CN102443625A - 一种快速检测人白细胞抗原b27的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速检测人白细胞抗原B27(HLA-B27)的方法及体外诊断试剂盒，属于医学生物技术领域。该试剂盒采用用一对HLA-B27特异性引物和一条特异性荧光探针快速检测HLA-B27。本试剂盒运用1对HLA-B27特异性引物和1条特异性荧光探针能快速准确检测人外周血等样本中的HLA-B27基因，具有特异性强、敏感性高、省时、省力、成本低廉和高通量等优点，可用于临床强直性脊柱炎、Reiter综合症、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎伴关节病、急性前葡萄膜炎等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明属临床医学生物检测技术领域，具体涉及一种快速人白细胞抗原B27(HLA-B27)的试剂盒及检测方法。
背景技术
在组织或器官移植中，供者与受者之间相容(不排斥)还是不相容(排斥)都是由它们组织特异性所决定的。这种代表个体特异性的组织抗原称组织相容性抗原，一套这样的抗原系统称主要组织相容性系统(major histocompatibility system，MHS)。编码MHS的基因群称为主要组织相容性复合体MHC即指某一染色体上一群紧密连锁的基因群。
人的MHC就称人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，HLA作为抗原研究时，称HLA抗原系统；HLA作为基因研究时称HLA复合体，它位于第6号染色体短臂上6p21.3，全长4000kb。它是为200个以上基因座位组成的基因复合体；是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体；其多态性与疾病的遗传易感性有明显关系。HLA有I类、II类和III类基因，HLA-B是I类HLA的三个位点(HLA-A、HLA-B、HLA-C)之一。
HLA-B27是位于人第6号染色体HLA基因B座位的一个等位基因。强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者HLA-B27阳性率高达94％，而正常人群仅为9％。对疑似AS患者进行HLA-B27检测，已成为临床重要的辅助诊断手段。目前HLA-B27检测手段主要有血清学方法如微量淋巴细胞毒试验(CDC)、流式细胞仪检测、ELISA法、引物特异性聚合酶链反应(SSP-PCR)等。传统的血清学方法，由于很难获得高质量单价抗血清，单份血清很容易漏检或出现假阳性，而采用多份血清又常常会遇到部分血清阳性时难以判断结果的现象。ELISA法操作繁琐，费时，不利于大批量临床标本检测；流式细胞仪检测具有较高的灵敏度和特异性，但需要配置流式细胞仪，硬件需求高，且检测结果受标本的质量、抗体的效价影响，容易产生假阳性或假阴性。SSP-PCR灵敏度和特异性均较好，但产物需电泳，操作繁琐，且也有一定的假阳性或假阴性。
实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 简称Real Time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定量的方法，分染料法和探针法两类检测方法。探针法实时荧光定量PCR在特异性引物的基础上加入了一条与目的基因特异性匹配的探针(带有荧光基团)，能显著提高检测的特异性，是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前已有多种运用探针法定量PCR技术的试剂盒应用于临床疾病相关的病原体检测、基因分型、突变研究等。
本试剂盒通过设计与HLA-B27基因完全匹配的1对特异性引物和1条Taqman水解荧光探针，用于快速准确的检测HLA-B27基因。该方法相比目前应用于临床的其它方法，具有特异性强、敏感性高、省时、省力、成本低廉及高通量等优点，可快速准确的检测患者HLA-B27基因阴阳性，用于临床强直性脊柱炎、Reiter综合症、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎伴关节病、急性前葡萄膜炎等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病的辅助诊断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种HLA-B27快速检测的试剂盒。
本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种HLA-B27快速检测的试剂盒，它包括：
(1)1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)1条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；
在一次检测中共同使用。
