CN104169302A - 抗-hla-b*27抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异结合HLA-B*27(亦称为HLA-B27)之抗体及其抗原-结合片段。在某些实施方案中，本发明抗体结合可溶性及/或细胞表面表达形式的HLA-B*27。在某些实施方案中，本发明抗体抑制HLA-B*27介导的T细胞活化。相较于对其他HLA-B等位基因变体(例如HLA-B*07)，本发明的某些例示性实施方案显示对HLA-B*27的结合提升。本发明亦提供具有pH依赖性结合特性(例如在中性pH下比在酸性pH下的亲和力结合力更高)的抗-HLA-B*27抗体。本发明抗体可用于治疗与HLA-B*27表达有关的疾病与病症，包括强直性脊柱炎与其他脊柱关节病。

Description

抗-HLA-B*27抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对人HLA-B*27具有特异性的抗体及其抗原-结合片段，以及其使用方法。
背景技术
人类的主要组织兼容性复合体(MHC)已知为人类白血球抗原(HLA)。HLA分子至关重要地涉入抗原呈现以及免疫反应。HLA-B*27是与强直性脊柱炎以及其他血清阴性脊柱关节病高发生率有关的特定HLA等位基因。
第I型HLA分子(诸如HLA-B*27)由两条链所构成：膜结合重链，由三个Ig-结构域(α-1、α-2与α-3)所构成；以及非共价缔合共同轻链，已知为β-2微球蛋白(β2m)。HLA-B*27存在有数种等位基因亚型，包括HLA-B*2701至HLA-B*2728。HLA等位基因之间的序列差异性大多局限在重链α-1与α-2结构域之间的肽结合槽(peptide-binding cleft)。在HLA-B*27中，呈递细胞内源的肽(自身肽或病毒肽)会使得表达T细胞受体(TCR)之对特定肽具特异性的HLA-限定型T细胞克隆活化。
对抗-HLA-B*27的抗体在本领域中为广泛熟知的，但主要描述于使用在诊断及/或检测应用。(参见，例如美国专利第5,369,010号以及Urban etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:1534-1538(1994))。因此，现今在本领域中，对于适于治疗应用以及其他使用的新颖、高亲和力结合的抗-HLA-B*27抗体存在着需要。
发明概述
本发明提供特异结合人类HLA-B*27的抗体。本发明抗体尤其可用于干扰由HLA-B*27呈递之抗原的T细胞辨识并用于治疗由HLA-B*27介导之抗原呈递所引起或与HLA-B*27介导之抗原呈递相关之疾病与病症。举例而言，本发明抗体可施用给患者供治疗或减轻强直性脊柱炎与其他脊柱关节病之用。
本发明抗体可以是全长(例如，IgG1或IgG4抗体)或可含有仅仅抗原-结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，且可经修饰而影响官能性，例如减少残余效应子功能(Reddy et al.,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明提供一种包含一重链可变区(HCVR)的抗体或抗体之抗原-结合片段，该重链可变区具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354及370，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列。
本发明亦提供一种包含一轻链可变区(LCVR)的抗体或抗体之抗原-结合片段，该轻链可变区具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362及378，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列。
本发明亦提供一种包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组的HCVR与LCVR(HCVR/LCVR)序列对的抗体或其抗原-结合片段：SEQ IDNO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378。
本发明亦提供一种抗体或抗体之抗原-结合片段，其包含一重链CDR3(HCDR3)域，具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360及376，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列；以及一轻链CDR3(LCDR3)域，具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368及384，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列。
在某些实施方案中，该抗体或抗体之抗原-结合部分包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对：SEQ IDNO:8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、328/336、344/352、360/368、376/384。
本发明亦提供一种抗体或其片段，其进一步包含一重链CDR1(HCDR1)域，具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356及372，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列；一重链CDR2(HCDR2)域，具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358及374，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列；一轻链CDR1(LCDR1)域，具有选自由下列SEQ IDNO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364及380，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列；以及一轻链CDR2(LCDR2)域，具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366及382，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性之实质相似序列。
本发明的某些非限制性、例示性抗体及抗原-结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，各别具有选自由下列SEQ ID NO所组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16(例如H1M2477N)；20-22-24-28-30-32(例如H1M2490N)；36-38-40-44-46-48(例如H2M2482N)；52-54-56-60-62-64(例如H1M2477N2)；68-70-72-76-78-80(例如H1M2490N2)；84-86-88-92-94-96(例如H2M2482N2)；100-102-104-108-110-112(例如H1M2480N)；116-118-120-124-126-128(例如H1M2497N)；132-134-136-140-142-144(例如H2M2491N)；148-150-152-156-158-160(例如H2M2499N)；164-166-168-172-174-176(例如H2M2718N)；180-182-184-188-190-192(例如H4H2524P)；196-198-200-204-206-208(例如H4H2526P)；212-214-216-220-222-224(例如H4H2528P)；228-230-232-236-238-240(例如H4H2530S)；244-246-248-252-254-256(例如H4H2532P)；260-262-264-268-270-272(例如H4H2534S)；276-278-280-284-286-288(例如H4H2538P)；292-294-296-300-302-304(例如H4H2542P)；308-310-312-316-318-320(例如H4H2555P)；324-326-328-332-334-336(例如H4H2559P)；340-342-344-348-350-352(例如H4H2560P)；356-358-360-364-366-368(例如H4H2562S)；及372-374-376-380-382-384(例如H4H2564S)。
在一个相关实施方案中，本发明包括特异结合HLA-B*27的抗体或抗体之抗原-结合片段，其中该抗体或片段包含选自下列SEQ ID NO所组成的组之重链与轻链序列中所含重链与轻链CDR域：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378。用于鉴定HCVR与LCVR氨基酸序列中的CDR的方法及技术为本领域中已知的，且可用于鉴定本文揭示之特定HCVR及/或LCVR氨基酸序列中的CDR。可用于鉴定CDR边界的例示性习知技术包括，例如Kabat界定法、Chothia界定法以及AbM界定法。在一般性术语中，Kabat界定法是以序列变异性为基础，Chothia界定法是以结构环区的位置为基础，而AbM界定法是一种介于Kabat法与Chothia法之间的折衷法。参见，例如Kabat，”Sequencesof Proteins of Immunological Interest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公开数据库亦可用来鉴定抗体内的CDR序列。
在一个相关实施方案中，本发明包括相较于其他HLA-B等位基因变体表现出对HLA-B*27的结合增高的分离的抗体或其抗原-结合片段，该抗体或其抗原-结合片段包含分别含有SEQ ID NO:52-54-56-60-62-64之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其中在HCDR1域中于氨基酸位33处有组氨酸置换，在HCDR2域中于氨基酸位52处有组氨酸置换，或在HCDR1域中于氨基酸位33处有组氨酸置换且在HCDR2中于氨基酸位52处有组氨酸置换。
在一个相关实施方案中，本发明包括相较于其他HLA-B等位基因变体表现出对HLA-B*27的结合增高的分离的抗体或其抗原-结合片段，该抗体或抗原-结合片段包含分别含有SEQ ID NO:148-150-152-156-158-160之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其中具有一或多个组氨酸置换：在HCDR1域中于氨基酸位32处有组氨酸置换；在HCDR2域中于氨基酸位53处有组氨酸置换；在HCDR1域中于氨基酸位32处有组氨酸置换且在HCDR2域中于氨基酸位53处有组氨酸置换；在LCDR1域中于氨基酸位27、30与32处有组氨酸置换；在LCDR1域中于氨基酸位27、28与32处有组氨酸置换；在LCDR1域中于氨基酸位28、30与32处有组氨酸置换；在LCDR1域中于氨基酸位28、30与31处有组氨酸置换；在LCDR1域中于氨基酸位27、28、30与32处有组氨酸置换；在LCDR3域中于氨基酸位90、92、93与97处有组氨酸置换；在LCDR3域中于氨基酸位90、92与97处有组氨酸置换；在LCDR3域中于氨基酸位92、93与97处有组氨酸置换；在LCDR3域中于氨基酸位90与93处有组氨酸置换；在LCDR3域中于氨基酸位92与93处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位98、100与106处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位98、100与104处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位98、100、104与106处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位98、104与106处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR1域中于氨基酸位28、30与31处有组氨酸置换；在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR3域中于氨基酸位90、92与97处有组氨酸置换；或在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR3域中于氨基酸位92、93与97处有组氨酸置换。
在一个相关实施方案中，本发明包括经组氨酸置换的分离的抗体或抗原-结合片段，其在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50大于至少1.5倍在pH 7.2下抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
在另一个实施方案中，本发明包括分离的抗体或其抗原-结合片段，其在pH 5.75下结合至HLA-B*27的KD大于至少5倍、至少10倍、至少12倍或至少25倍在pH 7.2下抗体结合至HLA-B*27的KD。在一些实施方案中，以在pH 5.75下之KD大于在pH 7.2下结合至HLA-B*27之抗体的KD结合HLA-B*27的抗体或其抗原-结合片段包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:226/234、258/266、290/298、338/346及370/378。
在一个相关实施方案中，本发明包括分离的抗体或其抗原-结合片段，其在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50大于至少1.5倍、至少10倍、至少12倍或至少25倍在pH 7.2下抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
在另一个方面，本发明提供编码抗-HLA-B*27抗体或其片段之核酸分子。带有本发明核酸之重组表达载体与引入该等载体的宿主细胞，与藉由在容许生产抗体的条件下培养宿主细胞而生产抗体和回收所生产之抗体的方法亦被本发明所包括。
在一个实施方案中，本发明提供一种抗体或其片段，其包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组之核酸序列所编码的HCVR：SEQ ID NO:1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353及369，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列。
本发明亦提供一种抗体或其片段，其包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组之核酸序列所编码的LCVR：SEQ ID NO:9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361及377，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列。
