CN104936614B - 抗-PDGFR-β抗体及其使用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供结合血小板源生长因子受体β(PDGFR‑β)的抗体以及使用其的方法。依据本发明的某些实施方案，抗体为以高亲和力结合人PDGFR‑β的完全人抗体。本发明的抗体可用于治疗与PDGFR‑β信号传递和/或PDGFR‑β细胞表达相关联的疾病和病症，诸如眼病、纤维化疾病、血管疾病和癌症。

Description

抗-PDGFR-β抗体及其使用
发明领域
本发明涉及对人PDGFR-β具有特异性的抗体及其抗原结合片段，以及其使用方法。
背景
血小板源生长因子(PDGF)是强有力的促细胞分裂原并作为由4种同种型亚基：A、B、C和D组成的五种不同的二聚体构型存在。PDGF的五种二聚体形式是AA、BB、AB、CC和DD，其通过对应的单独PDGF单体的二硫键形成。PDGF配体通过其与PDGF受体(PDGFR)的相互作用发挥其生物学效应。PDGFR是单次跨膜酪氨酸激酶受体，由alpha(α)受体链(PDGFR-α)和/或beta(β)受体链(PDGFR-β)的异源二聚或同源二聚缔合形成。因此，活性PDGFR可以由αα、ββ或αβ受体链配对组成。PDGFR共享共同的结构域结构，包括五个胞外免疫球蛋白(Ig)环，跨膜结构域，和裂开的细胞内酪氨酸激酶(TK)结构域。二聚的PDGF配体和PDGFR之间的相互作用导致受体链二聚化，受体自磷酸化和细胞内信号转导。已经显示在体外ββ受体由PDGF-BB和-DD激活，而αβ受体由PDGF-BB、-CC、-DD和–AB激活，并且αα受体由PDGF-AA、-BB、-CC和-AB激活(参见Andrae等人(2008)Genes Dev 22(10):1276-1312)。
PDGF信号传递已经在多种人类疾病中涉及，包括与病理学新血管形成相关的疾病、血管和纤维化疾病、肿瘤生长和眼病。因此，已经提出PDGF信号传递的抑制剂用于多种治疗环境。例如，已经提议将PDGFR-β的抑制剂用于治疗多种疾病和病症。(Andrae等人(2008)Genes Dev 22(10):1276-1312)。PDGFR-β抑制剂包括非特异性小分子酪氨酸激酶抑制剂诸如甲磺酸伊马替尼、苹果酸舒尼替尼和CP-673451，以及抗PDGFR-β抗体(参见，例如美国专利号7,060,271；5,882,644；7,740,850；和美国专利申请公开号2011/0177074)。也已经提出将抗配体适配体(例如，抗PDGF-B)用于治疗应用。然而，本领域存在对新的、高特异性和强有力的PDGF信号传递的抑制剂的需求。
发明概述
本发明提供了与人血小板源生长因子受体β(“PDGFR-β”)结合的抗体。除其他用途之外，本发明的抗体还可用于抑制PDGFR-β介导的信号传递以及治疗由PDGFR-β活性和/或信号传递所引起的或与其相关的疾病和病症。本发明的抗体也可用于在细胞中诱导细胞死亡，所述细胞在其表面表达高水平的PDGFR-β。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)，或可仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修饰以实现其功能，例如消除残余的效应子功能(Reddy等人,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明提供了包含重链可变区(HCVR)的抗体或其抗原结合片段，该重链可变区含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供了包含轻链可变区(LCVR)的抗体或其抗原结合片段，该轻链可变区含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包含选自由下列组成的组的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、和322/330。
本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、和328，或其基本上相似且具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的序列；以及轻链CDR3(LCDR3)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、和336，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
在某些实施方案中，抗体或抗体的抗原结合片段包含选自由下列组成的组的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对SEQ ID NO：8/16、24/32、40/48、56/64、72/80、88/96、104/112、120/128、136/144、152/160、168/176、184/192、200/208、216/224、232/240、248/256、264/272、280/288、296/304、312/320、和328/336。
本发明还提供了抗体或其片段，其还包含重链CDR1(HCDR1)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、和324，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列；重链CDR2(HCDR2)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、和326，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列；轻链CDR1(LCDR1)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、和332，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列；以及轻链CDR2(LCDR2)结构域，该结构域含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、和334，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明的某些非限制性、示例性的抗体和抗原结合片段分别包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其含有选自由下列组成的组的氨基酸序列SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16(例如H1M3299N)；20-22-24-28-30-32(例如H1M3305N)；36-38-40-44-46-48(例如H1M3310N)；52-54-56-60-62-64(例如H1M3361N)；68-70-72-76-78-80(例如H2M3363N)；84-86-88-92-94-96(例如H2M3365N)；100-102-104-108-110-112(例如H2M3368N)；116-118-120-124-126-128(例如H2M3373N)；132-134-136-140-142-144(例如H2M3374N)；148-150-152-156-158-160(例如H4H3094P)；164-166-168-172-174-176(例如H4H3095S)；180-182-184-188-190-192(例如H4H3096S)；196-198-200-204-206-208(例如H4H3097S)；212-214-216-220-222-224(例如H4H3098S)；228-230-232-236-238-240(例如H4H3099S)；244-246-248-252-254-256(例如H4H3102S)；260-262-264-268-270-272(例如H4H3103S)；276-278-280-284-286-288(例如H4H3104S)；292-294-296-300-302-304(例如H4H3105S)；308-310-312-316-318-320(例如H4H3106S)；和324-326-328-332-334-336(例如H4H3107S)。
在相关的实施方案中，本发明包括与PDGFR-β特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或抗体片段包含重链和轻链CDR结构域，该重链和轻链CDR结构域包含于选自由下列组成的组的重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、和322/330。鉴定HCVR/LCVR氨基酸序列内CDR的方法和技术是本领域内众所周知的，并可用于鉴定本文所公开的指明的HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR区。可用于鉴定CDR的边界的典型的规则包括例如Kabat定义、Chothia定义以及AbM定义。总的来说，Kabat定义是基于序列可变性，Chothia定义是基于结构环区的位置，而AbM定义则是Kabat与Chothia方法之间的折衷。参阅例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest",NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可供利用，以鉴定抗体内的CDR序列。
在另一方面，本发明提供了编码抗PDGFR-β抗体或其抗原结合片段的核酸分子。本发明还包括载有本发明之核酸的重组表达载体以及引入这类载体的宿主细胞，并包括通过在允许生产抗体的条件下培养宿主细胞生产抗体的方法，以及回收所生产的抗体的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了抗体或其片段，其包含由选自由下列组成的组的核酸序列编码的HCVR SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、和321，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列。
本发明还提供了抗体或其片段，其包含由选自由下列组成的组的核酸序列编码的LCVR SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、和329，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列。
本发明还提供了抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的HCDR3结构域SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、和327，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列；以及由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的LCDR3结构域：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、和335，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列。
本发明还提供了抗体或其片段，其还包含由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的HCDR1结构域SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、和323，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列；由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的HCDR2结构域SEQ IDNO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、和325，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列；以及由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的LCDR1结构域SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、和331，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列；以及由选自由下列组成的组的核苷酸序列编码的LCDR2结构域SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、和333，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的其基本上相同的序列。
依照某些实施方案，抗体或其片段包含由如下核酸序列编码的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NO:1和9(例如H1M3299N),17和25(例如H1M3305N),33和41(例如H1M3310N),49和57(例如H1M3361N),65和73(例如H2M3363N),81和89(例如H2M3365N),97和105(例如H2M3368N),113和121(例如H2M3373N),129和137(例如H2M3374N),145和153(例如H4H3094P),161和169(例如H4H3095S),177和185(例如H4H3096S),193和201(例如H4H3097S),209和217(例如H4H3098S),225和233(例如H4H3099S),241和249(例如H4H3102S),257和265(例如H4H3103S),273和281(例如H4H3104S),289和297(例如H4H3105S),305和313(例如H4H3106S),或321和329(例如H4H3107S).
本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗PDGFR-β抗体。在某些应用中，为除去不合乎需要的糖基化位点所进行的修饰，或寡糖链上缺乏存在岩藻糖部分的抗体，也许是有益的，例如用于，增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人.(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行糖基化修饰以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在另一方面，本发明提供了包含与PDGFR-β特异性结合的重组人抗体或其片段以及可药用载体的药物组合物。在相关的方面，本发明之特点是组合物，所述组合物是抗PDGFR-β抗体和第二种治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二种治疗剂是可有利地与抗PDGFR-β抗体组合的任何活性剂。可与抗PDGFR-β抗体有利地组合的示例性的活性剂包括，但不限于，抑制PDGFR-β活性的其他活性剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或不直接与PDGFR-β结合但干扰、阻断或减弱PDGFR-β介导的信号传递的活性剂。本文别处也公开了涉及本发明的抗PDGFR-β抗体的额外的联合疗法和共同制剂。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明之抗PDGFR-β抗体或抗体的抗原结合部分抑制PDGFR-β活性的治疗方法，其中该治疗方法包括施用治疗有效量的含有本发明之抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的病症是通过除去、抑制或降低PDGFR-β活性或信号传递而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或病况。本发明之抗PDGFR-β抗体或抗体片段可以发挥阻断PDGFR-β和PDGFR-β结合伙伴之间的相互作用，或抑制PDGFR-β的信号传递活性的功能。
本发明还包括本发明的抗PDGFR-β抗体或抗体的抗原结合部分用于制造药物的用途，所述药物用于治疗患者中与PDGFR-β活性相关或由其引起的疾病或病症。
在审阅随后的详细说明的过程中，其它实施方案将变得明显。
附图简述
图1是显示PDGF配体阻断测定法的结果的直方图，其中在用本发明的多种抗PDGFR-β抗体或对照抗体处理后，PDGFR-β在生物传感器表面捕获并且将PDGF配体(BB,DD或AB)应用到表面上。结果显示为RU。
图2是显示抗体交叉竞争测定法的结果的矩阵，其中将第一抗PDGFR-β抗体(mAb#1)应用到PDGFR-β包被的传感器尖端上，随后用第二抗PDGFR-β抗体(mAb#2)处理。描绘了测试的每个抗体组合的结合响应(数值-0.01至0.36)。具有黑色字体的浅灰色框代表了自我竞争的结合响应。在具有白色字体的黑色框中突出了在两个方向上均竞争的抗体，独立于抗原结合的顺序。提示不同结合区的无竞争表示为具有黑色字体的白框。
发明详述
在说明本发明之前先要声明，应该理解，本发明并不局限于所说明的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于说明具体实施方案之目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均将具有与本发明所属领域专业人士通常理解的相同含义。本文所用的术语“大约”，当用于列出的某一具体数值时，意为该数值可能在与所列数值相差不大于1％的范围内变化。例如，本文所用的措词“大约100”，包括99和101以及这两者之间的所有数值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。.
