CN103443274A - 单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的pcr引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法 - Google Patents

单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的pcr引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。本发明为一种单核苷酸多态性检测用的试样核酸，其具有下述(a)～(c)的特性，(a)总链长为200bp以下；(b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列(标识序列)；(c)与用于比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为10bp以下。

Description

单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法
技术领域
本发明涉及用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，本发明涉及单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
背景技术
近年来，开发了分析已经明确与各种疾病或药的副作用相关的单核苷酸多态性(SNP；Single Nucleotide Polymorphism)的技术，在这些开发中，简便并且在短时间内精度良好地检测单核苷酸多态性成为重要的要素。
作为分析单核苷酸多态性的方法，已知有RFLP法(限制性片段长度多态性，Restriction Fragmet Length Polymorphism)。RFLP法为如下方法：在存在识别PCR(聚合酶链反应，Polymerase Chain React ion)扩增产物中的基因变异部的限制酶的情况下，在共有序列部位设定引物，使在其内侧即PCR扩增产物内具有多态性，并进行扩增，用限制酶切断所得到的PCR扩增产物，根据该片段的长度判定多态性的有无。但是，由于使用限制酶，因此，存在分析成本提高、或分析整体的时间延长等课题。另外，由于通过电泳检测链长差别，因此，也存在作业变烦杂、或分析整体的时间延长等课题。
另一方面，在生物化学领域或医学领域等中，在核酸、蛋白质、多糖类这样的生物体高分子的分析中，作为能够简便并且在短时间内精度良好地检测的方法，利用离子交换色谱法。使用离子交换色谱法时，缓和对于利用电泳的测定而言必须的烦杂的作业。非专利文献1中公开了通过高效液相色谱法分离核酸相关化合物的方法。但是，在非专利文献1中公开的方法中，存在难以充分地分离单核苷酸多态性这样的具有接近的链长差的核酸的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-027518号公报
专利文献2：日本特开2006-075126号公报
非专利文献
非专利文献1：“ライフサイェンスのための高速液体クロマトグラフイ一基礎と実験(用于生命科学的高效液相色谱法基础与实验)”、广川书店、p.323(1988)
非专利文献2：Nature、324、p.163-166、(1986)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，本发明的目的在于，提供单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
用于解决问题的方法
本发明为具有下述(a)～(c)的特性的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。
(a)总链长200bp以下；
(b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列(标识序列)；
(c)与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为10bp以下。
以下，详细说明本发明。
本发明人发现，通过使用具有特定的特性的试样核酸，能够迅速并且简便地检测单核苷酸多态性，从而完成了本发明。
AS-PCR(等位基因特异性PCR，Allele Specific-PCR)法是检测利用序列特异性的扩增反应的基因多态性(特别是单核苷酸多态性)的方法。具体而言，使想要检测的单核苷酸多态性的碱基序列成为引物的3’末端，进行PCR。在目标核酸的序列与引物完全互补的情况下，通过DNA聚合酶引起延长反应。另一方面，在目标核酸的序列与引物不完全互补的情况下，阻碍DNA聚合酶的延长反应。这样，是使用在3’末端具有单核苷酸多态性的野生型或变异型的碱基序列的2种引物，基于扩增反应的结果，进行单核苷酸多态性的判定的方法。作为AS-PCR法，可以使用非专利文献2中公开的方法。
