CN108486226A - Hla-b27等位基因的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HLA‑B27等位基因的检测试剂盒及其应用；本发明试剂盒包括检测HLA‑B27等位基因的qPCR引物和探针，使用本发明引物和探针克服了现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA‑B27等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定的不足。本发明试剂盒使用简单、准确性高、过程可监控、结果快速，而且无电泳过程，有利于临床的推广及普及。

Description

HLA-B27等位基因的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及HLA-B27等位基因的检测试剂盒及其应用。

背景技术

强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一种主要累及脊柱、中轴骨及四肢大关节，以椎间盘纤维环及其结缔组织纤维化和骨融合及关节强直为病变特点的慢性自身免疫性疾病。以脊柱炎为主要病变者称为原发性AS，伴发反应性关节炎、银屑病、炎症性肠病等则称为继发性AS。本病的标志性特点是从骶髂关节炎开始，逐渐蔓延到脊柱和脊柱旁软组织。AS常具有遗传性，可致畸，对患者寿命无明显影响。AS为散发性疾病，其发病率在人种及地域上有轻微差异。欧洲约为0.05％～0.2％，美国为0.13％～0.22％，日本约为0.05％～0.2％，在我国约为03.％～0.40％。临床男女性患者比例约4:1，主要由于男性发病症状往往比较严重，导致临床上看到男性患者居多。强直性脊柱炎的多累及青壮年，发病年龄通常在13～3l岁，AS患者的平均年龄为29.4岁。在所有的腰背痛中，5％～10％的病因是强直性脊柱炎。AS早期没有典型的影像学改变，发病不明显，又常见腰背腿痛，在临床上往往与其他的腰腿痛相模糊。增加了临床上误诊和漏诊的几率，这就使得AS患者从发现症状到确诊疾病通常在5～6年以上。

目前尚无评价AS病情活动期检测的金标准，而常用于评价AS病情活动度的指标[如血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、强直性脊柱炎病情活动指数(BASDAI)等]有诸多局限性。AS治疗方案有限且有别于其他关节疾病，非甾体类抗炎药(NSAIDs)、物理治疗和肿瘤坏死因子(TNF)-α阻断剂是少数几种可以改善AS的治疗方案。AS发病年龄平均为28岁，如果治疗不及时很容易造成终生残疾。因此对关节疾病进行早期诊断是非常有意义的。

AS主要诊断指标为骶髂关节炎x线改变结合临床表现，但影像学诊断标准过于严格，常有漏诊。从而导致病人错失最佳治疗时机，预后不佳。

CT具有较高的分辨率，能够对AS骶髂关节病变进行较准确的分级，是诊断AS骶髂关节病变的主要检查方法，但是辐射较大；MRI能够显示脂肪沉积、关节软骨异常及骨髓水肿等改变，可作为AS骶髂关节病变的早期诊断方法，骶髂关节CT检测结果可为强脊炎各个时期临床分期的重要依据来源。目前大多数学者认为AS是多基因遗传病，而HLA-B27检测结果与骶髂关节CT高度契合，显著性差异，因此，HLA-B27可作为AS早期诊断指标，通过HLA-B27可助于AS早期诊断。

人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)是人类主要组织相容性复合体的表达产物，是目前发现最复杂的多态系统。HLA-B27基因是具有高度多态性的HLA B座位上的一个等位基因，位于人类第6号染色体短臂上，为共显性遗传，属于I型MHC基因，截止到2014年，发现的等位基因数达到105个之多，在蛋白质水平层面，有38种亚型，表现为丰富的多态性。1973年，Eric Thorsby和Brewerton等人证明与AS相关。此后，HLA-B27作为诊断AS的特异性指标，在临床上得到了广泛的应用。国内学者报道的数据显示，亚洲的正常健康人群中HLA-B27基因携带率为5％-10％，AS患者中HLA-B27阳性率高达80％～95％以上，因此，HLA-B27基因是强直性脊柱炎的易感基因之一。学者研究发现AS并不是与所有HLA-B27亚型均存在相关性，而只是与其中某些亚型有高度相关性。2702、2704、2705亚型与AS的发生呈正相关，而2703、2707、2708、2709与AS的发生呈负相关。而2706与AS相关性仍存在争议，认为相关性不强或为保护性亚型。目前检测HLA-B27的方法学分为两大类，包括：

(1)抗原水平的血清学检测法，该方法又分为经典的微量淋巴细胞毒试验(Microlymphocytotoxicity text，MLCT)又称补体依赖细胞毒实验；ELISA法；流式细胞分析法。(2)基因水平的DNA分型技术，该方法又分为聚合酶链反应PCR-SSP法(Sequencespecific primer，SSP)；序列特异性寡核苷酸探针杂交PCR-SSO法(Sequence specificoligonucleotide，SSO)；实时荧光PCR技术；液相芯片技术；测序法(Sequence-basedtyping，SBT)。

荧光定量PCR方法(qPCR)由于其方法的便捷性，在HLA基因分型上有广泛的应用。特别是分析HLA-B27等位基因型，荧光定量PCR方法已经见于文献报道和其他的一些专利资料。由于HLA-B27等位基因序列的丰富性，现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA-B27等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定。