尽管与本文所述之方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，但现在描述的是首选的方法和材料。
定义
表达法“血小板源生长因子受体β”、"PDGFRβ,"、"PDGFR-β,"、"PDGFRb"等，如本文所用，指具有SEQ ID NO:341的氨基酸序列的人PDGFR-β蛋白(也参见UniProt登录号P09619)。本文提及的蛋白质、多肽和蛋白片段全部旨在指各个蛋白、多肽或蛋白片段的人类版本，除非明确指明来自非人物种(例如“小鼠PDGFR-β”、“猴PDGFR-β”，等)。
如本文所用，“结合PDGFR-β的抗体”或“抗PDGFR-β抗体”包括这样的抗体，和其抗原结合片段，其结合PDGFR-β蛋白的可溶片段(例如，PDGFR-β胞外结构域的全部或部分)和/或细胞表面表达的PDGFR-β。表达法“细胞表面表达的PDGFR-β”意为PDGFR-β蛋白或其部分，其在体外或体内在细胞的表面上表达，使得PDGFR-β蛋白的至少一部分(例如SEQ ID NO:341的氨基酸33至532)暴露于细胞膜的细胞外侧并且让抗体的抗原结合部分可接近。“细胞表面表达的PDGFR-β”包括ββ受体同源二聚体背景下的PDGFR-β分子和αβ异源二聚体背景下的PDGFR-β分子。可溶PDGFR-β分子包括，例如，如本文实施例3中所描述的单体和二聚PDGFR-β构建体(例如，"PDGFRb.mmh",SEQ ID NO:337[单体]，"PDGFRb.mFc",SEQ ID NO:338[二聚体]和"PDGFRb.hFc",SEQ ID NO:339[二聚体])，或与其基本相似的构建体。
本文所用的术语“抗体”意为包含至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合体，该互补决定区与特定的抗原(如PDGFR-β)特异性地结合或与其相互作用。术语“抗体”包括由四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链，以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子，及其多聚体(例如IgM)。每条重链均包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链均包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。该轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施方案中，抗PDGFR-β抗体(或其抗原结合部分)的FR可能与人类种系序列相同，或可能经过天然或人工的修饰。氨基酸共有序列可根据两个或两个以上CDR的并排分析而定义。
本文所用的术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。本文所用的抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等术语，包括与抗原特异性结合而形成复合体的任何天然产生的、可以酶促方式获得的、合成的或基因改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和恒定区(可选)的DNA之操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。该DNA可以测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟该抗体高变区(例如分离的互补决定区CDR，如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单位。本文所用的“抗原结合片段”这一表达还包括其它工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域删除的抗体、嵌合抗体、CDR移植的抗体、双抗体、三聚抗体、四聚抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)，以及鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常会包含至少一个可变区。可变结构域可以是任何大小或具有任何氨基酸组成，且通常会包含至少一个邻近一个或多个框架序列或符合其读框的CDR。在含有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，该VH结构域和VL结构域的相对位置可为任何适宜的排列。例如，该可变区可以是二聚化的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。备选地，抗体的抗原结合片段可含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本发明之抗体的抗原结合片段内可发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性典型的构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包括上述任何典型的构型中，该可变结构域和恒定结构域可直接相互连接或可通过完整或部分的铰链区或连接区连接。铰链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或以上)氨基酸组成，其在单个肽分子中相邻的可变结构域和/或恒定结构域之间形成柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可包含任何上述可变结构域和恒定结构域构型以非共价相互缔合和/或与一个或多个单体VH或VL结构域缔合(例如通过二硫键)的同源二聚体或异源二聚体(或其它多聚体)。
如同完整的抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性(例如双特异性)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性地与单独的抗原或同一抗原的不同表位结合。对于任何多特异性抗体形式，包括本文所公开的典型的双特异性抗体形式，均可利用本领域内可利用的常规技术，使其适于在本发明之抗体的抗原结合片段的背景下使用。
本发明的抗体可通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)发挥功能。“补体依赖性细胞毒性”(CDC)指在补体的存在下由本发明的抗体裂解表达抗原的细胞。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并从而导致靶细胞裂解。能够使用本领域中公知并且可获得的测定法测量CDC和ADCC。(参见，例如，美国专利号5,500,362和5,821,337，以及Clynes等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656))。抗体的恒定区在抗体固定补体并介导细胞依赖的细胞毒性的能力中是重要的。因此，抗体的同种型可基于其是否对于抗体介导细胞毒性是理想的而选择。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗PDGFR-β抗体是人抗体。本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变所引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括上述氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人抗体”并不意图包括这样的抗体，其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被移植到人类框架序列上。
本发明的抗体，在某些实施方案中，可以是重组人抗体。本文所用的术语“重组人抗体”意在包括所有以重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(将在下文中进一步说明)，从重组的、组合人抗体库分离的抗体(将在下文中进一步说明)，从人类免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参阅例如Taylor等人.(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或者以任何其他涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。这类重组人抗体含有衍生自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，这类重组人抗体经受体外诱变(或者，当使用人类Ig序列转基因动物时，经受体内体细胞诱变)，从而使得该重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列成为这样的序列：它们虽然衍生自人类种系VH序列和VL序列并与它们相关，但也许并不天然地在体内存在于人抗体种系库之中。
人抗体可以两种与铰链异质性相关的形式存在。在第一种形式中，免疫球蛋白分子包含约为150-160kDa的稳定的四链构建物，其中二聚体由链间重链二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是由链间二硫键连接在一起，而是由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约为75-80kDa的分子。这些形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。
第二种形式在多种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人类IgG4铰链的铰链区内单个氨基酸替换可将第二种形式(Angal等人(1993)Molecular Immunology 30:105)的出现频率显著地降低到利用人类IgG1铰链时通常观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体；所述突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。本文所用的“分离的抗体”意为从其自然环境的至少一个组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，从生物体的至少一个组成部分或从抗体自然存在或自然产生的组织或细胞分离或移除的抗体，就是用于本发明目的之“分离的抗体”。“分离的抗体”也包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是经过至少一个纯化或分离步骤的抗体。依照某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本发明包括中和及/或阻断抗PDGFR-β抗体。如本文所用的“中和”或“阻断”抗体旨在指这样的抗体，其与PDGFR-β的结合：(i)干扰PDGFR-β或PDGFR-β片段和PDGF配体(例如，PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB等)之间的相互作用(ii)干扰ββ和/或αβ受体二聚体的形成；和/或(ii)导致PDGFR-β的至少一种生物学功能的抑制。由PDGFR-β中和或阻断抗体导致的抑制不需要是完全的，只要其使用合适的测定法可检测。用于检测PDGFR-β抑制的示例性测定法在本文的工作实施例中描述。
本文公开的抗PDGFR-β抗体与衍生该抗体的相应种系序列相比，在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区可包含一个或多个氨基酸的替换、插入和/或删除。通过将本文所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库可获得的种系序列相比，可以容易地证实这类突变。本发明包括衍生自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生该抗体的种系序列的相应残基，或突变为另一个人类种系序列的相应残基，或突变为相应的种系序列残基的保守氨基酸替换(这类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。本领域专业人士从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，能够容易地产生许多包含一个或多个单个种系突变或其组合的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，上述VH和/或VL区内的所有框架和/或CDR残基均回复突变为在衍生该抗体的原始种系序列中发现的残基。在其它一些实施方案中，只有某些残基被回复突变为原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸或FR4的后8个氨基酸中发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变的残基，被回复突变为原始种系序列。在其他实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即不同于最初衍生该抗体的种系序列的种系序列)的相应残基。此外，本发明之抗体可在框架区和/或CDR区内含有两个或多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个体残基突变为特定种系序列的相应残基，而其他某些不同于原始种系序列的残基则保持不变或突变为不同种系序列的相应残基。一旦获得含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段之后，就很容易测试其一种或多种所需的特性，例如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此一般方式获得的抗体和抗原结合片段均包括在本发明的范围内。
本发明还包括含有本文所公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体的抗PDGFR-β抗体，该变体含有一个或多个保守的氨基酸替换。例如，本发明包括含有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗PDGFR-β抗体，该氨基酸序列相对于本文所公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列，含有例如10个或以下、8个或以下、6个或以下、4个或以下等保守的氨基酸替换。
术语“表位”是指抗原决定簇，其与抗体分子可变区中称为抗原互补位的特异性抗原结合位点相互作用。单个抗原可以有一个以上的表位。因此，不同的抗体可与抗原的不同区域结合并可产生不同的生物学效应。表位可为构象的，也可为线性的。构象性表位是从线性多肽链的不同片段上空间并列的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链上邻近的氨基酸残基形成的。在某些情况下，表位可包括抗原上的糖部分、磷酰基，或磺酰基。
术语“基本的同一性”或“基本上相同”，当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，以下述任何众所周知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或Gap测量，至少有95％的核苷酸序列同一性，优选的是至少有96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基同一性。在某些情况下，与参照核酸分子具有基本的同一性的核酸分子，可编码含有与该参照核酸分子编码的多肽相同或基本上类似的氨基酸系列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本的相似性”或“基本上相似”意为两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的预设空位权重达到最佳比对时，两者至少共享95％的序列同一性，甚至更优选至少有98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置其差别在于保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”是指这样一种替换，即氨基酸残基被另一个带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基)的氨基酸残基所替换。一般而言，保守的氨基酸替换不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别在于保守的替换情况下，可将序列同一性百分比或相似性程度向上调整，以校正替换的保守特性。进行这种调整的方法是本领域专业人士众所周知的。参阅例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。含有化学性质相似侧链的几类氨基酸的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet等人(1992)Science 256:1443 45中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihood matrix)中具有任何正值的变化。“中度保守的”取代是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。.
