BR112015016312B1

BR112015016312B1 - Anticorpos anti-pdgfr-beta, seus usos e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015016312B1
Application number: BR112015016312-2A
Authority: BR
Inventors: Stanley J. Wiegand; Ivan B. Lobov
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2013-01-09
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2020-12-15
Also published as: US20140193402A1; NZ709683A; CA2897383C; IL239552A0; US20170210813A1; CL2018000703A1; EA201591072A1; IL245040A0; TWI647239B; US9650444B2; EP2943218B1; CN104936614B; SG11201505035YA; JP6367233B2; TW201441261A; IL239552B; EA031049B1; PH12015501493A1; HK1214969A1; CA2897383A1

Abstract

anticorpos anti-pdgfr-beta e usos dos mesmos. a presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a receptor beta de fator de crescimento derivado de plaqueta (pdgfr- beta) e processos de uso dos mesmos. de acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos são anticorpos inteiramente humanos que se ligam a pdgfr-beta humana com alta afinidade. os anticorpos da invenção são úteis para o tratamento de doenças e distúrbios associados com sinalização de pdgfr-beta e/ou expressão celular de pdgfr-beta, tais como doenças oculares, doenças fibróticas, doenças vasculares e câncer.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos, e seus fragmentos de ligação de antígeno, que são específicos para PDGFR- beta humano, e processos de seu uso.

Antecedentes

[002] Fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGFs) são mitógenos potentes que existem como cinco diferentes configurações diméricas compostas por quatro diferentes subunidades de isoforma: A, B, C e D. As cinco formas diméricas dos PDGFs são AA, BB, AB, CC e DD, que são formadas por ligação dissulfeto dos correspondentes monômeros PDGF individuais. Ligantes de PDGF exercem seus efeitos biológicos através de suas interações com receptores de PDGF (PDGFRs). PDGFRs são receptores tirosina cinase, transmembrana, de passe simples, compostos por associações heterodiméricas ou homodiméricas de uma cadeia receptora alfa (α) (PDGFR-alfa) e/ou uma cadeia receptora beta (β) (PDGFR-beta). Assim, PDGFRs ativos podem consistir em pares de cadeias receptoras αα, ββ ou αβ. PDGFRs compartilham uma estrutura de domínio comum, incluindo cinco laços imunoglobulina extracelulares, um domínio de transmembrana, e um domínio tirosina cinase (TK) intracelular de clivagem. A interação entre ligantes PDGF diméricos e PDGFRs conduz a dimerização de cadeia de receptor, auto fosforilação de receptor e transdução de sinal intracelular. Foi demonstrado in vitro que receptores ββ são ativados por PDGF-BB e - DD, enquanto receptores αβ são ativados por PDGF-BB, -CC, -DD e - AB, e receptores αα são ativados por PDGF-AA, -BB, -CC e -AB (ver Andrae et al. (2008) Genes Dev 22(10);1276-1312).

[003] Sinalização PDGF foi implicada em várias doenças humanas incluindo doenças associadas com neovascularização patológica, doenças vasculares e fibróticas, crescimento de tumor e doenças de olhos. Da mesma maneira, inibidores de sinalização PDGF foram sugeridos para uso em uma variedade de cenários terapêuticos. Por exemplo, inibidores de PDGFR-beta foram propostos para uso no tratamento de várias doenças e distúrbios (Andrae et al. (2008) Genes Dev 22(10):1276-1312). Inibidores de PDGFR-beta incluem inibidores tirosina cinase de molécula pequena não específicos tais como mesilato de imatinibe, malato de sunitinibe e CP- 673451, assim como anticorpos anti-PDGFR-beta (ver, por exemplo, patentes U.S. Nos. 7 060 271; 5 882 644; 7 740 850; e pedido de patente U.S. No. 2011/0177074). Aptâmeros antiligantes (por exemplo, anti-PDGF-B) também foram propostos para aplicações terapêuticas. Não obstante, existe uma necessidade na técnica de inibidores de sinalização PDGF novos, altamente específicos e potentes.

Sumário da Invenção

[004] A presente invenção provê anticorpos que se ligam a receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta humano beta (“PDGFR-beta”). Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para inibição de sinalização mediada por PDGFR-beta e para tratamento de doenças e distúrbios causados por ou relacionados à atividade e/ou sinalização de PDGFR-beta. Os anticorpos da invenção também são úteis para indução de morte de célula em células que expressam altos níveis de PDGFR-beta sobre suas superfícies.

[005] Os anticorpos da invenção podem ser de inteiro comprimento (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender somente uma porção de ligação de antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv), e podem ser modificados para afetar funcionalidade, por exemplo, para eliminar residuais funções efetoras (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:19251933).

[006] A presente invenção provê anticorpos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno compreendendo uma região variável de cadeia pesada (HCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, e 322, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[007] A presente invenção também provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, e 330, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[008] A presente invenção também provê um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno compreendendo um par de sequências HCVR e LCVR (HCVR/LCVR) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, e 322/330.

[009] A presente invenção também provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, e 328, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR3 de cadeia leve (LCDR3) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, e 336, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência,

[0010] Em certas modalidades, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo compreende um par de sequências de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320, e 328/336.

[0011] A presente invenção também provê um anticorpo ou seu fragmento ainda compreendendo um domínio CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, e 324, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, e 326, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio CDR1 de cadeia leve (LCDR1) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, e 332, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio CDR2 de cadeia leve (LCDR2) tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, e 334, ou uma sua sequência substancialmente similar tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.

[0012] Certos anticorpos exemplares não limitantes e fragmentos de ligação de antígeno da invenção compreendem domínios HCDR1- HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, tendo as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 (por exemplo, H1M3299N); 20-22-24-2830-32 (por exemplo, H1M3305N); 36-38-40-44-46-48 (por exemplo, H1M3310N); 52-54-56-60-62-64 (por exemplo, H1M3361N); 68-70-7276-78-80 (por exemplo, H2M3363N); 84-86-88-92-94-96 (por exemplo, H2M3365N); 100-102-104-108-110-112 (por exemplo, H2M3368N); 116-118-120-124-126-128 (por exemplo, H2M3373N); 132-134-136140-142-144 (por exemplo, H2M3374N); 148-150-152-156-158-160 (por exemplo, H4H3094P); 164-166-168-172-174-176 (por exemplo, H4H3095S); 180-182-184-188-190-192 (por exemplo, H4H3096S); 196-198-200-204-206-208 (por exemplo, H4H3097S); 212-214-216220-222-224 (por exemplo, H4H3098S); 228-230-232-236-238-240 (por exemplo, H4H3099S); 244-246-248-252-254-256 (por exemplo, H4H3102S); 260-262-264-268-270-272 (por exemplo, H4H3103S); 276-278-280-284-286-288 (por exemplo, H4H3104S); 292-294-296300-302-304 (por exemplo, H4H3105S); 308-310-312-316-318-320 (por exemplo, H4H3106S); e 324-326-328-332-334-336 (por exemplo, H4H3107S).

[0013] Em uma modalidade relacionada, a invenção inclui um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo que liga especificamente PDGFR-beta, onde o anticorpo ou fragmento compreende os domínios CDR de cadeia pesada e leve contidos em sequências de região variável de cadeia pesada e leve (HCVR/LCVR) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, e 322/330. Processos e técnicas para identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácidos de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificação de CDRs dentro das especificadas sequências de aminoácidos de HCVR e/ou LCVR aqui mostradas. Convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição Kabat, a definição Chothia e a definição AbM. Em termos gerais, a definição Kabat é baseada em variabilidade de sequência, a definição Chothia é baseada na localização das regiões de laço estrutural, e a definição AbM é um compromisso entre as abordagens Kabat e Chothia. Ver, por exemplo, Kabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991);Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); e Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989). Bases de dados públicas também são disponíveis para identificação de sequências CDR dentro de um anticorpo.

[0014] Em um outro aspecto, a invenção provê moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos PDGFR-beta ou seus fragmentos de ligação de antígeno. Vetores de expressão recombinantes carreando os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiras nas quais tais vetores foram introduzidos, também são abrangidos pela invenção, como são processos de produção de anticorpos através de cultura de células hospedeiras sob condições permitindo produção dos anticorpos, e recuperação de anticorpos produzidos.

[0015] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou seu fragmento compreendendo um HCVR codificado por uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, ou 321, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia.

[0016] A presente invenção também provê um anticorpo ou seu fragmento compreendendo um LCVR codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, e 329, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia.

[0017] A presente invenção também provê um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55,71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, e 327, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia; e um domínio LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, e 335, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia.

[0018] A presente invenção também provê um anticorpo ou seu fragmento que ainda compreende um domínio HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, e 323, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia; um domínio HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, e 325, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia; um domínio LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 2219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, e 331, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia; e um domínio LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, e 333, ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de homologia.

