CN1451762A - 通过pcr产物不同长度测定snp - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定脱氧核糖核酸(DNA)序列中单个碱基的序列，特别是应用于检测与分析多态性(SNP)。本发明公开了一种通过将核苷酸分子与三个寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下进行PCR反应，最后通过检测PCR产物长度的方法来测定所述DNA分子上单个预先选定位点SNP两种不同核苷酸的方法。

Description

通过PCR产物不同长度测定SNP

                             发明领域

本发明涉及检测与分析多态性(SNP)。

                             背景技术

最近人类基因组测序的基本完成，以及单核苷酸多态性(SNP)标记的出现，被公认将极大地加快确认导致复杂疾病如糖尿病、癌症和心血管疾病的遗传变异的过程。结果之一就是将开发出更准确全面的诊断和预测，以及对于疾病的更安全有效的治疗。SNP指的是在同一物种不同个体之间，在同一DNA位点上的核苷酸的不同(多态性)。SNP是最常见的遗传变异，在所有物种中都存在，目前在人类中的研究最为深入。在人类基因组中SNP的发生频率大约为1/1300碱基对。SNP是能引发人类疾病的稳定突变，与药物的有效性和毒理性有关，而且不同族裔的SNP也不相同。另外最新的研究表明SNP可以作为遗传标记有效地发现疾病基因。具体来说，在有三十亿个碱基对的人类基因组中扫描一个或一些与疾病易感性、药物毒性、药物有效性等有关的遗传标记，就象大海捞针一样。目前公认有效的是一个三阶段使用SNP标记逐步定位的方法。第一步是使用低分辨率连锁图谱确认与目标疾病有高连锁的一个1至3分摩根长度的遗传区间。第二步是利用高分辨率SNP通过疾病相关性研究在所述遗传区间内确认与目标疾病相关的基因。第三步则是对这些基因内的SNP的超细定位，确定可以用于疾病诊断的SNP及以其为基础的进一步研发。

因为SNP有广泛的用途，它的发现(discovery)、鉴定(validation)和测定(detection)就成为一种普遍需要。由于有无数多的病人和样品，对于多达几万个甚至几十万个SNP进行测定，如何简单、经济、大规模、高通量地发现、鉴定和测定SNP就成为最近几年研究者们努力解决的问题，关于这方面的新方法和专利也不断涌现。下面我们对一些主要的方法做一个简单介绍(参考了美国专利5,952,174的一些描述)。

1)DNA测序

最明显的方法莫过于对于包含SNP位点本身及其临近区域的DNA序列直接进行测序。这种测序可以通过两种方法来实现，即“双脱氧核苷酸链式中止法”，也称作“山格Sanger法”(Sanger，F.，et al.，J.Mol.Biol.94：441(1875))，和“化学降解法”，也称作“马克西姆-基尔伯特Maxam-Gilbert法”(Maxam，A.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)74：560(1977))。对于特定基因组序列的扩增放大，例如多聚酶链合反应，可以帮助对于目标多聚核苷酸链的收集及其测序。不过这类方法相对来说费用较高，通量较低。

2)核苷酸外切酶抗性法(Exonuclease Resistance)

曼迪Mundy，C.R.(美国专利号4,656,127)的方法使用了对于核苷酸外切酶具有特别抗性的核苷酸衍生物。首先从一个特定动物、人类或其他个体获得目标DNA，然后一个与目标DNA互补，并且其3’端正好位于目标SNP位点的前一个核苷酸的引物被使用与目标DNA进行杂交。如果目标SNP点的核苷酸与某种特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物互补，那么这种核苷酸衍生物就会在多聚酶的作用下被接合在所述杂交上的引物末端。这种接合可以使得杂交上的引物对核苷酸外切酶具有抗性，从而被检测到。由于具体使用的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物的种类已知，那么如果一个引物在某种核苷酸衍生物的作用下具有核苷酸外切酶抗性，那么就可以揭示目标SNP点的核苷酸正好与使用的核苷酸衍生物具有互补关系。曼迪方法的优点在于它不需要测定大量额外的序列。其缺点则在于扩增的目标DNA和未结合的引物都将被核苷酸外切酶所破坏，以及该方法对于特定的具核苷酸外切酶抗性的核苷酸衍生物在多聚酶作用下的接合反应的速率的极其敏感性。

3)微测序法(Microsequencing Methods)

