CN105002294A - Il28b基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒 - Google Patents

Il28b基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了IL28B基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒，该引物包括IL28B860位点检测引物和/或IL28B917位点检测引物，优选还包括HER2内标引物，两位点引物组的上游引物5’端均标记荧光基团，HER2上游引物的核苷酸序列5’端标记有前述荧光基团显色不同的荧光基团以便结果区分。含有上述引物组的试剂盒检测IL28B基因原理清楚，操作简单，结果清晰、容易判读，运行周期短，成本较低，可用于医疗机构的日常快速检测。

Description

IL28B基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及IL28B基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒。
背景技术
丙型肝炎是严重威胁人类生命的传染病之一，目前我国约有3700万~4000万感染者。每年的新发病例约300万~400万，其主要通过血源性途径进行传播，包括输血、性接触传播、纹身和吸毒等。
根据丙型肝炎病毒（HCV）基因序列的差异，可将HCV分为6个基因型（1-6），每个基因型又可分为不同亚型。HCV基因型分布具有明显的地域性，其中1型呈全球性分布，占所有HCV感染者的70%以上。1b和2a基因型在我国较为常见，其中以1b型为主。
目前HCV标准治疗方法是聚乙二醇干扰素联合利巴韦林治疗48周，但是对于1型丙型肝炎的病人来说，只有42%~52%的病人可获得持续的病毒学应答，同时由于干扰素的不良作用，导致10%~14%的病人被迫提前停药或减量。研究发现编码γ3干扰素（IFNγ3）的IL28B基因附近有一些单核苷酸多态位点与HCV病毒自发清除能力及对干扰素的应答有关。当这些等位基因发生突变后，患者的HCV自发清除和对干扰素应答能力发生明显变化。其中IL28B的860C>T SNP点基因型为C/C的患者的持续病毒学应答百分比明显高于T/T基因型患者；此外，IL28B的917T>G SNP点基因型为T/T的患者较T/G和G/G基因型患者的持续病毒学应答率更高。
因此，IL28B基因上的SNP位点860C>T和917T>G的基因多态性对HCV感染者标准化治疗影响重大，通过对IL28B基因上860C>T和917T>G两个SNP点基因型的检测来辅助临床诊断，为临床医生选择药物提供参考。
目前，检测基因位点多态性的技术手段有很多，但是大多数均停留在实验室水平，还不能真正应用于医疗机构的日常检测中，以下介绍目前存在的检测技术：
2.1 单链构象多态性技术(PCR-SSCP)
利用点突变或SNP可以对短的DNA单链构象造成影响，从而导致电泳速度的不同来进行检测。特点是可以进行特定区域突变的筛查，但需要跑PAGE胶，较为繁琐，并有一定的漏检率。
2.2 高分辨率融解曲线分析(HRM)
这是近两年发展起来的新技术，原理简便，不需要对反应条件和体系进行特别的优化，容易实现，可进行突变的筛查，但需要特定仪器和试剂的支持。并且只能对片段内突变点进行检测，不能确定检测突变点的具体位置，容易造成假阳性结果。
2.3 Taqman探针法(定量PCR)
适合已知SNP位点、位点数量少、通量高的检测。但是探针合成费用价格昂贵，不能同时发现未知SNP位点，并且容易造成假阳性结果。
2.4 变性高效液相色谱(DHPLC)
对于特定位点的突变检测，需要摸索各种条件，稳定性较差，影响因素太多，所以不容易做好。
2.5 限制性内切酶酶切法
根据突变或SNP位点选择合适的内切酶对PCR产物进行酶切，然后电泳鉴定。该方法稳定可靠，但要注意酶切效率完全，而且不是所有的突变或SNP位点都有酶可以选择，容易造成污染。
2.6 芯片技术
与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点，仅适用于全基因组SNP扫描，不适宜单个基因的SNP位点检测，精度低，价格昂贵。
目前国内珠海赛乐奇生物技术有限公司的IL28B基因多态性检测试剂盒采用的是基因芯片方法已获得认证。
2.7 位点特异性PCR引物(ARMS)
利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。利用Taqman探针在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，具有极高的特异性和敏感度。
2.8 直接测序法