多肽的序列相似性，也称为序列同一性，通常是用序列分析软件测量的。蛋白质分析软件用指定给各种替换(包括保守氨基酸替换)、删除和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit程序，可在默认参数情况下使用这些程序，以确定紧密相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质与其突变后形成的蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG 6.1版。也可以用FASTA及默认参数或推荐参数、GCG 6.1版程序来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供所查询序列和所搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明之序列与含有大量源自不同生物之序列的数据库进行比较时，另一首选的算法是BLAST电脑程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410及Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
pH依赖性结合
本发明包括具有pH依赖性结合特征的抗PDGFR-β抗体。例如，本发明的抗PDGFR-β抗体在酸性pH时可表现出较之中性pH的降低的与PDGFR-β的结合。备选地，本发明的抗PDGFR-β抗体在酸性pH时可表现出较之中性pH的增强的与其抗原的结合。表达法“酸性pH”包括低于约6.2的pH值，例如，约6.0,5.95,5,9,5.85,5.8,5.75,5.7,5.65,5.6,5.55,5.5,5.45,5.4,5.35,5.3,5.25,5.2,5.15,5.1,5.05,5.0,或更低。如本文所用，表达法“中性pH”意为约7.0至约7.4的pH。表达法“中性pH”包括约7.0,7.05,7.1,7.15,7.2,7.25,7.3,7.35,和7.4的pH值。
在某些情况中，“在酸性pH时较之中性pH的降低的与PDGFR-β的结合”是就酸性pH时抗体结合PDGFR-β的KD值与中性pH时抗体结合PDGFR-β的KD值的比例而言(或反之亦然)。例如，用于本发明的目的，如果抗体或其抗原结合片段表现出约3.0或更高的酸性/中性KD比例时，则可将抗体或其抗原结合片段视为表现出“在酸性pH时较之中性pH的降低的与PDGFR-β的结合”。在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段的酸性/中性KD比例可以为约3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0,11.5,12.0,12.5,13.0,13.5,14.0,14.5,15.0,20.0.25.0,30.0,40.0,50.0,60.0,70.0,100.0或更高。
例如，通过就在酸性pH时较之中性pH的降低的(或增强的)与特别抗原的结合筛选抗体群体，可以获得具有pH依赖性结合特征的抗体。额外地，在氨基酸水平的抗原结合结构域的修饰可以产生具有pH依赖性特征的抗体。例如，通过用组氨酸残基取代抗原结合结构域(例如CDR中)的一个或多个氨基酸，可以获得在酸性pH时相对于中性pH具有降低的抗原结合的抗体。
包含Fc变体的抗PDGFR-β抗体
根据本发明的某些实施方案，提供包含含有一个或多个突变的Fc结构域的抗PDGFR-β抗体，所述突变例如，在酸性pH时较之中性pH增强或降低抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变的抗PDGFR-β抗体，其中(一个或多个)突变增加酸性环境中(例如，在其中pH范围为从约5.5至约6.0的核内体中)Fc结构域与FcRn的亲和力。当施用于动物时此类突变可导致抗体的血清半寿期增加。此类Fc修饰的非限制性实例包括，例如，位置250(例如，E或Q)和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T),254(例如，S或T)，和256(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或位置250和/或428处的修饰；或位置307或308(例如，308F,V308F)，和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L,259I(例如，V259I)，和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252，254，和256(例如，252Y，254T，和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
例如，本发明包括包含Fc结构域的抗PDGFR-β抗体，所述Fc结构域包含选自以下组成的组的一或多对或组的突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y,254T和256E(例如，M252Y,S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；和433K和434F(例如，H433K和N434F)。在本发明的范围内考虑前述Fc结构域突变，和本文公开的抗体可变结构域内的其他突变的全部可能的组合。
抗体的生物学特征
本发明包括以高亲和力结合可溶单体或二聚体PDGFR-β分子的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括以低于约30nM的KD结合单体PDGFR-β(例如，在25℃或37℃)的抗体和抗体的抗原结合片段，所述KD如通过表面等离子共振所测量的，例如，使用如本文实施例3中所定义的测定法形式。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以低于约25nM、低于约20nM、低于约15nM、低于约10nM、低于约5nM、低于约2nM，或低于约1nM的KD结合单体PDGFR-β，所述KD如通过表面等离子共振所测量的，例如，使用如本文实施例3中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。
本发明也包括以低于约250pM的KD结合二聚体PDGFR-β(例如，在25℃或37℃)的抗体和其抗原结合片段，所述KD如通过表面等离子共振所测量的，例如，使用如本文实施例3中所定义的测定法形式。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以低于约240pM、低于约230pM、低于约220pM、低于约210pM、低于约200pM、低于约190pM、低于约180pM、低于约170pM、低于约160pM、低于约150pM、低于约140pM、低于约130pM、低于约120pM、低于约110pM、或低于约100pM的KD结合二聚体PDGFR-β，所述KD如通过表面等离子共振所测量的，例如，使用如本文实施例3中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。
本发明也包括阻断一种或多种PDGF配体(例如，PDGF-BB、-AB、-CC、或-DD)与PDGFR-β的结合的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括以低于约300pM的IC50值阻断PDGF-BB与单体PDGFR-β在体外的结合的抗PDGFR-β抗体，所述IC50值如通过基于ELISA的免疫测定法所测量的，例如，使用如本文实施例4(A)中所定义的测定法形式，或如通过实时生物测定法所测量的，例如，使用如实施例4(B)中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以低于约280pM、低于约260pM、低于约240pM、低于约220pM、低于约200pM、低于约180pM、低于约160pM、低于约150pM、低于约140pM、低于约130pM、低于约120pM、低于约110pM、低于约100pM、低于约90pM、低于约80pM、或低于约75pM的IC50值阻断PDGF-BB与单体PDGFR-β在体外的结合，所述IC50如通过基于ELISA的免疫测定法所测量的，例如，使用如本文实施例4(A)中所定义的测定法形式，或如通过实时生物测定法所测量的，例如，使用如实施例4(B)中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。
本发明也包括抑制细胞表面表达的PDGFR-β的PDGF配体介导的活化的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括以低于约500pM的IC50值阻断细胞表面表达的PDGFR-β的PDGF-BB-或PDGF-DD介导的活化的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段，所述IC50如在基于细胞的阻断生物测定法中所测量的，例如，使用如本文实施例6中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。在某些实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段以低于约400pM、低于约350pM、低于约300pM、低于约250pM、低于约200pM、低于约150pM、低于约100pM、低于约90pM、低于约80pM、低于约70pM、低于约60pM、低于约50pM、低于约40pM、或低于约30pM的IC50阻断细胞表面表达的PDGFR-β的PDGF-BB-或PDGF-DD介导的活化，所述IC50如在基于细胞的阻断生物测定法中所测量的，例如，使用如本文实施例6中所定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。
本发明也包括内化进入表达PDGFR-β的细胞中的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段。例如，本发明包括有效内化进入表达PDGFR-β的细胞中的抗PDGFR-β抗体和其抗原结合片段，如使用如本文实施例7中所定义的基于细胞的抗体内化测定法，或基本上相似的测定法所测量的。
本发明的抗体可具有一种或多种前述生物学特征，或其任意组合。本发明的抗体的其他生物学特征对于本领域普通技术人员在回顾包括本文的工作实施例的本文公开内容时将是显而易见的。
表位作图和相关的技术
本发明包括与人PDGFR-β的胞外结构域内(例如，PDGFR-β的胞外结构域的Ig结构域1、2、3、4和/或5内)发现的一个或多个氨基酸相互作用的抗PDGFR-β抗体。已知Ig结构域1至3(例如，SEQ ID NO:337的氨基酸1至277)涉及配体结合。本发明包括与在Ig结构域1(例如，SEQ ID NO:337的氨基酸1至88)、Ig结构域2(例如，SEQ ID NO:337的氨基酸97至178)和/或Ig结构域3(例如，SEQ ID NO:337的氨基酸182至277)内发现的一个或多个氨基酸相互作用，并从而有效阻断受体/配体相互作用的抗PDGFR-β抗体。在本发明的某些示例性实施方案中，提供特异性与Ig结构域2(例如，在SEQ ID NO:337的氨基酸97至178内；参见，例如，实施例8)相互作用的抗体。与抗体结合的表位可由位于PDGFR-β的胞外结构域内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多)氨基酸的单个连续序列组成。备选地，表位可由位于PDGFR-β的胞外结构域内的多个非连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成。
本领域普通技术人员已知的多种技术可用于确定抗体是否与多肽或蛋白内的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括，例如，Antibodies,Harlow和Lane(ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所述的常规交叉阻断测定法、丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463),以及肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内氨基酸的另一方法是用质谱检测的氢/氘交换。总的说来，氢/氘交换法涉及用氘标记的感兴趣蛋白，随后使抗体与氘标记的蛋白结合。然后，将该蛋白/抗体复合物转移至水中，除了受抗体保护的残基(其维持氘标记状态)，让所有残基均发生氢-氘交换。在抗体解离后，进行标靶蛋白的蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示与抗体相互作用的特定氨基酸对应的那些氘标记的残基。参阅例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。
本发明还包括与本文所述的任何具体的示例性抗体结合相同表位的抗PDGFR-β抗体(例如H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N、H2M3374N、H4H3094P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S等)。同样，本发明还包括与本文所述的任何具体的示例性抗体竞争结合PDGFR-β的抗PDGFR-β抗体(例如H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N、H2M3374N、H4H3094P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S等)。例如，本发明包括与如本文实施例5中定义的“箱1”的一个或多个抗体交叉竞争结合PDGFR-β的抗PDGFR-β抗体(例如，H4H3365N、H4H3374N、H4H3103S和H4H3094P)。本发明还包括与如本文实施例5中定义的“箱2”的一个或多个抗体交叉竞争结合PDGFR-β的抗PDGFR-β抗体(例如，H4H3099S、H4H3107S、H4H3305N和H4H3310N)。