[0019] De acordo com certas modalidades, o anticorpo ou seu fragmento compreende as sequências CDR de cadeia pesada e leve codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 1 e 9 (por exemplo, H1M3299N), 17 e 25 (por exemplo H1M3305N), 33 e 41 (por exemplo, H1M3310N), 49 e 57 (por exemplo, H1M3361N), 65 e 73 (por exemplo, H2M3363N), 81 e 89 (por exemplo, H2M3365N), 97 e 105 (por exemplo, H2M3368N), 113 e 121 (por exemplo, H2M3373N), 129 e 137 (por exemplo, H2M3374N); 145 e 153 (por exemplo, H4H3094P), 161 e 169 (por exemplo, H4H3095S), 177 e 185 (por exemplo, H4H3096S), 193 e 201 (por exemplo, H4H3097S), 209 e 217 (por exemplo, H4H3098S), 225 e 233 (por exemplo, H4H3099S), 241 e 249 (por exemplo, H4H3102S), 257 e 265 (por exemplo, H4H3103S), 273 e 281 (por exemplo, H4H3104S), 289 e 297 (por exemplo, H4H3105S), 305 e 313 (por exemplo, H4H3106S), ou 321 e 329 (por exemplo, H4H3107S).

[0020] A presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou um anticorpo carecendo de uma metade fucose presente sobre a cadeia oligossacarídeo, por exemplo, para aumentar função de citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) (ver Shield et al. (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galactosilação pode ser feita de modo a modificar citotoxidez dependente de complemento (CDC).

[0021] Em um outro aspecto, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humano recombinante ou um seu fragmento que liga especificamente PDGFR-beta e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em um aspecto relacionado, a invenção apresenta uma composição que é uma combinação de um anticorpo anti-PDGFR-beta e um segundo agente terapêutico. Em uma modalidade, o segundo agente terapêutico é qualquer agente que é vantajosamente combinado com um anticorpo anti-PDGFR-beta. Agentes exemplares que podem ser vantajosamente combinados com um anticorpo anti-PDGFR-beta incluem, sem limitação, outros agentes que inibem atividade de PDGFR-beta (incluindo outros anticorpos ou seus fragmentos de ligação de antígeno, inibidores peptídeos, antagonistas de moléculas pequenas, etc.) e/ou agentes que não ligam diretamente PDGFR-beta mas não obstante interferem com, bloqueiam ou atenuam sinalização mediada por PDGFR-beta. Adicionais terapias de combinação e coformulações envolvendo os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção são aqui mostradas em outras partes.

[0022] Ainda em um outro aspecto, a invenção provê processos terapêuticos para inibição de atividade de PDGFR-beta usando um anticorpo anti-PDGFR-beta ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção, onde os processos terapêuticos compreendem administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção. O distúrbio tratado é qualquer doença ou condição que seja aperfeiçoada, melhorada, inibida ou prevenida através de remoção, inibição ou redução de atividade ou sinalização de PDGFR-beta. Os anticorpos anti-PDGFR-beta ou fragmentos de anticorpos da invenção podem funcionar para bloquear a interação entre PDGFR-beta e um parceiro de ligação de PDGFR-beta (por exemplo, um ligante de PDGFR), ou de outro modo inibir a atividade sinalizante de PDGFR-beta.

[0023] A presente invenção também inclui o uso de um anticorpo anti-PDGFR-beta ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado a ou causado por atividade de PDGFR-beta em um paciente.

[0024] Outras modalidades tornar-se-ão aparentes a partir de uma revisão da seguinte descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

[0025] A Figura 1 é um histograma mostrando os resultados de um ensaio de bloqueio de ligante PDGFR onde PDGFR-beta foi capturado sobre uma superfície de biossensor e ligante PDGF (BB, DD ou AB) foi aplicado sobre a superfície seguindo tratamento com vários anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção ou anticorpo controle. Os resultados são mostrados como Rus.

[0026] A Figura 2 é uma matriz mostrando os resultados de um ensaio de competição cruzada de anticorpos onde um primeiro anticorpo anti-PDGFR-beta (mAb#1) foi aplicado a uma ponta sensora revestida com PDGFR-beta, seguido por tratamento com um segundo anticorpo anti-PDGFR-beta (mAb#2). Respostas de ligação (valores numéricos-0,01 a 0,36) para cada combinação de anticorpos testada são mostradas. Caixas cinza-claro com frente negra representam resposta de ligação para autocompetição. Anticorpos competindo em ambas direções, independente da ordem de ligação de antígeno, são destacados em caixas pretas com frente branca. Nenhuma competição, sugerindo distintas regiões de ligação, é representada como caixas brancas com frente preta.

Descrição Detalhada

[0027] Antes da presente invenção ser descrita, é para ser entendido que está invenção não é limitada a particulares processos e condições experimentais descritas, na medida em que tais processos e condições podem variar. Também é para ser entendido que a terminologia aqui usada é somente para o propósito de descrição de particulares modalidades, e não é pretendida ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção somente será limitado pelas reivindicações apostas.

[0028] A menos que de definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Como aqui usado, o termo “cerca”, quando usado em referência a um particular valor numérico recitado, significa que o valor numérico pode variar a partir do valor recitado por não mais que 1%. Por exemplo, como aqui usada, a expressão “cerca de 100” inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

[0029] Embora quaisquer processos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou testes da presente invenção, os processos e materiais preferidos são agora descritos.

Definições

[0030] As expressões “receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta beta”, “PDGFRβ”, “PDGFR-beta”, “PDGFRb” e semelhantes, aqui usadas, referem-se à proteína PDGFR-beta humana tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 341 (ver também UniProtaccession No. P09619). Todas as referências a proteínas, polipeptídeos e fragmentos de proteínas aqui são pretendidas referirem-se à versão humana da respectiva proteína, polipeptídeo ou fragmento de proteína a menos que explicitamente especificada como sendo de uma espécie não humana (por exemplo, “PDGFR-beta de camundongo”, “PDGFR-beta de macaco”, etc.).

[0031] Como aqui usado, “um anticorpo que liga PDGFR-beta” ou um “anticorpo anti-PDGFR-beta” inclui anticorpos, e seus fragmentos de ligação de antígeno, que ligam um fragmento solúvel de uma proteína PDGFR-beta (por exemplo, todo ou uma porção do domínio extracelular de PDGFR-beta) e/ou PDGFR-beta expressa em superfície de célula. A expressão “PDGFR-beta expressa em superfície de célula” significa uma proteína PDGFR-beta ou uma sua porção que é expressa sobre a superfície de uma célula in vitro ou in vivo, de modo que pelo menos uma porção da proteína PDGFR-beta (por exemplo, aminoácidos 33 a 532 de SEQ ID NO: 341) é exposta ao lado extracelular da membrana de célula e é acessível para uma porção de ligação de antígeno de um anticorpo. “PDGFR-beta expressa em superfície de célula” inclui moléculas de PDGFR-beta no contexto de homodímeros de receptor ββ assim como moléculas de PDGFR-beta no contexto de heterodímeros αβ. Moléculas de PDGFR- beta solúveis incluem, por exemplo, construções de PDGFR-beta monoméricas e diméricas como aqui descritas em Exemplo 3 (por exemplo, “PDGFRb.mmh”, SEQ ID NO: 337 [monomérica], “PDGFRb.mFc”, SEQ ID NO: 338 [dimérica] e “PDGFRb.hFc”, SEQ ID NO: 339 [dimérica], ou construções substancialmente similares às mesmas.

[0032] O termo “anticorpo”, como aqui usado, significa qualquer molécula ou complexo molecular de ligação de antígeno compreendendo pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) que liga especificamente a ou interage com um particular antígeno (por exemplo, PDGFR-beta). O termo “anticorpo” inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de polipeptídeos, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto, assim como seus multímeros (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL ainda podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir de terminus amino para terminus carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades da invenção, as FRs do anticorpo anti-PDGFR-beta (ou sua porção de ligação de antígeno) podem ser idênticas às sequências de linha germe humana, ou podem ser modificadas naturalmente ou artificialmente. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida baseado em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.

[0033] O termo “anticorpo”, como aqui usado, também inclui fragmentos de ligação de antígeno de moléculas inteiras de anticorpos. Os termos “porção de ligação de antígeno” de um anticorpo, “fragmento de ligação de antígeno” de um anticorpo, e semelhantes, como aqui usados, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína ocorrendo naturalmente, obtenível enzimaticamente, sintética ou geneticamente engenheirada que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação de antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas inteiras de anticorpos usando quaisquer técnicas padrões apropriadas envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificando domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpos. Tal DNA é conhecido e/ou é facilmente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago - anticorpo), ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e quimicamente manipulado ou através de uso de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para disposição de um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração apropriada, ou para introdução de códon, criação de resíduos cisteína, modificar, adicionar ou suprimir aminoácidos, etc.

[0034] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação de antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmewntos Fd; (v) moléculas Fv(scFv) de cadeia simples; (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácidos que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada tal como um peptídeo CDR3), ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restringido. Outras moléculas engenheiradas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio simples, anticorpos de domínios suprimidos, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc.), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs), e domínios IgNAR variáveis de tubarão também são abrangidos pela expressão “fragmento de ligação de antígeno”, como aqui usado.

[0035] Um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácidos e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR que está adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências de estrutura. Em fragmentos de ligação de antígeno tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer arranjo apropriado. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VL-VL. Alternativamente, o fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.

[0036] Em certas modalidades, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável ligado covalentemente a, pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares, não limitantes de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL.

[0037] Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ligados tanto diretamente uns aos outros como podem ser ligados por uma região ligante ou de articulação total ou parcial. Uma região de articulação pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos que resultam em ligação flexível ou semi - flexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo simples. Além disso, um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de quaisquer configurações de domínio variável e constante listadas acima em associação não covalente uns com os outros e/ou com um ou mais domínio VH ou VL monomérico (por exemplo, através de ligação(s) dissulffeto).