SNP分析的金标准，由于基因序列分析法检测的是易突变区的完整序列，因此可以检测未知突变位点。但测序实验操作较为复杂、实验周期较长、电泳容易造成实验室污染。
发明内容
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一组IL28B基因位点多态性检测引物组合物。
该IL28B基因位点多态性检测引物组合物，包括IL28B860位点检测引物和/或IL28B917位点检测引物，其中，
IL28B860位点检测引物由以下序列组成：
IL28B860-F1：SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
IL28B860-F2：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，
IL28B860-R：SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；
IL28B917位点检测引物由以下序列组成：
IL28B917-F1：SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，
IL28B917-F2：SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，
IL28B917-R：SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；
其中，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端均标记荧光标记基团。
等位基因特异性扩增（Alleles specific amplification，ASA）-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)，利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’端碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。本发明在引物IL28B860-F2和IL28B917-F2的5’端加上3个T对扩增出的片段进行区分。
不同引物特异性结合目标片段，使得不同基因型的DNA片段得到扩增，然后对PCR产物进行分析即可获得待检样品的基因型。
作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测引物组合物，还包括HER2内标引物，由以下序列组成：
HER2-F：SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，
HER2-R：SEQ ID NO:8所示核苷酸序列；
HER2-F的核苷酸序列5’端标记与IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端荧光标记基团显色不同的荧光标记基团。
设计内标引物，扩增原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER2）片段作为内标质控品，内标质控品与靶基因无同源性，是与靶基因没有冲突的另外分子量大小的基因。内标质控体系用来检测反应体系可能存在的抑制因素，使上述引物检测结果更准确。
作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测引物组合物，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端标记FAM基团，HER2-F的核苷酸序列5’端标记HEX基团。
本发明还提供了以上任一所述的IL28B基因位点多态性检测引物组合物在制备IL28B基因位点多态性检测试剂中的应用。
本发明还提供了一种IL28B基因位点多态性检测试剂盒，包括以上所述的IL28B860位点检测引物、IL28B917位点检测引物和HER2内标引物。其中，IL28B860位点检测引物由以下序列组成：
IL28B860-F1：SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
IL28B860-F2：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，
IL28B860-R：SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；
IL28B917位点检测引物由以下序列组成：
IL28B917-F1：SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，
IL28B917-F2：SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，