本发明亦提供一种抗体或抗体之抗原-结合片段，其包含选自由下列SEQ ID NO所组成的组之核苷酸序列所编码的HCDR3域：SEQ ID NO:7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359及375，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列；以及选自由下列SEQ ID NO所组成的组之核苷酸序列所编码的LCDR3域：SEQ IDNO:15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367及383，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列。
本发明亦提供一种抗体或其片段，其进一步包含选自由下列SEQ IDNO所组成的组之核苷酸序列所编码的HCDR1域：SEQ ID NO:3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355及371，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列；选自由下列SEQ IDNO所组成的组之核苷酸序列所编码的HCDR2域：SEQ ID NO:5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357及373，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列；选自由下列SEQ IDNO所组成的组之核苷酸序列所编码的LCDR1域：SEQ ID NO:11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363及379，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列；以及选自由下列SEQID NO所组成的组之核苷酸序列所编码的LCDR2域：SEQ ID NO:13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365及381，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性之实质相同序列。
依据某些实施方案，该抗体或其片段包含由下列SEQ ID NO的核酸序列所编码的重链与轻链CDR序列：1与9(例如H1M2477N)、17与25(例如H1M2490N)、33与41(例如H2M2482N)、49与57(例如H1M2477N2)、65与73(例如H1M2490N2)、81与89(例如H2M2482N2)、97与105(例如H1M2480N)、113与121(例如H1M2497N)、129与137(例如H2M2491N)、145与153(例如H2M2499N)、161与169(例如H2M2718N)、177与185(例如H4H2524P)、193与201(例如H4H2526P)、209与217(例如H4H2528P)、225与233(例如H4H2530S)、241与249(例如H4H2532P)、257与265(例如H4H2534S)、273与281(例如H4H2538P)、289与297(例如H4H2542P)、305与313(例如H4H2555P)、321与329(例如H4H2559P)、337与345(例如H4H2560P)、353与361(例如H4H2562S)及369与377(例如H4H2564S)。
本发明包括抗-HLA-B*27抗体，其具有经修饰的糖基化模式。在一些应用中，移除非所欲糖基化位点的修饰可能是有用的，或缺乏存在于寡糖链上的岩藻糖部分的抗体，例如增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield et al.(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含特异结合HLA-B*27之人类抗体或其抗原-结合片段，以及药学上可接受载体。在一个相关的方面，本发明特征为一种组合物，其包含抗-HLA-B*27抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂为任一种有利与抗-HLA-B*27抗体组合的药剂。可有利与抗-HLA-B*27抗体组合的例示性药剂包括，但不限于其他抑制HLA-B*27活性的药剂(包括其他抗体或其抗原-结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)，及/或不直接结合HLA-B*27但以其他方式干扰、阻断或减弱HLA-B*27介导之T细胞活化的药剂。
在又一个方面，本发明提供使用本发明抗-HLA-B*27抗体或抗体之抗原结合部分抑制HLA-B*27介导之活性的方法，其中该治疗方法包含施用治疗有效量之包含本发明抗体或抗体之抗原-结合片段的药物组合物。所治疗、预防或改善的病症可以是任何疾病或病况，其可藉由移除、抑制或降低HLA-B*27活性(例如HLA-B*27介导之抗原呈递)而被改善、改善、抑制或预防。本发明抗-HLA-B*27抗体或抗体之抗体片段可作用为干扰HLA-B*27/肽与T细胞受体复合的交互作用，或以其他方式抑制HLA-B*27介导之抗原呈递及/或T细胞活化。因此，本发明的一个方面为治疗、预防或改善与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导之疾病或病症的方法，该方法包含对罹患与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导之疾病或病症，或处于与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导之疾病或病症风险下的患者施用含有本发明抗体或抗体之抗原-结合片段的药物组合物。在本发明的一些实施方案中，与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导之疾病或病症为脊柱关节病、实体器官移植排斥，或移植物抗宿主病(GVHD)。在本发明的一些实施方案中，藉由本发明方法所治疗、预防或改善的脊柱关节病为强直性脊柱炎、反应性关节炎(莱特尔综合征)、急性前眼色素层炎、肌炎、牛皮癣关节炎及/或溃疡性结肠炎。
本发明亦包括本发明抗-HLA-B*27抗体或抗体之抗原结合部分供制造用以治疗与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性所致的疾病或病症之药物的用途。
其他实施方案将因为检阅下面详细说明而变得清楚。
详述
在说明本发明之前，应理解本发明不限于所述特定方法以及实验条件，因为这些方法以及条件可能会改变。亦应理解本文所用术语仅供说明特定实施方案之用，而不是限制性的，因为本发明的范围将仅会受到随附权利要求所限制。
除非另有定义，否则所有本文使用的技术以及科学术语具有与本发明所属领域中技术人员普遍理解的相同意思。如本文所用，术语”约”，当使用在有关特定引用的数值时，表示该数值可自所引用的数值起改变达不超过1％。举例而言，如本文所用，词句”约100”包括99与101以及其间的所有数值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管任何类似或等同于本文所述的方法以及材料可应用于实施或测试本发明，现将说明优选的方法以及材料。
定义
词句”HLA-B*27”(或者称为”HLA-B27”)表示一个多肽复合体，其含有HLA-B*27等位基因重链的α-1、α-2与α-3Ig结构域与β-2微球蛋白多肽相缔合。词句”HLA-B*27”，如本文所用，包括HLA-B*27家族的所有等位基因亚变体，包括HLA-B*2701至HLA-B*2728。例示性HLA-B*27等位基因亚变体为HLA-B*2705，其包含具有SEQ ID NO:385之氨基酸序列的重链。另一个例示性HLA-B*27等位基因亚变体为HLA-B*2709，其包含具有SEQ ID NO:386之氨基酸序列的重链。其他HLA-B*27等位基因亚变体的氨基酸序列可得自公用数据库且为本领域技术人员所熟知。词句”HLA-B*27”包括所有细胞表面表达的HLA-B*27复合体(参见例如本文的实施例4-6)，以及经人工工程化的可溶性融合蛋白，其包含HLA-B*27α-1、α-2与α-3Ig结构域融合至β-2微球蛋白以及视情况选用的HLA-限定型肽(参见例如本文的实施例3)。一种这样的可溶性HLA-B*27融合蛋白的实例为在本文意指为"scHLA-B27"的构建体，其包含SEQ ID NO:387的氨基酸序列。
术语”抗体”，如本文所用，意指特异结合至抗定抗原(例如HLA-B*27)或与特定抗原交互作用的任一种抗原-结合分子或分子复合体，其包含至少一个互补决定区(CDR)。术语”抗体”包括免疫球蛋白分子，其含有4个多肽链，藉由双硫键交互连结的2个重(H)链以及2个轻(L)链，以及其多聚体(例如IgM)。各个重链含有1个重链可变区(此处缩写为HCVR或VH)以及1个重链恒定区。重链恒定区含有3个结构域，CH1、CH2以及CH3。各个轻链含有1个轻链可变区(此处缩写为LCVR或VL)以及1个轻链恒定区。轻链恒定区含有1个结构域(CL1)。VH与VL区可进一步分成具有超变异性的区域(命名为互补决定区(CDR))，散布于较为保守的区域(命名为构架区(FR))。各个VH与VL由3个CDR以及4个FR所构成，按下列顺序从氨基酸往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗-HLA-B*27抗体(或其抗原-结合部分)的FR可能与人类种系序列相同，或可以经天然或人工修饰。氨基酸共有序列可以依据并行分析两个或多个CDR来定义。
术语”抗体”，如本文所用，亦包括完整抗体分子的抗原-结合片段。如本文所用，术语抗体的”抗原-结合部分”、抗体的”抗原-结合片段”等包括任何天然存在的、以酶所得到的、合成的或经遗传工程的多肽或糖蛋白，其特异结合抗原而形成复合体。抗体的抗原-结合片段可以使用任何适当的标准技术(诸如蛋白水解消化或涉及操作并表达编码抗体可变与视情况恒定域之DNA的重组遗传工程技术)而衍生自例如完整抗体分子。这样的DNA是已知的及/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得或可合成。DNA可以被测序且以化学的方式或使用分子生物学技术来操作，例如将一或多个可变及/或恒定域排成适当构型，或引入会产生半胱氨酸残基的密码子、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原-结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；与(vii)由模拟抗体的高变区之氨基酸残基所构成的最小识别单元(例如分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)，或限定型FR3-CDR3-FR4肽。其他经工程化的分子(诸如域特异性抗体、单域抗体、域缺失抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小调节分子免疫药物(SMIP)及鲨鱼可变IgNAR域)亦包括在如本文所用词句”抗原-结合片段”中。
抗体的抗原-结合片段典型含有至少1个可变域。可变域可以是任何大小与氨基酸组成，且通常含有至少1个邻近1或多个构架序列或在1或多个构架序列中的CDR。在带有与VL域缔合之VH域的抗原-结合片段中，VH以及VL域可相对另一者位在适当排列处。举例而言，可变区可以是二聚体且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原-结合片段可含有单体VH或VL域。
在某些实施方案中，抗体的抗原-结合片段可含有至少1个共价连接至少1个恒定域的可变域。可以在本发明之抗体的抗原-结合片段中发现到的可变与恒定域的非限制例示性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变与恒定域的任一种构型中(包括上面列示的任一种例示性构型)，可变域与恒定域可以是彼此直接连接或藉由完整或部分铰链或接头区而链接。铰链区是由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所构成，它在单一多肽分子中的相邻可变及/或恒定域间产生柔性或半柔性连接。此外，本发明抗体的抗原-结合片段可包含上列可变域与恒定域构型的任一者彼此及/或与一或多个单体VH或VL域以非共价缔合(例如藉由二硫键(等))所形成的同型二聚体或异型二聚体(或其他多聚体)。
就完整抗体分子而言，抗原-结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原-结合片段典型包含有至少两个不同可变域，其中各个可变域能够特异结合至个别抗原或相同抗原上的不同表位。任一种多特异性抗体形式，包括此处所揭示的例示性双特异性抗体形式，可使用本领域中可取得之惯用技术改造成用于本发明之抗体的抗原-结合片段中。
本发明抗体可透过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来作用。”补体依赖性细胞毒性”(CDC)意指藉由本发明抗体在补体存在下溶解表达抗原的细胞。”抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”意指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞与巨噬细胞)辨识目标细胞上的结合抗体且从而造成目标细胞溶解。CDC与ADCC可使用本领域中熟知且可取得的分析来测量。(参见，例如美国专利第5,500,362号与第5,821,337号及Clynes et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998))。抗体的恒定区就抗体固定补体与介导细胞依赖性细胞毒性的能力来说是重要的。因此，基于抗体介导细胞毒性是否是所要的来选定抗体同种型。
术语”人类抗体”，如本文所用，欲包括具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列之可变区及恒定区的抗体。本发明之人类抗体可包括不被人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如藉由体外随机或位点特异性诱变或藉由体内体细胞突变所引入的突变)，举例而言在CDR以及尤其在CDR3中。但是，术语”人类抗体”，如本文所用，不意欲要包括已被移植至人类构架序列上之衍生自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)之种系的CDR序列的抗体。
术语”重组人类抗体”，如本文所用，欲包括所有藉由重组方法所制备、表达、产生或分离的人类抗体，诸如使用被转染至宿主细胞中之重组表达载体而被表达的抗体(进一步说明如下)、分离自重组组合人类抗体文库的抗体(进一步说明如下)、分离自经人类免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)的抗体(参见，例如Taylor et al.Nucl.Acids Res.20:6287-6295(1992))，或藉由任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之方法所制备、表达、产生或分离的抗体。此等重组人类抗体具有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区。但是，在某些实施方案中，此等重组人类抗体经活体外诱变(或，当使用经人类Ig序列基因转基因的动物时为体内体细胞诱变)，而因此该等重组抗体之VH区与VL区的氨基酸序列为可能在体内人类抗体种系本中非天然存在的序列，尽管它们是衍生自人类种系VH与VL序列或与其相关。
人类抗体以两种与铰链异质性相关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体藉由链间重链二硫键而被约束在一起。在第二种形式中，二聚体不是经由链间二硫键连接，并形成一个由共价偶联轻链及重链组成的约75-80kDa分子(半抗体)。此等形式即使是在亲和力纯化之后也相当难以分离。