本发明中的AS-PCR，所使用的引物具有以下的特征。
(1)正向引物使用变异型用、野生型用的2种，变异型用在3’末端具有单核苷酸多态性的碱基序列，野生型用在3’末端(相当于单核苷酸多态性部位)具有野生型的碱基序列。
(2)上述2种正向引物中的一种引物在5’末端具有与目标核酸的碱基序列不完全互补的序列(以下有时称为“标识序列”)。
(3)上述标识序列的链长为10bp以下。
(4)上述2种正向引物以扩增产物的链长达到200bp以下的方式进行设计。
(5)反向引物使用在变异型用、野生型用中共同的引物。
(6)上述反向引物，在通过变异型用正向引物复制在5’末端具有标识序列的PCR扩增产物的情况下，能够在PCR扩增的第2次循环以后复制在3’末端具有标识序列的扩增产物。
在上述的引物中，示意地说明变异型用引物具有标识序列的情况下的PCR扩增反应的特征。
(A)PCR扩增的第1次循环的特征如下。变异型用、野生型用的2种引物对于变异型的模板DNA、野生型的模板DNA而言分别退火后，分别进行延长反应，分别复制变异型DNA、野生型DNA。此时，被复制的变异型DNA相对于被复制的野生型DNA，仅标识序列的链长部分总链长长。
(B)PCR扩增的第2次循环以后的特征如下。反向引物在变异型DNA的复制产物(在5’末端具有标识序列)以及野生型DNA的复制产物分别退火后，进行延长反应，分别复制变异型DNA、野生型DNA。此时，通过反向引物复制的变异型DNA，也相对于被复制的野生型DNA，仅标识序列的链长部分总链长长。
这样得到的仅标识序列部分总链长不同的2种PCR扩增产物，通过后述的离子交换色谱法进行分离分析。
上述示意的说明中，以2种PCR扩增产物能够通过离子交换色谱法进行分离分析作为限度，可以在变异型用引物、野生型用引物二者上附加标识序列，除了通常使用的引物应该具备的特性之外，不限于标识序列，这对于本领域技术人员而言能够容易地理解。
需要说明的是，正向引物、反向引物的用词以本发明的技术领域中的通常的含义进行使用，正向引物使用在变异型用、野生型用中共同的引物，反向引物中变异型用的在5’末端附加标识序列这样的形态当然也包括在本发明的范围内。
以往，在引物上付加与本发明同样的标识序列的情况下，以非特异反应的避免(专利文献1)、利用标识探针的检测(专利文献2)为目的，没有作为离子交换色谱法用的试样、特别是单核苷酸多态性的检测用试样的例子。
如上所述，本发明中，提供单核苷酸多态性检测用的试样核酸、单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，使用离子交换色谱。
用于离子交换色谱法的洗脱液，优选含有由下述式(1)所示的胍衍生的胍盐。
作为胍盐，例如可以列举：胍盐酸盐、胍硫酸盐、胍硝酸盐、胍碳酸盐、胍磷酸酯、胍硫氰酸盐、胍氨基磺酸盐、氨基胍盐酸盐、氨基胍碳酸氢盐等。其中，优选使用胍盐酸盐、胍硫酸盐。
洗脱液中的胍盐的分析时的浓度，根据检测对象物质适当调节即可，但优选为2000mmol／L以下。具体而言，可以列举：使胍盐的浓度在0～2000mmol／L的范围内进行梯度溶出的方法。因此，分析开始时的胍盐的浓度无需为0mmol／L，另外，分析结束时的胍盐的盐浓度也无需为2000mmol／L。
梯度溶出的方法可以为低压梯度法也可以为高压梯度法，但优选在进行利用高压梯度法的精密的浓度调节的同时使其溶出的方法。
胍盐可以单独添加到洗脱液中，也可以与其他盐组合添加。作为能够与胍盐组合使用的盐，可以列举例如：由氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾等卤化物和碱金属构成的盐，由氯化钙、溴化钙、氯化镁、溴化镁等卤化物和碱土金属构成的盐，高氯酸钠、高氯酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾等无机酸盐等。另外，也可以使用乙酸钠、乙酸钾、琥珀酸钠、琥珀酸钾等有机酸盐。
作为用于洗脱液的缓冲液，可以使用公知的缓冲液类和有机溶剂类，具体而言，可以列举例如：Tris-HCl缓冲液、由Tris和EDTA构成的TE缓冲液、由Tri s和乙酸和EDTA构成的TAE缓冲液、由Tri s和硼酸和EDTA构成的TBA缓冲液等。
洗脱液的pH没有特别限定，只要是通过阴离子交换能够分离核酸链的范围即可。