近年来，以引物来引导的核苷酸结合方式来分析DNA多态位点的几种方法相继出现(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids Res.17：7779-7784，(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.18：3671(1990)；Syvanen，A.-C.，et al.，Genomics 8：1143-1147(1991)；Prezant，T.R.，et al.，Hum.Mutat.1：159-164(1992)；Ugozzoll，L.et al.，GATA 9：107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208：171-175(1993))。这些方法要么依赖于带放射标记的单个脱氧核苷酸的结合以及特殊的磁珠，要么依赖于双脱氧核苷酸的使用。其共同点是在一个末端正好位于测定位点前的引物上结合单个核苷酸，并测定该结合核苷酸的种类从而推断出测定位点的核苷酸。

4)液相双脱氧核苷酸延伸法

科恩等人(Cohen，D.et al.)(法国专利号2,650,840；PCT申请号WO91/02087)讨论了一种液相测定一个多态位点碱基的方法。该方法与前述的曼迪方法(美国专利号4,656,127)非常类似，不过不是使用对于核苷酸外切酶具抗性的核苷酸衍生物，而是带标记的双脱氧核苷酸衍生物。

科恩方法有一个显著的缺陷在于它是一个使用带标记三磷酸双脱氧核苷酸的液相延伸反应。通常目标DNA模版要经过一步扩增反应，例如PCR，而这一过程要使用高浓度的DNA聚合酶天然底物即三磷酸脱氧核苷酸。这些单体将会在接下来的延伸反应中和三磷酸双脱氧核苷酸进行竞争。因此，在PCR之后，需要一个额外的步骤来将目标DNA模版与未结合的三磷酸脱氧核苷酸分开，亦即清除掉多余的三磷酸脱氧核苷酸单体，而这一步在液相中很难实现，也因此该方法不适用于大容量测试。

5)固相双脱氧核苷酸延伸法

另一种可选择的方法，被称为GBA法，是格列特等人(Goelet，P.et al.)所发明的(PCT申请号92/15712)。在一个更可取的实施方案中，格列特等人的方法使用了带标记的终止物的混合体，以及一个与目标DNA互补并且其3’端正好位于目标多态位点的前一个核苷酸的引物。这样能够与引物结合的终止物就由被测定位点的核苷酸所决定，而且实际上是与其互补。与前述科恩方法(法国专利号2,650,840；PCT申请号WO91/02087)相反，格列特等人的方法的更可取之处在于它是一种多相方法，其中引物或者目标DNA是固定在一个固相上。因此该方法更容易操作，也比科恩方法更精确。

6)寡核苷酸链连接反应法

另一种固相测定SNP的方法使用了不同的酶学方法，称作“寡核苷酸链连接反应法”(Oligonucleotide Ligation Assay，简称OLA方法)(Landegren，U.et al.，Science241：1077-1080(1988))。OLA方法使用了与一个目标DNA的单链上的两个毗连序列可以杂交的两个寡核苷酸链。其中一个寡核苷酸链经过生物素处理，另一个则加有可检测的标记。如果在目标DNA上有一个完全互补的序列，这两个寡核苷酸链将与目标DNA杂交，并且它们的末端将毗连从而形成一个连接反应的底物。接下来的连接反应就使得带标记的寡核苷酸链能被阿维丁(avidin)或者另一种生物素配体结合在另一个寡核苷酸链上，并从而被检测到。尼科松等人(Nickerson，D.A.et al.)描述了一种结合PCR和OLA的检测核苷酸的方法(Nickerson，D.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：8923-8927(1990))。在这个方法里，目标DNA首先用PCR方法进行扩增，然后再用OLA方法来检测。这种分析要求对于目标多态位点的每个dNTP都要用与其配套的一对寡核苷酸链来分开检查。OLA方法的主要缺点在于连接反应不是一个具有高识别率的过程，因而非特异性的信号是一个大问题。

目前所需要的是开发一个更有选择性的方式来分辨多态位点。我们这里报告的发明是为了满足这方面的要求。

                             发明的描述

本发明公开了一种通过将核苷酸分子与三个寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下进行PCR反应，最后通过检测PCR产物长度的方法来测定所述DNA分子上单个预先选定位点SNP两种不同核苷酸的方法，包括以下几个步骤：

a)将一份或多份所述核苷酸分子与所述三个寡核苷酸引物在聚合酶的作用下进行PCR反应；此处所述核苷酸分子包含有所述单个预先选定位点，并且在所述预先选定位点的3’端有18或以上个核苷酸，同时所述第一个和第二个寡核苷酸引物长度为20个左右，其3’端除顶端核苷酸外都与所述核苷酸分子在所述单个预先选定位点前的片断互补，但第一个引物比第二个引物在长度上短1个以上核苷酸，而且第一个引物的3’端顶端本身与要测定的SNP的第一种核苷酸互补，第二个引物的3’端顶端本身则与要测定的SNP的第二种核苷酸互补，同时所述第三个引物长度为20个左右，与所述DNA在所述预先选定位点的下游部分互补，并且其3’端位于所述单个预先选定位点的下游；