第二种形式在各种完整IgG同种型中的出现频率是由于(但不限于)与抗体之铰链区同种型有关的结构差异。在人类IgG4铰链的铰链区中，单个氨基酸置换可能将第二种形式的出现明显降低至一般使用人类IgG1铰链所观察到的程度(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30:105)。本发明包括具有一或多个在铰链CH2或CH3区中的突变的抗体，其可能是所要的，例如在制造时，俾以增进所欲抗体形式的产率。
”分离的抗体”，如本文所用，表示一种已被鉴定且或由其天然环境的至少一组分中被分离及/回收而来的抗体。例如，已由生物的至少一组分中，或由其中天然存在或天然生产之抗体的组织或细胞被分离或回收来的抗体就本发明之目的来说是一种”分离的抗体”。分离的抗体亦包括在重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已进行至少一个纯化或分离步骤的抗体。依据某些实施方案，分离的抗体基本上不含其他细胞物质及/或化学品。
”中和”或”阻断”抗体，如本文所用，欲意指一种结合至HLA-B*27的抗体，其抑制HLA-B*27/肽复合体与T细胞受体间的交互作用。因为HLA-B*27中和或阻断抗体所造成的抑制不必然是完全的，只要其可使用适当分析被检测即可。测定抗体是否阻断HLA-B*27与T细胞受体间的相互作用的例示性分析为本领域中所熟知且于本文他处中说明。
相较于抗体所衍生而来之对应种系序列，本文揭示的抗-HLA-B*27抗体可在重链及轻链可变域之构架及/或CDR区中含有一或多个氨基酸置换、插入及/或缺失。此等突变可透过将本文所揭示之氨基酸序列与可得自例如公用抗体序列数据库的种系序列相比对而轻易确认。本发明包括抗体及其抗原-结合片段，其等是衍生自本文所揭示的任一氨基酸序列，其中一或多个构架及/或CDR区中的一或多个氨基酸突变成对应该抗体所衍生而来的种系序列之对应残基，或另一人类种系序列的对应残基，或对应种系残基的保守性氨基酸置换(此等序列改变在本文中全意指为”种系突变”)。本领域中技术人员从本文揭示的重链与轻链可变区序列开始，可轻易制造出许多含有一或多个个别种系突变或其组合的抗体及抗原-结合片段。在某些实施方案中，VH及/或VL域中的所有构架及/或CDR残基突变回复成在抗体衍生而来之原有种系序列中所发现的残基。在其他实施方案中，仅有某些残基突变回复成原有种系序列，例如仅有在FR1的前8个氨基酸中或FR4的后8个氨基酸中所发现的突变残基，或仅有CDR1、CDR2或CDR3中所发现的突变残基。在其他实施方案中，构架及/或CDR残基的一或多者突变成不同种系序列的对应残基(亦即，不同于抗体原先衍生而来之种系序列的种系序列)。此外，本发明抗体可含有两个或更多个构架及/或CDR区中之种系突变的组合，例如其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而不同于原有种系序列的某些其他残基维持原状或突变成不同种系序列的对应残基。在得到后，含有一或多个种系突变的抗体及抗原-结合片段可针对一或多种所要特性(诸如结合特异性增进、结合亲和力增加、拮抗或激动生物特性增进或提高(视情况而定)、免疫原性降低等)来进行简易测试。以此一般方式所得到的抗体及抗原-结合片段包括在本发明中。
本发明亦包括抗-HLA-B*27抗体，该抗体含有本文揭示之具有一或多个保守性置换的HCVR、LCVR、及/或CDR氨基酸序列任一者的变体。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR、及/或CDR氨基酸序列的抗-HLA-B*27抗体，该抗体相对于本文揭示之任一HCVR、LCVR、及/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守性氨基酸置换。
本发明亦包括抗-HLA-B*27抗体，其包含具下列特征之抗-HLA-B*27抗体的变体：pH依赖性结合特性(亦即在低pH下相较于中性pH的结合降低)、对HLA-B*27亚变体的结合增加(例如对HLA-B*2705及/或HLA-B*2709比对HLA-B*07的结合还高)，以及体内效力增进(例如更长的抗体血清半衰期、延长T细胞活化的抑制等)。此等变体包括抗-HLA-B*27抗体变体，其中亲代抗-HLA-B*27抗体的CDR序列已被改变成由组氨酸残基取代一或多个非组氨酸氨基酸。可经修饰、突变或以其他方式经工程化成具有结合特性改变(例如pH依赖性结合特性增高)的”亲代”抗-HLA-B*27抗体的实例包括如本文实施例2、表1中所揭示，含有互补决定区(CDR)或重链与轻链可变域(HCVR/LCVR)的任一者的抗-HLA-B*27抗体。
术语”表位”意指一个与已知为抗原互补位(paratope)之抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单独一个抗原可能有超过一个表位。因此，不同抗体可结合至一个抗原的不同区域且可能具有不同的生物效用。表位可以是构象的或线性的。构象表位可透过在空间上并列的氨基酸由线性多肽链的不同区段所产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基所产生。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖类、磷酰基或磺酰基的部分。
当意指核酸或其片段时，”实质同一性”或”实质相同”表示若藉由任何序列同一性的已知算法(诸如FASTA、BLAST或Gap，如上所述)来测定时，当在有适当核苷酸插入或缺失的情况下与另一核酸(或其互补链)最佳比对时，在至少约95％，及更佳至少约96％、97％、98％或99％核苷酸碱基中有核苷酸序列同一性。在某些情况下，与参考核酸分子具有实质同一性的核酸分子可编码具有与参考核酸分子所编码之多肽相同或实质类似氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语”实质相似性”或”实质相似”表示当两个肽序列最佳地比对时(诸如按照程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重)，共有至少95％序列同一性，甚至更佳至少98％或99％序列同一性。较佳地，不同一的残基位置因为保守性氨基酸置换而有所差异。”保守性氨基酸置换”是一种氨基酸残基置换成另一种带有类似化学性质(例如电荷或疏水性)之侧链(R基团)的氨基酸残基。一般来说，保守性氨基酸置换大体上不会改变蛋白质的官能性质。在2或多个氨基酸序列因为保守性置换而彼此有所不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度百分比可以向上调整而校正置换的保守性质。用来做这个调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如Pearson,Methods Mol.Biol.24:307-331(1994)。带有具类似化学性质的侧链之氨基酸群组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸与苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺与谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸与组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸与谷氨酸；以及(7)含硫侧链为半胱氨酸与甲硫氨酸。较佳的保守性氨基酸置换群组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换可以是任何在Gonnet et al.Science 256:1443-1445(1992)中揭示的PAM250对数-相似矩阵中具有正值的变化。”中度守恒”置换是任何在PAM250对数-相似矩阵中具有非负值的改变。
关于多肽的序列相似性，其亦可意指为序列同一性，典型是使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分派给各种置换、缺失以及其他修饰(包括保守性氨基酸置换)的相似性的测量法来配对相似序列。例如，GCG软件含有诸如Gap与Bestfit的程序，它们可以与默认参数一起用来决定关系相近之多肽(诸如来自于不同物种之生物的同源性多肽)或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如GCG第6.1版。多肽序列也可以使用采默认或建议参数的FASTA(一种在GCG第6.1版中的程序)来比对。FASTA(例如FASTA2与FASTA3)提供查询以及检索序列之间最佳重复区域的比对以及百分比序列同一性(Pearson(2000)上文)。当要将本发明的序列与含有大量来自不同生物之序列的数据库比对时，另一个较佳的算法是计算机程序BLAST，特别是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参见，例如Altschul et al.J.Mol.Biol.215:403-410(1990)以及Altschul et al.Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
抗体的生物特性
本发明抗体包括特异结合HLA-B*27的抗体。术语”特异结合”或类似者表示抗体或其抗原-结合片段与抗原在生理条件下形成相对稳定复合体。特异结合的特征在于在25℃与中性pH下KD为约1x10-7M或更少。用于测定两个分子是否特异结合的方法为本领域中已知，且包括例如平衡透析、表面等离振子共振及类似方法。然而，特异结合特定HLA-B*27等位基因亚变体之分离的抗体可能对其他HLA-B*27等位基因亚变体具有交叉反应性。因此，”特异结合HLA-B*27”的抗体包括特异结合所有HLA-B*27等位基因亚变体或HLA-B*27等位基因亚变体的子集的抗体。举例而言，特异结合HLA-B*2705及/或HLA-B*2709的抗体被视为”特异结合HLA-B*27”的抗体。
本发明包括在25℃与中性pH(例如约pH 7.2)下以少于约260nM的KD结合可溶性HLA-B*27融合蛋白(例如scHLA-B27-mmH[SEQ IDNO:387])的抗-HLA-B*27抗体。举例而言，本发明包括在25℃与pH 7.2下，以少于约250nM、200nM、150nM、100nM、50nM、1nM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pm、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM或更少的KD结合scHLA-B27-mmH的抗-HLA-B*27抗体，如藉由表面等离振子共振所测试(参见例如本文的实施例3)。
本发明包括对HLA-B*27表现pH依赖性结合的抗-HLA-B*27抗体。在本发明的一些实施方案中，词句”pH依赖性结合”，如本文所用，表示当使用表面等离振子共振测试时，抗体在酸性pH(例如pH 5.75)下表现的KD值比在中性pH(例如pH 7.2)下的KD值高出至少5倍，其中在酸性与中性pH下的KD值是在相同或实质相同的实验条件(例如温度、抗原/抗体位向、试剂浓度、流速等)下测得。举例而言，就本揭示内容之目的，若在pH 5.75下结合至HLA-B*27的KD值比在pH 7.2下结合至HLA-B*27的KD值的比率为至少约5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、15.0、20.0、25.0或更高，则抗-HLA-B*27抗体被视为具有”pH依赖性结合”(参见例如本文[实施例3]表6)。在本发明的一些实施方案中，词句”pH依赖性结合”，如本文所用，表示于结合分析(例如化学发光分析)中在酸性pH(例如pH 6.0)下表现的EC50值(亦即半最大有效浓度)比在中性pH(例如pH 7.2)下的EC50值高出至少3倍，其中在酸性与中性pH下的EC50值是在相同或实质相同的实验条件(例如温度、抗原/抗体位向、试剂浓度、流速等)下测得。举例而言，就本揭示内容之目的，若在pH 6.0下结合至HLA-B*27的EC50值比在pH 7.2下结合至HLA-B*27的EC50值的比率为至少约1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、15.0、20.0、25.0或更高，则抗-HLA-B*27抗体被视为具有”pH依赖性结合”(参见例如本文[实施例11]表21与22)。在本发明的一些实施方案中，pH依赖性结合可以针对结合缔合速率常数(ka)、结合解离速率常数(kd)或解离半衰期(t1/2)来测得。
本发明亦包括能够在体外阻断或减低HLA-B*27介导之T细胞活化的抗-HLA-B*27抗体。用于测定一个抗体是否在体外阻断或减低HLA-B*27介导之T细胞活化的例示性分析显示于本文的实施例4中。在这个实施例中，使用两个经工程化的细胞系。第一个细胞系是在其表面表达HLA-B*27重链等位基因变体以及人类β2m与HLA限定型肽的细胞系。第二个细胞系是表达T细胞受体的报导细胞系，当T细胞受体活化时，产生一个可检测到的萤光素酶信号。不同数量的抗-HLA-B*27抗体在与报导细胞系混合之前被添加至第一个细胞系，并计算IC50值。本发明包括当在如实施例4中所示的阻断生物分析或实质相似分析中测试时表现少于约12.5nM之IC50的抗体。举例而言，本发明包括当在如实施例4中所示的阻断生物分析或实质相似分析中测试时表现少于约12nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM、900pM、850pM、800pM、750pM、700pM、650pM、600pM、550pM、500pM、450pm、400pM或更少之IC50的抗-HLA-B*27抗体。
本发明亦包括相较于其他(非-B*27)HLA-B等位基因变体(诸如，例如HLA-B*07)表现结合至HLA-B*27等位基因变体(诸如，例如HLA-B*2705及/或HLA-B*2709)升高之抗-HLA-B*27抗体。用于测定一个抗体是否表现结合至一或多个HLA-B*27等位基因变体升高的例示性分析形式显示于本文的实施例8中。在这个实施例中，测定各抗体相较于其结合至不表达HLA之亲代细胞对表达HLA-B*07、HLA-B*2705或HLA-B*2709的细胞的相对结合。使用这个类型的分析形式，表现结合至表达HLA-B*27等位基因变体之细胞相较于结合至亲代细胞系高出至少50倍(在表15中以[++]或[+++]表示)，同时表现结合至表达非HLA-B*27等位基因变体(例如HLA-B*07)之细胞相较于结合至亲代细胞高出少于10倍(在表15中表示为[+])的抗体被视为是表现相较于另一HLA-B等位基因变体对HLA-B*27的”结合升高”的抗体。在某些情况下，若在本文实施例8的分析形式或实质相似的分析形式中测试时，某抗体显示结合至表达HLA-B*27等位基因变体之细胞相较于结合至亲代细胞高出至少50倍(在表15中由[++]或[+++]表示)，但相较于结合至亲代细胞结合至表达非HLA-B*27等位基因变体(例如HLA-B*07)之细胞高出少于3倍(在表15中表示为[-])，则该抗体被视为表现相较于其他HLA-B等位基因变体对HLA-B*27的”结合升高”。
表位作图以及相关技术