作为用于离子交换色谱法的填充剂，优选为在基材粒子的至少表面上引入阳离子性基团的填充剂，更优选为在基材粒子的至少表面上具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的填充剂。
本说明书中，“强阳离子性基团”是指在pH为1至14的宽范围内进行解离的阳离子性基团。即，强阳离子性基团不受水溶液的pH的影响而能够保持解离了的(阳离子化的)状态。
作为强阳离子性基团，可以列举：季铵基。具体而言，例如可以列举：三甲基铵基、三乙基铵基、二甲基乙基铵基等三烷基铵基等。
另外，作为强阳离子性基团的抗衡离子，例如可以列举：氯化物离子、溴化物离子、碘化物离子等卤化物离子。
强阳离子性基团量没有特别限定，填充剂的每单位干燥重量的优选的下限为1μeq／g，优选的上限为500μeq／g。强阳离子性基团量低于1μeq／g时，有时填充剂的保持力减弱，分离性能变差。强阳离子性基团量超过500μeq／g时，填充剂的保持力变得过强，不能使检测对象物质容易地溶出，有时产生分析时间延长等问题。
本说明书中，“弱阴离子性基团”是指pKa为3以上的阴离子性基团。即，上述弱阴离子性基团受水溶液的pH的影响，解离状态发生变化。pH高于3时，羧基的质子发生解离，具有负的电荷的比例增加。相反，pH低于3时，结合了羧基的质子的非解离状态的比例增加。
作为上述弱阴离子性基团，例如可以列举羧基、磷酸基等。其中，优选为羧基。
作为在基材粒子的至少表面上引入羧基的方法，可以使用例如：将具有羧基的单体进行共聚的方法、将单体中的酯部水解的方法、通过臭氧水处理形成羧基的方法、通过臭氧气体形成羧基的方法、通过等离子体处理形成羧基的方法、使具有羧基的硅烷偶联剂反应的方法、使具有环氧基的单体共聚、通过环氧基的开环形成羧基的方法等公知的方法。其中，在基材粒子具有疏水性的结构部分、特别是具有碳-碳双键的情况下，优选使用通过臭氧水处理形成羧基的方法。
对通过臭氧水处理形成羧基的方法进行说明。
臭氧与双键的反应性高，与双键反应了的臭氧，形成作为中间体的臭氧化物，然后，形成羧基等。
臭氧水是指臭氧气体在水中溶解而成的。
通过使用臭氧水，仅通过使粒子分散在臭氧水中，就能够使粒子表面简便地氧化。其结果，基材粒子中的疏水性的结构部分被氧化，形成羧基、羟基、醛基、酮基等亲水性基团。
臭氧具有强力的氧化作用，通过使用臭氧水进行处理，通过使用臭氧气体进行处理，均能够使粒子表面均匀地氧化，更均匀地形成羧基，因此优选。
臭氧水中的溶解臭氧的浓度没有特别限定，优选的下限为20ppm。溶解臭氧的浓度低于20ppm时，形成羧基需要长时间，或羧基的形成变得不充分，无法充分地抑制检测对象物质的非特异吸附等。溶解臭氧的浓度的更优选的下限为50ppm。
关于臭氧水，如例如日本特开2001-330969号公报等所记载，可以通过将原料水和臭氧气体隔着仅透过气体、阻止液体透过的臭氧气体透过膜使其接触的方法等进行制备。
在碱性条件下，在基材粒子的表面上引入的羧基处于基本解离的状态，在与核酸碱基中的少许阳离子之间产生弱阳离子交换相互作用。
另外认为，通过臭氧水进行处理，由此，除了羧基之外，还形成羟基、醛基、酮基等亲水性基团，通过这些亲水性基团的存在，在填充剂的表面与核酸之间起作用的疏水性相互作用减弱。
因此，使用在至少表面上具有强阳离子性基团和弱阴离子性基团的填充剂的情况下，除了作为主要的相互作用的在填充剂表面与核酸之间发挥的阴离子交换相互作用之外，如上所述，发挥弱的阳离子交换相互作用，或疏水性相互作用变弱，由此，分离性能提高。
在基材粒子的至少表面上引入的弱阴离子性基团量，只要是强阳离子性基团量以下，则没有特别限定。
作为基材粒子，可以使用例如使用聚合性单体等而得到的合成高分子微粒、二氧化硅系等无机微粒等，优选包括：由有机合成高分子构成的疏水性交联聚合物粒子、和由在该疏水性交联聚合物粒子的表面具有共聚的离子交换基团的亲水性聚合物构成的层。
疏水性交联聚合物可以为如下聚合物中的任意一种，即：将1种疏水性交联性单体进行均聚而得到的疏水性交联聚合物、将2种以上疏水性交联性单体进行共聚而得到的疏水性交联聚合物、将至少1种疏水性交联性单体与至少1种疏水性非交联性单体进行共聚而得到的疏水性交联聚合物。
作为疏水性交联性单体，只要是在单体1分子中具有2个以上乙烯基的单体，则没有特别限定，例如可以列举：乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚丙二醇二(甲基)丙烯酸酯等二(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯等三(甲基)丙烯酸酯或四(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基萘等芳香族类化合物等。