[0038] Como com moléculas inteiras de anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação de antígeno multiespecífico de um anticorpo tipicamente compreenderá pelo menos dois diferentes domínios variáveis, onde cada domínio variável é capaz de ligação específica a um antígeno separado ou a um diferente epítopo sobre o mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpos biespecíficos exemplares aqui mostrados, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas rotineiras disponíveis.

[0039] Os anticorpos da presente invenção podem funcionar através de citotoxidez dependente de complemento (CDC) ou citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). “Citotoxidez dependente de complemento” (CDC) refere-se à lise de células expressando antígeno por um anticorpo da invenção na presença de complemento. “Citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo” (ADCC) refere-se a uma reação mediada por célula na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células assassinas naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado sobre uma célula-alvo e pelo que conduz a lise da célula-alvo. CDC e ADCC podem ser medidas usando ensaios que são bem conhecidos e disponíveis na técnica. (Ver, por exemplo, patente U.S. 5 500 362 e 5 821 337, e Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652656). A região constante de um anticorpo é importante na habilidade de um anticorpo para fixar complemento e mediar citotoxidez dependente de célula. Assim, o isotipo de um anticorpo pode ser selecionado nas bases de se ele é desejável para o anticorpo para mediar citotoxidez.

[0040] Em certas modalidades da invenção, os anticorpos anti- PDGFR-beta da invenção são anticorpos humanos. O termo “anticorpo humano”, como aqui usado, é pretendido incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germe humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linha germe humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese randômica ou específica de sítio in vitro ou através de mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é pretendido incluir anticorpos nos quais sequências CDR derivadas da linha germe de outra espécie mamífera, ta como um camundongo, tenham sido enxertadas sobre sequências de estrutura humanas.

[0041] Os anticorpos da invenção podem, em algumas modalidades, ser anticorpos humanos recombinantes. O termo “anticorpo humano recombinante”, como aqui usado, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (ainda descrita abaixo), anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatoriais (ainda descrita abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvam união de sequências de gene imunoglobulina humanas a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linha germe humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para sequências Ig humanas é usado, em mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de, e relacionadas a sequências VH e VL de linha germe humana, não podem existir naturalmente dentro de repertório de linha germe de anticorpo humano in vivo.

[0042] Anticorpos humanos podem existir em duas formas que são associadas com heterogeneidade de articulação. Em uma forma, uma molécula de imunoglobulina compreende uma construção de quatro cadeias estável de aproximadamente 150-160 kDa onde os dímeros são mantidos juntos através de uma ligação dissulfeto de cadeia pesada intercadeia. Em u ma segunda forma, os dímeros não são ligados via ligações dissulfeto intercadeia e uma molécula de cerca de 75-80 kDa é formada composta cadeia leve e pesada acopladas covalentemente (meio-anticorpo). Estas formas têm sido extremamente difíceis de separar, mesmo após purificação por afinidade.

[0043] A frequência de aparecimento da segunda forma em vários isotipos IgG intatos é devida a, mas não limitada a, diferenças estruturais associadas com o isotipo de região de articulação do anticorpo. Uma substituição simples de aminoácido na região de articulação da articulação de IgG4 humana pode reduzir significantemente o aparecimento da segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105) para níveis tipicamente observados usando articulação IgG1 humana. A presente invenção abrange anticorpos tendo uma ou mais mutações na articulação, região CH2 ou CH3 que podem ser desejáveis, por exemplo, na produção, para aperfeiçoar o rendimento da desejada forma de anticorpo.

[0044] Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos isolados. Um “anticorpo isolado”, como aqui usado, significa um anticorpo que foi identificado e separado e/ou recuperado de pelo menos um componente de seu ambiente natural. Por exemplo, um anticorpo que foi separado ou removido de pelo menos um componente de um organismo, ou de um tecido ou célula na qual o anticorpo existe naturalmente ou é naturalmente produzido, é um “anticorpo isolado” para propósitos da presente invenção. Um anticorpo isolado também inclui um anticorpo in situ dentro de uma célula recombinante. Anticorpos isolados são anticorpos que foram submetidos a pelo menos uma etapa de purificação ou isolamento. De acordo com certas modalidades, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou compostos químicos.

[0045] A presente invenção inclui neutralização e/ou bloqueio de anticorpo anti-PDGFR-beta. Um anticorpo “neutralizante” ou “bloqueador”, como aqui usado, é pretendido referir-se a um anticorpo cuja ligação a PDGFR-beta : (i) interfere com a interação entre PDGFR-beta ou um fragmento de PDGFR-beta e um ligante de PDGF (por exemplo, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-AB, etc.); (ii) interfere com a formação de dímeros receptores ββ e/ou αβ; e/ou (iii) resulta em inibição de pelo menos uma função biológica de PDGFR- beta. A inibição causada por um anticorpo de bloqueio ou neutralização de PDGFR-beta não precisa ser completa tanto quanto ela seja detectável usando um ensaio apropriado. Ensaios exemplares para detecção de inibição de PDGFR-beta são aqui descritos nos Exemplos de trabalho.

[0046] Os anticorpos anti-PDGFR-beta aqui mostrados podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou supressões de aminoácidos nas regiões de estrutura e/ou CDR dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve como comparados às correspondentes sequências de linha germe da qual os anticorpos foram derivados. Tais mutações podem ser facilmente determinadas através de comparação de sequências de aminoácidos aqui mostradas a sequências de linha germe disponíveis de, por exemplo, bases de dados públicas de sequências de anticorpos. A presente invenção inclui anticorpos, e seus fragmentos de ligação de antígeno, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácidos aqui mostradas, onde um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais regiões de estrutura e/ou CDR sofrem mutação para o correspondente resíduo(s) da sequência de linha germe da qual o anticorpo foi derivado, ou para o correspondente resíduo(s) de uma outra sequência de linha germe humana, ou para uma substituição de aminoácido conservativa do correspondente resíduo(s) de linha germe (tais mudanças de sequência são aqui referidas coletivamente como “mutações de linha germe”). Aqueles versados na técnica, partindo das sequências de região variável de cadeia pesada e leve aqui mostradas, pode facilmente produzir numerosos anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linha germe individual ou suas combinações. Em certas modalidades, todos os resíduos de CDR e/ou estrutura dentro dos domínios VH e VL sofrem mutação de volta para os resíduos encontrados na sequência de linha germe original da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, somente certos resíduos sofrem mutação de volta para a sequência de linha germe original, por exemplo, somente os resíduos que sofreram mutação encontrados dentro de 8 primeiros aminoácidos de FR1 ou dentro de últimos 8 aminoácidos de FR4, ou somente o resíduos que sofreram mutação encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais dos resíduos de estrutura e/ou CDR sofrem mutação para o correspondente resíduo(s) de uma diferente sequência de linha germe (isto é, uma sequência de linha germe que é diferente da sequência de linha germe da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Além disso, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linha germe dentro de regiões de estrutura e/ou CDR, por exemplo, onde certos resíduos individuais sofrem mutação para o correspondente resíduo de uma particular sequência de linha germe enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linha germe original são mantidos ou sofrem mutação para o correspondente resíduo de uma diferente sequência de linha germe. Uma vez obtidos, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno que contêm uma ou mais mutações de linha germe podem ser facilmente testados para uma ou mais desejadas propriedades tais como, aperfeiçoada especificidade de ligação, aumentada afinidade de ligação, aperfeiçoadas ou aumentadas propriedades biológicas antagonistas ou agonistas (como pode ser o caso), reduzida imunogenicidade, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno obtidos nesta maneira genérica são abrangidos na presente invenção.

[0047] A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR- beta compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR aqui mostradas tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta tendo sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc., substituições conservativas de aminoácidos em relação a qualquer das sequências de aminoácidos de HCVR, LCVR, e/ou CDR aqui mostradas.

[0048] O termo “epítopo” refere-se a um determinante antigênico que interage com específico sítio de ligação de antígeno na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como paratopo. Um antígeno simples pode ter mais de um epítopo. Assim, diferentes anticorpos podem se ligar a diferentes áreas sobre um antígeno e podem ter diferentes efeitos biológicos. Epítopos também podem ser conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos a partir de diferentes segmentos da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácidos adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em certa circunstância, um epítopo pode incluir metades de sacarídeos, grupos fosforila, ou grupos sulfonila sobre o antígeno.

[0049] O termo “identidade substancial” ou “substancialmente idêntico”, quando referindo-se a um ácido nucleico ou seu fragmento, indica que, quando otimamente alinhado com apropriadas inserções ou supressões de nucleotídeos com um outro ácido nucleico (ou sua fita complementar), há identidade de sequência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeos, como medida através de um algoritmo bem conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico tendo substancial identidade a uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos exemplos, codificar um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos idêntica ou substancialmente similar como o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.

[0050] Como aplicado a polipeptídeos, o termo “substancial similaridade” ou “substancialmente similar” significa que duas sequências de peptídeos, quando otimamente alinhadas, tal como através de programas GAP ou BESTFIT usando pesos de folga default, compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência, mesmo mais preferivelmente pelo menos 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não alterará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a porcentagem de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado ascendente para correção de natureza conservativa da substituição. Meios para obtenção deste ajuste são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331. Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem (1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadeias laterais hidroxila alifáticas: serina e treonina; (3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; (4) cadeias laterais aromáticas: fenil alanina, tirosina, e triptofano; (5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; (6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato, e (7) cadeias laterais contendo enxofre são cisteína e metionina. Grupos preferidos de substituição convervativa de aminoácidos são: valina - leucina - isoleucina, fenil alanina - tirosina, lisina - arginina, alanina - valina, glutamato - aspartato, e asparagina - glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade-log PAM250 mostrada em Gonnet et al. (1992) Science 256:1443-1445. Uma substituição “moderadamente conservativa” é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade - log PAM250.