发明内容

本发明为了克服上述提到的qPCR方法中的缺陷，本发明提供一种HLA-B27等位基因的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测HLA-B27等位基因的以下PCR引物和探针：HLA-B27上游引物：5'-agtattgggaccgggaga-3'(SEQ ID NO:1)；HLA-B27下游引物：5'-gcctcgctctggttgt-3'(SEQ ID NO:2)；和HLA-B27探针序列：5'-gatctgcaargccaaggcaca-3'(SEQ ID NO:3)，简并碱基r表示a/g碱基。

在一些实施方式中，所述HLA-B27探针序列的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。

在一些实施方式中，所述扩增内参基因为ActB；ActB上游引物：5'-cctgccctcatttccctct-3'(SEQ ID NO:4)，ActB下游引物：5'-tctttgcggatgtccacgt-3'(SEQ ID NO:5)；和ActB探针的序列为：5'-tggcatccacgaaactacc-3'(SEQ ID NO:6)。

在一些实施方式中，所述ActB探针序列的荧光发光基团为HEX，荧光淬灭基团为MGB。

在一些实施方式中，所述检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为水，所述阳性对照为含有HLA-B27基因的人类基因组DNA溶液。

在一些实施方式中，本发明提供上述检测试剂盒在进行HLA-B27等位基因检测和/分型中的应用。

在一些实施方式中，本发明提供上述检测试剂盒所检测和/分型的HLA-B27基因型为B27-04和B27-05。

本发明是在对已知的HLA-B27序列进行大量分析和研究后，找出其相对保守序列，对差异性的碱基序列进行分析。另外，综合考虑中国人群中，2704、2705所占比例最高，并且与AS的发生呈正相关。在此基础上，本发明提供一条带有简并碱基的探针，在保证最低简并度的情况下，能最大范围检出HLA-B27基因型。本发明采用荧光PCR方法来进行HLA-B27等位基因有无的确定，采用荧光PCR法检测样本，可以根据扩增曲线的有无直接判读样本的阴阳性。

本发明试剂盒克服了现有的qPCR方法只能使用多条引物和探针才能把HLA-B27等位基因的序列覆盖全，导致qPCR反应体系复杂，结果不稳定的不足。本发明试剂盒使用简单、准确性高、过程可监控、结果快速，而且无电泳过程，利于临床的推广及普及。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是已有HLA-B27基因型的序列进行比对分析图；和

图2是本发明检出的HLA-B27阳性样本(图2a)和阴性样本(图2b)的荧光定量结果展示图；长散点线条表示HLA-B27探针；短散点线表示内参基因ActB探针。

具体实施方式

为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例一.已有HLA-B27基因型的序列比对分析

为克服上述提到的qPCR方法中的缺陷，本发明提供一条带有简并碱基的探针，并且在保证最低简并度的情况下，能最大范围检出HLA-B27基因型。对已知的HLA-B27序列进行分析后，找出其相对保守序列，对差异性的碱基序列进行分析，如图1所示。

综合考虑中国人群中，2704、2705所占比例最高，并且与AS的发生呈正相关，本发明检测HLA-B27的引物、探针，已经作为内参对照的ActB基因的引物探针见表1。

表1.HLA-B27基因和内参基因ActB的引物和探针序列

备注：B27探针上的简并碱基r表示a/g碱基

实施例二.样品HLA-B27阳性/阴性的检测

通过以下荧光定量PCR反应体系进行反应，qPCR反应体系使用北京康为世纪生物科技公司的产品，如表2，反应条件如表3。

表2.qPCR方法检测HLA-B27等位基因的反应体系

表3.qPCR反应条件

在荧光定量PCR仪器ABI7500上，检出HLA-B27阳性和阴性的荧光定量反应曲线图参见图2a和2b。

取20例通过Sanger测序方法确认的HLA-B27阳性，和20例HLA-B27阴性样本，用本发明所述方法进行检测，阳性和阴性结果为100％吻合。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

序列表

<110> 佛山市顺德区辉锦创兴生物医学科技有限公司

<120> HLA-B27等位基因的检测试剂盒及其应用

<130> PF18004

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtattggga ccgggaga 18

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcctcgctct ggttgt 16

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatctgcaar gccaaggcac a 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgccctca tttccctct 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctttgcgga tgtccacgt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tggcatccac gaaactacc 19

Claims (7)

1.HLA-B27等位基因的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测HLA-B27等位基因的以下PCR引物和探针：

HLA-B27上游引物：5'-agtattgggaccgggaga-3'；

HLA-B27下游引物：5'-gcctcgctctggttgt-3'；和

HLA-B27探针序列：5'-gatctgcaargccaaggcaca-3'，简并碱基r表示a/g碱基。

2.根据权利要求1中所述的检测试剂盒，所述HLA-B27探针序列的荧光发光基团为FAM，荧光淬灭基团为MGB。

3.根据权利要求1中所述的检测试剂盒，所述扩增内参基因为ActB；ActB上游引物：5'-cctgccctcatttccctct-3'，ActB下游引物：5'-tctttgcggatgtccacgt-3'；和ActB探针的序列为：5'-tggcatccacgaaactacc-3'。

4.根据权利要求3中所述的检测试剂盒，所述ActB探针序列的荧光发光基团为HEX，荧光淬灭基团为MGB。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照；所述阴性对照为水，所述阳性对照为含有HLA-B27基因的人类基因组DNA溶液。

6.权利要求1-5任一所述的检测试剂盒在进行HLA-B27等位基因检测和/分型中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，所检测和/分型的HLA-B27基因型为B27-04和B27-05。