上述HLA-B27快速检测的试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取液A：0.32M蔗糖，10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl2，0.1％(v/v)Triton X-100，室温保存；
(2)DNA提取液B：30mM Tricine pH 8.5，210mM辛酸钠，2.5％(m/v)Chelex-100，-20℃保存；
(3)PCR反应液：0.2μM引物对SEQ ID NO：1和2，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：3，30mM Tricine pH 8.9，0.05％(v/v)Tween-20，0.01％(m/v)明胶，0.03％(m/v)BSA，6.5mM MgCl2，-20℃保存；
(4)5U/μlTaq DNA聚合酶，-20℃保存；
(5)阳性对照品100ng/μl，-20℃保存；
(6)阴性对照品100ng/μl，-20℃保存。
一种HLA-B27快速检测的试剂盒，它包括上述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：
(1)1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示引物对；
(2)1条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；
在一次检测中共同使用。
上述HLA-B27快速检测的试剂盒，具体包括如下试剂：
(1)DNA提取液A：0.32M蔗糖，10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl2，0.1％(v/v)Triton X-100，室温保存；
(2)DNA提取液B：30mM Tricine pH 8.5，210mM辛酸钠，2.5％(m/v)Chelex-100，-20℃保存；
(3)PCR反应液：0.2μM引物对SEQ ID NO：4和5，0.04μM荧光探针SEQ IDNO：6，30mM Tricine pH 8.9，0.05％(v/v)Tween-20，0.01％(m/v)明胶，0.03％(m/v)BSA，6.5mM MgCl2，-20℃保存；
(4)5U/μlTaq DNA聚合酶，-20℃保存；
(5)阳性对照品100ng/μl，-20℃保存；
(6)阴性对照品100ng/μl，-20℃保存。
上述HLA-B27快速检测的检测方法包括如下步骤：
(1)提取外周血人基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用特异性引物和荧光探针进行HLA-B27的检测；
(3)参考阴阳性对照品，得出临床标本HLA-B27结果。
步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测体系为：PCR反应液(0.2μM引物对SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：3，30mM Tricine pH 8.9，0.05％(v/v)Tween-20，0.01％(m/v)明胶，0.03％(m/v)BSA，6.5mM MgCl2)22.7μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，DNA模板2μl；PCR扩增程序为：94℃3分钟，94℃ 20秒，61℃40秒，40个循环。荧光采集点在61℃，检测模式设置为单色杂交探针，反应体积设置为25。或者将SEQ ID NO：4替换上述SEQ ID NO：1，将SEQ ID NO：5替换上述SEQ ID NO：2，同时将SEQ ID NO：6替换上述SEQ ID NO：3，其它条件相同。
有益效果：本试剂盒运用1对HLA-B27特异性引物和1条特异性荧光探针能快速准确的检测人外周血等样本中的HLA-B27基因，具有特异性强、敏感性高、省时、省力、成本低廉和高通量等优点，可用于临床强直性脊柱炎、Reiter综合症、银屑病性关节炎、溃疡性结肠炎伴关节病、急性前葡萄膜炎等许多严重危害人类健康的脊柱性关节病的辅助诊断。
附图说明
图1为阳性对照品检测结果图，Ct值为23.67，。
图2为阴性对照品检测结果图，Ct值为大于40。
图3为1例患者HLA-B27基因检测结果图，阳性对照品Ct值为23.67，阴性对照品Ct值为大于40，体系合格；患者标本号“sample 50”，Ct值为22.74，结果为HLA-B27基因阳性。
图4为1例患者HLA-B27基因检测结果图，阳性对照品Ct值为23.67，阴性对照品Ct值为大于40，体系合格；患者标本号“sample 55”，Ct值为大于40，结果为HLA-B27基因阴性。
图中英文字母对应的中文名称为：cycles：循环数；Fluorescence：荧光值；mplification Curves：扩增曲线；select：选择；Zoom：放大。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：检测HLA-B27的引物和探针序列。
委托上海英骏生物技术有限公司合成：
SEQ ID NO：1 5′-GGGTCTCACACCCTCCAGAAT-3′