需要说明的是，本说明书中，“(甲基)丙烯酰基”是指“丙烯酰基或甲基丙烯酰基”，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯”。
作为疏水性非交联性单体，只要是具有疏水性的性质的非交联性的聚合性有机单体，则没有特别限定，例如可以列举：(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸异丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯等(甲基)丙烯酸酯，苯乙烯，甲基苯乙烯等苯乙烯类单体等。
疏水性交联聚合物由疏水性交联性单体与疏水性非交联性单体的共聚构成的情况下，疏水性交联聚合物中的来自疏水性交联性单体的链段的含有比例的优选的下限为10重量％，更优选的下限为20重量％。
具有离子交换基团的亲水性聚合物由具有离子交换基团的亲水性单体构成，可以包含来自具有1种以上离子交换基团的亲水性单体的链段。即，作为制造具有离子交换基团的亲水性聚合物的方法，可以列举：使具有离子交换基团的亲水性单体均聚的方法、使具有离子交换基团的亲水性单体与不具有离子交换基团的亲水性单体共聚的方法等。
作为具有离子交换基团的亲水性单体，优选为具有强阳离子性基团的亲水性单体，更优选为具有季铵基的亲水性单体。具体而言，例如可以列举：甲基丙烯酸乙基三甲基铵氯化物、甲基丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、甲基丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、丙烯酸乙基三甲基铵氯化物、丙烯酸乙基三乙基铵氯化物、丙烯酸乙基二甲基乙基铵氯化物、丙烯酰胺乙基三甲基铵氯化物、丙烯酰胺乙基三乙基铵氯化物、丙烯酰胺乙基二甲基乙基铵氯化物等。
填充剂的平均粒径没有特别限定，优选的下限为0.1μm，优选的上限为20μm。填充剂的平均粒径低于0.1μm时，色谱柱的内压增高，有时引起分离不良。填充剂的平均粒径超过20μm时，色谱柱内的死体积变得过大，有时引起分离不良。
需要说明的是，本说明书中，平均粒径表示体积平均粒径，可以使用粒度分布测定装置(AccuSizer780／Particle Sizing Systems公司制)进行测定。
在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，通过AS-PCR法扩增的产物的大小优选为200bp以下。通过AS-PCR法扩增的产物的大小超过200bp时，有时PCR的扩增时间和离子交换色谱法中的分析时间延长，或不能得到充分的分离性能。通过AS-PCR法扩增的产物的大小更优选为100bp以下。
在本发明的单核苷酸多态性的检测方法中，通过AS-PCR法扩增的野生型与变异型的产物的大小之差(链长差)优选为10bp以下。以被扩增的野生型与变异型的产物的大小之差超过10bp的方式设计AS引物，有时通过非特异扩增反应等不能得到期望的扩增产物。
发明效果
根据本发明，能够提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，根据本发明，能够提供单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
附图说明
图1是实施例1中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
图2是在实施例1中使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
图3是在参考例1中使用阴离子交换色谱柱1分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图。
图4是在参考例1中使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图。
图5是在参考例2中使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图。
具体实施方式
以下，列举实施例，对本发明更详细地进行说明，但本发明不仅限定于这些实施例。
(阴离子交换色谱柱的准备)
(阴离子交换色谱柱1)