使用本领域内已知的并在本文示例的常规方法，可以容易地确定抗体是否与本发明之参照抗PDGFR-β抗体结合同一表位，或与其竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本发明之参照抗PDGFR-β结合同一表位，允许参照抗体与PDGFR-β蛋白(例如PDGFR-β细胞外结构域的可溶部分或细胞表面表达的PDGFR-β)结合。然后，评估测试抗体与PDGFR-β分子结合的能力。如果测试抗体在与参照抗PDGFR-β抗体饱和结合之后能够与PDGFR-β结合，就可得出结论，该测试抗体和参照抗PDGFR-β抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该测试抗体在与参照抗PDGFR-β抗体饱和结合之后不能与PDGFR-β分子结合，那么测试抗体可与本发明之参照抗PDGFR-β抗体所结合的同一表位结合。然后可进行其它常规的实验(例如肽突变和结合分析)，以证实是否所观察到的测试抗体的结合缺乏在实际上是由于其与参照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间位阻(或另一种现象)是所观察到的结合缺乏的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞计数法或本领域内可供利用的任何其他定量或定性的抗体结合测定法来完成。依照本发明之某些实施方案，如果例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的抗体对另一抗体结合的抑制作用达至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％(如竞争结合测定法所测量的)，则两种抗体就是与同一个(或重叠的)表位结合(参阅例如Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。备选地，如果抗原中减弱或消除一个抗体的结合的几乎所有氨基酸突变减弱或消除另一个抗体的结合，则两个抗体就被认为与相同的表位结合。只要减弱或消除一个抗体的结合的氨基酸突变亚群减弱或消除另一个抗体的结合，则两个抗体就被认为具有”重叠的表位”。
为了确定抗体是否与参照抗PDGFR-β抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向实施上述结合方法学：在第一个方向，让参照抗体在饱和条件下与PDGFR-β蛋白(例如PDGFR-β细胞外结构域的可溶部分或细胞表面表达的PDGFR-β)结合，然后评估测试抗体与PDGFR-β分子的结合。在第二个方向，让测试抗体在饱和条件下与PDGFR-β分子结合，然后评估参照抗体与PDGFR-β分子的结合。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与PDGFR-β分子结合，那就可以得出结论，该测试抗体与参照抗体竞争结合PDGFR-β(参见，例如，本文实施例5中描述的测定法形式，其中在传感器尖端上捕获可溶PDGFR-β蛋白并且用参照抗体[mAb#1]和测试抗PDGFR-β抗体[mAb#2]顺序地并且以两种结合顺序处理PDGFR-β包被的传感器尖端)。如同本领域普通技术人士所能理解的，与参照抗体竞争结合的抗体未必与参照抗体结合相同表位，但可通过结合重叠或邻近的表位而在空间上阻断该参照抗体的结合。
人抗体的制备
产生单克隆抗体包括完整人单克隆抗体的方法是本领域内周知的。任何这类已知的方法均可在本发明之背景下用于制造与人PDGFR-β特异性结合的人抗体。
采用VELOCIMMUNETM技术，例如，或任何其它产生完整人单克隆抗体的已知技术，初步分离出对PDGFR-β具有高亲和力的含有人类可变区和小鼠恒定区的嵌合抗体。如以下实验部分所述，就所想要的特征包括亲和力、选择性、表位等表征和选择抗体。如果必要，用合乎需要的人类恒定区，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4取代小鼠恒定区，以产生完整人抗PDGFR-β抗体。尽管所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特征则留存于可变区中。在某些情况中，直接从抗原阳性的B细胞分离完整人抗PDGFR-β抗体。
生物等效物
本发明之抗PDGFR-β抗体和抗体片段包括某些蛋白，这些蛋白含有不同于所述抗体氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了与人PDGFR-β结合的能力。当与亲本序列比较时，这类变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、删除或替换，但显示了与所述抗体的生物活性基本上相当的生物活性。类似地，本发明之编码抗PDGFR-β抗体的DNA序列涵盖这样的序列，所述序列当与所公开的序列比较时包含一个或多个核苷酸的添加、删除或替换，但编码与本发明之抗PDGFR-β抗体或抗体片段基本上生物等效的抗PDGFR-β抗体或抗体片段。这类变体氨基酸和DNA序列的实例已在上面讨论过。
如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替换物，当在相似实验条件下无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差异，则它们就被认为是生物等效的。如果某些抗体的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将被认为是等效物或医药替换物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差异是有意设计的并反映在标记上，这种差异对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的(例如对于慢性用途)，并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效力方面没有临床意义上的差异，则它们是生物等效的。
在一个实施方案中，如果患者可以在参照产品和生物产品之间转换一次或多次而不良反应的预期风险不会增加，包括与继续没有这种转换的治疗相比没有在免疫原性方面临床显著的变化或有效性的降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的作用机制起作用，且这类机制是周知的，则它们就是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外的方法演示。生物等效性的量度包括，例如，(a)在人类或其他哺乳类动物体内的测试，其中血液、血浆、血清或其他生物体液中抗体或其代谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b)体外测试，该测试已与人的体内生物利用率数据建立相关联系并可合理预测该数据；(c)人类或其他哺乳类动物的体内测试，其中抗体(或其靶标)的适宜的急性药理作用是作为时间的函数测量的；以及(d)有良好对照的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。
本发明的抗PDGFR-β抗体的生物等效变体可通过例如替换生物活性不需要的多种残基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性无关紧要的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复性时形成不必要或不正确的分子内二硫化物桥。在其他情况下，生物等效的抗体可包括抗PDGFR-β抗体变体，该变体包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或除去糖基化的突变
物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施方案，本发明提供了与人PDGFR-β结合但不与其他物种的PDGFR-β结合的抗PDGFR-β抗体。本发明还包括与人PDGFR-β结合并与一种或多种非人PDGFR-β结合的抗PDGFR-β抗体。例如，本发明之抗PDGFR-β抗体可与人PDGFR-β结合，但可与或不可与小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩PDGFR-β中的一种或多种结合，视情况而定。根据本发明的某些示例性实施方案，提供抗PDGFR-β抗体，其特异性结合人PDGFR-β(例如，单体和/或二聚体hPDGFR-β构建体)和食蟹猴(例如，食蟹猴)PDGFR-β(例如，单体和/或二聚体mfPDGFR-β构建体)(参见，例如，本文的实施例3)。
免疫缀合物
本发明涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等缀合的抗PDGFR-β单克隆抗体。细胞毒剂包括任何损害细胞的活性剂。适宜于形成免疫缀合物的细胞毒剂和化疗药剂的例子是本领域内周知的(参阅如WO 05/103081)。
多特异性抗体
本发明之抗体可以是单特异性、双特异性，或多特异性的。多特异性抗体可以对于一个靶标多肽的不同表位是特异性的，或可含有对于一个以上靶标多肽特异性的抗原结合域。参阅例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufert等人,2004,TrendsBiotechnol.22:238-244。本发明之抗PDGFR-β抗体可与另一个功能分子例如另一个肽或蛋白连接或共表达。例如，抗体或其片段可与一个或多个其他分子实体，如另一个抗体或抗体片段功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一臂对人PDGFR-β或其片段具有特异性，而免疫球蛋白的另一臂则对第二种治疗靶标具有特异性或与治疗部分缀合。
可用于本发明背景的示例性的双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差异降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig CH3结构域含有降低或消除与蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(系按照IMGT外显子编号法；按照EU编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含Y96F修饰(系按照IMGT编号法；按照EU编号法则为Y436F)。可在第二个CH3结构域内发现的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(系按照IMGT；按照EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下为N44S、K52N和V82I(系按照IMGT；按照EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(系按照IMGT；按照EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体的变化均被认为属于本发明之范围。
可以在本发明的背景中使用的其他示例性双特异性形式包括，但不限于，例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合物、双可变结构域(DVD)-Ig、细胞杂交瘤、结入孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有结入孔的共同轻链，等)、CrossMab、CrossFab,(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody,IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG、和Mab2双特异性形式(参见，例如，Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11,和其中引述的参考，关于前述形式的综述)。也可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于生成位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，其然后自组装为具有确定的组成、价和几何的多聚体复合物(参见，例如，Kazane等人,J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗制剂和给药
本发明提供了包含本发明之抗PDGFR-β抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明之药物组合物是与适宜的载体、赋形剂以及提供改善的转移、递送、耐受性等性质的其他活性剂一起配制的。在以下这本所有药剂化学师都知道的处方集里可以找到许多适宜的制剂：雷明登药学大全(Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCompany,Easton,PA.)。这些制剂包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有碳蜡的半固体状混合物。还可参阅Powell等人.“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”,PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
给患者施用的抗体剂量可根据患者的年龄和体形大小、靶标疾病、病症、给药途径等因素而改变。优选的剂量通常是按照体重或体表面积计算的。当本发明之抗体用于治疗成人患者的与PDGFR-β活性相关的病症和疾病时，将本发明之抗体经由静脉输入也许是有利的，通常是单剂量约0.01至约20mg/kg体重的剂量给药，更优选为约0.02至约7、约0.03至约5，或约0.05至约3mg/kg体重的剂量。取决于病症的严重性，治疗的频率和持续时间可以调整。抗PDGFR-β抗体给药的有效剂量和时间表可根据经验确定；例如，可通过定期评估来监控患者病情的发展并相应地调整剂量。而且，可以使用本领域内众所周知的方法进行物种间剂量缩放比例(例如Mordenti等人.,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