SEQ ID NO：2 5′-CGGCGGTCCAGGAGCT-3′
SEQ ID NO：3 5′-FAM-CGTTCAGGGCGATGTAATCCTTGC-TAMRA-3′
SEQ ID NO：4 5′-ATTCTGGAGGGTGTGAGACCC-3′
SEQ ID NO：5 5′-AGCTCCTGGACCGCCG-3′
SEQ ID NO：6 5′-FAM-GCAAGGATTACATCGCCCTGAACG-TAMRA-3′
实施例2：试剂盒的制备方法。
(1)DNA提取液A：
0.32M蔗糖(购于美国Sigma公司)，10mM Tris-HCl pH 7.5(购于美国Sigma公司)，5mM MgCl2(购于美国Sigma公司)，0.1％(v/v)Triton X-100(购于美国Sigma公司)；
(2)DNA提取液B：
30mM Tricine pH 8.5(购于美国Sigma公司)，210mM辛酸钠(购于美国Sigma公司)，2.5％(m/v)Chelex-100(购于美国Bio-rad公司)；
(3)PCR反应液：
0.2μM引物对SEQ ID NO：1和2(或SEQ ID NO：4和5)，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：3(或SEQ ID NO：6)，30mM pH 8.9Tricine(购于美国Sigma公司)，0.05％(v/v)Tween-20(购于美国Sigma公司)，0.01％(m/v)明胶(购于美国Sigma公司)，0.03％(m/v)BSA(购于美国Sigma公司)，6.5mM MgCl2(购于美国Sigma公司)；
(4)5U/μlTaq DNA聚合酶(购于美国Fermentas公司)，-20℃保存；
(5)阳性对照品100ng/μl，HLA-B27阳性患者外周血提取DNA后定量；
(6)阴性对照品100ng/μl，HLA-B27阴性患者外周血提取DNA后定量。
实施例3：检测方法。
仪器：Roche 荧光定量PCR检测仪，BECKMAN 
22R台式微量冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司WH-866型涡旋振荡器。
(1)提取外周血人基因组DNA，具体包括如下步骤：
(1a)用无菌注射针头采3ml静脉血于含EDTA-K2的密闭无菌玻璃管中，轻轻混匀，3000rpm离心5min，吸取300ul中间的白细胞层及1ml DNA提取液A加到1.5ml离心管中，混合均匀，于室温下孵育3-10min(在此期间翻转离心管10次)，让其红细胞破坏，液体呈透明。
(1b)13000rpm离心30s，小心吸弃上清液，留下可见的白细胞沉淀层。加入500ulDNA提取液A，颠倒混匀10次。
(1c)13000rpm离心30s，小心吸弃上清液及残留的血红蛋白，留下可见的白细胞沉淀层，加入500ul生理盐水，颠倒混匀10次。
(1d)13000rpm离心30s，小心吸弃上清液及残留的血红蛋白，留下的白细胞沉淀 中加入50ul DNA提取液B，2400rpm涡旋震荡15s混匀。
(1e)100℃煮沸10min，13,000rpm离心5min，上清作为PCR反应模板备用。(2)以步骤(1)所得基因组DNA为模板，利用1对特异性引物和1条特异性荧光探针进行HLA-B27基因的荧光检测，具体包括如下步骤；
(2a)试剂配制：从-20℃冰箱取出HLA-B27PCR反应液，室温融化，放冰盒上备用。加样前10分钟之内，按比例(HLA-B27PCR反应液22.7ul/人份+Taq酶0.3ul/人份)取PCR反应液和Taq酶，振荡混匀后，2000rpm离心5秒，按23ul/人份分装到PCR反应管中(反应管要求放冰上)，传至样本制备区备用。
(2b)加样：向准备好试剂的反应管中，分别加入处理后的样本模板2ul(若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm离心5min)，阴阳性对照品直接加入2ul，加样过程要求冰上操作。贴好封口膜或盖好管盖，3000rpm离心30秒，放入仪器进样槽。
(2c)PCR扩增：Roche 
荧光定量PCR仪进行HLA-B27基因检测，程序设计如下：94℃3分钟，94℃20秒→61℃40秒→40个循环。荧光采集点在61℃，检测模式设置为单色杂交探针，反应体积设置为25。保存文件，运行。
(2d)结果分析，具体包括如下步骤：
Roche 
荧光PCR检测仪点击分析，选取定量模式，进入分析窗口，选定噪音线项，阈值设定为刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点(可根据实际情况适当调整)，且阳性曲线无拐点，保证噪音线项下的数值和分析项下的域值一致。点击计算，自动计算得到每个测试的CT值。
(2e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：
阴性对照品PCR扩增的Ct值应无数值且增长曲线不规则；阳性对照品PCR扩增增长曲线呈S型曲线且CT值小于35。
(3)步骤(2)所得的临床样本HLA-B27基因检测结果判断，具体按照如下标准：