在带搅拌机的反应器中，在3重量％聚乙烯醇(日本合成化学公司制)水溶液2000mL中添加四乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)300g、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化学工业公司制)100g、以及过氧化苯甲酰(キシダ化学公司制)1.0g的混合物。搅拌的同时进行加热，在氮气气氛下，80℃下聚合1小时。接着，作为具有强阳离子性的离子交换基团(季铵基)的单体，将甲基丙烯酸乙基三甲基铵氯化物(和光纯药工业公司制)100g在离子交换水中溶解，进一步将所得到的溶液添加到上述反应器中。接着，搅拌的同时，在氮气气氛下，80℃下聚合2小时，得到聚合物组合物。将所得到的聚合物组合物用水以及丙酮清洗，由此，得到在基材粒子的表面上具有季铵基的亲水性的被覆聚合物粒子。
将所得到的被覆聚合物粒子10g在溶解臭氧浓度100ppm的臭氧水300mL中浸渍，搅拌30分钟。搅拌结束后，使用离心分离机(日立制作所公司制、“Himac CR20G”)进行离心分离，除去上清液。重复该操作2次，对被覆聚合物粒子实施臭氧水处理，得到季铵基和羧基共存的离子交换色谱法用填充剂。
需要说明的是，关于臭氧水，使用在具有内径15em×长度20em的圆柱形的外套内包含收纳有由全氟烷氧基树脂构成的内径0.5mm×厚度0.04mm×长度350cm的中空管状的臭氧气体透过膜400根的臭氧溶解模块的臭氧水制造系统(积水化学工业公司制)进行制备。
关于所得到的离子交换色谱法用填充剂，使用粒度分布计(ParticleSizing Systems公司制、“Accusizer780”)进行测定，结果平均粒径为10μm。
使用所得到的离子交换色谱法用填充剂，准备以下的色谱柱(阴离子交换色谱柱1)。
色谱柱尺寸：内径4.6mm×20mm
离子交换基团：季铵基
(阴离子交换色谱柱2)
作为市售的色谱柱，准备以下的色谱柱。
品名：TSK-gel DNA-STAT(东曹公司制)
色谱柱尺寸：内径4.6mm×长度100mm
离子交换基团：季铵基
(实施例1)
实施例1中，进行UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp的分离检测。
(AS-PCR扩增)
通过以下所示的AS-PCR条件得到野生型和变异型的扩增产物。
(1)试药
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen公司制、Lot.760816)
10×AccuPrime PCR缓冲液I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidel ity(5U／μL)
UGT1A1*6引物(0peron Biotechnologies公司制)
正向(野生型)(10pmol／μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向(变异型)(10pmol／μL)：5’-(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号2)
反向(10pmol／μL)：5’-(cacatcc tccc t t tggaatggca)-3”(序歹号3)无核酸酶的水(非DEPC处理过的)(Ambi on公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因野生型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
UGT1A1基因变异型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水调节而成的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツドラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒、68℃下30秒的扩增循环进行循环40次，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)确认在80bp附近来自扩增产物的带。扩增产物的大小使用20bp DNA Ladder标记物(宝生物公司制)进行确认。
(HPLC分析)
使用准备的阴离子交换色谱柱，在以下的条件下分离检测AS-PCR扩增产物。
系统：LC-20A系列(岛津制作所公司制)
洗脱液：洗脱液A25mmol／L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)
洗脱液B25mmol／L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1mol／L胍盐酸盐
分析时间：使用阴离子交换色谱柱1时的分析时间为10分钟
使用阴离子交换色谱柱2时的分析时间为20分钟
溶出法：通过以下所示的梯度条件，使洗脱液B的混合比率直线增加。