[0051] Similaridade de sequências para polipeptídeos, que também é referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando suporte lógico de análise de sequência. Suporte lógico de analise de proteína ajusta sequências similares usando medidas de similaridade atribuídas a várias substituições, supressões e outras modificações, incluindo substituições conservativas de aminoácidos. Por exemplo, suporte lógico GCG contém programas como Gap e Bestfit que podem ser usados com parâmetros default para determinação de homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos relacionados de perto, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína tipo selvagem e uma sua muteína. Ver, por exemplo, GCG Version 6.1. Sequências de polipeptídeos também podem ser comparadas usando FASTA usando parâmetros recomendados ou default, um programa GCG Version 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e porcentagem de identidade de sequência das regiões de melhor sobreposição entre as sequências de busca e questão (Pearson (2000) supra). Um outro algoritmo preferido quando comparando uma sequência da invenção a uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros default. Ver, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Ligação dependente de pH

[0052] A presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta com características de ligação dependente de pH. Por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR-beta da presente invenção pode exibir reduzida ligação a PDGFR-beta em pH ácido como comparado a pH neutro. Alternativamente, anticorpo anti-PDGFR-beta da invenção pode exibir aperfeiçoada ligação a seu antígeno em pH ácido comparado a pH neutro. A expressão “pH ácido” inclui valores de pH de menos que cerca de 6,2, por exemplo, cerca de 6,0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0, ou menos. Como aqui usada, a expressão “pH neutro” significa um pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,4. A expressão “pH neutro” inclui valores de pH de cerca de 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, e 7,4.

[0053] Em certos exemplos, “ligação reduzida a PDGFR-beta em pH ácido comparado a pH neutro” é expressa em termos de uma razão do valo r KD do anticorpo ligando a PDGFR-beta em pH ácido ao valor de KD do anticorpo ligando a PDGFR-beta em pH neutro (ou vice-versa). Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno pode ser visto como exibindo “reduzida ligação a PDGFR- beta em pH ácido comparado a pH neutro” para propósitos da presente invenção se o anticorpo ou seu fragmento de ligação de antígeno exibe uma razão KD ácida / neutra de cerca de 3,0 ou maior. Em certas modalidades exemplares, a razão KD ácida / neutra para um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno da presente invenção pode ser cerca de 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 ou maior.

[0054] Anticorpos com características de ligação dependentes de pH podem ser obtidos, por exemplo, através de seleção de uma população de anticorpos para reduzida (ou aperfeiçoada) ligação a um particular antígeno em pH ácido comparado a pH neutro. Adicionalmente, modificações do domínio de ligação de antígeno no nível de aminoácido pode render anticorpos com características dependentes de pH. Por exemplo, através de substituição de um ou mais aminoácidos de um domínio de ligação de antígeno (por exemplo, dentro de uma CDR) com um resíduo histidina, um anticorpo com reduzida ligação de antígeno em pH ácido em relação a pH neutro pode ser obtido.

Anticorpos anti-PDGFR-beta compreendendo variantes Fc

[0055] De acordo com certas modalidades da presente invenção, anticorpos anti-PDGFR-beta são providos compreendendo um domínio Fc compreendendo uma ou mais mutações que aperfeiçoam ou diminuem ligação de anticorpo ao receptor FcRn, por exemplo, em pH ácido como comparado a pH neutro. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta compreendendo uma mutação na região CH2 ou CH3 do domínio Fc, onde a mutação(s) aumenta a afinidade do domínio Fc para FcRn em um ambiente ácido (por exemplo, em um endossoma onde pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0). Tais mutações podem resultar em um aumento em meia-vida em soro do anticorpo quando administrado a um animal. Exemplos não limitantes de tais modificações Fc incluem, por exemplo, uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação na posição 428 e/ou 433 (por exemplo, H/L/R/S/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação na posição 250 e/ou 428; ou uma modificação na posição 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em uma modalidade, a modificação compreende uma modificação 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S); uma modificação 428L, 259I (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, V308F); uma modificação 433K (por exemplo, H433K), e uma 434 (por exemplo, 434Y); uma modificação 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T e 256E); uma modificação 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); e uma modificação 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).

[0056] Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti- PDGFR-beta compreendendo um domínio Fc compreendendo um ou mais pares ou grupos de mutações selecionados do grupo consistindo em: 250Q e 248L (por exemplo, T250Q e M248L); 252Y, 254T e 256E (por exemplo, M252Y, S254T e T256E); 428L e 434S (por exemplo, M428L e N434S); e 433K e 434F (por exemplo, H433K e N434F). Todas as combinações possíveis das mutações de domínio Fc anteriores, e outras mutações dentro de domínios variáveis de anticorpo aqui mostrado, são contempladas dentro do escopo da presente invenção.

Características biológicas dos anticorpos

[0057] A presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam moléculas de PDGFR-beta monoméricas ou diméricas solúveis com alta afinidade. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos eu ligam PDGFR-beta monomérica (por exemplo, a 25oC ou 37oC) com uma KD de menos que cerca de 30 nM como medida por ressonância plásmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 3. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção ligam PDGFR-beta monomérica com uma KD de menos que cerca de 25 nM, menos que cerca de 20 nM, menos que cerca de 15 nM, menos que cerca de 10 nM, menos que cerca de 5 nM, menos que cerca de 2 nM, ou menos que cerca de 1 nM, como medida por ressonância plásmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 3, ou um ensaio substancialmente similar.

[0058] A presente invenção também inclui anticorpos e seus fragmentos de ligação de antígeno que ligam PDGFR-beta dimérico (por exemplo, a 25oC ou 37oC) com uma KD de menos que cerca de 250 pM como medida por ressonância plásmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 3. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção ligam PDGFR-beta dimérica com uma KD de menos que cerca de 240 pM, menos que cerca de 230 pM, menos que cerca de 220 pM, menos que cerca de 210 M, menos que cerca de 200 pM, menos que cerca de 190 pM, menos que cerca de 180 pM, menos que cerca de 170 pM, menos que cerca de 160 pM, menos que cerca de 150 pM, menos que cerca de 140 pM, menos que cerca de 130 pM, menos que cerca de 120 pM, menos que cerca de 110 pM, ou menos que cerca de 100 pM, como medida por ressonância plásmon de superfície, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 3, ou um ensaio substancialmente similar.

[0059] A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR- beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que bloqueiam a ligação de um ou mais ligantes PDGF (por exemplo, PDGF-BB, -AB, - CC, ou -DD) a PDGFR-beta. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que bloqueiam a ligação de PDGF-BB a PDGFR-beta monomérica in vitro, com um valor de IC50 de menos que cerca de 300 pM, como medido por um ensaio imunobaseado em ELISA, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 4(A), ou um bioensaio de tempo real, por exemplo, usando o formato de ensaio como definido no Exemplo 4(B), ou um ensaio substancialmente similar. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção bloqueiam a ligação de PDGF-BB a PDGFR-beta monomérica in vitro com um valor de IC50 de menos que cerca de 280 pM, menos que cerca de 260 pM, menos que cerca de 240 pM, menos que cerca de 220 pM, menos que cer4ca de 200 pM, menos que cerca de 180 pM, menos que cerca de 160 pM, menos que cerca de 150 pM, menos que cerca de 140 pM, menos que cerca de 130 pM, menos que cerca de 120 pM, menos que cerca de 110 pM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 90 pM, menos que cerca de 80 pM, ou menos que cerca de 75 pM, como medido por um ensaio imunobaseado em ELISA, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 4(B), ou um ensaio substancialmente similar.

[0060] A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR- beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que inibem ativação mediada por ligante PDFG de PDGFR-beta expressa sobre superfície de célula. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti- PDGFR-beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que inibem ativação mediada por PDGF-BB ou PDGF-DD de PDGFR-beta expressa em superfície de célula, com um valor IC50 de menos que 500 pM, como medido em um bioensaio de bloqueio baseado em célula, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente similar. Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção bloqueiam ativação mediada por PDGF-BB ou PDGF-DD de PDGFR-beta expressa em superfície de célula com uma IC50 de menos que cerca de 400 pM, menos que cerca de 350 pM, menos que cerca de 300 pM, menos que cerca de 250 pM, menos que cerca de 200 pM, menos que cerca de 150 pM, menos que cerca de 100 pM, menos que cerca de 90 pM, menos que cerca de 80 pM, menos que cerca de 70 pM, menos que cerca de 60 pM, menos que cerca de 50 pM, menos que cerca de 40 pM, ou menos que cerca de 30 pM, como medido meu m bioensaio de bloqueio baseado em célula, por exemplo, usando o formato de ensaio como aqui definido no Exemplo 6, ou um ensaio substancialmente similar.

[0061] A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR- beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que são internalizados em células expressando PDGFR-beta. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta e seus fragmentos de ligação de antígeno que são efetivamente internalizados em células expressando PDGFR-beta como medido usando um ensaio de internalização de anticorpo baseado em célula como aqui definido no Exemplo 7, ou um ensaio substancialmente similar.