已知有多种递送系统可用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体封装、微颗粒、微胶囊、能表达本发明的抗体或其他治疗蛋白的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅如Wu等人，1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。本发明的抗体和其他治疗活性组分也可通过基因疗法技术递送。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可经由任何方便的途径给药，例如，输注或大剂量注射，经上皮或粘膜(例如口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并可与其他生物活性药剂一起给药。给药可为全身性或局部性。
本发明之药物组合物可用标准的针头和注射器经皮下或静脉给药。此外，对于皮下给药，笔型递送装置可方便地用于递送本发明之药物组合物。这种笔型递送装置可以是可重复使用型或一次性使用型。可重复使用的笔型递送装置一般采用可更换的含药物组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用含有药物组合物的新药筒取代。然后，该笔型给药装置即可重复使用。在一次性使用的笔型递送装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置具有预先灌满药物组合物的贮藏器。一旦该贮藏器内药物组合物用完，整个装置则被丢弃。
许多可重复使用的笔型和自动注射递送装置已用于本发明之药物组合物的皮下给药。其实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf，Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(Eli Lilly and Co.，Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III型(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk，Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson，Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM，以及OPTICLIKTM(sanofi-aventis，Frankfurt,Germany)，此处仅举几例而已。用于皮下注射本发明之药物组合物的一次性使用的笔型递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(sanofi-aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart，Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)，以及HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)，此处仅举几例。
在某些情况下，药物组合物可用控释系统给药。在一个实施方案中，可使用泵(参阅Langer，出处同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可采用聚合材料；参阅Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),1974，CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施方案中，可将控释系统置于该组合物靶标附近，从而只需要使用全身性剂量的一部分(参阅例如，Goodson,1984,于Medical Applications of Controlled Release,见上文,第2卷,第115-138页)。在Langer，1990，Science 249:1527-1533的综述中讨论了其他控释系统。
注射用制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些注射用制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中，以制备该注射用制剂。作为注射用的水性介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其他佐剂的等渗溶液等，其可结合适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等使用。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，其可结合增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等使用。如此制备的注射液优选装入适当的安瓿瓶中。
有利的是，上述口服或胃肠外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂型，以适于容纳一次剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。上述抗体含量一般为单位剂量约5至约500mg/剂型；尤其是注射剂型，优选的是上述抗体含量为约5至约100mg，其他剂型中抗体含量为约10至约250mg。
抗体的治疗用途
本发明的抗体尤其可用于治疗，预防和/或减缓与PDGFR-β表达、信号传递，或活性相关或由其介导的、或通过阻断PDGFR-β和PDGFR-β配体(例如，PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、PDGF-AB，等)之间的相互作用或抑制PDGFR-β活性和/或信号传递可治疗的任何疾病或病症。例如，本发明提供了通过对需要治疗的患者施用如本文所述的抗PDGFR-β抗体(或包含抗PDGFR-β抗体的药物组合物)治疗眼病、纤维化疾病(纤维化)、血管疾病和/或癌症(肿瘤生长抑制)的方法。在本文描述的治疗方法的背景下，可作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种额外的治疗剂(其实例描述于本文别处)的组合施用抗PDGFR-β抗体。
通过施用本发明的抗PDGFR-β抗体可治疗的示例性眼病包括年龄相关的黄斑变性(例如，“湿”AMD)、渗出性AMD、糖尿病性视网膜病变(例如，增殖性糖尿病性视网膜病变)、视网膜静脉阻塞性疾病诸如中央视网膜静脉阻塞(CRVO)、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼手术后纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)、脉络膜新生血管形成、视神经盘新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳、血管翳,翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)、血管性视网膜病、视网膜退化、葡萄膜炎，和眼的炎性疾病。
通过施用本发明的抗PDGFR-β抗体可治疗的示例性纤维化疾病包括肺纤维化(例如，特发性肺纤维化、博莱霉素诱导的肺纤维化,石棉诱导的肺纤维化，和闭塞性细支气管炎综合症)、慢性哮喘、与急性肺损伤和急性呼吸窘迫相关联的纤维化(例如，细菌性肺炎诱导的纤维化、创伤诱导的纤维化、病毒性肺炎诱导的纤维化、呼吸器诱导的纤维化、非肺败血症诱导的纤维化和吸入诱导的纤维化)、矽肺、辐射诱导的纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、眼纤维化(例如，眼纤维化瘢痕)、皮肤纤维化(例如，硬皮病)、肝纤维化(例如，肝硬化、醇诱导的肝纤维化、非醇性脂肪性肝炎(NASH)、胆管损伤、原发性胆汁性肝硬化、感染或病毒诱导的肝纤维化[例如，慢性HCV感染]、自身免疫肝炎)、肾(肾)纤维化、心肌纤维化、动脉粥样硬化、支架再狭窄、和骨髓纤维化。
通过施用本发明的抗PDGFR-β抗体可治疗的示例性血管疾病包括血管增殖性疾病、肺动脉高压、再狭窄、血管瘢痕，等。
本发明也包括通过对需要此类治疗的患者施用如本文描述的抗PDGFR-β抗体治疗癌症、抑制肿瘤生长、促进肿瘤消退、抑制转移和/或抑制病理性血管生成(例如，与肿瘤生长相关的血管生成)的方法。例如，本发明抗体及抗原结合片段可用于治疗，例如发生在脑部与脑膜、口咽、肺部与支气管树、胃肠道、男性和女性生殖道、肌肉、骨、皮肤与附件、结缔组织、胰脏、免疫系统、造血细胞与骨髓、肝脏和泌尿道，及特化感觉器官(诸如眼)的原发性及/或转移性肿瘤。在某些实施方案中，本发明抗体及抗原结合片段用于治疗下列癌症中的一或多者：肾细胞癌、胰脏癌、乳癌、头和颈癌(例如，脑、口腔、口咽、鼻咽、下咽、鼻腔、鼻旁窦、喉、唇等的癌症)、前列腺癌、尿膀胱癌、恶性神经胶质瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、骨软骨瘤、结肠直肠癌、胃癌(例如带有MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、成视网膜细胞瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、结缔组织瘤、卡波西氏肉瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌，或黑色素瘤。
组合疗法和制剂
本发明包括包含本文所述的任何抗PDGFR-β抗体与一种或多种额外的治疗活性组分的组合的组合物和治疗制剂，和包括向有需要的对象施用此类组合的治疗方法。
本发明的抗PDGFR-β抗体可以与，例如，VEGF拮抗剂，例如，“VEGF-trap”诸如阿柏西普(aflibercept)或如US 7,087,411中示出的其他VEGF抑制性融合蛋白、抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗(bevacizumab),来尼珠单抗(ranibizumab)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼、或帕唑帕尼)，或抗VEGF受体抗体共同配制和/或组合施用。抗PDGFR-β抗体也可以与PDGF配体拮抗剂(例如，抗PDGF-BB抗体、抗PDGF-DD抗体、抗PDGF-CC抗体、抗PDGF-AB抗体，或其他PDGF配体拮抗剂诸如适配体[例如，抗PDGF-B适配体诸如FovistaTM，Ophthotech Corp.,Princeton,NJ]，反义分子、核酶、siRNA、peptibody、纳米抗体或针对PDGF配体的抗体片段)组合。在其他实施方案中，本发明的抗PDGFR-β抗体可以与EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗或帕尼单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或埃罗替尼])、另一个EGFR家族成员诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII特异性的拮抗剂(例如，特异性结合EGFRvIII的抗体)、cMET拮抗剂(例如，抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、或B-raf抑制剂(例如，维罗非尼、索拉非尼、GDC-0879,PLX-4720)共同配制和/或组合施用。在某些情况中，本发明的抗PDGFR-β抗体与PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、DLL4拮抗剂(例如，US 2009/0142354中公开的抗DLL4抗体诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US 2011/0027286中公开的抗Ang2抗体诸如H1H685P)等组合、共同配制和/或组合施用。可以与本发明的抗PDGFR-β抗体有益地组合施用的其他活性剂包括细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和结合细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18，或结合其各自受体的抗体。
本发明的抗PDGFR-β抗体也可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、金属螯合剂、IFN-γ，和/或NSAIDs组合施用和/或共同配制。本发明的抗PDGFR-β抗体也可以作为治疗方案的部分施用，所述治疗方案也包括放疗和/或常规化疗(例如，在治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的背景下)。
任何前述额外的治疗活性组分可与任何本发明的抗PDGFR-β抗体组合施用用于治疗其中施用抗PDGFR-β抗体是有益的任何疾病或病症，包括，例如，本文提及的任何眼病、纤维化疾病、血管疾病和/或癌症。例如，在治疗眼病的背景下(例如，湿AMD、糖尿病性视网膜病变、CRVO、或本文描述的任何其他眼病)，本发明的抗PDGFR-β抗体可以与VEGF拮抗剂，例如，“VEGF-trap”诸如阿柏西普或如US 7,087,411中示出的其他VEGF抑制性融合蛋白，或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗、或来尼珠单抗)共同配制和/或组合施用。