本发明包括与HLA-B*27重链之α-1、α-2及/或α-3Ig结构域中所发现的一或多个氨基酸相互作用的抗-HLA-B*27抗体。就HLA-B*2705(SEQID NO:385)以及HLA-B*2709(SEQ ID NO:386)而言，α-1Ig结构域由对应完整重链氨基酸序列的氨基酸25-114组成，α-2Ig结构域由氨基酸115-206组成，而α-3Ig结构域由氨基酸207-298组成。抗体结合的表位可由HLA-B*27重链之一或多个Ig结构域中的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的单一连续序列所组成。或者，表位可由HLA-B*27重链之一或多个Ig结构域中的数个非连续氨基酸(或氨基酸序列)所组成。本发明抗体亦可与β2m序列(SEQ ID NO:388)中的一或多个氨基酸相互作用。
可使用本领域技术人员所熟知的各种技术来决定一个抗体是否会与多肽或蛋白质中的”一或多个氨基酸相互作用”。例示性技术包括，例如Harlow和Lane的”Antibodies”所述的惯用交叉-阻断分析(Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harb.,NY)、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke Methods Mol Biol 248:443-63(2004))及肽切割分析。此外，可以采用诸如表位切除、表位提取以及化学修饰抗原的方法(Tomer,ProteinScience 9:487-496(2000))。另一种可用于鉴别与抗体相互作用之多肽中的氨基酸的方法为透过质谱检测氢/氘交换。在一般性术语中，氢/氘交换法涉及将感兴趣的蛋白质标记氘，然后透过将抗体结合至经氘标记的蛋白质。接下来，蛋白质/抗体复合体被转移至水中以容许氢-氘交换在除了受抗体保护之残基(其维持经氘标记)以外的所有残基发生。在抗体解离后，目标蛋白质被进行蛋白酶切割与质谱分析，从而揭开经氘标记的残基，其对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见，例如Ehring,AnalyticalBiochemistry 267(2):252-259(1999)；Engen and Smith,Anal.Chem.73:256A-265A(2001)。
本发明进一步包括结合至与本文所述特定例示性抗体任一者(例如，H1M2477N、H1M2490N、H2M2482N、H1M2477N2、H1M2490N2、H2M2482N2、H1M2480N、H1M2497N、H2M2491N、H2M2499N、H2M2718N、H4H2524P、H4H2526P、H4H2528P、H4H2530S、H4H2532P、H4H2534S、H4H2538P、H4H2542P、H4H2555P、H4H2559P、H4H2560P、H4H2562S、H4H2564S等)相同之表位的抗-HLA-B*27抗体。同样地，本发明亦包括与本文所述特定例示性抗体任一者(例如，H1M2477N、H1M2490N、H2M2482N、H1M2477N2、H1M2490N2、H2M2482N2、H1M2480N、H1M2497N、H2M2491N、H2M2499N、H2M2718N、H4H2524P、H4H2526P、H4H2528P、H4H2530S、H4H2532P、H4H2534S、H4H2538P、H4H2542P、H4H2555P、H4H2559P、H4H2560P、H4H2562S、H4H2564S等)竞争结合至HLA-B*27的抗-HLA-B*27抗体。
吾人可容易地藉由使用本领域已知的惯常方法决定一个抗体是否会与参考抗-HLA-B*27抗体结合至相同的表位，或与参考抗-HLA-B*27抗体竞争结合至相同表位。例如，为决定一测试抗体是否会结合至与本发明参考抗-HLA-B*27抗体相同的表位，容许该参考抗体结合至HLA-B*27复合体(例如可溶性HLA-B*27/肽融合蛋白或细胞表面表达的HLA-B*27与HLA限定型肽复合)。接着，评估测试抗体结合至HLA-B*27复合体的能力。若测试抗体能够在参考抗-HLA-B*27抗体饱合结合之后结合至HLA-B*27，则可推论该测试抗体结合至与参考抗-HLA-B*27抗体不同的表位。另一方面，若测试抗体无法在参考抗-HLA-B*27抗体饱合结合后结合至HLA-B*27复合体，则该测试抗体可能结合至与本发明参考抗-HLA-B*27抗体所结合之表位相同的表位。接而可进行其他惯常实验(例如肽突变与结合分析)以确认观察到的测试抗体没有结合是因为结合至与参考抗体相同的表位，或若没有观察到结合是因为其空间位阻(或另一现象)。这类实验系使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞仪或本领域中可供使用的其他任何定量或定性抗体-结合分析来进行。依据本发明的某些实施方案，若例如在一个竞争性结合分析中测量一个过量1-、5-、10-、20-或100-倍的抗体抑制另一个抗体达至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，则两个抗体结合至相同(或重叠)表位(参见，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者，若基本上所有在抗原中会减少或消除一个抗体结合的氨基酸突变也会减少或消除另一个抗体结合，则两个抗体被视为是结合至相同表位。若减少或消除一抗体结合之仅有一部分氨基酸突变也会减少或消除另一个抗体结合，则两个抗体被视为具有”重叠的表位”。
为测定一个抗体是否与参考抗-HLA-B*27抗体竞争结合，以两个方面来进行上述结合方法学：在第一个方面，容许参考抗体在饱和条件下结合至HLA-B*27复合体，继而评估测试抗体对HLA-B*27复合体的结合。在第二个方面，容许测试抗体在饱和条件下结合至HLA-B*27复合体，继而评估参考抗体对HLA-B*27复合体的结合。若在两个方面中，仅有第一(饱和)抗体能够结合至HLA-B*27复合体，则推断测试抗体与参考抗体竞争结合至HLA-B*27。如本领域技术人员所了解，与参考抗体竞争结合之抗体不必然会结合至与参考抗体相同的表位，但可能会在空间上藉由结合重叠或相邻表位来阻断参考抗体的结合。
制备人类抗体
用于制造单克隆抗体(包括完整人类单克隆抗体)的方法为本领域中已知的。任何此等已知方法可用于本发明的上下文中以制造特异结合至人类HLA-B*27的人类抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术或任何其他用于生成单克隆抗体的已知方法，首先分离出带有人类可变区以及小鼠恒定区之对HLA-B*27具高亲和力的嵌合抗体。如同在下面实验节中，鉴定抗体的特征并且筛选所欲的特性，包括亲和力、选择性、表位等。小鼠恒定区取代成所欲的人类恒定区以生成本发明的完整人类抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管选定的恒定区可能会依据特定用途、可变区中的高亲和力抗原-结合以及标的特异性特性而改变。
生物等同物
本发明的抗-HLA-B*27抗体以及抗体片段包括带有由那些所述抗体变化而来，但仍保有结合人类HLA-B*27能力之氨基酸序列的蛋白质。当与亲代序列相较之下，此等变异抗体以及抗体片段包含有一或多个氨基酸添加、缺失或置换，但仍展现出基本上与所述抗体等同的生物活性。同样地，当与所揭示的序列相较之下，本发明之抗-HLA-B*27抗体编码DNA序列包括具有一或多个核苷酸添加、缺失或置换，但仍编码基本上与本发明之抗-HLA-B*27抗体或抗体片段生物等同的抗-HLA-B*27抗体或抗体片段的序列。上面详述此等变体氨基酸以及DNA序列的实例。
举例而言，若2个抗原-结合蛋白或抗体是药学等同物或药学代用品，当它们以相同摩尔剂量在类似实验条件下施用时的吸收速率与程度未显示出明显差异(不论是单剂量或多剂量)，它们被视为生物等同的。若一些抗体在它们的吸收程度上相等但在它们的吸收速率上不等，它们将会被视为等同物或药学代用品但仍被视为生物等同，因为此等在吸收速率上的差异是有目的并且在归类时被反映，对于在例如长期使用上达到有效身体药物浓度来说不是必要的，并且就所研究的特定药物产品来说被视为在医学上不重要的。
在一个实施方案中，若2个抗原-结合蛋白在临床上就其安全性、纯度以及效力而言并无有意义的差异，它们是生物等同的。
在一个实施方案中，若患者在参考产品与生物产品之间可以改变一或多次而没有预期增高不良反应的风险(包括与持续治疗而没有这样改变的情况下相比，在免疫原性上的临床显著变化，或减低的有效性)时，它们是生物等同的。
在一个实施方案中，若2个抗原-结合蛋白就使用条件来说均是藉由共同作用机制而作用达致此等机制已知的程度，它们是生物等同的。
生物等同性可以藉由体内和体外方法证实。生物等同性测量法包括，例如(a)在人类或其他哺乳动物体内的体内测试，其中随着时间测量抗体或其代谢物在血液、血浆、血清或其他生物液中的浓度；(b)已使用人类体内生物可利用性数据校正并且可合理预测的体外测试；(c)在人类或其他哺乳动物体内的体内测试，其中随着时间测量抗体(或其标的)之适当急性药理学效用；以及(d)在已证实抗体的安全性、效力或生物可利用性或生物等同性的充分控制临床试验中。
本发明之抗-HLA-B*27抗体的生物等同变体可以藉由例如，制造各种残基或序列置换，或缺失不是生物活性所必需的末端或内部残基或序列而构建。举例而言，对于生物活性来说不是必要的半胱氨酸残基可以被缺失或取代为其他会在复性之后防止形成不必要或不正确分子内双硫桥的氨基酸。在其他上下文中，生物等同抗体可包括抗-HLA-B*27抗体变体，其含有会修饰抗体之糖基化特性的氨基酸变化，例如消除或移除糖基化的突变。
免疫缀合物
本发明包括接合至一治疗部分(”免疫缀合物”)(诸如细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素)的抗-HLA-B*27单克隆抗体。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。用于形成免疫缀合物的适当细胞毒性剂以及化学治疗剂的实例在本领域中是已知的(参见例如WO 05/103081)。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以是对一个标的多肽的不同表位具有特异性或者可能含有对超过一个标的多肽具有特异性的抗原-结合域。参见例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60-69(1991)；Kufer et al.,Trends Biotechnol.22:238-244(2004)。本发明的抗-HLA-B*27抗体可以链接至另一个功能性分子(例如另一个肽或蛋白质)或与该另一个功能性分子共表达。举例而言，抗体或其片段在功能上可以链接(例如，藉由化学偶合、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一或多个其他分子实体，诸如另一个抗体或抗体片段，以产生带有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。举例而言，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂对于HLA-B*27或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一臂对第二治疗标的具有特异性或缀合至一个治疗部分。
可以使用于本发明上下文的例示性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域以及第二Ig CH3域，其中第一与第二Ig CH3域因为至少1个氨基酸而彼此不同，以及其中与缺少该氨基酸差异的双特异性抗体相较之下，至少1个氨基酸差异会减低该双特异性抗体结合至蛋白质A。在一个实施方案中，该第一Ig CH3域结合蛋白质A而该第二Ig CH3域含有1个会减低或消除蛋白质A结合的突变，诸如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号为H435R)。该第二CH3可进一步包含有Y96F修饰(按照IMGT；按照EU为Y436F)。可以在第二CH3中发现到的更多修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M以及V82I(按照IMGT；按照EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M以及V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N以及V82I(IMGT；按照EU为N384S、K392N以及V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q以及V82I(按照IMGT；按照EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q以及V422I)。上述双特异性抗体形式的变异在本发明范围中是可预想的。
可以使用于本发明上下文的其他例示性双特异性抗体形式包括，但不限于以基于scFv-的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变域(DVD)-Ig、四价体瘤、杵至臼(knobs-into-holes)、共同轻链(例如具有杵至臼的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG，以及Mab2双特异性形式(参见例如Klein et al.2012,mAbs 4:6,1-11，及其中所引用的参考资料，有关先前形式的回顾)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸缀合来构建，例如其中具有直角化学反应性的非天然氨基酸用来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，其接而自我组装成具有限定组成、化合价与几何学的多聚合复合体(参见例如Kazane et al.,J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗制剂以及施用
本发明提供包含有本发明之抗-HLA-B*27抗体或其抗原-结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物可与适当载体、赋形剂以及其他提供改善输送、递送、耐受性等的药剂一起配制。可以在对于药学化学家来说为熟悉的处方书中找到大量适当的剂型：Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些剂型包括，例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(诸如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油与油包水乳剂、乳化卡波蜡(具有各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶以及含有卡波蜡的半固体混合物。亦参见Powell et al.”Compendium of excipientsfor parenteral formulations”PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用给患者的抗体剂量可以视患者的年龄与身材、标的疾病、病况、给药途径以及类似者来改变。较佳剂量通常是依据体重或体表面积来计算。当本发明的抗体用于在成人患者体内治疗与HLA-B*27活性有关的病况或疾病时，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更佳约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明抗体是有益的。可以视病况的严重性调整治疗频率以及持续时间。用于施用抗-HLA-B*27抗体的有效剂量与时间表可按经验来决定；例如，可透过定期评估来监测患者进展，并据此调整剂量。此外，剂量的物种间标度可使用本领域中已知的方法来进行(例如Mordenti et al.,Pharmaceut.Res.5:1351(1991))。
