CN101864492A - 用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液A、内参体系PCR反应液B、Taq酶、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：检测体系PCR反应液A包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、检测用上下游引物B27F/B27R和探针B27-Allglo；其中，B27F：GGGTCTCACA CCCTCCAGAAT；B27R：CGGCGGTCCAGGAGCT；B27-Allglo：MAR-TACCACC AGGACGCCTAC-MAR；内参体系PCR反应液B包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、参照用上下游引物IPCF/IPCR和探针IPC-P；其中，IPCF：GAAGGTGAAGGTCG GAGTC；IPCR：AGATGGTGATGGGATTTC；IPCP：FAM-CAAGCTTCCCGTT CTCAGCC-BHQ。本发明将实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于HLA-B27基因检测，能对与强直性脊柱炎相关的HLA-B27基因亚型进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单、快速。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种临床检验用途的基因检测试剂盒，采用实时荧光PCR技术，能对人类白细胞抗原B27(HLA-B27)基因进行检测，特异性好，灵敏度高。
背景技术
强直性脊柱炎AS是一种不同于类风湿性关节炎的独立疾病，主要影响中轴，骶髂关节受累是本病重要标志，临床表现以腰部疼痛、僵直不适为常见症状，同时可累及眼、肺、心血管、肾等多个器官及其他组织的慢性进展性自身免疫性疾病，类风湿因子阴性。该疾病的诊断主要依据临床症状和放射线检查，但早期由于受累关节未发生明显改变，容易漏诊或误诊，一般患者要在发病后7年左右才能被诊断，故早期诊断成为争取其良好预后的关键。
20世纪70年代研究发现，HLA-B27与AS呈强相关，在普通人群中，HLA-B27阳性率约为4％，而在AS患者中却高达90％。在我国AS发病率约为0.3％，据有关文献分析，如果一位患者根据临床资料诊断为AS的概率为50％，在检出HLA-B27基因时则可提高至93％。因此，检测HLA-B27对AS的早期诊断的预防具有重要意义。此外，HLA-B27阳性者患AS的概率是阴性者的200-300倍，因此认为HLA-B27可作为AS的筛选方法。
在临床实验室中，目前检测HLA-B27的常用方法有微量淋巴细胞毒技术、流式细胞技术等。流式细胞技术比微量淋巴细胞毒技术简便快捷、自动化程度高，结果判断客观性强，因而更为可靠。但是流式细胞技术仍然存在以下缺点：1)标本要求新鲜，不能长期保存，不利于进行实验室间质量评价。2)其方法原理基于抗原抗体结合反应，而HLA-B27的单克隆抗体不同程度与其它HLA-B等位基因产物发生交叉反应，其中以HLA-B7的交叉最多见，会出现假阳性结果。近年来随着分子生物学技术的发展，对HLA-B27的检测已进入到基因水平，基因检测是一种很有发展前途的方法。如目前国内外广泛应用的SSP-PCR B27等位基因检测技术，可直接对B27基因进行检测，准确、特异，且能对B27的亚型进行分型。但其技术要求较高，操作复杂，耗时约4h，不利于实验室高通量的筛查和推广。
实时荧光PCR(real-time PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃。其以特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，成为分子生物学和分子诊断的重要技术平台，并广泛应用于遗传病、病原体和肿瘤等方面的检测和诊断。如：使用dsDNA结合染料SYBR Green I，结合融解曲线分析对α-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊断。使用双色荧光标记探针，结合不同的引物设计，可以实现唐氏综合征的筛查。在病原体检测方面，实时荧光PCR技术已应用于肝病、性病以及人类免疫缺陷病毒(HIV)等的临床诊断。而在肿瘤诊断方面，实时荧光PCR技术正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备工具。
发明内容
鉴于现有技术中检测HLA-B27方法的不足，本发明将实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于HLA-B27基因检测，开发了一种用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒：
用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液A、内参体系PCR反应液B、Taq酶、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：
检测体系PCR反应液A包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物B27F/B27R和探针B27-Allglo；其中，
B27F：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT
B27R：CGGCGGTCCAGGAGCT
B27-Allglo：MAR-TACCACCAGGACGCCTAC-MAR
内参体系PCR反应液B包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、参照用上下游引物IPCF/IPCR和探针IPC-P；其中，
IPCF：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
IPCR：AGATGGTGATGGGATTTC
IPCP：FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-BHQ。
根据HLA-B27各个亚型的序列差异，本发明试剂盒设计的检测用上下游引物B27F/B27R和探针B27-Allglo分别为：
B27F：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT
B27R：CGGCGGTCCAGGAGCT
B27-Allglo：MAR-TACCACCAGGACGCCTAC-MAR
上游引物B27F不能扩增下列亚型：HLA-B2707、B2711、B2714、B2719、B2721、B2724、B2730、B2732、B2733、B2734；下游引物B27R不能扩增下列亚型：HLA-B2707、B2711、B2720、B2724、B2734、B2736；因探针B27-Allglo的特异性，检测不到下列亚型：HLA-B2706、B2707、B2711、B2720、B2721、B2724、B2727、B2733、B2734、B2735、B2741。研究发现，上述不能扩增的亚型与强直性脊柱炎无关。
而与强直性脊柱炎呈强相关的亚型：B2701、B2702、B2703、B2704、B2705、B2708、B2709、B2710、B2712、B2713、B2715、B2716、B2717、B2718、B2722、B2723、B2725、B2726、B2728、B2729、B2731、B2737、B2738、B2739、B2740、B2742，通过本发明试剂盒检测用上下游引物及探针的特异性，均可检测到，尤其是其中的B2704、B2705(中国人群中最为多见)、B2702、B2701、B2703、B2708、B2714、B2715、B2710亚型。
进一步地，所述的DNA提取液为含有5％(W/V)Chelex、10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)。其中，百分比指的是重量与体积百分浓度。
所述阳性对照品为含有HLA-B27基因组的溶液；所述阴性对照品为无HLA-B27基因组的溶液。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合Allglo探针应用于HLA-B27基因检测，是一种新型的用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒。由于引物和探针的特异性，能对与强直性脊柱炎相关的HLA-B27基因亚型进行检测，特异性好，灵敏度高，操作简单、快速，可用于临床作为强直性脊柱炎早期预防、早期诊断的辅助性指标及高危人群的筛选。