IL28B917-R：SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；
IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端均标记荧光标记基团。HER2内标引物由以下序列组成：
HER2-F：SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，
HER2-R：SEQ ID NO:8所示核苷酸序列；
HER2-F的核苷酸序列5’端标记与IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端荧光标记基团显色不同的荧光标记基团。
作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测试剂盒中，还包括IL28B860(C/T)阳性质控品、IL28B917(T/G)阳性质控品、IL28B内标质控品、IL28B阴性质控品和PCR反应液，其中，IL28B860(C/T)阳性质控品为杂合基因型IL28B860(C/T)灭活全血，IL28B917(T/G)阳性质控品为杂合基因型IL28B917(T/G)灭活全血，IL28B内标质控品为HER2基因片段，IL28B阴性质控品为纯化水，PCR反应液包括dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶和UDG酶。
阳性质控品的存在是为了验证试剂盒中的试剂是否有效。每次做实验时都要用阳性质控品作为对照试验，当阳性质控品检测正常时，才能证明我们该次试验结果可靠。阳性质控品选择灭活全血是因为全血保存起来更加稳定。
内标质控品HER2基因片段为无生物活性的HER2基因片段。
作为优选方案，上述IL28B基因位点多态性检测试剂盒中，试剂分为7个独立包装的体系，分别为IL28B860(C/T)阳性质控品、IL28B917(T/G)阳性质控品、IL28B内标质控品、IL28B阴性质控品、PCR反应液、IL28B860位点检测引物混合物和IL28B917位点检测引物混合物；IL28B860位点检测引物混合物包括：IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B860-R、HER2-F和HER2-R；
IL28B917位点检测引物混合物包括：IL28B917-F1、IL28B917-F2、IL28B917-R、HER2-F和HER2-R。
本发明还提供以上任一所述的IL28B基因位点多态性检测试剂盒的使用方法，是将待检样品、两种阳性质控品、IL28B内标质控品和阴性质控品分别进行DNA提取操作，提取的DNA需要用紫外分光光度计测定浓度，确保样品无蛋白或RNA污染，OD260/OD280 =1.8~2.0，OD260/OD230≥2.0；阴性质控品提取DNA时需要加少量内标质控品参与提取；
所得每种提取液分成两份，其中一份加入IL28B860位点检测引物混合物和PCR反应液，另一份加入IL28B917位点检测引物混合物和PCR反应液，进行PCR扩增反应，反应程序如下：
37℃ UDG酶反应2分钟；95℃预变性3分钟；94℃变性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，重复40个循环；72℃延伸10分钟，25℃仪器冷却1分钟；
将各份PCR反应产物分别用纯化水稀释后，与分子量内标和Hi-Di Formamide一起混合均匀，转移到毛细管电泳仪进行毛细管电泳；
结果判断：
HEX内标基因扩增产物必须全部出峰，否则视为实验失败；HEX内标基因扩增产物全部出峰的情况下，
IL28B860位点基因型判断：IL28B860反应体系扩增产物只在158bp片段处出现显色峰，表明待检样本为CC纯合基因型，只在161bp片段处出现显色峰，表明待检样本为TT纯合基因型，两个位置均出现显色峰，表明待检样本为CT杂合基因型；
IL28B917位点基因型判断：IL28B917反应体系扩增产物只在240bp片段处出现显色峰，表明待检样本为TT纯合基因型，只在243bp片段处出现显色峰，表明待检样本为GG纯合基因型，两个位置均出现显色峰，表明待检样本为TG杂合基因型。
本发明试剂盒适用的待检测样本为人全血样本，外周全血采集后切勿在室温放置太久，在4℃条件下保存不超过一个月，-20±5℃条件下保存不超过一年。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明选取IL28B860和IL28B917两个位点设计ARMS引物，同时设计内标引物。对原有ARMS技术引物设计上做出了改良，利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性 PCR扩增引物特异性扩增不同基因型的DNA片段。在提取样本DNA后，加入靶基因引物进行PCR，不同引物特异性结合目标片段，使得不同基因型的DNA片段得到扩增；然后对PCR产物毛细管电泳分型，在整个过程中加入与目标片段没有冲突另一内标基因HER2引物，用于监测整个PCR过程和毛细管过程是否正常。该引物组特别适用于荧光PCR结合毛细管电泳这一检测技术。