[0062] Os anticorpos da presente invenção podem possuir uma ou mais das características biológicas mencionadas anteriormente, ou qualquer combinação das mesmas. Outras características biológicas dos anticorpos da presente invenção serão evidentes para aqueles versados na técnica a partir de uma revisão da presente exposição incluindo os presentes exemplos de trabalho.

Mapeamento de epítopo e tecnologias relacionadas

[0063] A presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro de domínio extracelular de PDGFR-beta humana (por exemplo, dentro de domínios Ig 1, 2, 3, 4 e/ou 5 do domínio extracelular de PDGFR-beta). Domínios Ig 1 a 3 (por exemplo, aminoácidos 1 a 227 de SEQ ID NO: 337) são conhecidos estarem envolvidos em ligação de ligante. A presente invenção inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados dentro do domínio Ig 1 (por exemplo, aminoácidos 1 a 88 de SE ID NO: 337), domínio Ig 2 (por exemplo, aminoácidos 97 a 178 de SEQ ID NO: 337) e/ou domínio Ig 3 (por exemplo, aminoácidos 182 a 277 de SEQ ID NO: 337), e pelo que bloquear efetivamente a interação de receptor / ligante. Em certas modalidades exemplares da presente invenção, anticorpos são providos com interagem especificamente com domínio Ig 2 (por exemplo, dentro de aminoácidos 97 até 178 de SEQ ID NO: 337; ver, por exemplo, Exemplo 8). O epítopo ao qual os anticorpos se ligam pode consistir em uma sequência contígua simples de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos localizados dentro de domínio extracelular de PDGFR-beta. Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácidos) localizadas dentro de domínio extracelular de PDGFR- beta.

[0064] Várias técnicas conhecidas por aqueles versados podem ser usadas para determinar se um anticorpo “interage comum ou mais aminoácidos” dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito em Antibodies, Harlow and Lane (Cold spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análise mutacional de exploração de alanina, análises de manchas de peptídeo (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463), e análise de clivagem de peptídeo. Em adição, processos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496). Um outro processo que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio / deutério detectada por espectrometria de massa. Em termos genéricos, o processo de troca de hidrogênio / deutério envolve marcação de proteína de interesse com deutério, seguida pela ligação de anticorpo à proteína marcada com deutério. A seguir, o complexo de proteína / anticorpo é transferido para água para permitir a ocorrência de troca de hidrogênio - deutério em todos os resíduos exceto os resíduos protegidos pelo anticorpo (que permanece marcado com deutério). Após dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida a clivagem com protease e análise de espectrometria de massa, pelo que revelando os resíduos marcados com deutério que correspondem aos específicos aminoácidos com os quais o anticorpo interage. Ver, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engene and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A.

[0065] A presente invenção ainda inclui anticorpos anti-PDGFR- beta que ligam o mesmo epítopo como qualquer um dos específicos anticorpos exemplares aqui descritos (por exemplo, H1M3299N, H1M3305N, H2M3368N, H4H3096S, H1M3310N, H2M3373N, H4H3097S, H1M3361N, H2M3374N, H4H3098S, H2M3363N, H4H3094P, H4H3099S, H2M3365N H4H3095S H4H3102S H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S, etc.).

[0066] Da mesma maneira, a presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que competem para ligação a PDGFR- beta com qualquer dos anticorpos específicos exemplares aqui descritos (por exemplo, H1M3299N, H1M3305N, H1M3310N, H1M3361N, H2M3363N, H2M3365N, H2M3368N, H2M3373N, H2M3374N, H4H3094P, H4H3095S, H4H3096S, H4H3097S, H4H3098S, H4H3099S, H4H3102S, H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S, etc.). Por exemplo, a presente invenção inclui os anticorpos anti-PDGFR-beta que competem-cruzado para ligação a PDGFR-beta com um ou mais anticorpos de “Bin 1” como aqui definido em Exemplo 5 (por exemplo, H4H3365N, H4H3374N, H4H3103S e H4H3094P). A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que competem cruzado para ligação a PDGFR-beta com um ou mais anticorpos de “Bin2” como aqui definidos no Exemplo 5 (por exemplo, H4H3099S, H4H3107S, H4H3305N e H4H3310N).

[0067] Pode-se facilmente determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo como, ou compete para ligação com, um anticorpo anti-PDGFR-beta referência através de uso de processos rotineiros conhecidos e aqui exemplificados. Por exemplo, para determinar se um anticorpo teste se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti- PDGFR-beta referência da invenção, o anticorpo referência é deixado ligar a uma proteína PDGFR-beta (por exemplo, uma porção solúvel do domínio extracelular de PDGFR-beta ou PDGFR-beta expressa em superfície de célula). A seguir, a habilidade de um anticorpo teste para ligar-se à molécula de PDGFR-beta é avaliada. Se o composto teste é capaz de ligar-se a PDGFR-beta seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-PDGFR-beta de referência, pode ser concluído que o anticorpo teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti- PDGFR-beta referência. Por outro lado, se o anticorpo teste não é capaz de se ligar à molécula de PDGFR-beta seguindo ligação de saturação com o anticorpo anti-PDGFR-beta referência, então o anticorpo teste pode se ligar ao mesmo epítopo como o epítopo ligado pelo anticorpo anti-PDGFR-beta referência da invenção. Adicional experimentação de rotina (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) então pode ser realizada para confirmar se a falta de ligação observada do anticorpo teste é de fato devida a ligação ao mesmo epítopo como o anticorpo referência ou se bloqueio estéreo (ou um outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, Biacore, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível na técnica. De acordo com certas modalidades da presente invenção, dois anticorpos se ligam (ou sobrepõem) ao mesmo epítopo se, por exemplo, um excesso de 1-, 5-, 20- ou 100-vezes de um anticorpo inibe ligação do outro por pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou mesmo 99% como medido em um ensaio de ligação competitivo (ver, por exemplo, Junghans et al., Cancert Res. 1990:50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos são julgados ligarem-se ao mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácidos no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam ligação do outro. Dois anticorpos são julgados terem “epítopos em sobreposição” se somente um subconjunto das mutações de aminoácidos que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzem ou eliminam ligação do outro.

[0068] Para determinar se um anticorpo complete por ligação (ou compete - cruzado por ligação) com um anticorpo anti-PDGFR-beta referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o anticorpo referência é deixado ligar-se a uma proteína PDGFR-beta (por exemplo, uma porção solúvel do domínio extracelular de PDGFR-beta ou PDGFR- beta expressa em superfície de célula) sob condições saturantes seguido por avaliação de ligação do anticorpo teste à molécula de PDGFR-beta. Em uma segunda orientação, o anticorpo teste é deixado ligar-se a uma molécula de PDGFR-beta sob condições saturantes seguido por avaliação de ligação do anticorpo referência à molécula de PDGFR-beta. Se, em ambas orientações, somente o primeiro (saturante) anticorpo é capaz de ligação à molécula de PDGFR-beta, então é concluído que o anticorpo teste e e o anticorpo referência competem por ligação a PDGFR-beta (ver, por exemplo, o formato de ensaio aqui descrito no Exemplo 5, onde proteína PDGFR- beta solúvel é capturada sobre pontas sensoras e as pontas sensoras revestidas com PDGFR-beta são tratadas com um anticorpo referência [mAb#1] e um anticorpo anti-PDGFR-beta teste [mAb#2] sequencialmente e em ambas ordens bsinding). Como será apreciado por aqueles versados na técnica, um anticorpo que compete por ligação com um anticorpo referência pode não necessariamente se ligar ao mesmo epítopo como o anticorpo referência, mas pode bloquear estereamente ligação do anticorpo referência através de ligação de um epítopo em sobreposição ou adjacente.

Preparação de anticorpos humanos

[0069] Processos para geração de anticorpos monoclonais, incluindo anticorpos monoclonais inteiramente humanos são conhecidos na técnica. Quaisquer tais processos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para obtenção de anticorpos humanos que se ligam especificamente a PDGFR-beta humana.

[0070] Usando tecnologia VELOCIMMUNE, por exemplo, ou qualquer outro processo conhecido para geração de anticorpos monoclonais inteiramente humanos, anticorpos quiméricos de alta afinidade para PDGFR-beta são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados por características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. Se necessário, regiões constantes de camundongos são substituídas com uma desejada região constante humana, por exemplo, IgG1 ou IgG4 tipo selvagem ou modificada, para gerar um anticorpo anti-PDGFR-beta inteiramente humano. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com uso específico, ligação de antígeno de alta afinidade e características de especificidade de alvo reside na região variável. Em certos exemplos, anticorpos anti-PDGFR-beta inteiramente humanos são isolados diretamente de células B positivas - antígeno.

Bioequivalentes

[0071] Os anticorpos anti-PDGFR-beta e fragmentos de anticorpos da presente invenção abrangem proteínas tendo sequências de aminoácidos que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas retêm a habilidade para ligar PDGFR-beta humana. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpos compreendem uma ou mais adições, supressões, ou substituições de aminoácidos quando comparados à sequência de origem, que exibe atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma maneira, as sequências de DNA codificando anticorpo anti- PDGFR-beta da presente invenção abrangem sequências que compreendem uma ou mais adições, supressões, ou substituições de nucleotídeos quando comparadas à sequência mostrada, mas que codificam o anticorpo anti-PDGFR-beta ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo anti-PDGFR-beta ou fragmento de anticorpo da invenção. Exemplos de tal aminoácido variante e sequências de DNA são discutidos acima.