在其中本发明的抗PDGFR-β抗体与VEGF拮抗剂(例如，VEGF trap诸如阿柏西普)组合施用，包括施用包含抗PDGFR-β抗体和VEGF拮抗剂的共同制剂的示例性的实施方案中，个体组分可向对象施用和/或使用多种剂量组合共同配制。例如，抗PDGFR-β抗体可向对象施用和/或以选自0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、和5.5mg的量含有在共同制剂中；并且VEGF拮抗剂(例如，VEGF trap诸如阿柏西普)可向对象施用和/或以选自1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg的量含有在共同制剂中。本发明的示例性抗PDGFR-β抗体/阿柏西普剂量组合包括，例如：(i)0.2mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普；(ii)0.5mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普；(iii)1mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普；(iv)3mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普；和(v)4mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普。可以根据本文别处公开的任何施用方案施用组合/共同制剂，包括，例如，每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次等。
可以在施用本发明的抗PDGFR-β抗体之前向对象施用额外的治疗活性组分。例如，如果在施用第二组分1周前、72小时前、60小时前、48小时前、36小时前、24小时前、12小时前、6小时前、5小时前、4小时前、3小时前、2小时前、1小时前、30分钟前、15分钟前、10分钟前、5分钟前、或少于1分钟前施用第一组分，则可认为第一组分在第二组分“之前”施用。在其他实施方案中，可以在施用本发明的抗PDGFR-β抗体后向对象施用额外的治疗活性组分。例如，如果在施用第二组分1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、30分钟后、1小时后、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、12小时后、24小时后、36小时后、48小时后、60小时后、72小时后施用第一组分，则可认为第一组分在第二组分“之后”施用。还在其他的实施方案中，可以与施用本发明的抗PDGFR-β抗体同时向对象施用额外的治疗活性组分。“同时”施用，出于本发明的目的，包括，例如，以单个剂型(例如，共同配制的)向对象施用抗PDGFR-β抗体和额外的治疗活性组分，或以单独的剂型彼此在约30分钟内或更短向对象施用。如果以单独的剂型施用，可经过相同的途径施用每个剂型(例如，抗PDGFR-β抗体和额外的治疗活性组分均可玻璃体内，或皮下等施用)；备选地，可经过不同的途径施用每个剂型(例如，可玻璃体内施用抗PDGFR-β抗体，并且可全身施用额外的治疗活性组分)。无论如何，以单个剂型，以单独的剂型通过相同的途径，或以单独的剂型通过不同的途径施用组分全部被认为是“同时施用”，出于本文公开内容的目的。出于本文公开内容的目的，在施用额外的治疗活性组分“之前”、“同时”、或“之后”(如上文定义的那些术语)施用抗PDGFR-β抗体被认为是组合施用抗PDGFR-β抗体与额外的治疗活性组分。
本发明包括这样的药物组合物，其中本发明的抗PDGFR-β抗体与一种或多种如本文别处描述的额外的治疗活性组分共同配制。
本发明也包括额外的治疗组合物，所述治疗组合物包含PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合。根据本发明的此方面的PDGF拮抗剂包括PDGF受体拮抗剂以及PDGF配体拮抗剂。相似地，根据本发明的此方面的VEGF拮抗剂包括VEGF受体拮抗剂以及VEGF配体拮抗剂。
施用方案
根据本发明的某些实施方案，可以在确定的时期内向对象施用多剂量的抗PDGFR-β抗体(或包含抗PDGFR-β抗体和本文提及的任何额外的治疗活性剂的组合的药物组合物)。根据本发明该方面的方法包括向对象顺序施用多剂量的本发明的抗PDGFR-β抗体。如本文所用，“顺序施用”表示在不同的时间点上，例如预定间隔(例如，小时、天、周或月)分隔开的不同的日期上向对象施用每一剂量的抗PDGFR-β抗体。本发明包括这样的方法，其包括向患者顺序施用单次初始剂量的抗PDGFR-β抗体，随后是一次或多次第二剂量的抗PDGFR-β抗体，并任选地随后是一次或多次第三剂量的抗PDGFR-β抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指施用抗PDGFR-β抗体的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是第二剂量之后施用的剂量。所述初始、第二和第三剂量可以含有相同量的抗PDGFR-β抗体，但一般可以在施用频率方面彼此不同。然而在某些实施方案中，初始、第二和/或第三剂量中含有的抗PDGFR-β抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如适当时上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两次或多次(例如，2、3、4或5次)剂量作为“负荷剂量”，随后是在更不频繁基础上施用的后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本发明的某些示例性实施方案中，在紧接先前剂量之后1-26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周施用每个第二和/或第三剂量。如本文所用，短语“紧接先前剂量”表示在多次施用的顺序中，以没有介于其中的剂量的顺序在紧接着施用下次剂量之前向患者施用的抗PDGFR-β抗体的剂量。
本发明该方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量的抗PDGFR-β抗体。例如，在某些实施方案中，仅向患者施用单次第二剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或多次)第二剂量。同样，在某些实施方案中，仅向患者施用单次第三剂量。在其他实施方案中，向患者施用两次或多次(例如，2、3、4、5、6、7、8或多次)第三剂量。
在涉及多次第二剂量的实施方案中，以与其他第二剂量相同的频率施用每次第二剂量。例如，可以在紧接先前剂量之后向患者施用每次第二剂量1-2周或1至2月。类似地，在涉及多次第三剂量的实施方案中，以与其他第三剂量相同的频率施用每次第三剂量。例如，可以在紧接先前剂量之后向患者施用每次第三剂量2-12周。在本发明的某些实施方案中，向患者施用第二和/或第三剂量的频率在治疗方案期间可以变化。还可以由医生在临床检查后根据个体患者的需要在治疗期间调整施用频率。
本发明包括这样的施药方案，其中以第一频率(例如，一周一次，每两周一次，每三周一次，每月一次，每两月一次，等)对患者施用2至6次负荷剂量，随后以较不频繁的基础对患者施用两次或更多次维持剂量。例如，根据本发明的此方面，如果以例如，每月一次的频率施用负荷剂量(例如，每月施用两次、三次、四次或更多次负荷剂量)，那么可以以每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每十二周一次等对患者施用维持剂量。
抗体的诊断用途
本发明之抗PDGFR-β抗体还可用于检测和/或测量样品中的PDGFR-β或表达PDGFR-β的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗PDGFR-β抗体或其片段可用于诊断特征为PDGFR-β的异常表达(例如过度表达、表达不足、缺乏表达等)的病症或疾病。典型的PDGFR-β诊断测定法可包括例如用本发明之抗PDGFR-β抗体与获自患者的样品接触，其中该抗PDGFR-β抗体以可检测的标记或报告分子标记。被许多，在诊断应用中也可以将未标记的抗PDGFR-β抗体与本身具有可检测标记的第二种抗体结合使用。该可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如异硫氰酸荧光素，或罗丹明；或酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶，或荧光素酶。可用于检测或测量样品中PDGFR-β的具体的示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)，以及荧光激活细胞分选(FACS)。
可依照本发明用于PDGFR-β诊断测定法的样品包括获自患者的在正常或病理条件下含有可检测量PDGFR-β蛋白或其片段的任何组织或液体样品。一般而言，测量从健康患者(例如未患与异常PDGFR-β水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得特定的样品的PDGFR-β水平，以初始地建立PDGFR-β水平的基线或标准。然后，可将这一PDGFR-β基线水平与从获自疑为患有PDGFR-β相关性疾病或病症的个体的样品中测得的PDGFR-β的水平进行比较。
实施例
举出以下实例是为了向本发明所属领域普通技术人员就如何利用本发明之方法和组合物提供完整的公开和描述，并非是为了限制本发明人视为其发明的范围。已作出努力以确保所用数据(例如剂量、温度等)的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压强是指处于或接近大气压。
实施例1.生成PDGFR-β的人类抗体
直接对小鼠(含有编码人类免疫球蛋白重链与κ轻链可变区的DNA)施用包含PDGFR-β胞外结构域的免疫原与佐剂以刺激免疫反应。藉由PDGFR-β-特异性免疫测定法监测抗体免疫反应。当达到所欲的免疫反应时，收取脾脏细胞并且与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并形成融合瘤细胞系。筛选并挑选杂交瘤细胞系以鉴定生产PDGFR-β-特异性抗体的细胞系。使用此技术获得数种抗PDGFR-β嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以此方式生成的示例性抗体命名如下:H1M3299N、H1M3305N、H1M3310N、H1M3361N、H2M3363N、H2M3365N、H2M3368N、H2M3373N和H2M3374N。然后将来自嵌合抗体的人可变结构域克隆到人恒定结构域上以制造如本文描述的完整人抗PDGFR-β抗体。
如US 2007/0280945A1中所述，亦在不融合至骨髓瘤细胞的情况下直接从抗原-阳性B细胞分离抗PDGFR-β抗体。使用此方法，获得数种完整人抗PDGFR-β抗体(亦即具有人可变结构域与人类恒定结构域的抗体)；以此方式所生成的示例性抗体命名如下:H4H3394P、H4H3095S、H4H3096S、H4H3097S、H4H3098S、H4H3099S、H4H3102S、H4H3103S、H4H3104S、H4H3105S、H4H3106S、H4H3107S。
依据本实施例方法所生成的示例性抗PDGFR-β抗体的某些生物性质详细描述于下面的实施例中。
实施例2.重链与轻链可变区氨基酸序列
表1显示所选的抗PDGFR-β抗体的重链与轻链可变区氨基酸序列及其对应的抗体标识符号。
表1
抗体在本文中通常以下列命名法来意指:Fc前缀(例如"H1M,""H2M,""H4H")，接着是数字标识符号(例如表1中所示的"3299,""3363,"或"3094")，然后为"P,""N"或"S"后缀。因此，依据这个命名法，抗体在本文可称作例如"H1M3299N,""H2M3363N,""H4H3094,"等。本文中所用抗体命名的H1M、H2M和H4H前缀表示抗体的特定Fc区同种型。例如，"H1M"抗体具有小鼠IgG1Fc，而"H4H"抗体具有人类IgG4Fc。如本领域普通技术人员所理解，具有特别的Fc同种型的抗体可转换成具有不同Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG1Fc的抗体可转换成具有人类IgG4Fc的抗体，等.)，但在任何情况下，可变结构域(包括CDR)-由表1中所示数字标识符号所提示-保持相同，并且预期结合性质为相同或基本相似的，无论Fc结构域的性质如何。
下列实施例中所用的对照构建体
下面实施例中包括抗PDGFR-β对照抗体供比较之用。对照抗体在此命名为对照I:人类抗PDGFR-β抗体，具有"2C5"的重链和轻链可变结构域序列如US 7,740,850中所述。
实施例3.如通过表面等离子共振测定的抗体与人PDGFR-β的结合
使用实时表面等离子共振生物传感器(Biacore T100,GE Healthcare LifeSciences,Piscataway,NJ)测定法在25℃和37℃测定抗原结合选择的纯化的抗人PDGFR-β单克隆抗体的结合亲和力和动力学常数。表达为小鼠Fc(前缀H1M；H2M)或人Fc(前缀H4H)的抗体捕获在其各自的抗Fc传感器表面上(Mab捕获形式)。以50μL/min的流速在捕获有抗PDFR-β单克隆抗体的表面上注射不同浓度的可溶单体PDGFR-β构建体(hPDGFRb.mmh[SEQID NO:337]、食蟹猴PDGFRb.mmh[SEQ ID NO:340])或二聚体PDGFR-β构建体(人PDGFRb.mFc[SEQ ID NO:338]或人PDGFRb.hFc[SEQ ID NO:339])。通过处理并使用Scrubber 2.0曲线拟合软件将数据拟合至1:1结合模型测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。结合解离平衡常数(KD)与解离半寿期(t1/2)是由如下的动力学速率常数计算的:KD(M)＝kd/ka；且t1/2(min)＝(ln2/(60*kd)。不同抗PDGFR-β单克隆抗体的动力学结合参数显示于表2至5中。(NB＝在使用的条件下未观察到结合；NT＝未测试)。
表2:25℃时抗PDGFR-β抗体(小鼠Fc形式)与单体和二聚体PDGFR-β构建体的结合特征
表3:25℃时抗PDGFR-β抗体(人Fc形式)与单体和二聚体PDGFR-β构建体的结合特征
表4:37℃时抗PDGFR-β抗体(小鼠Fc形式)与单体和二聚体PDGFR-β构建体的结合特征