荧光PCR结合毛细管电泳法是一种新的检测技术，目前尚未有报道采用荧光PCR结合毛细管电泳技术进行基因位点多态性检测。本技术采用上述引物特异性扩增不同基因型的DNA片段，并利用毛细管电泳实现对样品DNA中突变的检测，具有极高的特异性和敏感度。本技术整个操作简单明了，结果直观，并且避免了交叉污染和非特异性扩增引起的假阴性和假阳性问题，实现了在同一个反应管中同时加入靶基因的引物，仅1管反应便可对2种型别同时检测，既节省成本又达到了快速检测的目的。同时本技术采用内标质控体系，用于监测反应体系可能存在的抑制因素。内标质控品与靶基因无同源性，内标选择的是与靶基因没有冲突的另外分子量大小的位置。
含有上述引物组的试剂盒检测IL28B基因原理清楚，操作简单，结果清晰、容易判读，运行周期短，成本较低，可用于医疗机构的日常快速检测。
附图说明
图1是本发明试剂盒对阳性参考品的检测结果；
图2是本发明试剂盒对阴性参考品的检测结果；
图3是本发明试剂盒检测灵敏度的验证结果；
图4是本发明试剂盒检测精密度的验证结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。
实施例1
1. IL28B基因位点多态性检测试剂盒
所述的试剂盒包括：
其中，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端均标记FAM基团，HER2-F的核苷酸序列5’端标记HEX基团。
IL28B860-F1：GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG（SEQ ID NO:1），
IL28B860-F2：TTTGGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA（SEQ ID NO:2），
IL28B860-R：GCGCTTATCGCATACGGTTA（SEQ ID NO:3），
IL28B917-F1：GCATGGTTCCAATTTGGGTGAA（SEQ ID NO:4），
IL28B917-F2：TTTGCATGGTTCCAATTTGGGTGAC（SEQ ID NO:5），
IL28B917-R：GGAACAAATCGTCCCAATACATA（SEQ ID NO:6），
HER2-F：ACTTCAACCACAGTGGCATCTG（SEQ ID NO:7），
HER2-R：GGCATGGACTCAAACGTGTCT（SEQ ID NO:8）。
引物合成与纯度检测：a) 合成机构出具的合成报告单内显示纯化级别为ΜLTRAPAGE级，提供的ΜLTRAPAGE电泳结果显示为单一条带；质谱结果图显示为单一峰，或杂峰强度不高于主峰强度的1/10；b) 10μM的溶液 OD260/OD280的比值在1.60~2.05之间。
2. 试剂盒使用方法
2.1样本处理
2.1.1 样本处理和核酸提取
本试剂盒不包含核酸提取成分，待测样本、阳性质控品和阴性质控品的提取需要采用商品化的核酸提取试剂盒，使用TIANamp Blood DNA Kit (Cat NO.DP318)，具体操作参见该试剂盒说明书，但要注意以下事项：
待测样本、阳性质控品提取时，用100μL缓冲液洗脱。
阴性质控品提取时，200μL IL28B阴性质控品中加入4μL IL28B内标质控品参与提取，用100μL缓冲液洗脱。
提取DNA需要用紫外分光光度计测定浓度，样品无蛋白或RNA污染，OD260/OD280 =1.8~2.0，OD260/OD230≥2.0；DNA含量要求：推荐DNA上样量50~100ng；提取完的DNA立即进行检测，并于-20±5℃保存。
2.1.2准备
实验开始前取出试剂盒各组分，充分解冻并持续振荡15秒混匀，2000 rpm离心15秒。
准备相应数量的PCR仪样品反应管，除样本外还应包括阴性质控品及阳性质控品反应管。
2.2 试剂配置
2.2.1确定反应数10，10=待检样本数(7)+质控品数(2)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下：
表2 体系配制
2.2.2 取1.5mL离心管(灭菌)配置反应体系，试剂全部加入后涡旋混匀10秒，2000rpm离心10秒。
2.2.3然后将上述混合液23μL/管分装至无菌PCR反应管中。
2.3 加样