[0072] Duas proteínas de ligação de antígeno, ou anticorpos, são consideradas bioequivalentes se, por exemplo, elas são equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cuja taxa e extensão de absorção não mostram uma significante diferença quando administradas na mesma dose molar sob condições experimentais similares, tanto dose simples como dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticas se eles são equivalentes na extensão de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na rotulagem, não são essenciais para a obtenção de efetivas concentrações de droga no corpo em, por exemplo, uso crônico, e são consideradas medicamente insignificantes para o particular produto droga estudado.

[0073] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se não existem diferenças clinicamente significantes em sua segurança, pureza e potência.

[0074] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se um paciente pode ser trocado uma ou mais vezes entre o produto referência e o produto biológico sem um esperado aumento no risco de efeitos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significante em imunogenicidade, ou diminuída eficácia, comparada a terapia continuada sem tal comutação.

[0075] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação de antígeno são bioequivalentes se ambas atuam através de um mecanismo comum ou mecanismos de ação para a condição ou condições de uso, na extensão em que tais mecanismos são conhecidos.

[0076] Bioequivalência pode ser demonstrada através de processos in vivo e in vitro. Medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, onde a concentração do anticorpo ou seus metabólitos é medida em sangue, plasma, soro, ou outro fluido biológico como uma função de tempo; (b) um teste in vitro que foi correlacionado com e é razoavelmente preditivo de dados de biodisponibilidade in vivo; (c) como um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos onde o apropriado efeito farmacológico agudo do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função de tempo; e (d) em um experimento clínico bem controlado que estabelece segurança. Eficácia, ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.

[0077] Variantes bioequivalentes de anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção podem ser construídas através de, por exemplo, modalidade de várias substituições de resíduos ou sequências ou supressão de resíduos ou sequências terminais ou internas não necessárias para atividade biológica. Por exemplo, resíduos cisteína não essencialmente para atividade biológica podem ser suprimidos ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir a formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas com desnaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpos anti-PDGFR-beta compreendendo mudanças de aminoácidos que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.

Seletividade de espécies e reatividade cruzada de espécies

[0078] A presente invenção, de acordo com certas modalidades, provê anticorpos anti-PDGFR-beta que ligam PDGFR-beta humana, mas não PDGF-beta de outras espécies. A presente invenção também inclui anticorpos anti-PDGFR-beta que ligam PDGFR-beta humana e PDGFR-beta de uma ou mais espécies não humanas. Por exemplo, os anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção podem se ligar a PDGFR- beta humana e podem ou não se ligar, como pode ser o caso, a uma ou mais de PDGFR-beta de camundongo, rato, porquinho da Índia, hamster, gerbil, porco, gato, cão, coelho, cabra, ovelha, vaca, cavalo, camelo, cinomolgo, sagui, rhesus ou chimpanzé. De acordo com certas modalidades exemplares da presente invenção, anticorpos anti- PDGFR-beta são providos que se ligam especificamente a PDGFR- beta hu mana (por exemplo, construções de hPDGFR-beta monoméricas e/ou diméricas) e PDGFR-beta de macaco cynomolgus (por exemplo, Macaca fascicularis) (por exemplo, construções de mfPDGFR- beta monomoméricas e/ou diméricas). (Ver, por exemplo, Exemplo 3).

Imunoconjugados

[0079] A invenção abrange anticorpos monoclonais anti-PDGFR- beta conjugados a uma metade terapêutica (“conjugado imuno”), tal como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Agentes citotóxicos incluem qualquer agente que é prejudicial para células. Exemplos de apropriados agentes citotóxicos e agentes quimioterapêuticos para formação de imuno conjugados são conhecidos na técnica, (ver, por exemplo, WO 05/103081).

Anticorpos multiespecíficos

[0080] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipeptídeo-alvo ou podem conter domínios de ligação de antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Ver, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção podem ser ligados ou coexpressos com uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento pode estar funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como um outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos onde um braço de uma imunoglobulina é específico para PDGFR-beta humana ou um seu fragmento, e o outro braço da imunoglobulina é específico para o segundo alvo terapêutico ou está conjugado a uma metade terapêutica.

[0081] Um formato de anticorpo biespecífico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3 de Ig, onde os primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro por pelo menos um aminoácido, e onde pelo menos uma diferença de aminoácido reduz ligação do anticorpo biespecífico a Proteína A como comparado a um anticorpo biespecífico carecendo de diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 Ig liga Proteína A e o segundo domínio CH3 Ig contém uma mutação que reduz ou aboli ligação de Proteína A tal como uma modificação H95R (por numeração de éxon IMGT; H435R por numeração EU). O segundo CH3 ainda pode compreender uma modificação Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Ainda modificações que podem ser encontradas dentro de segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (by IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I by EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU) no caso de anticorpos IgG4. Variações sobre o formato de anticorpo biespecífico descrito acima são contempladas dentro do escopo da presente invenção.

[0082] Outros formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos de diacorpo ou baseados em scFv, fusões de IgG-scFv, domínio variável dual (DVD)-Ig, Quadroma, protuberâncias-em-orifícios, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com protuberâncias-em-orifícios, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)corpo, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, Fab de atuação dual (DAF)-IgG, e formatos biespecíficos Mab2 (ver, por exemplo, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências ali citadas, para uma revisão dos formatos anteriores). Anticorpos biespecíficos também podem ser construídos usando conjugação de peptídeo / ácido nucleico, por exemplo, onde aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar conjugados anticorpo - oligonucleotídeo específicos de sítio que então realizam automontagem em complexos multiméricos com definida composição, valência e geometria. (Ver, por exemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]).

Formulação e administração terapêutica

[0083] A invenção provê composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos anti-PDGFR-beta ou seus fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção. As composições farmacêuticas da invenção são formuladas com apropriados veículos, excipientes, e outros agentes que provêm aperfeiçoada transferência, liberação, tolerância, e semelhantes. Uma variedade de apropriadas formulações pode ser encontrada no formulário conhecido por todos os químicos farmacêuticos: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulações incluem, por exemplo, pulverizados, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (como LIPOFECTIN, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões de óleo-em-água e água-em-óleo, emulsões carbo cera (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos, e misturas semissólidas contendo carbo cera. Ver também, Powell et al. “Compendium of excipientes for parenteral formulations” PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

[0084] A dose de anticorpo administrada a um paciente pode variar dependendo da idade e o tamanho do paciente, doença-alvo, condições, viavia de administração, e semelhantes. A dose preferida é tipicamente calculada de acordo com o peso de corpo ou área de superfície de corpo. Quando um anticorpo da presente invenção é usado para tratamento de uma condição ou doença associada com atividade de PDGFR-beta em um paciente adulto, pode ser vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg de peso de corpo, mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5, ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso de corpo. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustadas. Dosagens e esquemas efetivos para administração de anticorpos anti-PDGFR- beta podem ser empiricamente determinadas; por exemplo, progresso de paciente pode ser monitorado por avaliação periódica, e a dose da mesma maneira ajustada. Além disso, escala de dosagens interespécies pode ser realizada usando processos bem conhecidos na técnica (por exemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351).

[0085] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar um anticorpo ou outra proteína terapêutica da invenção, endocitose mediada por receptor (ver, por exemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Os anticorpos e outros componentes terapeuticamente ativos da presente invenção também podem ser liberados através de técnicas de terapia de gene. Processos de introdução incluem, mas não são limitados a, vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. A composição pode ser administrada através de qualquer via conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção de quantidade relativamente grande, por absorção através de forros epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local.

[0086] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser liberada subcutaneamente ou intravenosamente com uma agulha e seringa padrões. Em adição, com relação à liberação subcutânea, um dispositivo de liberação de caneta facilmente tem aplicações em liberação de uma composição farmacêutica da presente invenção. Um tal dispositivo de caneta de liberação pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de caneta de liberação reutilizável genericamente utiliza um cartucho recarregável que contém uma composição farmacêutica. Uma vez toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tenha sido administrada e o cartucho seja esvaziado, o cartucho esvaziado pode ser facilmente descartado e substituído com um novo cartucho que contem a composição farmacêutica. O dispositivo de caneta de liberação então pode ser reutilizado. Em um dispositivo de caneta de liberação descartável, não há cartucho substituível. Antes, o dispositivo de caneta de liberação descartável vem previamente enchido com a composição farmacêutica retida em um reservatório dentro de dispositivo. Uma vez o reservatório seja esvaziado da composição farmacêutica, o dispositivo inteiro é descartado.

[0087] Numerosos dispositivos de liberação autoinjetores e de caneta reutilizável têm aplicações na liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas não são limitados a AUTOPEN (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC pen (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25 pen, HUMALOG pen, HUMALIN 70/30 pen (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD pen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN, OPTIPEN PRO, OPTIPEN STARLET, e OPTICLIK (Sanofi-Aventis, Frankfurt, Germany), para nomear somente uns poucos. Exemplos de dispositivos de caneta de liberação descartáveis tendo aplicações em liberação subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas não são limitados à caneta SOLOSTAR (Sanofi-aventis), FLEXPEN (Novo Nordisk), e KWIKPEN (Eli Lilly), SURECLICK Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), e HUMIRA Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL), para citar somente alguns.

[0088] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser liberada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados; ver, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. Ainda em uma outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo da composição, assim requerendo somente uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, 1984, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Outros sistemas de liberação controlada são discutidos na revisão por Langer, 1990, Science 249:1527-1533.