使用阴离子交换色谱柱1时的条件
0分钟(洗脱液B40％)→10分钟(洗脱液B50％)
使用阴离子交换色谱柱2时的条件
0分钟(洗脱液B70％)→20分钟(洗脱液B90％)
检体：UGT1A1*6区域的野生型76bp
UGT1A1*6区域的变异型79bp
流速：0.5mL／分钟(使用阴离子交换色谱柱1时)
1.0mL／分钟(使用阴离子交换色谱柱2时)
检测波长：260nm
试剂注入量：10μL
(参考例1)
参考例1中，进行UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp的分离检测。
(AS-PCR扩增)
通过以下所示的AS-PCR条件，得到野生型与变异型的扩增产物。
(1)试药
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitorgen公司制、Lot.760816)10×AccuPrime PCR缓冲液I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidel ity(5U／μL)
UGT1A1*6引物(0peron Biotechnologies公司制)
正向(野生型)(10pmol／μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向(变异型)(10pmol／μL)：5’-(ctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号2)
反向(10pmol／μL)：5’-(gaaagggtccgtcagcatgac)-3”(序歹号4)
无核酸酶的水(非DEPC处理过的)(Ambion公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因野生型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
UGT1A1基因变异型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水进行调节后的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツドラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒、68℃下30秒的扩增循环进行循环40次，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)确认在270bp附近(200bp与300bp之间)来自扩增产物的带。扩增产物的大小使用20bp DNA Ladder标记物(宝生物公司制)进行确认。
(HPLC分析)
使用准备的阴离子交换色谱柱，在以下的条件下分离检测AS-PCR扩增产物。
系统：LC-20A系列(岛津制作所公司制)
洗脱液：洗脱液A25mmol／L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)
洗脱液B25mmol／L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)+1mol／L胍盐酸盐
分析时间：使用阴离子交换色谱柱1时的分析时间为10分钟
使用阴离子交换色谱柱2时的分析时间为20分钟
溶出法：通过以下所示的梯度条件，使洗脱液B的混合比率直线增加。
使用阴离子交换色谱柱1时的条件
0分钟(洗脱液B60％)→10分钟(洗脱液B80％)
使用阴离子交换色谱柱2时的条件
0分钟(洗脱液B80％)→20分钟(洗脱液B100％)
检体：UGT1A1*6区域的野生型271bp
UGT1A1*6区域的变异型274bp
流速：0.5mL／分钟(使用阴离子交换色谱柱1时)
1.0mL／分钟(使用阴离子交换色谱柱2时)
检测波长：260nm
试剂注入量：10μL
(比较例1)
比较例1中，尝试进行UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型96bp的分离检测。
(1)试药
AccuPrimeTaq DNA Polymerase High Fidel ity(Inv i torgen公司制、Lot.760816)10×AccuPrime PCR缓冲液I
AccuPrime Taq DNA Polymerase High Fidelity(5U／μL)
UGT1A1*6引物(Operon Biotechnologies公司制)
正向(野生型)(10pmol／μL)：5’-(cgcctcgttgtacatcagagcgg)-3’(序列号1)