将已提取的待测样本DNA、IL28B860(C/T)阳性质控品 DNA、IL28B917(T/G)阳性质控品DNA、IL28B阴性质控品DNA分别按表3规定量加入PCR反应管中，盖紧管盖，2000rpm离心10秒将管壁上的液体全部甩至管底（避免气泡产生），然后立即进行PCR扩增反应。样本摆放位置如表4：
表3 加样
表4 样本摆放位置
注：①-⑦代表待测样本；STD1、STD2分别代表IL28B860(C/T)阳性质控品DNA和IL28B917(T/G)阳性质控品DNA；NTC代表IL28B阴性质控品DNA。
2.4 PCR扩增程序设置
表5  PCR扩增仪960型PCR反应条件
2.5 处理PCR产物，进行毛细管电泳
针对IL28B917位点，用纯化水将各组PCR产物稀释100倍，然后取1μL稀释后的PCR产物、1μL LIZ500 分子量内标和8μL Hi-Di Formamide置于0.2mL单管中涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒。
针对IL28B860位点，用纯化水将各组PCR产物稀释100倍，然后取1μL稀释后的PCR产物、1μL LIZ500 分子量内标和8μL Hi-Di Formamide置于0.2mL单管中涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒。
2.6 仪器准备、毛细管电泳及检测
参照ABI 3500Dx基因分析仪用户手册进行上机操作。将处理好的产物转移到96孔自动进样托盘上，将自动进样托盘置于仪器内，关上仪器门。开始毛细管电泳。
2.7 结果分析
采用毛细管电泳仪，检测目的片段峰和内标质控峰。内标片段峰必须全出，否则视为实验失败。内标片段出峰，同时根据目标片段的峰图判断样本基因型。
IL28B860位点基因型判定表
IL28B917位点基因型判定表
注1：FAM标记的为蓝色峰，HEX标记的绿色峰。
注2：“+”表示有峰图，“-”表示无峰图。
3. 试剂盒检测性能评价
3.1 检测准确性
阳性参考品：包括P1~P6，其中P1为IL28B860 CC纯合型样本DNA；P2为IL28B860 TT纯合型样本DNA；P3为IL28B860 CT杂合型样本DNA；P4为IL28B917 TT纯合型样本DNA；P5为IL28B917 GG纯合型样本DNA；P6为IL28B917 TG杂合型样本DNA通过验证后，以20μL/管分装，保存于-80±5℃，用于考察本发明引物的检测准确性。
经本发明IL28B基因位点多态性检测试剂盒（荧光PCR-毛细管电泳法）检测，结果见图1，各基因型检测结果与样本已知基因型一致。
3.2 检测特异性
阴性参考品：包括（N1~N6），其中N1为纯化水，N2为IL28A 同源片段，N3为IL28B860 TT型样本DNA，N4为IL28B860 CC型样本DNA，N5为IL28B917 GG型样本DNA，N6为IL28B917 TT型样本DNA，此参考品通过验证后，以20μL/管分装，保存于-80±5℃，用于考察本发明引物的检测特异性。
测试结果见图2，显示良好的特异性。
3.3分析灵敏度（最低检测限）：5ng/μL
最低检测限参考品：共6份（L1~L6），浓度均为5ng/μL：其中L1-L3为IL28B860 CC型、IL28B860 TT型、IL28B860 CT型样本DNA，L4-L6为IL28B917 TT型、IL28B917 GG型、IL28B917 TG型样本DNA，重复检测8次，均能检出，检测结果分别为对应的基因型。此参考品通过验证后，以20μL/管分装，保存于-80±5℃，用于考察试剂盒的检测灵敏度。检测结果见图3.。
3.4 精密度检测
精密度参考品：共4份（J1~J4）：J1同最低检测限参考品L3，J2为浓度25ng/μL的IL28B860 CT型样本DNA，J3同最低检测限参考品L6，J4为浓度25ng/μL的IL28B917 TG型样本DNA，重复检测8次，均能检出，检测结果分别为对应的基因型。此参考品通过验证后，以20μL/管分装，保存于-80±5℃，用于考察试剂盒的分析精密度。检测结果见图4。
同一批试剂对同一样本（精密度参考品J1-J4）进行8次重复检测，分型结果正确。
通过上述技术方案，本发明设计针对IL28B基因位点特异的引物，对IL28B基因不同基因型进行高效特异性扩增，实现了运用一管试剂，扩增不同基因型的效果；然后通过毛细管电泳将不同基因型分开，达到分型目的，毛细管电泳能有效避免定量PCR由于污染和非特异性扩增引起的假阴性和假阳性干扰，是的分型结果更加可信；同时毛细管电泳的结果简单明了，便于解读；整个技术方案操作过程简单，周期短，成本低，很容易在现有的医疗技术机构普及实现。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
 