表5:37℃时抗PDGFR-β抗体(人Fc形式)与单体和二聚体PDGFR-β构建体的结合特征
如表2-5中所示，本发明的若干抗PDGFR-β抗体展示了对人和食蟹猴PDGFR-β构建体的亚纳摩尔亲和力。此外，若干克隆显示较之参照(对照I)抗体更紧(较低的KD)的与PDGFR-β构建体的结合。
实施例4.抗PDGFR-β抗体阻断PDGF配体对PDGFR-β的结合
A.使用基于ELISA的免疫测定法评价的受体/配体阻断
首先用基于ELISA的免疫测定法评价本发明的某些抗人PDGFR-β抗体阻断受体与其配体PDGF-BB结合的能力。简而言之，用人PDGF-BB(2μg/mL)包被平板。单独地，在室温(25℃)将250pM的生物素化的可溶hPDGFR-β.mmh("biot-hPDGFR-β-mmh,"SEQ ID NO:337)与系列稀释的抗PDGFR-β抗体(0-100nM)预混合1hr。将经平衡的PDGFR-β/抗体溶液添加至配体包被的平板，允许孵育1hr，并洗涤。使用HRP缀合的链霉亲和素检测结合的biot-hPDGFR-β.mmh的水平。使用Prism软件分析数据并将IC50值计算为达到与配体结合的hPDGFR-β-mmh降低50％所需要的抗体的量。也计算最大阻断值并反映相对于基线抗体阻断的能力。在剂量曲线上的恒定量250pM biot-hPDGFR-β-mmh处测量的吸光度被定义为0％阻断，并且没有添加的PDGFR-β的吸光度被定义为100％。含有最高抗体浓度的孔的吸光度测定了最大阻断百分比。结果在表6中显示。("E"提示抗体是增强剂，即，在存在一些浓度的抗体时，较之缺乏抗体时信号更高。)
表6:抗PDGFR-β抗体阻断PDGF-BB与PDGFR-β的结合
*指示三次单独实验的平均IC50。
如表6中所示，本发明的若干抗体有力地阻断了PDGFR-β与其天然配体PDGF-BB的相互作用，IC50值从约7.6nM(H1M3299N)至约66pM(H4H3107S)，并且某些抗体增强了受体-配体相互作用(例如，H4H3097S,H4H3098S和H4H3102S)。
B.使用实时生物传感器测定法评估受体/配体阻断
也使用实时SPR生物传感器测定法(Biacore 3000)评价了选择的抗人PDGFR-β抗体阻断配体(PDGF-BB,PDGF-DD和PDGF-AB)与人PDGFR-β结合的能力。
简而言之，在用多克隆兔抗小鼠Fc抗体衍生(共价偶联)的Biacore传感器表面上捕获400RU的可溶人PDGFR-β.mFc(SEQ ID NO:338)(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)。用300nM的选择的抗PDGFR-β抗体饱和捕获的表面4分钟，然后在25℃注射30nM配体(PDGF-BB,PDGF-DD或PDGF-AB)额外4分钟。贯穿于测定法过程中监控实时结合响应并与在不存在捕获的抗体的条件下在衍生化的捕获的对照表面上应用PDGF配体时测量的结合响应比较。结果在图1中说明。
如图1中所见，全部抗体展示出阻断PDGF-BB和PDGF-AB配体的能力，较少的抗体能够有效率地阻断PDGF-DD，当与无抗体对照比较时。值得注意的是抗体H4H3094P、H4H3374N和对照I，其展示了当配体在Biacore传感器表面上应用时最少量的RU响应。
实施例5.抗PDGFR-β抗体的交叉竞争分析
实施交叉竞争测定法以评价选择的抗体彼此竞争结合人PDGFR-β的能力。简而言之，在抗Penta-his Octet传感器尖端(ForteBio Corp.,Menlo Park,CA)上捕获可溶人PDGFR-β.mmh(SEQ ID NO:337)。用第一抗PDGFR-β抗体(Mab#1；50μg/mL)饱和每个PDGFR-β.mmh包被的传感器尖端5分钟。随后，用第二抗PDGFR-β抗体(Mab#2)的溶液饱和每个传感器尖端。然后监控Mab#2结合与Mab#1预复合的PDGR-β.mmh的实时响应。根据制造商的说明(ForteBio Corp.,Menlo Park,CA)在Octet HBST缓冲液中的Octet RED384生物传感器上在25℃进行全部测定法，流速为1000rpm。结果在图2中说明。
低于0.1nM的结合响应在图2中以黑色或灰色阴影显示并提示对应的抗体对彼此竞争结合PDGFR-β。大于0.2nM的结合响应(在图2中的白框中显示)指示不彼此竞争结合PDGFR-β的抗体对。
此实施例的结果提示本发明的抗PDGFRβ抗体可以基于表位结合特征分组为两个不同的“箱子”：箱1包括对照I，H4H3365N、H4H3374N、H4H3103S和H4H3094P。箱2包括H4H3099S、H4H3107S、H4H3305N和H4H3310N。此实施例的结果提示箱1的抗体与箱2的抗体结合PDGFR-β上的不同区域。
实施例6.用抗PDGFR-β抗体抑制配体介导的受体激活和MAPK信号传递
为了进一步表征本发明的抗PDGFR-β抗体，开发生物测定法以检测PDGFR-β通过其已知的结合配体中的两种，PDGF BB和DD的激活。PDGFR-β受体及其配体之间的相互作用对于诱导多种细胞过程包括增殖、存活、迁移和形态发生是必要的(Hoch和Soriano,2003,Development 130:5769-4784)。PDGF受体是受体酪氨酸激酶并在由PDGF BB和DD激活后通过α和β受体的同源或异源二聚化形成。在激活后，诱导自体磷酸化并引发若干信号转导途径级联，包括Ras-MAPK(促细胞分裂原活化的蛋白激酶)途径。
为了检测通过配体结合PDGFRβ的MAPK信号转导途径的激活，生成稳定的HEK293细胞系以表达全长人PDGFR-β连同荧光素酶报告子(血清响应性元件[SRE-荧光素酶])。在96孔板中接种HEK293/hPDGFR-β细胞并在含有0.1％FBS的低血清培养基中培养过夜。在孵育后，将浓度范围从100nM至0.002nM的1:3系列稀释的PDGF BB或DD添加至细胞以测定剂量响应。为了检查配体激活的MAPK信号传递级联的抑制，抗体以1:3系列稀释并以范围从100nM至0.002nM的浓度添加至细胞。PDGF BB和DD浓度分别在250pM和400pM保持恒定并且在5.5h后检测荧光素酶活性。PDGF BB和DD激活人PDGFRb，EC50分别为0.04-1.11nM和0.34-1.82nM。对于每种抗体测定了抑制50％的PDGFR-β介导的信号传递所需要的抗体浓度(IC50)。结果总结于表7中。(NB＝无阻断；同种型1＝小鼠IgG阴性对照不相关抗体；同种型2＝人IgG阴性对照不相关抗体)。
表7:抗PDGFR-β抗体阻断PDGF-BB和PDGF–DD配体激活的IC50值
PDGF-BB(250pM) PDGF-DD(400pM)
抗体 IC50(M) IC50(M)
H4H3094P 4.0E-10 3.9E-10
H4H3095S 6.1E-10 8.2E-10
H4H3096S 4.5E-10 5.8E-10
H4H3097S NB NB
H4H3098S 1.2E-09 1.1E-09
H4H3099S 2.1E-10 1.9E-10
H4H3102S 4.1E-09 4.4E-09
H4H3103S 2.0E-10 2.6E-10
H4H3104S 5.0E-10 3.3E-10
H4H3105S 5.8E-10 5.1E-10
H4H3106S 7.4E-10 5.2E-10
H4H3107S 1.7E-10 2.4E-10
H1M3299N 5.6E-10 4.2E-10
H1M3305N 8.5E-09 1.9E-10
H1M3310N 2.3E-08 2.8E-10
H1M3361N 6.8E-09 8.4E-11
H2M3363N 7.5E-09 1.9E-10
H2M3365N 7.9E-09 1.1E-10
H2M3368N 1.8E-10 1.7E-10
H2M3373N 7.0E-11 9.2E-11
H1M3374N 3.1E-10 2.1E-10
H4H3305N 5.0E-10 4.8E-10
H4H3310N 6.8E-10 6.6E-10
H4H3365N 2.3E-10 3.7E-10
H4H3374N 1.3E-10 1.5E-10
对照I 1.8E-10 1.8E-10
同种型1 NB NB
同种型2 NB NB
如表7中所示，本发明的若干抗PDGFR-β抗体强有力地阻断了配体依赖性PDGFR-β激活，IC50处于亚纳摩尔范围。此外，小鼠IgG(同种型1)和人IgG(同种型2)阴性对照均未阻断受体的配体激活。
实施例7.PDGFR-β表达细胞上的抗PDGFR-β抗体的内化
为了研究抗体介导的受体内化，使用经改造以表达人PDGFR-β的细胞(HEK293/SRE-luc/PDGFRb细胞)进行试验。简而言之，在完全培养基(DMEM中10％FBS,Pen/Strep/Glut,NEAA,和G418)中铺板20,000HEK293/SRE Luc/PDGFRb细胞/孔并在4℃用10μg/ml的抗PDGFR-β抗体染色30min。洗涤细胞两次并在4℃用Dylight 488缀合的Fab山羊抗人IgG二抗(10ug/mL；Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)染色30min。之后，在37℃孵育细胞2小时以允许受体内化。通过在4℃用抗Alexa fluor 488(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)孵育洗涤的细胞45min淬灭Alexa-488荧光以区分表面结合的抗体与内化的抗体。使用ImageXpress Micro XL(Molecular Devices LLC,Sunnyvale,CA)取得图像并使用Columbus软件(Perkin Elmer,Waltham,MA)进行点分析。通过比较每个抗体的淬灭的染色(即内化的抗体)与对照1抗体的淬灭的染色计算相对内化。结果在表8中总结。
表8:选择的抗PDGFR-β抗体的内化
抗体 百分比内化(相对于对照I)
H4H3094P 77％
H4H3099S 88％
H4H3103S 87％
H4H3107S 92％
H4H3305N 79％
H4H3310N 66％
H4H3365N 65％
H4H3374N 81％
同种型对照 4％
对照I 100％
如表8中所示，在此测定法形式中研究的全部抗PDGFR-β抗体显示稳健的内化，反映了抗体在多种治疗环境中有效地靶向PDGFR-β表达细胞的潜在能力。
实施例8.抗PDGFR-β抗体在PDGFR-β上的不同结构域中结合
PDGFR-β的胞外部分由称为D1-D5的5个Ig样C2型结构域组成。需要D1至D3用于高亲和力配体结合。在此实施例中，进行实验以测定哪(几)个胞外结构域与本发明的某些抗PDGFR-β抗体相互作用。
对于此实验，使用四种不同的PDGFR-β胞外结构域构建体：D1(SEQ ID NO:342)，D1-D2(SEQ ID NO:343)，D1-D3(SEQ ID NO:344)，和D1-D4(SEQ ID NO:345)，以及全长PDGFR-β。通过表面等离子共振(Biacore)就结合多种构建体测试四种不同的抗PDGFR-β抗体。简而言之，经由抗人Fc CM5芯片捕获150-200RU的抗PDGFRβ抗体。接下来，以50nM的浓度在抗体结合的表面上应用个别的结构域构建体，或全长PDGFRβ。测量多种抗体结合多种结构域构建体的能力。结果显示在表9中。(-)＝未观察到结合；(+)＝观察到结合；ND＝未测定.
表9.观察到的选择的抗PDGFR-β抗体与PDGFR-β结构域和全长PDGFR-β蛋白的结合
如表9中所总结的，全部抗体结合全长PDGFR-β。两个抗体，H4H3094P和H4H3374N，测定为结合结构域2。令人感兴趣的是这两个抗体也是基于ELISA免疫测定法的配体阻断剂，验证了结构域2对于配体(PDGF-BB)结合是重要的。测试的另外两个示例性抗体，H4H3099S和H4H3305N，未显示出与任何结构域构建体的结合，提示这些抗体可能需要结构域4和5之间和/或结构域5本身的氨基酸用于高亲和力结合。
实施例9.抗PDGFR-β抗体消耗体内视网膜模型中的周细胞
在体内视网膜周细胞消耗模型中测试两个示例性抗PDGFRβ抗体，H4H3374N和H4H3094P。周细胞是表达PDGFR-β的平滑肌样细胞。在内皮细胞上表达的PDGF-B在将周细胞招募至新形成的血管中起作用，因而促进血管生成和建立血管构筑。然而，周细胞和内皮细胞之间的相互作用，和PDGF-B/PDGFR-β信号传递，在病原性血管生成过程中被破坏，导致不受控制的血管形成。在眼病中，此新血管形成可以导致视觉病态和失明。
在第一个实验中，用3mg/kg H4H3374N，H4H3094P，对照I(2C5)或人Fc(hFc)皮下(s.c.)注射人源化的PDGFR-β小鼠幼崽以观察在新形成的血管中阻断PDGF-B/PDGFR-β信号传递的作用。简而言之，在出生后第2天(P2)用3mg/kg的hFc对照或PDGFR-β抗体皮下注射人源化的PDGFR-β幼崽。在出生后第5天，杀死幼崽。收集两只眼睛并在4％P.F.A中固定1h。用PBS洗涤眼睛3x并解剖视网膜，移除玻璃体血管。在室温用在抗体稀释血清(ADS；1％BSA于0.05％Triton-X-100于PBS中)中制备的兔抗NG2硫酸软骨素一抗对视网膜O/N染色。在孵育后，在PBS中洗涤全部视网膜3X为时15min，并然后在4℃用荧光素标记的GriffoniaSimplicifolia凝集素和在ADS中制备的山羊抗兔alexa 594标记的二抗O/N染色。在孵育后，在PBS中再洗涤全部视网膜3X为时15min。在载片上平面固定视网膜并使用Fluoromount-GTM而没有DAPI盖片。
使用Nikon 80i荧光显微镜对视网膜成像。使用Adobe Photoshop和Fovea分析图像。对于每个治疗组测量对hFc归一化的平均NG2阳性面积。以双盲形式进行成像和分析。使用prism软件中的单向ANOVA进行统计分析。结果总结于表10-11中。
表10:用3mg/kg H4H3374N,对照I或hFc治疗后NG2阳性视网膜面积减少
表11:用3mg/kg H4H3094P,对照I或hFc治疗后NG2阳性视网膜面积减少
如表10-11中所示，在用抗PDGFR-β抗体治疗的小鼠中平均视网膜NG2阳性面积较之hFc降低。对于抗体H4H3374N和H4H3094P，NG2阳性面积相对于hFc显著降低(p<0.001)。此外，当与H4H3094P和对照I抗体二者比较时，H4H3374N展示出NG2阳性面积的最大降低。.