已知有各种不同的递送系统并且可用于施用本发明的药物组合物，例如封装在脂质体内、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))。引入的方法包括，但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜上以及口服途径。组合物可以藉由任何习知途径来施用，例如藉由输注或快速浓注、藉由透过上皮或黏膜内衬(例如口腔黏膜、直肠以及小肠黏膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。给药可以是全身性或局部的。
本发明的药物组合物可以使用标准注射针与注射器来皮下或静脉内递送。此外，关于皮下递送，笔型递送装置很容易应用于递送本发明的药物组合物。这样的一种笔型递送装置可以是重复使用或抛弃式。可重复使用的笔型递送装置通常使用含有药物组合物的可换式卡匣。一旦卡匣内的所有药物组合物被施用且卡匣空了，空的卡匣可易于丢弃并且置换成含有药物组合物的新卡匣。那么就可以重复使用笔型递送装置。就抛弃式笔型递送装置来说，没有可换式卡匣。更确切地来说，抛弃式笔型递送装置在装置的贮器内预先填充药物组合物供选购。一旦贮器没有药物组合物，整个装置就被丢弃。
许多可重复使用的笔型以及自动注射递送装置在皮下递送本发明之药物组合物方面具实用性。实例包括，但不限定于AUTOPENTM(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTMpen(DisetronicMedical Systems,Bergdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TMpen、HUMALOGTMpen、HUMALIN 70/30TMpen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II与III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTMpen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，仅举几个为例。在皮下投递本发明之药物组合物方面具实用性的抛弃式笔型递送装置的实例包括，但不限于SOLOSTARTMpen(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(NovoNordisk)以及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM Autoinjector(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)以及HUMIRATMPen(Abbott Labs,Abbott Park IL)，仅举几个为例。
在某些情况下，药物组合物以控制释放系统的方式被投递。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer，上文；Sefton 1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又另一个实施方案中，控制释放系统被置放在组合物标的邻近处，因此仅需要全身性剂量的一部分(参见，例如Goodson,1984,Medical Applications of Controlled Release,上文,vol.2,pp.115-138中)。其他控制释放系统在Langer,1990,Science 249:1527-1533的回顾中被讨论。
可注射制品可包括用于静脉内、皮下、皮内及肌肉内注射、点滴输注等的剂型。此等可注射制品可依照公知方法制备。例如，可注射制品可例如，藉由将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于习知用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备。有关用于注射的水性介质，例如生理盐水、含有葡萄糖与其他助剂的等渗溶液等，其可与适当助溶剂(诸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。有关油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可与助溶剂(诸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)组合使用。由此制备的注射剂较佳地被填充于适当安瓿中。
有利地，上述供经口或肠胃外使用的药物组合物被制备为呈适于活性成分剂量之单位剂量的剂型。此等呈单位剂量之剂型包括，例如锭剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿)、栓剂等。在1个单位剂量中，所含前述抗体量通常每剂型约5至约500mg；尤其是呈注射型式，前述抗体就其他剂型而言较佳含有约5至约100mg以及约10至约250mg。
抗体的治疗用途
本发明抗体(及包含抗体之药物组合物)尤其可用于治疗、预防及/或改善与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导，或可藉由阻断或减弱HLA-B*27介导之抗原呈递而治疗的任一种疾病或病症。可使用本发明抗-HLA-B*27抗体治疗的例示性疾病与病症包括脊柱关节病，诸如强直性脊柱炎、反应性关节炎(莱特尔综合征)、急性前眼色素层炎、肌炎、牛皮癣关节炎、溃疡性结肠炎等。其他可使用本发明抗-HLA-B*27抗体预防、治疗及/或改善的疾病与病症包括实体器官移植排斥与移植物抗宿主病(GVHD)。
给药方案
依据本发明的某些实施方案，多剂量之抗-HLA-B*27抗体可在一段限定时间里被施用给个体。依据本发明此方面的方法包含顺序将多剂量之抗-HLA-B*27抗体施用给个体。如本文所用，”顺序施用”表示各剂量的抗-HLA-B*27抗体在不同时间点被施用给个体，例如在由预定间隔(例如数小时、数天、数周或数月)所分开的不同天。本发明包括含有将单一起始剂量之抗-HLA-B*27抗体，接而为一或多个第二剂量的抗-HLA-B*27抗体，以及视情况一或多个第三剂量的抗-HLA-B*27抗体顺序施用给患者的方法。
术语”起始剂量”、”第二剂量”及”第三剂量”意指施用抗-HLA-B*27抗体的时间顺序。因此，”起始剂量”是在治疗方案开始时被施用的剂量(亦意指为”基线剂量”)；”第二剂量”为在起始剂量之后被施用的剂量；而”第三剂量”为在第二剂量之后被施用的剂量。起始剂量、第二剂量与第三剂量可全都含有等量之抗-HLA-B*27抗体，但通常会在施用频率方面有所不同。但是，在某些实施方案中，起始剂量、第二剂量及/或第三剂量中所含有之抗-HLA-B*27抗体数量将会在治疗期间彼此改变(例如调高或调低，若需要的话)。在某些实施方案中，两个或更多个(例如2、3、4或5)剂量在治疗方案开始被施用作为”加载剂量”，接着以较不频繁的方式施用后续剂量(例如”维持剂量”)。
在本发明的一个例示性实施方案中，各第二剂量及/或第三剂量在紧接先前剂量之后1至26(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更久)周被施用。词组”紧接先前剂量”，如本文所用，表示以多次施用的顺序，抗-HLA-B*27抗体剂量在顺序上于下一个剂量施用之前没有任何插入的剂量被施用给患者。
依据本发明此方面的方法可含有将任一数目的第二剂量及/或第三剂量抗-HLA-B*27抗体施用给患者。例如，在某些实施方案中，仅有单一第二剂量被施用给患者。在其他实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第二剂量被施用给患者。同样地，在某些实施方案中，仅有单一第三剂量被施用给患者。在其他实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多)第三剂量被施用给患者。
在涉及多个第二剂量的实施方案中，各第二剂量可以与其他第二剂量相同的频率被施用。例如，各第二剂量可在紧接先前剂量之后1至2周被施用给患者。同样地，在涉及多个第三剂量的实施方案中，各第三剂量可以与其他第三剂量相同的频率被施用。例如，各第三剂量可在紧接先前剂量之后2至4周被施用给患者。或者，第二剂量及/或第三剂量施用给患者的频率可能随着治疗方案过程而改变。施用频率也可在治疗过程期间由临床医师依据个别患者的需要遵循临床检验来予以调整。
组合疗法
本发明包括治疗给药方案，其包含将本发明抗-HLA-B*27抗体与至少一种其他治疗有效成分组合施用。该等其他治疗有效成分的非限制性实例包括其他HLA-B*27阻断剂，诸如，例如第二抗-HLA-B*27抗体。可与本发明抗-HLA-B*27抗体有益组合施用的其他药剂包括，细胞因子抑制剂(包括小分子细胞因子抑制剂与抗体，其结合至诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18的细胞因子或其个别受体)、抗病毒剂、抗生素、止痛剂、皮质类固醇及/或NSAID。
其他治疗活性成分可在本发明抗-HLA-B*27抗体施用之前、同时或之后被施用；(为本揭示内容之用，此等施用方案被视为”组合”其他治疗活性成分施用抗-HLA-B*27抗体)。
抗体的诊断用途
本发明的抗-HLA-B*27抗体也可以用来检测及/或测量样品中的HLA-B*27或表达HLA-B*27的细胞，例如供诊断之用。举例而言，抗-HLA-B*27抗体或其片段可以用来诊断特征为存在有HLA-B*27等位基因亚变体(例如HLA-B*2705或HLA-B*2709)的病况或疾病。有关HLA-B*27的例示性诊断分析可包含，例如使得自于一患者的样品与本发明之抗-HLA-B*27抗体接触，其中抗-HLA-B*27抗体标定有可检测的标记或报导分子。或者，未标定的抗-HLA-B*27抗体可以组合本身可被检测到标定之二级抗体一起使用于诊断应用。可检测到的标记或报导分子可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，诸如异氰酸荧光素或罗丹明；或诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或萤光素酶的酶。可用来检测或测量样品中的HLA-B*27的特定例示性分析包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)以及荧光-活化细胞分选(FACS)。
依据本发明，可用于HLA-B*27诊断分析中的样品包括任何可得自于患者的组织或体液样品，其在正常或病理状态下含有可检测数量的HLA-B*27蛋白或其片段。一般来说，测量HLA-B*27在自健康患者(例如未罹患与HLA-B*27或特定HLA-B*27等位基因有关之疾病或病况的患者)所得到之特定样品中的水平以在开始时建立基线，或标准HLA-B*27水平。HLA-B*27的这个基线水平接而可以与得自于被怀疑带有与HLA-B*27相关疾病或病况之个体的样品中所测得的HLA-B*27水平来进行比较。
实施例
提出下列实施例俾以将如何制造与使用本发明方法和组合物之完整揭示内容以及说明提供给本领域技术人员，且不欲限制发明人就其发明所视为的范围。已尽力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但可能产生某些实验误差与偏差。除非另有指明，否则份为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，而压力为大气压或近乎大气压。
实施例1.制造抗-HLA-B*27的人类抗体
为制造抗-HLA-B*27抗体，依据标准方法，使用可溶性HLA-B*27融合蛋白(包含融合至HLA-限定型肽与β2m序列的HLA-B*2705重链细胞外域)，或使用表达HLA-B*27的组织/细胞及其组合免疫小鼠(参见，例如美国专利第6,596,541号)。藉由HLA-B*27特异性免疫分析监控抗体免疫反应。当达到所欲的免疫反应时，收集脾脏细胞并且与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并挑选杂交瘤细胞系而鉴定出会生产HLA-B*27特异性抗体的细胞系。使用此技术获得数种抗-HLA-B*27嵌合抗体(亦即具有人类可变域及小鼠恒定域的抗体)；以此方式所制造的例示性抗体命名如下：2477N、2490N、2482N、2477N2、2490N2、2482N2、2480N、2497N、2491N、2499N及2718N。
如US 2007/0280945A1中所述，亦在不融合至骨髓瘤细胞的情况下直接由抗原-阳性B细胞分离抗-HLA-B*27抗体。使用此方法，获得数种完整人类抗-HLA-B*27抗体(亦即具有人类可变域与人类恒定域的抗体)；以此方式所制造的例示性抗体命名如下：2524P、2526P、2528P、2530S、2532P、2534S、2538P、2542P、2555P、2559P、2560P、2562S及2564S。
依据本实施例方法所制造的例示性抗-HLA-B*27抗体的某些生物特性详细描述于下面的实施例中。
实施例2.重链与轻链可变区氨基酸序列
表1显示所选抗-HLA-B*27抗体的重链与轻链可变区(HCVR与LCVR)及互补决定区(CDR)的氨基酸标识符号(SEQ ID NO)。
表1
抗体在本文中通常依据下列命名法来指称：Fc前缀(例如”H4H”、”H1M”、”H2M”)，接着是数字标识符号(例如表1中所示的”2477”或”2524”)，然后为”P”、”N”或”S”字尾。因此，依据这个命名法，抗体在本文可指称为例如”H1M2477N”或”H4H2524P”。本文中所用抗体命名的H4H、H1M及H2M前缀表示抗体的特定Fc区。例如，”H1M”抗体具有小鼠IgG1Fc，而”H4H”抗体具有人类IgG4Fc。如同本领域技术人员所理解，H1M或H2M抗体可转换成H4H抗体，且反之亦然，但在任何情况下，可变域(包括CDR)-由表1中所示数字标识符号所指-维持相同。
实施例3.表面等离振子共振导出之人类单克隆抗-HLA-B*27抗体的结合亲和力与动力学常数
使用实时表面等离振子共振生物传感器分析(Biacore T200、3000或T100-2)，针对结合至经纯化的抗-HLA-B*27抗体之抗原，测定结合缔合与解离速率常数(分别为ka及kd)并且计算平衡解离常数与解离半衰期(分别为KD与t1/2)。测试抗体结合至经工程化之HLA-B*27胞外域线内融合蛋白(”scHLA-B27-mmH”，SEQ ID NO:387)的抗体，该融合蛋白由下列组分构成：N端HLA限定型肽序列(SRYWAIRTR，SEQ ID NO:387的氨基酸1-9)；继而为第一接头序列(SEQ ID NO:387的氨基酸10-19)；接着是人类β-2微球蛋白(β2m)序列(SEQ ID NO:387的氨基酸20-118)；继而为第二接头序列(SEQ ID NO:387的氨基酸119-133)；接着为HLA-B*2705重链的细胞外区(SEQ ID NO:387的氨基酸134-409)；以及最后为一个myc-myc-六组氨酸C端标志(SEQ ID NO:387的氨基酸410-437)。
在透过将胺直接偶联至Biacore CM5传感芯片而产生的多克隆山羊抗-人类Fc-γ-特异性抗体(Jackson Lab,#109-005-098)或单克隆小鼠抗-人类Fc抗体(GE Healthcare,#BR-1008-39)表面上捕获抗-HLA-B*27抗体。不同浓度的scHLA-B27-mmH被注射通过单克隆抗体捕获表面历时4分钟以测定缔合速率，且接着监控解离历时8分钟。在25℃与37℃下以50μl/分的流速使用HBST缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)测定温度依赖性结合(表4与5)。以相同流速在含有0.05％v/v表面活性剂P20的PBS缓冲液中测定pH依赖性结合(表2与3)。