正向(变异型)(10pmol／μL)：5’-(atagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagcga)-3”(序列号5)
反向(10pmol／μL)：5’-(cacatcctccctttggaatggca)-3”(序歹号3)
无核酸酶的水(非DEPC处理过的)(Ambion公司制、Lot.0803015)
UGT1A1基因野生型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
UGT1A1基因变异型序列插入质粒(1×106拷贝／μL)
(2)制备
在5μL的10×AccuPrime PCR缓冲液I、1μL的正向引物、1μL的反向引物中以总量达到49μL的方式用无核酸酶的水调节后的溶液中，添加1μL的UGT1A1基因序列插入质粒，得到反应溶液。
(3)反应
使用C1000(バイオ·ラツドラボラトリ一ズ公司制)，进行PCR反应。温度循环如下所示。
在94℃、30秒下使模板热改性，将94℃下15秒、62℃下15秒，68℃下30秒的扩增循环进行循环40次，最后，在68℃保温5分钟。4℃下保存直到样品使用。
在AS-PCR扩增后，用电泳(Advance公司制、“Mupid-ex”)进行扩增产物的确认，结果，观察到可以认为是非特异扩增的多个带。这表示AS-PCR扩增没有正常进行。因此，没有实施HPLC分析。
(参考例2)
参考例2中，进行UGT1A1*6区域的野生型76bp与变异型79bp的分离检测。
除了将洗脱液B中添加的盐设定为氯化钠来代替胍盐酸盐之外，与实施例1同样操作，使用阴离子交换色谱柱2，进行HPLC分析。
实施例1中，将分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp与变异型79bp而得到的色谱图示于图1(使用阴离子交换色谱柱1的情况)和图2(使用阴离子交换色谱柱2的情况)。由图1、2的结果可知，两色谱柱均能够良好地分离检测通过AS-PCR扩增的UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp。特别是使用阴离子交换色谱柱1的情况下，能够在短时间内基本完全分离检测。
参考例1中，将分离检测UGT1A1*6区域的野生型271bp和变异型274bp而得到的色谱图示于图3(使用阴离子交换色谱柱1的情况)和图4(使用阴离子交换色谱柱2的情况)。由图3、4的结果可知，与实施例1对照，无法分离通过AS-PCR扩增的UGT1A1*6区域的野生型271bp与变异型274bp。这可以认为是由于，相对于AS-PCR扩增产物的尺寸，野生型与变异型的链长差小。
参考例2中，将使用阴离子交换色谱柱2分离检测UGT1A1*6区域的野生型76bp和变异型79bp而得到的色谱图示于图5。在洗脱液B中添加氯化钠代替胍盐酸盐时，无法分离野生型76bp与变异型79bp。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供用于迅速并且简便的单核苷酸多态性的检测方法的单核苷酸多态性检测用的试样核酸。另外，根据本发明，能够提供单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物以及用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法。
Figure IDA0000386178330000011
Figure IDA0000386178330000021

Claims (5)

1.一种单核苷酸多态性检测用的试样核酸，其具有下述(a)～(c)的特性，
(a)总链长为200bp以下；
(b)在5’末端、3’末端中的任意一个末端具有与模板DNA不完全互补的序列，该序列为标识序列；
(c)与要比较单核苷酸多态性的有无的试样核酸的链长差为10bp以下。
2.根据权利要求1所述的试样核酸，其中，(d)标识序列的链长为10bp以下。
3.根据权利要求1或2所述的试样核酸，其用于离子交换色谱法分析。
4.一种单核苷酸多态性检测试样制备用的PCR引物，其具有下述(a)～(c)的特性，
(a)在用于AS-PCR法的情况下，复制总链长200bp以下的扩增产物；
(b)在5’末端具有与模板DNA不完全互补的序列，该序列为标识序列；
(c)标识序列的链长为10bp以下。
5.一种用于离子交换色谱法分析的单核苷酸多态性检测用试样的制备方法，其特征在于，使用权利要求4所述的PCR引物。
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