在单独的实验组中，在P2用抗小鼠PDGFR-β抗体"mAb39"(具有称为APB5的抗体的可变区，参见Uemura等人,J.Clin.Invest.2002；110(11):1619-1628)以50mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg，或6.25mg/kg的剂量，或用50mg/kg的Fc作为对照，皮下(SC)注射C57Bl/6小鼠幼崽(研究1)。在P5使用兔抗NG2硫酸软骨素蛋白多糖4一抗评价对周细胞覆盖的效果。在发育中的视网膜血管中，≥12.5mg/kg的全部剂量的mAb39抑制血管周细胞覆盖。
在另一个研究中(研究2)，用25mg/kg的mAb39或对照SC注射P2幼崽。在P5收集视网膜并用Griffonia simplicifolia凝集素("GS Lectin I,"Vector Labs)染色。在25mg/kg剂量，较之对照mAb39中等地降低血管形成的视网膜面积和血管密度
在单独的实验组(研究3)中，在P4用5μg(0.5μl)的mAb39或对照玻璃体内(IVT)注射幼崽的左眼并在P6收集。单次的玻璃体内抗PDGFR-β抗体施用几乎完全消耗了壁细胞并对视网膜血管分化和形态学产生了明显的作用，例如，不规则的血管管径。进行了额外的实验以探究成年小鼠的眼中PDGFR-β中和的作用。特别地，用mAb39(5μg或10μg)或对照(5μg或10μg)IVT注射成年小鼠的左眼。48小时后收集眼并用抗NG2和GS凝集素I染色。在成年小鼠中，mAb39没有产生任何周细胞损失或任何血管形态学改变的证据。
这些研究共同证明PDGFR-β的选择性的药理学中和在促进周细胞消耗中有效并对血管形态学的改变和发育中的视网膜新血管的生长有贡献。相反，这一相同的抑制似乎并未对成年小鼠视网膜中已经建立的血管系统的成熟周细胞和血管有任何作用。
实施例10.包含抗PDGFR-β抗体和VEGF拮抗剂的组合制剂在患有年龄相关的黄斑变性的患者中的1期临床试验
研究概述
进行1期临床试验以测试在患有新血管年龄相关的黄斑变性(AMD)的患者中通过玻璃体内注射递送的本发明的抗PDGFR-β抗体连同玻璃体内(IVT)阿柏西普的安全性。阿柏西普的氨基酸序列(也称为VEGFR1R2-FcΔC1(a))，以及编码其的核酸序列，示于，例如WO2012/097019中。
本研究的主要目标是探究在患有新血管AMD的患者中玻璃体内(IVT)抗PDGFR-β抗体的安全性。第二目标是探索IVT抗PDGFR-β对具有新血管AMD的患者中的角膜新血管形成(CNV)的解剖学作用，以及测定抗PDGFR-β和阿柏西普在人中的药物代谢动力学。本研究的另一目标是测定在用这些活性剂治疗的对象中针对抗PDGFR-β抗体和/或阿柏西普的抗体的存在。
靶群体
此研究的靶群体是年龄为50岁和以上的患有新血管AMD的男人和女人。在4个计划的组中将招募约3-6名患者。计划总共15-24名患者。最大耐受剂量(MTD)(如果鉴定出)，或最高剂量水平将招募6名患者。
关键的纳入/排除标准
此研究的关键纳入标准如下：(1)年龄为50岁或以上的男人和女人；和(2)继发于AMD的活跃的中心凹下CNV，包括影响凹的近中心凹损伤，如通过研究眼的FA所证明的。
此研究的关键排除标准如下：(1)研究开始(第1天)的8周内研究眼中的IVT抗VEGF治疗；(2)使用PDGF或PDGFR抑制剂的任何先前治疗；(3)研究眼中眼内压大于或等于25mmHg；(4)任一眼中感染性睑炎、角膜炎、巩膜炎、或结膜炎的证据；(5)筛选访问3个月内任一眼中的任何眼内炎症/感染(6)筛选评估时研究眼中可见的当前的虹膜新血管形成，玻璃体出血，或牵引型视网膜脱离；(7)任一眼中由于AMD以外的任何原因的CNV的证据；(8)任一眼中糖尿病性视网膜病变或糖尿病性黄斑水肿的证据；(9)不能得到照片、FA或OCT以记录CNV，例如，由于间质混浊，对荧光素染料过敏或缺少静脉通路；和(10)在第1天的6周内的全身(IV)抗VEGF施用。
研究设计
在筛选访问时将就研究资格性评估患者，直至第1天/基线(第2次访问)前两周。在第1天/基线(第2次访问)时，在接受研究药物的第一次剂量前患者将进行安全性评价。
有资格的患者将招募至当前开放招募的组中。初始组将接受抗PDGFR-β/阿柏西普(以0.2mg:2mg共配制)。在第1天和第29天(±3天)时，患者将接受注射抗PDGFR-β/阿柏西普。
将基于在先前组过程中评估的安全性和耐受性升高抗PDGFR-β/阿柏西普的剂量(从第1名患者开始，首个剂量至该组的最后1名患者的第二剂量后2周，或约第6周)。在每个组中招募的第一名患者也将在第一次剂量后观察至少1周，之后对其他患者施药。一旦完成数据回顾后，将发生升高至下一个剂量组。不允许患者内剂量升高。
在研究访问时将评价患者的眼和全身安全性(包括眼科检查、实验室评估等)和效力(OCT、FA/FP、CNV面积、经典的CNV大小、总损伤大小、黄斑体积、成像、和使用4米ETDRS流程的BCVA)并且将跟踪至第24周。
研究药物治疗
将对患者施用四种不同的抗PDGFR-β/阿柏西普共制剂。共制剂总结于表12中。
表12
共制剂 抗PDGFR-β抗体 阿柏西普
1 0.2mg 2mg
2 0.5mg 2mg
3 1mg 2mg
4 3mg 2mg
每种制剂将由10mM磷酸钠，pH 6.2，0.03％(w/v)聚山梨醇酯20、5％(w/v)蔗糖和40mM氯化钠组成。
多种抗PDGFR-β/阿柏西普共制剂将经由IVT注射递送并且注射体积将为50μl。如上文注意到的，患者将接受共制剂的两次单独的施用。第一次施用将在第1天，并且第二次施用将在第29天。
主要和次要研究终点
研究的主要终点是研究药物的安全性。次要终点是：(1)第8周和第12周时中央视网膜厚度相对于基线的改变(通过OCT测量)；(2)第8周和第12周时具有视网膜液的完全消退(通过OCT测量)的患者的比例；(3)第8周和第12周时CNV面积相对于基线的改变(通过OCT测量)；(4)第8周和第12周时CNV大小相对于基线的改变(通过FA测量)；(5)第8周和第12周时渗漏面积相对于基线的改变(通过FA测量)；(6)BCVA相对于基线的改变；和(7)药物代谢动力学和抗药物抗体的出现。
本发明将不受本文所述特定实施方案的限制。的确，除了本文所述的实施方案以外，对于本领域技术人员而言，基于上述说明和附图，本发明之多种修改形式也将变得很明显。这些修改形式也旨在落入所附权利要求的范围。

Claims (24)

1.以低于200pM的结合解离平衡常数特异性结合二聚体人血小板源生长因子受体β的完整人抗体或其抗原结合片段，所述结合解离平衡常数是在37℃在表面等离子共振测定法中测量的，
其中抗体或其抗原结合片段包含三个重链互补决定区，分别为HCDR1、HCDR2和HCDR3；和三个轻链互补决定区，分别为LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述三个重链互补决定区分别如SEQID NO:132、134和136所示，并且所述三个轻链互补决定区分别如SEQ ID NO:140、142和144所示，所述血小板源生长因子受体β的缩写为PDGFR-β。
2.权利要求1的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段阻断至少一种PDGF配体与PDGFR-β的结合。
3.权利要求2的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以低于300pM的IC50值阻断PDGF-BB配体结合可溶性单体PDGFR-β，所述IC50值是在25℃在体外受体/配体结合测定法中测量的。
4.权利要求3的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段以低于150pM的IC50值阻断PDGF-BB配体结合可溶性单体PDGFR-β，所述IC50值是在25℃在体外受体/配体结合测定法中测量的。
5.权利要求1至4中任一项的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段抑制表达PDGFR-β的细胞中的PDGFR-β信号传递的PDGF配体介导的激活。
6.权利要求1至4中任一项的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段与PDGFR-β胞外结构域的SEQ ID NO:337中氨基酸97至178所示Ig结构域2中的一个或多个氨基酸特异性相互作用。
7.包含权利要求1至6中任一项的完整人抗体或抗原结合片段，和可药用的运载体或稀释剂的药物组合物。
8.权利要求7的药物组合物在制备用于治疗眼病的方法的药物中的用途，所述方法包括对罹患眼病的对象施用所述药物。
9.权利要求8的用途，其中眼病选自由年龄相关的黄斑变性、渗出性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、中央视网膜静脉阻塞、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼手术后纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变、脉络膜新生血管形成、视神经盘新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳,翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、血管性视网膜病、视网膜退化、葡萄膜炎，和眼的炎性疾病组成的组。
10.包含权利要求1至6中任一项的完整人抗体或抗原结合片段，还包含VEGF拮抗剂，和可药用的运载体或稀释剂的药物组合物。
11.权利要求10的药物组合物，其中VEGF拮抗剂是VEGF抑制性融合蛋白或抗VEGF抗体或抗VEGF抗体的抗原结合片段。
12.权利要求11的药物组合物，其中VEGF拮抗剂是阿柏西普、贝伐单抗、或来尼珠单抗。
13.权利要求10-12中任一项的药物组合物在制备用于治疗眼病的方法的药物中的用途，所述方法包括对罹患眼病的对象施用所述药物。
14.权利要求13的用途，其中眼病选自由年龄相关的黄斑变性、渗出性年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、中央视网膜静脉阻塞、虹膜新生血管形成、新生血管性青光眼、青光眼手术后纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变、脉络膜新生血管形成、视神经盘新生血管形成、角膜新生血管形成、视网膜新生血管形成、玻璃体新生血管形成、血管翳,翼状胬肉、黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿、血管性视网膜病、视网膜退化、葡萄膜炎，和眼的炎性疾病组成的组。
15.(i)权利要求1至6中任一项的完整人抗体或抗原结合片段；和(ii)阿柏西普在制备用于治疗年龄相关的黄斑变性的方法的药物中的用途，所述方法包括对有需要的对象施用所述药物。
16.权利要求15的用途，其中在向对象施用阿柏西普之前、同时或之后，向对象施用完整人抗体或其抗原结合片段。
17.权利要求15或16的用途，其中在单个制剂中共同向对象施用完整人抗体或其抗原结合片段和阿柏西普。
18.权利要求15或16的用途，其中在单独的剂型中向对象施用完整人抗体或其抗原结合片段和阿柏西普。
19.权利要求12的药物组合物在制备用于抑制肿瘤生长的方法的药物中的用途，所述方法包括向罹患肿瘤的对象施用所述药物。
20.权利要求19的用途，其中肿瘤选自由肾肿瘤、胰腺肿瘤、头和颈肿瘤、乳肿瘤、前列腺肿瘤、结肠肿瘤、胃肿瘤，和卵巢肿瘤、肺肿瘤，和皮肤肿瘤组成的组。
21.权利要求12的药物组合物在制备用于治疗纤维化的方法的药物中的用途，所述方法包括对罹患纤维化病况的对象施用所述药物。
22.权利要求21的用途，其中纤维化病况是肺纤维化、眼纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化，或肝纤维化。
23.权利要求1至4中任一项的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:130，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:138。
24.权利要求6所述的完整人抗体或抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:130，并且所述轻链可变区包含SEQ ID NO:138。
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