<120>  IL28B基因位点多态性检测引物组合物和试剂盒
 
<130>  P20150147
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ggagtgcaat tcaaccctgg ttcg                                            24
 
 
<210>  2
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
tttggagtgc aattcaaccc tggttca                                         27
 
 
<210>  3
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
gcgcttatcg catacggtta                                                 20
 
 
<210>  4
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gcatggttcc aatttgggtg aa                                              22
 
 
<210>  5
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
tttgcatggt tccaatttgg gtgac                                           25
 
 
<210>  6
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
ggaacaaatc gtcccaatac ata                                             23
 
 
<210>  7
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  7
acttcaacca cagtggcatc tg                                              22
 
 
<210>  8
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
ggcatggact caaacgtgtc t                                               21

Claims (8)

1.IL28B基因位点多态性检测引物组合物，其特征在于，包括IL28B860位点检测引物和/或IL28B917位点检测引物，其中，
IL28B860位点检测引物由以下序列组成：
IL28B860-F1：SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
IL28B860-F2：SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，
IL28B860-R：SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；
IL28B917位点检测引物由以下序列组成：
IL28B917-F1：SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，
IL28B917-F2：SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，
IL28B917-R：SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；
其中，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端均标记荧光标记基团。
2.根据权利要求1所述的IL28B基因位点多态性检测引物组合物，其特征在于，还包括HER2内标引物，由以下序列组成：
HER2-F：SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，
HER2-R：SEQ ID NO:8所示核苷酸序列；
HER2-F的核苷酸序列5’端标记与IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端荧光标记基团显色不同的荧光标记基团。
3.根据权利要求1或2所述的IL28B基因位点多态性检测引物组合物，其特征在于，IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B917-F1和IL28B917-F2的核苷酸序列5’端标记FAM基团，HER2-F的核苷酸序列5’端标记HEX基团。
4.权利要求1~3任一所述的IL28B基因位点多态性检测引物组合物在制备IL28B基因位点多态性检测试剂中的应用。
5.一种IL28B基因位点多态性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一所述的IL28B860位点检测引物、IL28B917位点检测引物和HER2内标引物。
6.根据权利要求5所述的IL28B基因位点多态性检测试剂盒，其特征在于，还包括IL28B860(C/T)阳性质控品、IL28B917(T/G)阳性质控品、IL28B内标质控品、IL28B阴性质控品和PCR反应液，其中，IL28B860(C/T)阳性质控品为杂合基因型IL28B860(C/T)灭活全血，IL28B917(T/G)阳性质控品为杂合基因型IL28B917(T/G)灭活全血，IL28B内标质控品为HER2基因片段，IL28B阴性质控品为纯化水，PCR反应液包括dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶和UDG酶。
7.根据权利要求6所述的IL28B基因位点多态性检测试剂盒，其特征在于，分为7个独立包装的体系，分别为IL28B860(C/T)阳性质控品、IL28B917(T/G)阳性质控品、IL28B内标质控品、IL28B阴性质控品、PCR反应液、IL28B860位点检测引物混合物和IL28B917位点检测引物混合物；IL28B860位点检测引物混合物包括：IL28B860-F1、IL28B860-F2、IL28B860-R、HER2-F和HER2-R；
IL28B917位点检测引物混合物包括：IL28B917-F1、IL28B917-F2、IL28B917-R、HER2-F和HER2-R。
8.权利要求6或7所述的IL28B基因位点多态性检测试剂盒的使用方法，其特征在于，待检样品、两种阳性质控品、IL28B内标质控品和阴性质控品分别进行DNA提取操作，提取的DNA需要用紫外分光光度计测定浓度，确保样品无蛋白或RNA污染，OD260/OD280 =1.8~2.0，OD260/OD230≥2.0；阴性质控品提取DNA时需要加少量内标质控品参与提取；
所得每种提取液分成两份，其中一份加入IL28B860位点检测引物混合物和PCR反应液，另一份加入IL28B917位点检测引物混合物和PCR反应液，进行PCR扩增反应，反应程序如下：
37℃ UDG酶反应2分钟；95℃预变性3分钟；94℃变性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸20秒，重复40个循环；72℃延伸10分钟，25℃仪器冷却1分钟；
将各份PCR反应产物分别用纯化水稀释后，与分子量内标和Hi-Di Formamide一起混合均匀，转移到毛细管电泳仪进行毛细管电泳；
结果判断：
HEX内标基因扩增产物必须全部出峰，否则视为实验失败；HEX内标基因扩增产物全部出峰的情况下，
IL28B860位点基因型判断：IL28B860反应体系扩增产物只在158bp片段处出现显色峰，表明待检样本为CC纯合基因型，只在161bp片段处出现显色峰，表明待检样本为TT纯合基因型，两个位置均出现显色峰，表明待检样本为CT杂合基因型；
IL28B917位点基因型判断：IL28B917反应体系扩增产物只在240bp片段处出现显色峰，表明待检样本为TT纯合基因型，只在243bp片段处出现显色峰，表明待检样本为GG纯合基因型，两个位置均出现显色峰，表明待检样本为TG杂合基因型。
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