的结果。
6.结果判读
具体实验结果见图1。
实施例2
本实施例涉及一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒及其使用所述试剂盒包括IL28B rs12979860型PCR反应液组分及含量如下：
所述探针序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述引物序列如SEQ ID NO.6。
1.DNA提取：用商品化的全血DNA抽提试剂盒，抽提DNA20～50ng用于扩增样使用。
2.PCR试剂准备
2.1提取前取出本发明试剂盒IL28B rs8099917型PCR反应液常温下解冻。解冻后，上下颠倒几次试剂管使其均匀混合。
2.2将IL28B rs8099917型PCR反应液分装备用。
3.加样
每个PCR反应管加1μL相应的DNA提取、阴性质控品。盖紧管盖，4000rmp离心数秒后转移至扩增区检测。
4.PCR扩增
4.1荧光染料选择
4.2扩增程序设定
| 步骤 | 循环数 | 时间/min | 温度/℃ | 备注 |
| 1 | 1 | 2:00 | 50.0 | UNG酶激活 |
| 2 | 1 | 10:00 | 95.0 | Taq酶激活 |
| 3 | 50 | 0:10 | 95.0 | 扩增循环 |
| 0:45 | 60 |
4.3样本参数界面，按照样本对应顺序设置阴性质控、基因型别的阳性质控、待检样本的序号等信息。
4.4设置完成，保存文件，运行程序。
5.结果分析
扩增反应结束后保存结果，根据仪器SOP操作进行软件设置和分析，记录未知样本的结果。
6.结果判读
具体实验结果见图2。
实施例3
本实施例涉及一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒及其应用，试剂盒包括IL28B rs8099917型PCR反应液，其组分与实施例1相同，不同之处仅在于：
Tris-Cl缓冲液24ul，所述探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；所述引物序列如SEQ ID NO.5。
1.DNA提取：用商品化的全血DNA抽提试剂盒，抽提DNA20～50ng用于扩增样使用。
2.PCR试剂准备
2.1提取前取出本发明试剂盒IL28B rs8099917型PCR反应液常温下解冻。解冻后，上下颠倒几次试剂管使其均匀混合。
2.2将IL28B rs8099917型PCR反应液分装备用。
3.加样
每个PCR反应管加1μL相应的DNA提取、阴性质控品。盖紧管盖，4000rmp离心数秒后转移至扩增区检测。
4.PCR扩增
4.1荧光染料选择
4.2扩增程序设定
4.3样本参数界面，按照样本对应顺序设置阴性质控、基因型别的阳性质控、待检样本的序号等信息。
4.4设置完成，保存文件，运行程序。
5.结果分析
扩增反应结束后保存结果，根据仪器SOP操作进行软件设置和分析，记录未知样本的结果。
6.结果判读
实施例4
本实施例涉及一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒及其应用，包括IL28B rs12979860型PCR反应液，其组分与实施例2相同，不同之处仅在于：
所述探针序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述引物序列如SEQ ID NO.6。
1.DNA提取：用商品化的全血DNA抽提试剂盒，抽提DNA20～50ng用于扩增样使用。
2.PCR试剂准备
2.1提取前取出本发明试剂盒IL28B rs8099917型PCR反应液常温下解冻。解冻后，上下颠倒几次试剂管使其均匀混合。
2.2将IL28B rs8099917型PCR反应液分装备用。
3.加样
每个PCR反应管加1μL相应的DNA提取、阴性质控品。盖紧管盖，4000rmp离心数秒后转移至扩增区检测。
4.PCR扩增
4.1荧光染料选择
4.2扩增程序设定
4.3样本参数界面，按照样本对应顺序设置阴性质控、基因型别的阳性质控、待检样本的序号等信息。
4.4设置完成，保存文件，运行程序。
5.结果分析
扩增反应结束后保存结果，根据仪器SOP操作进行软件设置和分析，记录未知样本的结果。
6.结果判读
实施例5性能测试
本实施例以珠海赛乐奇生物公司生产基于芯片技术的检测试剂盒为对照，对本发明荧光PCR探针试剂盒的性能进行检测，检测方法参照常规技术，
准确性对比：选取经过测序方法确认的样本50例，分别使用对照试剂及本发明试剂盒按操作说明书进行准确性检测，检测结果分别与测序结果对比。
灵敏度对比：选取20份测序方法验证的样本提取基因组DNA,测量提取DNA的浓度并调整至20ng/份样本DNA，分别使用对照试剂和本发明试剂盒检测。同时，10倍稀释 样本DNA浓度至2ng,分别使用对照试剂和本发明试剂盒检测。
结果如下所述：
| 试剂盒 | 灵敏度 | 特异性 | 准确性(符合率) | 测试样品耗时 |
| 实施例1试剂盒 | 2ng | 不存在非特异性配对 | 99.33％ | 1.8h |
| 实施例2试剂盒 | 2ng | 不存在非特异性配对 | 99.36％ | 1.8h |
| 对照 | 20ng | 不存在非特异性配对 | 75.69％ | 4.9h |
| 对照 | 2ng | 不存在非特异性配对 | 63.4％ | 4.9h |
由性能测试结果可知，与现有技术相比，本发明基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒灵敏度高、准确率高、测试样品耗时短，具有实质特点和显著进步！
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (9)
1.一种IL28B SNP荧光检测探针，其特征在于，所述探针序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
2.一种根据权利要求1所述的IL28B SNP荧光检测探针的用途，其特征在于，所述用途具体指分别用于检测IL28B rs8099917、IL28B rs12979860位点的突变。
3.一种基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，包括IL28Brs8099917型PCR反应液、IL28B rs12979860型PCR反应液；
所述IL28B rs8099917型PCR反应液包括组分及含量如下：
所述IL28B rs12979860型PCR反应液包括组分及含量如下：
4.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，IL28B rs8099917型PCR反应液中，所述探针序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，IL28B rs8099917型PCR反应液中，引物序列如SEQ ID NO.5所示。
6.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，IL28B rs12979860型PCR反应液中，所述探针序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
7.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，IL28B rs12979860型PCR反应液中，所述引物序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒，其特征在于，所述IL28B rs8099917型PCR反应液、IL28B rs12979860型PCR反应液中缓冲液包括Tris-Cl缓冲液。
9.一种根据权利要求3所述的基于实时荧光PCR的IL28B SNP检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法具体包括：提取DNA，加入到基于实时荧光PCR的IL28BSNP检测试剂盒的反应液中，利用实时荧光PCR仪进行检测，通过荧光扩增曲线来判读位点突变类型。
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