动力学缔合(ka)与解离(kd)速率常数是藉由使用Scrubber2.0曲线拟合软件处理并将数据拟合至1：1结合模型而被测定。结合解离平衡常数(KD)与解离半衰期(t1/2)是由如下的动力学速率常数计算出：KD(M)＝kd/ka；且t1/2(分)＝(ln2/(60*kd)。结果显示于表2-5中(IC＝不确定；NB＝无结合)。
表2：在25℃下于pH 7.2的PBS中，scHLA-B27-mmH结合至不同单克隆抗体的动力学
mAb捕获的 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(分)
H4H2524P 1.13E+05 7.85E-03 6.90E-08 1
H4H2526P 4.32E+04 3.32E-05 7.60E-10 348
H4H2528P 2.80E+04 7.64E-05 2.71E-09 151
H4H2530S 3.98E+05 2.66E-04 6.68E-10 43
H4H2532P 4.86E+05 2.22E-04 4.57E-10 52
H4H2534S 3.46E+05 7.35E-04 2.13E-09 16
H4H2538P 4.50E+05 1.66E-04 3.70E-10 69
H4H2542P 9.70E+04 5.03E-03 5.21E-08 2
H4H2555P 4.97E+05 2.44E-04 4.91E-10 47
H4H2559P 4.07E+05 1.77E-04 4.34E-10 65
H4H2560P 5.80E+05 7.25E-04 1.25E-09 16
H4H2562S 9.15E+04 2.79E-03 3.05E-08 4
H4H2564S 6.67E+04 5.90E-04 8.84E-09 20
H4H2477N2 1.30E+04 5.79E-04 4.40E-08 20
H4H2480N 2.01E+04 6.43E-04 3.20E-08 18
H4H2482N2 3.88E+04 5.64E-03 1.45E-07 2
H4H2490N2 2.50E+04 5.98E-03 2.39E-07 2
H4H2491N 5.43E+04 4.38E-04 8.06E-09 26
H4H2497N 2.28E+04 5.07E-04 2.23E-08 23
H4H2499N IC IC IC IC
H4H2718N 3.14E+04 3.05E-03 9.73E-08 4
表3：在25℃下于pH 5.75的PBS中，scHLA-B27-mmH结合至不同单克隆抗体的动力学
mAb捕获的 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(分)
H4H2524P 3.80E+04 7.68E-03 2.04E-07 2
H4H2526P 5.14E+04 3.84E-05 7.39E-10 301
H4H2528P 3.14E+04 8.57E-05 2.74E-09 135
H4H2530S 7.13E+04 7.62E-04 1.07E-08 15
H4H2532P 4.45E+05 3.20E-04 7.17E-10 36
H4H2534S 4.50E+04 2.40E-03 5.34E-08 5
H4H2538P 4.12E+05 2.64E-04 6.41E-10 44
H4H2542P 3.68E+04 1.80E-02 4.88E-07 1
H4H2555P 4.42E+05 3.78E-04 8.55E-10 31
H4H2559P 3.76E+05 2.71E-04 7.20E-10 43
H4H2560P 2.71E+05 2.09E-03 7.70E-09 6
H4H2562S 6.00E+04 5.71E-03 9.50E-08 2
H4H2564S 5.88E+04 4.40E-03 7.48E-08 3
H4H2477N2 1.32E+04 2.11E-03 1.60E-07 5
H4H2480N 1.92E+04 2.47E-03 1.29E-07 5
H4H2482N2 4.78E+04 6.76E-03 1.42E-07 2
H4H2490N2 3.09E+04 7.33E-03 2.37E-07 2
H4H2491N 9.60E+04 2.76E-03 2.89E-08 4
H4H2497N 2.91E+04 9.88E-04 3.39E-08 12
H4H2499N IC IC IC IC
H4H2718N 3.28E+04 3.19E-03 9.75E-08 4
表4：在25℃下于pH 7.4的HBST中，scHLA-B27-mmH结合至不同单克隆抗体的动力学
mAb捕获的 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(分)
H4H2524P 2.16E+05 5.17E-03 2.39E-08 2
H4H2526P 5.75E+04 1.20E-04 2.08E-09 96
H4H2528P 2.50E+04 1.51E-04 6.00E-09 77
H4H2530S 5.78E+05 7.05E-04 1.22E-09 16
H4H2532P 1.23E+06 5.55E-04 4.52E-10 21
H4H2534S 3.47E+05 1.80E-03 5.18E-09 6
H4H2538P 9.70E+05 5.86E-04 6.04E-10 20
H4H2542P 9.00E+04 5.20E-03 5.80E-08 2
H4H2555P 1.25E+06 6.49E-04 5.21E-10 18
H4H2559P 6.85E+05 6.13E-04 8.95E-10 19
H4H2560P 1.22E+06 1.79E-03 1.47E-09 6
H4H2562S 2.48E+05 2.47E-03 1.00E-08 5
H4H2564S 1.69E+05 6.03E-04 3.57E-09 19
H4H2477N2 6.50E+04 1.10E-03 1.69E-08 11
H4H2480N 5.50E+04 1.32E-03 2.40E-08 9
H4H2482N2 5.52E+04 6.60E-03 1.20E-07 2
H4H2490N2 3.27E+04 8.46E-03 2.59E-07 1
H4H2491N 1.60E+05 2.87E-04 1.80E-09 40
H4H2497N 2.96E+04 9.95E-04 3.36E-08 12
H4H2499N 7.90E+04 1.68E-03 2.13E-08 7
H4H2718N 6.17E+04 2.77E-03 4.49E-08 4
H4H2477N NB NB NB NB
H4H2482N 4.71E+04 9.30E-03 1.97E-07 1.2
H4H2490N 3.53E+04 3.52E-04 9.97E-09 33
表5：在37℃下于pH 7.4的HBST中，scHLA-B27-mmH结合至不同单克隆抗体的动力学
mAb捕获的 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) t1/2(分)
H4H2524P 2.06E+05 5.51E-03 2.68E-08 2
H4H2526P 8.05E+04 3.15E-04 3.91E-09 37
H4H2528P 3.34E+04 6.81E-04 2.04E-08 17
H4H2530S 9.51E+05 1.79E-03 1.88E-09 6
H4H2532P 1.48E+06 1.24E-03 8.37E-10 9
H4H2534S 4.52E+05 3.92E-03 8.70E-09 3
H4H2538P 1.23E+06 1.40E-03 1.13E-09 8
H4H2542P 4.40E+04 7.56E-03 1.70E-07 2
H4H2555P 1.60E+06 1.63E-03 1.02E-09 7
H4H2559P 1.19E+06 1.40E-03 1.18E-09 8
H4H2560P 1.36E+06 2.66E-03 1.96E-09 4
H4H2562S 3.79E+05 2.89E-03 7.63E-09 4
H4H2564S 1.89E+05 1.35E-03 7.17E-09 9
H4H2477N2 8.70E+04 4.06E-03 4.70E-08 3
H4H2480N NB NB NB NB
H4H2482N2 3.50E+04 1.50E-02 4.30E-07 1
H4H2490N2 3.70E+04 1.31E-02 3.60E-07 1
H4H2491N 2.11E+05 4.78E-04 2.27E-09 24
H4H2497N 1.19E+04 4.01E-03 3.37E-07 3
H4H2499N 1.08E+05 3.00E-03 2.80E-08 4
H4H2718N 1.57E+05 4.58E-03 2.90E-08 3
在25℃下于pH 7.2的PBS中，21个抗-HLA-B*27抗体中有20个如表2中所示以370pM至239nM的KD值结合scHLA-B27-mmH。某个抗体，H4H2499N，产生低结合信号，其中动力学数据无法被拟合至标准模型(IC)。
在25℃下于pH 5.75的PBS中，21个抗-HLA-B*27抗体中有20个如表3中所示以641pM至488nM的KD值结合scHLA-B27-mmH。某个抗体，H4H2499N，产生低结合信号，其中动力学数据无法被拟合至标准模型(IC)。
在25℃下于pH 7.4的HBST中，24个测试抗-HLA-B*27抗体中有23个如表4中所示以452pM至259nM的KD值结合scHLA-B27-mmH。某个抗体，H4H2477N，在这些条件下未结合scHLA-B27-mmH(NB)。
当在37℃下于pH 7.4的HBST中，21个测试抗-HLA-B*27抗体中有20个如表5中所示以837pM至430nM的KD值结合scHLA-B27-mmH。某个抗体，H4H2480N，在这些条件下未结合scHLA-B27-mmH。
针对各测试抗体计算在pH 5.75下的KD值对在pH 7.2下的KD值的比率，以评估抗-HLA-B*27抗体的pH依赖性结合特性(表6)。如本文中所用，相较于在较低pH值下所表现的结合，若抗-HLA-B*27抗体在pH值增加下表现较高程度的结合(例如较低的KD值)，则该抗体表现”pH依赖性结合”；这可以表示为结合率(例如，藉由在pH 5.75下的KD值比在pH 7.2下的KD值高出至少5倍而证实pH依赖性结合)(如下表6中)。
表6：pH依赖性结合
如表6中所示，表现如上文定义之pH依赖性结合的本发明抗-HLA-B*27抗体为：H4H2530S、H4H2534S、H4H2542P、H4H2560P及H4H2564S。
实施例4.抗-HLA-B*27抗体在体外阻断HLA-B*27所诱发的T细胞活化
藉由使用一个混合培养物展开一个生物分析以测量由HLA-B*27-肽复合体与对应T细胞受体(TCR)之间相互作用所诱发的T细胞活化，该混合培养物是衍生自两种哺乳动物细胞系：C1R-neo(ATCC，#CRL-2369)，一种先前显示表现低或无内源性程度之HLA-A与HLA-B分子的B淋巴母细胞系；以及Jurkat，为一种人类CD4+T细胞系。
关于生物分析的第一个组分，C1R-neo细胞系经稳定转染以过度表现HLA-B*2705等位基因亚变体的重链(SEQ ID NO:385的氨基酸25-362)以及人类β2微球蛋白(β2m；SEQ ID NO:388的氨基酸21-119)与NP383-391，一种衍生自A型流感病毒核蛋白的九个氨基酸的HLA-B*27限定型肽(SRYWAIRTR[SEQ ID NO:389])。NP383-391阳性细胞经由FACS分选，而分离出一个稳定的细胞系(C1R-neo/HLA-B*2705/β2m/NP383-391)，其被维持在补充10％胎牛血清以及盘尼西林/链霉素/L-谷氨酰胺的依思考夫培养基(Iscove’s medium)(Irvine Scientific,Cat.No.#9032)中。
关于生物分析的第二个组分，报导细胞系，Jurkat/NFAT-Luc(带有一个IL-2反应性要素偶合至萤光素酶表现[NFAT-萤光素酶])经工程化以表现：(1)GRb，一种由两个次单位α(SEQ ID NO:390)与β(SEQ ID NO:391)所组成的TCR，其等被选殖自HLA-B*27个体(完整受体，GRbAB，在与HLA-B*2705的复合体中特异结合NP383-391肽)；以及(2)CD8共受体，由两个次单位α(SEQ ID NO:392)与β(SEQ ID NO:393)所组成，其等对于活化第I型限定性TCR(通常表现在CD8+T细胞上)来说是必要的。分离所得到的稳定细胞系(Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB)并维持在补充10％胎牛血清以及盘尼西林/链霉素/L-谷氨酰胺的RPMI(Irvine Scientific,#9160)中。
就生物分析而言，以10,000个细胞/孔将C1R-neo/HLA-B*2705/β2m/NP383-391细胞种植至96孔分析盘中。为测定IC50值，将从100nM降至0.1nM抗-HLA-B*27抗体的1：3连续稀释品(加上无抗体对照)添加至细胞并在37℃下于5％CO2中培育1小时。为刺激HLA-TCR活化，将100,000个Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB细胞加至各孔并在37℃下于5％CO2中培育5小时。藉由添加OneGlo受质(Promega,#E6051)试剂检测萤光素酶活性。结果归纳于表7中。
表7：抗-HLA-B*27抗体阻断Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB细
胞的C1R-neo/HLA-B*2705/β2m/NP383-391细胞依赖性刺激
抗体 IC50(M)
H4H2524P 1.185E-09
H4H2526P 8.559E-11
H4H2528P 2.639E-10
H4H2530S 3.749E-10
H4H2532P 3.748E-10
H4H2534S 4.432E-10
H4H2538P 3.626E-10
H4H2542P 1.143E-10
H4H2555P 3.465E-10
H4H2559P 1.802E-10
H4H2560P 6.242E-10
H4H2562S 阻断，非S形
H4H2564S 阻断，非S形
H4H2477N2 强烈活化，非S形
H4H2480N 阻断，非S形
H4H2482N2 阻断，非S形
H4H2490N2 阻断，非S形
H4H2491N 无阻断
H4H2497N 1.193E-10
H4H2499N 1.812E-08
H4H2718N 阻断，非S形
同种型对照 无阻断
如表7中所示，21个测试抗-HLA抗体中有13个于混合培养物分析中以85.6pM至18.1nM的IC50值阻断Jurkat/NFAT-Luc/CD8AB/GRbAB细胞的C1R-neo/HLA-B*2705/β2m/NP383-391细胞依赖性刺激。另外，21个抗体中有6个在分析中阻断，但未呈S形的方式。某个测试抗体，H4H2477N2，在混合培养物生物分析中表现强烈活化，但未呈S形的方式。
实施例5.流式细胞分析确认抗-HLA-B*27抗体结合至表现HLA-B*27的细胞