[0089] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutânea e intramuscular, infusões de gotejamento, etc. Estas preparações injetáveis podem ser preparadas através de processos conhecidos publicamente. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, através de dissolução, suspensão ou emulsificação de anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso usado convencionalmente para injeções. Como o meio aquoso para injeções, existem, por exemplo, solução salina fisiológica, uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usadas em combinação com um apropriado agente de solubilização tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poli álcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 moles) aduto de óleo de mamona hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc., que podem ser usados em combinação com um agente solubilizante tal como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção assim preparada é preferivelmente enchida em uma apropriada ampola.

[0090] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagens em uma dose unitária apropriada para adaptar uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagens em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo mencionado acima contida é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo mencionado anteriormente esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagens.

Usos terapêuticos dos anticorpos

[0091] Os anticorpos da invenção são úteis, inter alia, para o tratamento, prevenção e/ou melhora de qualquer doença ou distúrbio associado com ou mediado por expressão, sinalização, ou atividade de PDGFR-beta, ou tratável através de bloqueio de interação entre PDGFR-beta e um ligante de PDGFR-beta (por exemplo, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-AB, etc.) ou de outro modo inibindo atividade e/ou sinalização de PDGFR-beta. Por exemplo, a presente invenção provê processos para tratamento de doenças de olhos, doenças fibróticas (fibrose), doenças vasculares e/ou câncer (inibição de crescimento de tumor) através de administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta (ou composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-PDGFR-beta) como aqui descrita a um paciente em necessidade de tal tratamento. No contexto dos processos de tratamento aqui descritos, o anticorpo anti-PDGFR-beta pode ser administrado como uma monoterapia (isto é, como o único agente tterapêutico) ou em combinação com um ou mais adicionais agentes terapêuticos (exemplos dos quais são aqui descritos em outras partes).

[0092] Doenças oculares exemplares que são tratáveis através de administração de anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção incluem degeneração macular relacionada com idade (por exemplo, AMD “úmida”), AMD exsudativa, retinopatia diabética (por exemplo, retinopatia diabética proliferativa), doenças oclusivas venosas retinais como oclusão de veia retinal central (CRVO), neovascularização de íris, glaucoma neovascular, fibrose pós-cirúrgica em glaucoma, vítreo- retinopatia proliferativa (PVR), neovascularização coroidal, neovascularização de disco ótico, neovascularização de córnea, neovascularização de retina, neovascularização vitreal, pannus, pterygium, edema macular, edema macular diabético (DME), retinopatia vascular, degeneração de retina, uveíte, e doenças inflamatórias do olho.

[0093] Doenças fibróticas exemplares que são tratáveis através de administração de anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção incluem fibrose pulmonar (por exemplo, fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por asbestos, e síndrome de bronquiolite obliterans), asma crônica, fibrose associada com dano agudo de pulmão e doença respiratória aguda (por exemplo, fibrose induzida por pneumonia bacteriana, fibrose induzida por trauma, fibrose induzida por pneumonia viral, fibrose induzida por ventilador, fibrose induzida por sepsia não pulmonar, e fibrose induzida por aspiração), silicose, fibrose induzida por radiação, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), fibrose ocular (por exemplo, cicatrização fibrótica ocular), fibrose de pele (por exemplo, escleroderma), fibrose hepática (por exemplo, cirrose, fibrose de fígado induzida por álcool, esteato hepatite não alcoólica (NASH), dano de duto biliar, cirrose biliar primária, fibrose de fígado induzida por infecção ou vírus [por exemplo, infecção de HCV crônica], hepatite autoimune), fibrose de rim (renal), fibrose cardíaca, aterosclerose, restenose de sonda, e mielofibrose.

[0094] Doenças vasculares exemplares que são tratáveis por administração de anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção incluem doenças vasoproliferativas, hipertensão arterial pulmonar, restenose, cicatrização vascular, etc.

[0095] A presente invenção também inclui processos para tratamento de câncer, inibição de crescimento de tumor, promoção de regressão de tumor, inibição de metástase, e/ou inibição de angiogênese patológica (por exemplo, angiogênese relacionada a crescimento de tumor) através de administração de um anticorpo anti- PDGFR-beta como aqui descrito a um paciente em necessidade de tal tratamento. Por exemplo, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da presente invenção podem ser usados para tratar, por exemplo, tumores primários e/ou metastáticos surgindo no cérebro e meninges, orofaringe, pulmão e árvore bronquial, trato gastrointestinal, trato reprodutivo de macho e fêmea, músculo, osso, pele e apêndices, tecido conjuntivo, baço, sistema imune, células de formação de sangue e medula óssea, trato urinário e fígado, e órgãos sensoriais especiais como o olho. Em certas modalidades, os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno da invenção são usados para tratar um ou mais dos seguintes cânceres: carcinoma de célula renal, carcinoma pancreático, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, câncer do cérebro, cavidade oral, orofaringe, nasofaringe, hipofaringe, cavidade nasal, sinos paranasais, laringe, lábios, etc.), câncer de próstata, câncer de bexiga urinária, gliomas malignos, osteosarcoma, osteoblastoma, osteocondroma, câncer colo retal, câncer gástrico (por exemplo, câncer gástrico com amplificação MET), mesotelioma maligno, astrocitoma, glioblastoma, meduloblastoma, retinoblastoma, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, sarcoma sinovial, câncer de tiroide, neoplasmas de tecido conjuntivo, sarcoma de Kaposi, carcinoma de célula basal, carcinoma de célula escamosa, ou melanoma.

Terapias de combinação e formulações

[0096] A presente invenção inclui composições e formulações terapêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti- PDGFR-beta aqui descritos em combinação com um ou mais componentes adicionais terapeuticamente ativos, e processos de tratamento compreendendo administração de tais combinações a indivíduos em sua necessidade.

[0097] Os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção podem ser coformulados com e/ou administrados em combinação com, por exemplo, um antagonista VEGF, por exemplo, uma “armadilha-VEGF” tal como aflibercept ou outra proteína de fusão de inibição de VEGFcomo mostrada na US 7 087 411, e anticorpo anti- VEGF ou seu fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, bevacizumabe, ranibizumabe), um inibidor de cinase de molécula pequena de receptor VEGF (por exemplo, sunitinibe, sorafenibe ou pazopanibe), ou um anticorpo receptor anti-VEGF. O anticorpo anti- PDGFR-beta também pode ser combinado com um antagonista de ligante de PDGF (por exemplo, um anticorpo anti-PDGF-BB, um anticorpo anti-PDGF-DD, um anticorpo anti-PDGF-CC, um anticorpo anti-PDGF-ASB, ou outro antagonista de ligante de PDGF tal como um aptâmero [por exemplo, um aptâmero anti-PDGF-B tal como Fovista, Ophthotech Corp., Princeton, NJ], uma molécula antissenso, uma ribozima, um siRNA, pepticorpo, um nanocorpo ou um fragmento de anticorpo direcionado contra um ligante de PDGF). Em outras modalidades, os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção podem ser co-formulados com e/ou administrados em combinação com um antagonista de EGFR(por exemplo, um anticorpo anti-EGFR [por exemplo, cetuximabe ou panitumumabe] ou inibidor de molécula pequena de EGFR [por exemplo, gefitinibe ou erlotinibe]), um antagonista de um outro membro de família EGFR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 ou ErbB4 (por exemplo, anticorpo anti-ErbB2, anti- ErbB3 ou anti-ErbB4 ou inibidor de molécula pequena de atividade de ErbB2, ErbB3 ou ErbB4), um antagonista específico para EGFRvIII (por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a EGFRvIII), um antagonista de cMET (por exemplo, um anticorpo anti-cMET), um antagonista de IGF1R (por exemplo, um anticorpo anti-IGF1R), ou um inibidor de B-raf (por exemplo, vemurafenibe, sorafenibe, GDC-0879, PLX-4720). Em certos exemplos, os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção são combinados, coformulados e/ou administrados em combinação com um inibidor de PDGFR-alfa (por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR-alfa), um antagonista DLL4 (por exemplo, um anticorpo anti-DLL4 mostrado na US 2009/0142354 tal como REGN421), um antagonista Ang2 (por exemplo, um anticorpo anti- Ang2 mostrado em US 2011/0027286 tal como H1H685P), etc. Outros agentes que podem ser beneficamente administrados em combinação com os anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção incluem inibidores citocina, incluindo inibidores de citocina de molécula pequena e anticorpos que se ligam a citocinas tais como IL-1, IL-2, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18, ou seus respectivos receptores.

[0098] Os anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção também podem ser administrados e/ou coformulados em combinação com antivirais, antibióticos, analgésicos, corticosteroides, esteroides, oxigênio, antioxidantes, quelantes de metais, IFN-gama, e/ou NSAIDs. Os anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção também podem ser administrados como parte de um regime de tratamento que também inclui tratamento com radicação e/ou quimioterapia convencional (por exemplo, no contexto de processos de tratamento de câncer ou inibição de crescimento de tumor).