(3a)如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判样本HLA-B27为阴性。
(3b)如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜40，则按以下方法判断：
若样本的CT＜30，则判样本HLA-B27为阳性；
检测样本Ct≥30，重新提取样本进行PCR扩增。提取时要注意白细胞沉淀是否够多(要能肉眼看见离心管底白色块状沉淀)，复查结果如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值为空白，则判样本HLA-B27为阴性。如果增长曲线呈S型曲线判样本HLA-B27为阳性。
将本发明所述的试剂盒及方法用于96例临床疑似AS患者HLA-B27基因快速检测， 检测结果与流式细胞仪检测结合SSP-PCR进行比对，检测结果如下表：
| 样本号 | 采用本试剂盒检测结果 | 采用流式细胞仪检测结果 |
| 1 | 阴性 | 阴性 |
| 2 | 阴性 | 阴性 |
| 3 | 阴性 | 阴性 |
| 4 | 阴性 | 阴性 |
| 5 | 阴性 | 阴性 |
| 6 | 阴性 | 阴性 |
| 7 | 阴性 | 阴性 |
| 8 | 阴性 | 阴性 |
| 9 | 阴性 | 阴性 |
| 10 | 阴性 | 阴性 |
| 11 | 阳性 | 阳性 |
| 12 | 阳性 | 阳性 |
| 13 | 阳性 | 阳性 |
| 14 | 阳性 | 阳性 |
| 15 | 阳性 | 阳性 |
| 16 | 阳性 | 阳性 |
| 17 | 阳性 | 阳性 |
| 18 | 阳性 | 阳性 |
| 19 | 阳性 | 阳性 |
| 20 | 阳性 | 阳性 |
| 21 | 阳性 | 阳性 |
| 22 | 阳性 | 阳性 |
| 23 | 阳性 | 阳性 |
| 24 | 阳性 | 阳性 |
| 25 | 阳性 | 阳性 |
| 26 | 阳性 | 阳性 |
| 27 | 阳性 | 阳性 |
| 28 | 阳性 | 阳性 |
| 29 | 阳性 | 阳性 |
| 30 | 阳性 | 阳性 |
| 31 | 阳性 | 阳性 |
| 32 | 阳性 | 阳性 |
| 33 | 阳性 | 阳性 |
| 34 | 阳性 | 阳性 |
| 35 | 阳性 | 阳性 |
| 36 | 阳性 | 阳性 |
| 37 | 阳性 | 阳性 |
| 38 | 阳性 | 阳性 |
[0084]
| 39 | 阳性 | 阳性 |
| 40 | 阳性 | 阳性 |
| 41 | 阳性 | 阳性 |
| 42 | 阳性 | 阳性 |
| 43 | 阳性 | 阳性 |
| 44 | 阳性 | 阳性 |
| 45 | 阳性 | 阳性 |
| 46 | 阳性 | 阳性 |
| 47 | 阳性 | 阳性 |
| 48 | 阳性 | 阳性 |
| 49 | 阳性 | 阳性 |
| 50 | 阳性 | 阳性 |
| 51 | 阳性 | 阳性 |
| 52 | 阳性 | 阳性 |
| 53 | 阳性 | 阳性 |
| 54 | 阳性 | 阳性 |
| 55 | 阳性 | 阳性 |
| 56 | 阳性 | 阳性 |
| 57 | 阳性 | 阳性 |
| 58 | 阳性 | 阳性 |
| 59 | 阳性 | 阳性 |
| 60 | 阳性 | 阳性 |
| 61 | 阳性 | 阳性 |
| 62 | 阳性 | 阳性 |
| 63 | 阳性 | 阳性 |
| 64 | 阳性 | 阳性 |
| 65 | 阳性 | 阳性 |
| 66 | 阳性 | 阳性 |
| 67 | 阳性 | 阳性 |
| 68 | 阳性 | 阳性 |
| 69 | 阳性 | 阳性 |
| 70 | 阳性 | 阳性 |
| 71 | 阳性 | 阳性 |
| 72 | 阳性 | 阳性 |
| 73 | 阳性 | 阳性 |
| 74 | 阳性 | 阳性 |
| 75 | 阳性 | 阳性 |
| 76 | 阳性 | 阳性 |
| 77 | 阳性 | 阳性 |
| 78 | 阳性 | 阳性 |
| 79 | 阳性 | 阳性 |
[0085]
| 80 | 阳性 | 阳性 |
| 81 | 阳性 | 阳性 |
| 82 | 阳性 | 阳性 |
| 83 | 阳性 | 阳性 |
| 84 | 阳性 | 阳性 |
| 85 | 阳性 | 阳性 |
| 86 | 阳性 | 阳性 |
| 87 | 阳性 | 阳性 |
| 88 | 阳性 | 阳性 |
| 89 | 阳性 | 阳性 |
| 90 | 阳性 | 阳性 |
| 91 | 阳性 | 阳性 |
| 92 | 阳性 | 阳性 |
| 93 | 阳性 | 阳性 |
| 94 | 阳性 | 阳性 |
| 95 | 阳性 | 阴性 |
| 96 | 阳性 | 阴性 |
96例中：94例标本用两种方法检测的检测结果一致，其中10例阴性和84例阳性，符合率为97.9％；2例标本用两种方法检测的检测结果不一致，流式细胞仪检测为HLA-B27阴性，而本试剂盒检测为HLA-B27阳性，该结果不一致的2例标本经ABI测序验证，均为HLA-B27等位基因。由于流式细胞仪检测易受标本质量(如标本保存时间过长等)、抗体效价的影响，故导致假阴性。本试剂盒及HLA-B27快速检测方法操作简便，结果准确，可快速、灵敏、特异的检测HLA-B27等位基因。