用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒
附图说明
图1是使用核酸检测试剂盒检测样品1的结果图
图2是使用核酸检测试剂盒检测样品2的结果图
具体实施方式
实施例1
本发明的用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，包括：
红细胞裂解液；
DNA提取液：Tris-HCl pH 8.0、Chelex(5％)、SDS(0.01％)
检测体系PCR反应液A：PCR Buffer(1×)、d NTP(0.2mM)、Mg2+(4mM)、B27F/B27R各0.3uM、B27-Allglo(探针)0.2uM；其中B27F为：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT；B27R为：CGGCGGTCCAGGAGCT；B27-Allglo为：MAR-TACCACCAGGACGCCTAC-MAR；
内参体系PCR反应液B：PCR Buffer(1×)、dNTP(0.2mM)、Mg2+(4mM)、IPCF/IPCR各0.2uM、IPC-P(探针)0.1uM；其中IPCF为：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC；IPCR为：AGATGGTGATGGGATTTC；IPCP为：FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-BHQ；
Taq酶：HotStar DNA Taq(5U/ul)；
阳性对照品：含HLA-B27基因组溶液；
阴性对照品：不含HLA-B27基因组溶液。
实施例2
本发明试剂盒的使用方法：
(1)人基因组提取：取1.5ml离心管，加入1ml红细胞裂解液+500ul全血，混匀室温放置10min；5000rpm，4℃离心5min，用红细胞裂解液洗涤一次；加DNA提取液100ul，混匀后100℃干浴10min；12000rpm，4℃离心10min，上清待用；
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液A和内参体系PCR反应液B各X ul，每人份18ul分装：
X＝(17.8ul反应液A/B+0.2ul HotStar DNA Taq)×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(3)加样：一份标本同时加入检测体系PCR反应液A(检测B27)和内参体系PCR反应液B(内参)各2ul；阳性对照和阴性对照直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2ul生理盐水或不加任何物质。
(4)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min 40个循环，荧光信号于60℃1min时采集。
(5)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统自动计算出CT值。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：CT值＞38的为阴性，CT值＜36的为阳性。CT值在36-38之间的需要复查，结果CT值仍然在36-38之间的为阳性，否则为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
取已知临床检测HLA-B27结果(采用流式细胞技术)的全血标本45份，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份标本同时加入检测体系PCR反应液A和内参体系PCR反应液B各2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测45份样品，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间仅为100分钟。结果如下表：
45份标本中，人类白细胞抗原B27结果阳性18份，阴性27份。通过HLA-B27核酸检测试剂盒，用荧光PCR检测技术检测的结果与流式细胞技术检测的结果完全一致。
实施例4
临床标本比对试验
取待检的临床标本229例，分别采用用本发明核酸检测试剂盒进行荧光PCR检测和流式细胞术检测，结果如下表：
标本例数 流式细胞技术检测结果 核酸检测试剂盒检测结果
93 阳性 阳性
2 弱阳性 阴性
3 阴性 阳性(其中两例为弱阳性)
131 阴性 阴性
HLA-B27核酸检测试剂盒(荧光PCR技术)检测结果和流式细胞术检测结果符合率达97.8％。结果不符的5例均为结果较难判断的弱阳性。
说明本发明核酸检测试剂盒不但检测结果易于判断，而且准确性高。
实施例5临床样品检测
取待检的临床样品1和样品2，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品同时加入检测体系PCR反应液A和内参体系PCR反应液B各2ul。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用荧光PCR仪检测，时间为100分钟。
样品1的检测结果图如图1所示，内参基因GAPDH的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品1的CT值＜36之前有扩增信号，所以样品1为阳性。
样品2的检测结果图如图2所示，内参基因GAPDH的扩增信号显示被检样本基因组提取成功，检测结果有效，样品2的CT值＞38之后无扩增信号，所以样品2为阴性。
序列表
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒
<130>
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gggtctcaca ccctccagaa t 21
<210>2
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<212>DNA
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cggcggtcca ggagct 16
<210>3
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
taccaccagg acgcctac 18
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<400>6
caagcttccc gttctcagcc 20
Claims (3)
1.用于强直性脊柱炎辅助诊断的核酸检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液A、内参体系PCR反应液B、Taq酶、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于：
检测体系PCR反应液A包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、检测用上下游引物B27F/B27R和探针B27-Allglo；其中，
B27F：GGGTCTCACACCCTCCAGAAT
B27R：CGGCGGTCCAGGAGCT
B27-Allglo：MAR-TACCACCAGGACGCCTAC-MAR
内参体系PCR反应液B包括PCR缓冲液、d NTP、Mg2+、参照用上下游引物IPCF/IPCR和探针IPC-P；其中，
IPCF：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
IPCR：AGATGGTGATGGGATTTC
IPCP：FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-BHQ。
2.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于所述的DNA提取液为含有5％(W/V)Chelex、10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)。
3.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照品为含有HLA-B27基因组的溶液；所述阴性对照品为无HLA-B27基因组的溶液。
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