b)检测所述PCR产物的长度和数量以确定所述核苷酸分子中存在所述SNP中两种核苷酸的哪几种，及其相对比例。

本发明使用了两种长度不同，而分别针对SNP不同核苷酸的引物来进行PCR反应，并从PCR产物的长度来测定SNP的核苷酸种类。技术设计简单有效，检测简便。

本发明的优选方案是同时测定多个SNP位点。一方面每个SNP内部的两个PCR产物长度有异，同时不同SNP之间的PCR产物的长度也互不相同，这样可以大规模、高通量测定SNP。这里的技术关键有二：一是在同一容器里能有效地进行的PCR产物的个数有限，目前一般为13个左右，因此需要将所有反应适当分开，而检测PCR反应长度的时候又可以合并起来进行；二是引物的设计，要求同样做到大规模、高通量并准确可靠，同时要配合上述第一项中的反应分类，这就要求有生物信息学的专长。

由于只需测定PCR产物的长度，所以反应不需要使用标记，而且只需走agrose胶或一般的测序胶或毛细管电泳即可；但也可以使用标记以在不同的检测条件下方便地得到数据，这些标记可选自荧光标记，放射性标记，生物发光标记，化学发光标记，核苷酸标记，半抗原标记和酶标记。

本发明也可以用来检测从多个个体中取得的混合样品，而且这些样品可以是来自于基因组DNA(genomic DNA)，环形DNA，cDNA，EST，或对其进行扩增的结果；或者是来自于对RNA进行反转录扩增的结果。更有意义的是，本发明可以通过PCR反应的产量计算SNP两种核苷酸的相对比例，这对于集合样品(pooled sample)的SNP检测意义重大。

本发明可以大规模操作，如用来同步测定多达数千个甚至数十万个位点的序列和SNP，并且可以实现高通量操作。

Claims (9)

1.本发明公开了一种通过将核苷酸分子与三个寡核苷酸引物，在聚合酶的作用下进行PCR反应，最后通过检测PCR产物长度的方法来测定所述DNA分子上单个预先选定位点SNP两种不同核苷酸的方法，包括以下几个步骤：

a)将一份或多份所述核苷酸分子与所述三个寡核苷酸引物在聚合酶的作用下进行PCR反应；此处所述核苷酸分子包含有所述单个预先选定位点，并且在所述预先选定位点的3’端有18或以上个核苷酸，同时所述第一个和第二个寡核苷酸引物长度为20个左右，其3’端除顶端核苷酸外都与所述核苷酸分子在所述单个预先选定位点前的片断互补，但第一个引物比第二个引物在长度上短1个以上核苷酸，而且第一个引物的3’端顶端本身与要测定的SNP的第一种核苷酸互补，第二个引物的3’端顶端本身则与要测定的SNP的第二种核苷酸互补，同时所述第三个引物长度为20个左右，与所述DNA在所述预先选定位点的下游部分互补，并且其3’端位于所述单个预先选定位点的下游；

b)检测所述PCR产物的长度和数量以确定所述核苷酸分子中存在所述SNP中两种核苷酸的哪几种，及其相对比例。

2.权利要求1的方法，其中同时测定多个SNP，一方面每个SNP内部的两个PCR产物长度有异，同时不同SNP之间的PCR产物的长度也互不相同，这样可以大规模、高通量测定SNP。

3.权利要求1的方法，其中反应不需要使用标记，而且只需走agrose胶或一般的测序胶或毛细管电泳即可。

4.权利要求1的方法，其中反应使用标记并选自荧光标记，放射性标记，生物发光标记，化学发光标记，核苷酸标记，半抗原标记和酶标记。

5.权利要求1的方法，其中所述DNA分子是来源于同一个体的不同染色体，或者是来源于不同个体的染色体。

6.权利要求1或4的方法，其中所述DNA分子是经过了以另一个单链或双链核酸模板进行扩增。

7.权利要求6的方法，其中用于扩增的核酸模板选自基因组DNA(genomic DNA)、环形DNA、cDNA、EST。

8.权利要求6的方法，其中用于扩增的核酸模板是RNA，使用的聚合酶是反转录酶。

9.权利要求6的方法，其中用于扩增的DNA或RNA模板来自一个或多个个体。