使用流式细胞分析来确认HLA-B*27抗体结合至HLA-B*27+细胞。测试细胞包括：(a)C1R-neo-B*2705细胞系；(b)来自HLA-B*27转殖小鼠的脾脏细胞；以及(c)来自HLA-B*27+个体的初代人类周边血液单核细胞(PBMC)。C1R-neo-B*2705细胞系为经稳定转染以过度表现HLA-B*2705等位基因之重链与人类β2微球蛋白之亲代C1R-neo细胞系衍生物(参见实施例4)。未经转染的亲代C1R-neo细胞用作为阴性对照。藉由HLA-B*2705之重链与人类β2微球蛋白的转殖异型合子表现而产生转殖小鼠品系[C57BL/6J-Tg(HLA-B27)30-4Trg小鼠品系；原液#003440来自TheJackson Laboratory]。野生型同窝小鼠的脾脏细胞用作为异型合子HLA-B*27+脾脏细胞的阴性对照。初代人类PBMC经鉴定基因型为HLA-B*27阳性，且藉由以商业抗-HLA-B*27抗体(HLA ABC Ab；Millipore#MAB1285F)染色确认表现HLA-B*27等位基因表现。来自HLA-B*27-捐赠者的PBMC用作为阴性对照。
关于使用小鼠脾脏细胞的实验，将小鼠处死并取出脾脏且以机械匀浆。过滤细胞悬浮物并在Histopaque梯度管柱上纯化单核细胞。在Histopaque梯度管柱上由白血球浓缩物(Leukopak；New York BloodBank,NY,#E3752V00)纯化人类PBMC。
关于流式细胞分析，在染色缓冲液(eBioscience,#00-4222)中洗涤100,000个细胞并与全人类IgG(10μg/ml)(Jackson ImmunoResearch,#009-000-003)在4℃下一起培育15分钟，以阻断细胞上的Fc受体。接着，以预定浓度(0.1或1μg/ml)添加抗-HLA-B*27抗体并在4℃下培育30分钟。洗涤细胞一次并与二级抗人类Fc抗体(1：2000稀释度)(JacksonImmunoResearch,#709-116-149)在4℃下一起培育20分钟。洗涤细胞两次并使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,MD)取得荧光测量值，且藉由FlowJo软件分析。当使用二级抗-hFc抗体来检测时，单独使用全人类IgG阻断不会产生超出背景的结合信号。结果归纳于表8中(WT＝野生型小鼠；TG＝HLA-B27/hβ2m转基因小鼠)。
表8：抗-HLA抗体对具有不同HLA表达模式之细胞的FACS结合
如表8中所示，所有的测试抗-HLA-B*27抗体结合至HLA-B*27+转基因脾脏细胞，而在来自野生型小鼠的脾脏细胞上没有检测到超出背景水平的结合。同样地，所有抗体结合C1R-neo-B*2705细胞。在亲代C1R-neo细胞中，H4H2499N、H4H2542P及H4H2562P没有检测到超出背景水平的结合，而所有其他抗体显示超出背景水平的不等结合水平，但低于C1R-neo-B*2705细胞。在人类PBMC中，所有经抗体染色之分来自个体血液的细胞通过基因分型表达HLA-B*27等位基因(”B27(pos)”)。当与结合至来自HLA-B*27阴性捐赠者(”B27(neg)”)的PBMC相比较，结合率从1.1至5.6，其中H4H2499N对HLA-B*27+PBMC表现最高的特异性。
实施例6.HLA-B*27抗体对外周血单核细胞(PBMC)的结合
使用显示会表达HLA-B*27以外之等位基因的PBMC进行其他流式细胞分析实验。将来自4名捐赠者的人类血液收集在K2-EDTA抗凝血管(BD,#366643)中。依据制造商的说明书使用QIAamp DNA blood mini试剂盒(Qiagen,#51304)从全血样品纯化基因组DNA。接着扩增基因组DNA样品，之后使用SeCore试剂盒(Invitrogen，基因座A#5300925，基因座B#5311925D，基因座C#5320925)进行后续HLA-基因座特异性测序反应。使用ABI 3730xL DNA分析仪测定DNA序列，且使用uType SBT HLA测序软件(Invitrogen,#53999-1)测定HLA型。
使用Ficoll离心由相同捐赠者的血液分离人类PBMC。使用ChromPure人类IgG(Jackson Immunoresearch,#009-000-003)阻断PBMC，在4℃下以1μg/ml抗-HLA抗体染色历时30分钟，接着使用染色缓冲液(BD Biosciences,#554657)洗涤，并在4℃下与1：500稀释度的APC-标记的抗人类-IgG二级抗体(Jackson Immunoresearch,#109-136-098)一起培育20分钟。然后洗涤PBMC，再悬浮于稳定固定剂(BDBiosciences,#338036)中并在FACS Canto机器上分选。使用FlowJo软件分析数据。
从捐赠者HD1、HD2、HD3与HD4的测定的第I型HLA等位基因显示于表9中。4个测试的捐赠者中没有一者测定为HLA-B*27阳性。
表9：4名捐赠者全血样品的第I型HLA分类
如同藉由流式细胞分析所测定之抗-HLA抗体对HLA型捐赠者之PBMC的结合显示于表10中。
表10：来自4名捐赠者之抗-HLA抗体对PBMC的FACS结合
如表10中所示，除了抗体H4H2534S、H4H2538P、H4H2542P与H4H2555P以外，所有抗-HLA抗体结合至所有捐赠者之PBMC达某种程度，H4H2534S、H4H2538P、H4H2542P与H4H2555P未结合至HD2捐赠者的PBMC。抗体H4H2499N与H4H2718N(表10的最后两栏)显示结合至非B*27捐赠者之PBMC的最低量。
实施例7.HLA-B*27抗体对表面HLA*B的结合
进一步使用流式细胞分析来测定抗-HLA抗体对于经工程化而过表达不同HLA*B等位基因的细胞系的结合特异性。为了产生表达不同HLA等位基因的细胞系，使用DNA质粒对亲代K562(永生化人类骨髓性白血病)细胞进行电穿孔，以促使23种不同HLA等位基因(显示于表11中)以及对抗新霉素或潮霉素之抗生素抗性基因稳定整合。接着，经电穿孔的细胞系处在抗生素筛选下历时2.5至5周，以筛选出表达特定HLA等位基因的细胞。使用缀合至藻红蛋白(Biolegend,#311406)的HLA-A、B、C、泛特异性抗体(克隆W6/32)，针对带有最高水平表面HLA(表达者的前10％)的群体经FACS来分选所生成的K562/HLA细胞系。
表11：在产生表达HLA-B之K562细胞系时所用的HLA-B等位基因
为实施流式细胞分析，在200μL的染色缓冲液(BSA)(BDPharmingen,#554657)中洗涤～2x105细胞/孔，并在室温下使用1μg/mL的纯化人类IgG(Jackson ImmunoResearch,#009-000-003)阻断15分钟。接着，以1μg/mL添加抗-HLA抗体并在4℃下培育30分钟。使用染色缓冲液洗涤细胞两次，接着在4℃下以1：500稀释度与缀合至别藻蓝蛋白的山羊多克隆F(ab’)2二级试剂(Jackson ImmunoResearch,#109-136-098)一起培育20分钟，该试剂对人类IgG Fc-γ片段具有特异性。以200μL洗涤细胞两次并使用FACSCanto II仪器(BD Biosciences,MD)取得荧光测量值并使用FlowJo软件(Tree Star)分析。
结合至表达不同HLA-B等位基因的K562细胞系的20个抗-HLA抗体的结果显示为MFI信号相对于亲代K562细胞系之MFI信号的比率，其显示于下面表12、13及14中。在20个测试抗体中，H4H2499N表现最高程度的特异性。
表12：抗-HLA抗体对表达七种不同HLA-B等位基因之K562细胞的FACS结合
表13：抗-HLA抗体对表达六种不同HLA-B等位基因之K562细胞的FACS结合
表14：抗-HLA抗体对表达十种不同HLA-B等位基因之K562细胞的FACS结合
实施例8.抗体对HLA-B*27等位基因亚变体的偏好结合
相较于结合HLA-B*07等位基因变体的能力，使用电化学发光检测技术测量抗-HLA-B*27抗体结合至细胞表面人类HLA-B*27等位基因亚变体(亦即HLA-B*2705与HLA-B*2709)的能力。关于这些研究，使用经稳定转染以表达HLA-B*07重链(CR1-B7,ATCC#CRL-2371)、HLA-B*2705重链(SEQ ID NO:385的氨基酸25-362)或HLA-B*2709重链(SEQ IDNO:386的氨基酸25-362)的C1R-neo细胞。表达HLA-B*的每一细胞系也表达人类β2微球蛋白(β2m；SEQ ID NO:388的氨基酸21-119)，其与HLA重链形成非共价复合体。
收获细胞并使用CellometerTMAuto T4细胞计数器(NexcelomBioscience)进行计数。每孔约20,000个细胞于PBS中被接种至碳电极板(Meso Scale Discovery,#L15-XB-3/L11XB-3)并接着在37℃下培育1小时。在使用PBS+2％(w/v)BSA于25℃下阻断1小时后，在25℃下将1nM或1.1nM的抗-HLA-B*27抗体转移至结合平板的细胞并在25℃下培育1小时。使用AquaMax2000平板洗涤器(MDS Analytical Technologies)洗去未结合的抗体。使用缀合SULFO-TAG的TM抗-mFc抗体(JacksonImmunoResearch,#115-005-164)或抗-hFc抗体(Meso Scale Discovery,#R32AJ-1)检测细胞结合的抗-HLA-B*27抗体。就细胞结合测量而言，添加MSD读取缓冲液(Meso Scale Discovery,#R92TD-2)至细胞-抗体混合物，并于电化学刺激之前容许在室温下培育15分钟。使用SECTOR Imager6000读取仪(MSD)利用620nm波长滤波器检测发光。发光强度与结合至细胞之抗体量相关。结合C1R-B*07、C1R-neo B*2705或C1R-neo B*2709之抗-HLA-B*27抗体相对于C1R-neo亲代细胞的特异性比率显示于表15中。(-)表示高于结合至C1R-neo细胞1至3倍的比率；(+)表示超出结合至C1R-neo细胞3至10倍的比率；(++)表示超出结合至C1R-neo细胞10至50倍的比率；而(+++)表示超出结合至C1R-neo细胞50倍的比率。
表15：结合至表达HLA-B*等位基因之细胞的抗体相对于结合至亲代细胞之抗体的相对比率
如表15中所示，仅有H2aM2482N表现显著结合至表达HLA-B*07等位基因之细胞(具有超出结合至C1R-neo细胞10至50倍的特异性比率)。抗体H1M2477N、H1M2480N、H2aM2482N、H1M2490N、H2aM2499N、H4H2524P、H4H2526P、H4H2528P、H4H2532P、H4H2538P、H4H2555P、H4H2559P及H4H2562S表现与结合至表达HLA-B*2709等位基因变体之细胞大致相同结合至表达HLA-B*2705等位基因变体之细胞。另一方面，相较于结合至表达HLA-B*2709等位基因之细胞，某些例示性抗体表现相对更为强烈结合至表达HLA-B*2705等位基因的细胞(H1M2497N、H2bM2718N、H4H2530S、H4H2534S、H4H2542P及H4H2560P)。
除了H2bM2491N与H4H2564S以外，相较于表达HLA-B*07等位基因变体之细胞，所有的测试抗体表现增强的结合至表达HLA-B*2705及/或HLA-B*2709等位基因亚变体之细胞。举例而言，抗体H2aM2499N显示结合至表达HLA-B*2705及HLA-B*2709等位基因亚变体之细胞超出结合至C1R-neo细胞至少50倍(在表15中表示为[+++])，且结合至表达HLA-B*07等位基因变体之细胞超出结合至C1R-neo细胞少于3倍(在表15中以[-]表示)。同样但较不明显地，在本实施例中所测试的数个其他例示性抗-HLA-B*27抗体也观察到结合特性升高，如表15中所示。
实施例9.在体内评估抗-HLA-B*27抗体的活性
研究抗-HLA-B*27抗体在体内的活性。在得自于Jackson实验室的C57BL/6野生型(WT)小鼠的肝脏中，藉由流体动力学递送DNA(HDD)过表达HLA-B*27(UniProt存取编号P03989的氨基酸25-362)以及人类β2微球蛋白(β2m；GenBank存取编号NP_004039的氨基酸21-119)。关于HDD实验，将WT小鼠分组，每组2-5只小鼠，且每只小鼠注射50μg表达HLA-B*27之质粒加上50μg表达β2m之质粒，或50μg空质粒对照。在HDD注射后第3天及第10天，四组中每一组的小鼠经腹膜内注射30mg/kg的抗-HLA抗体H4H2542P、H4H2499N或H4H2482P，或同种型对照抗体。在HDD后第14天处死小鼠，并藉由胶原蛋白酶处理以及percoll离心分离出浸润肝脏的细胞。使用ACK溶解缓冲液(Gibco,#A1492-01)溶解肝脏红血球。以活/死细胞染料(Invitrogen,#L34957)以及抗CD45抗体(eBioscience,#12-0451-82)对浸润的免疫细胞进行染色，以检测浸润白血球，并以抗CD3抗体(BD Biosciences,#552774)、抗CD4抗体(Biolegend,#100414)及抗CD8抗体(Biolegend,#100734)进行染色以鉴别不同的T细胞群。在FACS Canto上进行流式细胞分析并使用FlowJO软件分析数据。以频率(亦即从肝脏使用胶原蛋白酶处理与percoll离心分离而且为淋巴细胞、CD8+细胞或CD4+细胞(相对于例如肝细胞)的完整/活细胞的百分比)测量免疫细胞且通常尤其是CD8+与CD4+细胞浸润已处死动物之肝脏的水平。
藉由流式细胞仪分析在淋巴细胞门中的活细胞频率(表16)以及浸润肝脏之CD8+T细胞(表17)和CD4+T细胞(表18)的频率。注射对照质粒的小鼠显示约10％免疫细胞，以及浸润肝脏之1％CD8+T细胞和CD4+T细胞的频率，与抗体处理无关。相反地，在使用同种型对照抗体处理的小鼠中，过表达HLA-B*27和β2m使得免疫细胞浸润频率升高(平均值＝27％)，包括CD8+T细胞和CD4+T细胞(分别为6.1％和3.3％)增加。以抗-HLA抗体(H4H25422P及H4H2499N)处理表达HLA-B*27/β2m的小鼠会使得浸润肝脏的免疫细胞明显降低。这个在使用H4H2499N处理的小鼠中最为明显，其亦造成CD8+T细胞和CD4+T细胞的百分率明显降低。相反地，抗-HLA抗体H4H2482P与同种型对照对于免疫细胞浸润至肝脏中没有显著降低。因此，抗-HLA抗体H4H2499N能够阻断炎性细胞浸润至因为HDD而过表达HLA-B*27和β2m之小鼠的肝脏中。
表16：肝脏浸润免疫细胞的频率
表17：肝脏中总CD8+T细胞的频率
表18：肝脏中总CD4+T细胞的频率
实施例10.构建组氨酸置换变体抗-HLA-B*27抗体
在尝试生产具有pH依赖性结合特性(亦即相较于中性pH，在低pH下的结合减少)以及增进体内效力(亦即抗体血清半衰期较长、延长T细胞活化的抑制等)的抗HAL-B*27抗体变体时，构建一系列的变体抗体。具体而言，构建亲代抗体H4H2477N2和H4H2499N的突变形式，其中各抗体的互补决定区(CDR)中的各(非组氨酸)氨基酸被个别突变成组氨酸。如表1中所示，亲代H4H2477N2抗体的重链可变区(HCVR)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列，而亲本H4H2477N2抗体的轻链可变区(LCVR)包含SEQ IDNO:58的氨基酸序列；亲本H4H2499N抗体的重链可变区(HCVR)包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，而亲本H4H2499N抗体的轻链可变区(LCVR)包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列；亲代H4H2477N2和H4H2499N抗体的CDR序列分别显示于表19A及19B中。
表19A：mAb H4H2477N2的CDR序列
CDR 氨基酸序列 SEQ ID NO:
HCDR1 GGSFSDYY 52
HCDR2 INHRGNT 54
HCDR3 ARIQLWLRGYDYYGMDV 56
LCDR1 QGIRND 60
LCDR2 AAS 62