序列表
Claims (7)
1.一种快速检测人白细胞抗原B27的试剂盒，其特征在于它包括：
(1)1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对；
(2)1条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；
(1)所述的引物对和(2)所述的特异性荧光探针在一次检测中共同使用。
2.根据权利要求1所述的快速检测人白细胞抗原B27的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取液A：0.32M蔗糖，10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl2，0.1％(v/v)Triton X-100，室温保存；
(2)DNA提取液B：30mM Tricine pH 8.5，210mM辛酸钠，2.5％(m/v)Chelex-100，-20℃保存；
(3)PCR反应液：0.2μM引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：3，30mM Tricine pH 8.9，0.05％(v/v)Tween-20，0.01％(m/v)明胶，0.03％(m/v)BSA，6.5mM MgCl2，-20℃保存；
(4)5U/μlTaq DNA聚合酶，-20℃保存；
(5)阳性对照品100ng/μl，-20℃保存；
(6)阴性对照品100ng/μl，-20℃保存。
3.一种快速检测人白细胞抗原B27的试剂盒，其特征在于它包括权利要求1所述的所有核苷酸序列的碱基互补序列，也就是包括：
(1)1对扩增HLA-B27的特异性引物，其特征在于如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示引物对；
(2)1条HLA-B27特异性荧光探针，其特征在于如SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，在其5’端标记荧光报告基团FAM，在其3’端标记荧光淬灭基团TAMRA；
(1)所述的引物对和(2)所述的特异性荧光探针在一次检测中共同使用。
4.根据权利要求3所述的快速检测人白细胞抗原B27的试剂盒，其特征在于它包括如下试剂：
(1)DNA提取液A：0.32M蔗糖，10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM MgCl2，0.1％(v/v)Triton X-100，室温保存；
(2)DNA提取液B：30mM Tricine pH 8.5，210mM辛酸钠，2.5％(m/v)Chelex-100，-20℃保存；
(3)PCR反应液：0.2μM引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：6，30mM Tricine pH 8.9，0.05％(v/v)Tween-20，0.01％(m/v)明胶，0.03％(m/v)BSA，6.5mM MgCl2，-20℃保存；
(4)5U/μlTaq DNA聚合酶，-20℃保存；
(5)阳性对照品100ng/μl，-20℃保存；
(6)阴性对照品100ng/μl，-20℃保存。
5.一种快速检测人白细胞抗原B27的方法，其特征在于它包括如下步骤：
(1)提取外周血人基因组DNA；
(2)以步骤(1)所得DNA为模板，利用特异性引物和荧光探针进行HLA-B27的荧光定量PCR检测；
(3)参考阴阳性对照品，得出临床标本HLA-B27结果。
6.根据权利要求5所述的快速检测人白细胞抗原B27的方法，其特征在于步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测的检测体系为：
PCR反应液22.7μl：0.2μM引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：3，30mM Tricine pH 8.9，0.05％v/v Tween-20，0.01％m/v明胶，0.03％m/v BSA，6.5mM MgCl2，
5U/μl的Taq DNA聚合酶0.3μl，
DNA模板2μl；
PCR扩增程序为：94℃3分钟，94℃20秒，61℃40秒，40个循环。
7.根据权利要求5所述的快速检测人白细胞抗原B27的方法，其特征在于步骤(2)中所述的荧光定量PCR检测体系为：
PCR反应液22.7μl：0.2μM引物对SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，0.04μM荧光探针SEQ ID NO：6，30mM Tricine pH 8.9，0.05％v/v Tween-20，0.01％m/v明胶，0.03％m/v BSA，6.5mM MgCl2，
5U/μlTaq DNA聚合酶0.3μl，
DNA模板2μl；
PCR扩增程序为：94℃3分钟，94℃20秒，61℃40秒，40个循环。
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