LCDR3 LQHNTYPWT 64
表19B：mAb H4H2499N的CDR序列
CDR 氨基酸序列 SEQ ID NO:
HCDR1 GFTFSDYY 148
HCDR2 ISTSGSTI 150
HCDR3 LLHYYYGMDV 152
LCDR1 QSVSSY 156
LCDR2 DAS 158
LCDR3 QQRSNWPWT 160
做出H4H2477N2的48种个别组氨酸置换变体(31种重链CDR突变体和17种轻链CDR突变体)；以及H4H2499N的43种个别组氨酸置换变体(25种重链CDR突变体和18种轻链CDR突变体)。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，于暂时表达后由培养基(上清液)所得到的变体抗体针对pH依赖性结合(亦即相较于中性pH，在酸性pH下对表达HLA-B*27之细胞之结合减少)进行筛选。依据初步上清液筛选，在CDR中包含单一与多个组氨酸置换的数个变体抗体被筛选出来进行更多研究，如表20中所归纳。表20中所显示的His-置换标识符号(例如H4H2477N2的"Y33H"、"N52H"等；以及H4H2499N的"Y32H"、"T53H"等)与H4H2477N2(SEQ ID NO:50/58)和H4H2499N(SEQ ID NO:146/154)的重链及轻链可变区(HCVR/LCVR)氨基酸序列相关。表20中的空细胞表示亲代序列。
表20：筛选进行更多研究的组氨酸置换
实施例11.组氨酸置换变体抗-HLA-B*27抗体对表达HLA-B*27之细胞的pH选择性结合
在两个抗-HLA抗体(H4H2477N2和H4H2499N)的CDR区中针对亲代氨基酸做出组氨酸的单位点与多位点置换，以增加pH选择性结合(参见实施例10)。在pH 7.2与pH 6.0下并使用电化学发光检测技术，测试这些组氨酸变体及其亲代抗体结合至表达在C1R-neo HLA-B*2705细胞上之细胞表面人类HLA-B27。收获细胞、计数并种植至96孔碳电极板上，且如先前所述进行阻断(参见实施例8)。就pH 6.0结合评估来说，在添加抗体前以pH 6.0缓冲液[50mM MES、0.0025M KCl、0.137M NaCl、0.0005MMgCl2x6H2O、0.0009M CaCl2、0.5％(w/v)BSA；透过添加5M NaOH调整至pH 6.0]冲洗平板结合的细胞。在针对pH 7.2结合评估的中性pH缓冲液[PBS+0.5％(w/v)BSA；pH 7.2]或针对pH 6.0结合评估的pH 6.0缓冲液中，透过12点、3倍连续稀释，从50nM起稀释抗-HLA抗体，接着转移至平板结合的细胞并在25℃下培育1小时。使用AquaMax2000板洗涤器(MDS Analytical Technologies)洗去未结合的抗体。使用缀合SULFO-TAGTM的抗人类CH1-特异性抗体(自行生产)检测细胞结合的抗-HLA抗体。亦如上所述添加MSD读取缓冲液、电化学刺激，以及发光检测。发光强度(表示为RLU)与结合至细胞的抗体量相关。使用Prism软件计算结合至C1R-neo B*2705细胞之抗-HLA抗体H4H2499N和H4H2477N2的组氨酸变体的EC50值并分别显示表21与22中。
表21：在pH 7.2与pH 6.0下H4H2499N及其组氨酸变体结合至C1R-neo B*2705细胞之EC50值与最大RLU结合信号的比较
*在与第一个实验不同之日进行
IC＝不确定
表22：在pH 7.2与pH 6.0下H4H2477N2及其组氨酸变体结合至C1R-neo B*2705细胞之EC50值与最大RLU结合信号的比较
在两个不同之日进行亲代抗体H4H2499N及其组氨酸变体的结合实验。两个实验中包括某些抗体，而两个实验的数据显示于表21中。数个组氨酸变体(H4H2499N3、H4H2499N4、H4H2499N11、H4H2499N17、H4H2499N20、H4H2499N21及H4H2499N22)在pH 6.0下的EC50值相较于其在pH 7.2下的EC50值表现出3倍降低，而在两个实验中，亲代抗体在pH 6.0下的EC50值相较于其在pH 7.2下的EC50值表现出1.6倍与2.6倍降低。组氨酸变体中的两者(H4H2499N16与H4H2499N19)在pH 6.0及pH 7.2下均无法分派EC50值，因为在所测试的抗体浓度下缺少完整S形曲线。
如表22中所示，亲代抗体H4H2477N2之组氨酸变体中的两者(H4H2477N3及H4H2477N4)就测试结合至C1R-neo B*2705细胞来说，于pH 6.0下的EC50值相较于其在pH 7.2下的EC50值分别表现出7.7倍与21.8倍降低，而亲代H4H2477N2抗体在pH 6.0下的EC50值相较于其在pH 7.2下的EC50值没有可测量到的降低。就组氨酸变体H4H2477N5而言，在pH6.0及pH 7.2下均无法分派EC50值，因为在所测试的抗体浓度下缺少完整S形曲线。
本发明就范围来说并不受到此处所述的特定实施方案限制。更确切地说，除了此处所述者以外，本发明的各种修饰对于本领域技术人员来说由前面说明与附图来说是清楚的。此等修饰意欲落在随附权利要求的范围内。

Claims (24)

1.一种分离的抗体或其抗原-结合片段，其相较于其他HLA-B等位基因变体表现出对HLA-B*27的结合升高。
2.权利要求1的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段相较于HLA-B*07表现出对HLA-B*2705或HLA-B*2709的结合升高。
3.权利要求2的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，其具有选自由SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354及370所组成的组的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，其具有选自由SEQ IDNO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362及378所组成的组的氨基酸序列。
4.权利要求3的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含选自由SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链与轻链CDR。
5.权利要求4的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，各自具有选自由SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-204-206-208；212-214-216-220-222-224；228-230-232-236-238-240；244-246-248-252-254-256；260-262-264-268-270-272；276-278-280-284-286-288；292-294-296-300-302-304；308-310-312-316-318-320；324-326-328-332-334-336；340-342-344-348-350-352；356-358-360-364-366-368及372-374-376-380-382-384所组成的组。
6.一种特异结合HLA-B*27的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含：(a)重链可变区(HCVR)，具有选自由SEQ IDNO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354及370所组成的组的氨基酸序列；以及(b)轻链可变区(LCVR)，具有选自由SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362及378所组成的组的氨基酸序列。
7.权利要求6的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含选自由SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
8.一种与参考抗-HLA-B*27抗体结合至HLA-B*27上相同表位的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中该参考抗体包含选自由SEQ IDNO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
9.一种与参考抗-HLA-B*27抗体竞争结合至HLA-B*27的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中该参考抗体包含选自由SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362及370/378所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
10.一种相较于其他HLA-B等位基因变体表现出对HLA-B*27的结合升高的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含分别含有SEQ ID NO:52-54-56-60-62-64的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其中在HCDR1域中于氨基酸位33处有组氨酸置换，在HCDR2域中于氨基酸位52处有组氨酸置换，或在HCDR1域中于氨基酸位33处有组氨酸置换且在HCDR2域中于氨基酸位52处有组氨酸置换。
11.一种相较于其他HLA-B等位基因变体表现出对HLA-B*27的结合升高的分离的抗体或其抗原-结合片段，其中该抗体或抗原-结合片段包含分别含有SEQ ID NO:148-150-152-156-158-160的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，具有由下列所组成的组的一或多个置换：
(a)在HCDR1域中于氨基酸位32处有组氨酸置换；
(b)在HCDR2域中于氨基酸位53处有组氨酸置换；
(c)在HCDR1域中于氨基酸位32处有组氨酸置换且在HCDR2域中于氨基酸位53处有组氨酸置换；
(d)在LCDR1域中于氨基酸位27、30与32处有组氨酸置换；
(e)在LCDR1域中于氨基酸位27、28与32处有组氨酸置换；
(f)在LCDR1域中于氨基酸位28、30与32处有组氨酸置换；
(g)在LCDR1域中于氨基酸位28、30与31处有组氨酸置换；
(h)在LCDR1域中于氨基酸位27、28、30与32处有组氨酸置换；
(i)在LCDR3域中于氨基酸位90、92、93与97处有组氨酸置换；
(j)在LCDR3域中于氨基酸位90、92与97处有组氨酸置换；
(k)在LCDR3域中于氨基酸位92、93与97处有组氨酸置换；
(l)在LCDR3域中于氨基酸位90与93处有组氨酸置换；
(m)在LCDR3域中于氨基酸位92与93处有组氨酸置换；
(n)在HCDR3域中于氨基酸位98、100与106处有组氨酸置换；
(o)在HCDR3域中于氨基酸位98、100与104处有组氨酸置换；
(p)在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换；
(q)在HCDR3域中于氨基酸位98、100、104与106处有组氨酸置换；
(r)在HCDR3域中于氨基酸位98、104与106处有组氨酸置换；
(s)在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR1域中于氨基酸位28、30与31处有组氨酸置换；
(t)在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR3域中于氨基酸位90、92与97处有组氨酸置换；以及
(u)在HCDR3域中于氨基酸位100、104与106处有组氨酸置换且在LCDR3域中于氨基酸位92、93与97处有组氨酸置换。
12.一种分离的抗体或其抗原-结合片段，其在pH 5.75下结合至HLA-B*27的KD至少大于5倍在pH 7.2下该抗体结合至HLA-B*27的KD。
13.权利要求12的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 5.75下结合至HLA-B*27的KD至少大于10倍在pH 7.2下抗体结合至HLA-B*27的KD。
14.权利要求13的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 5.75下结合至HLA-B*27的KD至少大于25倍在pH 7.2下抗体结合至HLA-B*27的KD。
15.权利要求14的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段包含选自由SEQ ID NO:226/234、258/266、290/298、338/346及370/378所组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
16.一种分离的抗体或其抗原-结合片段，其在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50至少大于1.5倍在pH 7.2下该抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
17.权利要求16的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50至少大于10倍在pH7.2下该抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
18.权利要求17的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50至少大于25倍在pH7.2下该抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
19.权利要求10的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50至少大于1.5倍在pH7.2下该抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
20.权利要求11的分离的抗体或抗原-结合片段，其中该抗体或其抗原-结合片段在pH 6.0下结合至HLA-B*2705的EC50至少大于1.5倍在pH7.2下该抗体结合至HLA-B*2705的EC50。
21.一种药物组合物，其包含如权利要求1、10、11、12或16中任一项的抗体或抗原-结合片段，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
22.一种治疗、预防或改善与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导的疾病或病症的方法，该方法包含对患有与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导的疾病或病症或处于该疾病或病症风险下的患者施用权利要求21的药物组合物。
23.权利要求22的方法，其中与HLA-B*27活性有关或由HLA-B*27活性介导的疾病或病症选自由脊柱关节病、实体器官移植排斥及移植物抗宿主病(GVHD)组成的组。
24.权利要求23的方法，其中脊柱关节病选自由强直性脊柱炎、反应性关节炎(莱特尔综合征)、急性前眼色素层炎、肌炎、牛皮癣关节炎及溃疡性结肠炎组成的组。
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