[0099] Qualquer um dos componentes terapeuticamente ativos adicionais pode ser administrado em combinação com qualquer um dos anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção para o tratamento de qualquer doença ou distúrbio onde administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta seja benéfica, incluindo, por exemplo, qualquer uma das doenças de olhos, doenças fibróticas, doenças vasculares, e/ou cânceres aqui mencionados. Por exemplo, no contexto de tratamento de uma doença de olho (por exemplo, AMD úmida, retinopatia diabética, CRVO, ou qualquer uma das outras doenças de olhos aqui descritas), um anticorpo anti-PDGFR-beta das presente invenção pode ser coformulado com, e/ou administrado em combinação com um antagonista VEGF, por exemplo, uma “armadilha- VEGF” tal como aflibercept ou outra proteína de fusão de inibição de VEGF como mostrada em US 7 087 411, ou um anticorpo anti-VEGF ou seu fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, bevacizumabe, ou ranibizumabe).

[00100] Em modalidades exemplares nas quais um anticorpo anti- PDGFR-beta da invenção é administrado em combinação com um antagonista de VEGF (por exemplo, uma armadilha de VEGF tal como aflibercept), incluindo administração de coformulações compreendendo um anticorpo anti-PDGFR-beta e um antagonista de VEGF, os componentes individuais podem ser administrados a um indivíduo e/ou coformulados usando uma variedade de combinações de dosagens. Por exemplo, o anticorpo anti-PDGFR-beta pode ser administrado a um indivíduo e/ou contido em uma coformulação em uma quantidade selecionada do grupo consistindo em 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.3 mg, 0.4 mg, 0.5 mg, 0.6 mg, 0.7 mg, 0.8 mg, 0.9 mg, 1.0 mg, 1.5 mg, 2.0 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg, 5.0 mg, e 5.5 mg e o antagonista de VEGF (por exemplo, uma armadilha de VEGF tal como aflibercept) pode ser administrado ao indivíduo e/ou contido em uma co-formulação em uma quantidade selecionada do grupo consistindo em 1.0 mg, 1.1 mg, 1.2 mg, 1.3 mg, 1.4 mg, 1.5 mg, 1.6 mg, 1.7 mg, 1.8 mg, 1.9 mg, 2.0 mg, 2.1 mg, 2.2 mg, 2.3 mg, 2.4 mg, 2.5 mg, 2.6 mg, 2.7 mg, 2.8 mg, 2.9 mg e 3.0 mg. Combinações de dosagens exemplares de anticorpo anti-PDGFR-beta / aflibercept da presente invenção incluem, por exemplo: (i) 0,2 mg de anticorpos anti-PDGFR-beta + 2 mg de aflibercept; (ii) 0,5 mg de anticorpos anti- PDGFR-beta + 2 mg de aflibercept; (iii) 1 mg de anticorpo anti- PDGFR-beta + 2 mg de aflibercept; (iv) 3 mg de anticorpo anti- PDGFR-beta + 2 mg de aflibercept; e (v) 4 mg de anticorpo anti- PDGFR-beta + 2 mg de aflibercept. As combinações / co-formulações podem ser administradas a um indivíduo de acordo com qualquer um dos regimes de administração aqui mostrados em outras partes, incluindo, por exemplo, uma vez por semana, uma vez cada 2 semanas, uma vez cada 3 semanas, uma vez por mês, uma vez cada 2 meses, uma vez cada 3 meses, uma vez cada 4 meses, uma vez cada 5 meses, uma vez cada 6 meses, etc.

[00101] O componente(s) terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado a um indivíduo antes de administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta da presente invenção. Por exemplo, um primeiro componente pode ser julgado ser administrado “antes de” um segundo componente se o primeiro componente é administrado 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas antes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes,10 minutos antes, 5 minutos antes, ou menos que 1 minuto antes de administração do segundo componente. Em outras modalidades, o componente(s) terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado a um indivíduo após administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta da presente invenção. Por exemplo, um primeiro componente pode ser julgado ser administrado “após” um segundo componente se o primeiro componente é administrado 1 minuto após, 5 minutos após, 10 minutos após, 15 minutos após, 30 minutos após, 1 hora após, 2 h oras após, 3 horas após, 4 horas após, 5 horas após, 6 horas após, 12 horas após, 24 horas após, 36 horas após, 48 horas após, 60 horas após, 72 horas após administração do segundo componente. Ainda em outras modalidades, o adicional componente(s) terapeuticamente ativo pode ser administrado a um indivíduo simultaneamente com administração de um anticorpo anti-PDGFR- beta da presente invenção. Administração “simultânea”, para propósitos da presente invenção inclui, por exemplo, administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta e um componente adicional terapeuticamente ativo a um indivíduo em uma forma de dosagem simples (por exemplo, coformulada), ou em forma de dosagem separada administrada ao indivíduo dentro de cerca de 30 minutos ou menos um do outro). Se administrada em forma de dosagem separada, cada forma de dosagem pode ser administrada através da mesma via (por exemplo, ambos o anticorpo anti-PDGFR-beta e o adicional componente terapeuticamente ativo podem ser administrados intravitrealmente, subcutaneamente, etc.); alternativamente, cada forma de dosagem pode ser administrada intravitrealmente, e o componente terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado sistemicamente). Em qualquer caso, administração de componentes em uma dose simples a partir de, em formas de dosagem separada através da mesma via, ou em formas de dosagem separada através de diferentes rotas são todas consideradas “administração concorrente”, para propósitos da presente exposição. Para propósitos da presente exposição, administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta “antes de”, “simultaneamente com”, ou “após” (como aqueles termos são aqui definidos acima) administração de um componente adicional terapeuticamente ativo é considerada administração de um anticorpo anti-PDGFR-beta “em combinação com” um componente terapeuticamente ativo adicional.

[00102] A presente invenção inclui composições farmacêuticas nas quais um anticorpo anti-PDGFR-beta da presente invenção é coformulado com um ou mais componentes terapeuticamente ativos adicionais como aqui descrito em outra parte.

[00103] A presente invenção também inclui adicionais composições terapêuticas compreendendo uma combinação de um antagonista de PDGF e um antagonista de VEGF. Antagonistas de PDGF de acordo com este aspecto da invenção incluem antagonistas de receptores de PDGF assim como antagonistas de ligante de PDGF. Da mesma maneira, antagonistas de VEGF de acordo com este aspecto da invenção incluem antagonistas de receptor de VEGF assim como antagonistas de ligante de VEGF.

Regimes de administração

[00104] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de um anticorpo anti-PDGFR-beta (ou uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um anticorpo anti-PDGFR-beta e qualquer um dos agentes terapeuticamente ativos adicionais aqui mencionados) podem ser administradas a um indivíduo sobre um curso definido de tempo. Os processos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administração sequencial a um indivíduo de múltiplas doses de um anticorpo anti-PDGFR-beta da invenção. Como aqui usado, “administração sequencial” significa que cada dose de anticorpo anti- PDGFR-beta é administrada ao indivíduo em um diferente ponto de tempo, por exemplo, em diferentes dias separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui processos que compreendem administração sequencial ao paciente de uma dose inicial simples de um anticorpo anti-PDGFR-beta, seguida por uma ou mais doses secundárias do anticorpo anti-PDGFR-beta, e opcionalmente seguida por uma ou mais doses terciárias do anticorpo anti-PDGFR-beta.

[00105] Os termos “dose inicial”, “dose secundária”, e “doses terciárias”, referem-se à sequência temporal de administração do anticorpo anti-PDGFR-beta da invenção. Assim, a “dose inicial” é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a “dose de linha base”): as “doses secundárias” são as doses que são administradas após a dose inicial; e as “doses terciárias” são as doses que são administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem todas conter a mesma quantidade de anticorpo anti-PDGFR-beta, mas genericamente podem diferir umas das outras em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, entretanto, a quantidade de anticorpo anti-PDGFR-beta contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária varia de uma para outra (por exemplo, ajustadas para cima e para baixo quando apropriado) durante o curso de tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como “doses de carga” seguidas por subsequentes doses que são administradas em uma base menos frequente (por exemplo, “doses de manutenção”).

[00106] Em certas modalidades exemplares da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo 1, 1%, 2, 2%, 3, 3%, 4, 4%, 5, 5%, 6, 6%, 7, 7%, 8, 8%, 9, 9%, 10, 10%, 11, 11%, 12, 12%, 13, 13%, 14, 14%, 15, 15%, 16, 16%, 17, 17%, 18, 18%, 19, 19%, 20, 20%, 21, 21%, 22, 22%, 23, 23%, 24, 24%, 25, 25%, 26, 26% ou mais) semanas após a dose imediatamente precedente. A frase “a dose imediatamente precedente”, como aqui usada, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose de anticorpo anti-PDGFR-beta que é administrada a um paciente antes da administração de toda dose seguinte na sequência sem doses intervenientes.

[00107] Os processos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender administração a um paciente de qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo anti-PDGFR- beta. Por exemplo, em certas modalidades, somente uma dose secundária simples é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses secundárias são administradas ao paciente. Da mesma maneira, em certas modalidades, somente uma dose terciária simples é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mais) doses terciárias são administradas ao paciente.

[00108] Em modalidades envolvendo múltiplas doses secundárias, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência como as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas ou 1 a 2 meses após a dose imediatamente precedente. Similarmente, em modalidades envolvendo múltiplas doses terciárias, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência como as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 12 semanas após a dose imediatamente precedente. Em certas modalidades da invenção, a frequência na qual as doses secundária e/ou terciária são administradas a um paciente pode variar sobre o curso do regime de tratamento. A frequência de administração também pode ser ajustada durante o curso de tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual seguindo exame clínico.

[00109] A presente invenção inclui regimes de administração nos quais 2 a 6 doses de carga são administradas a um paciente em uma primeira frequência (por exemplo, uma vez por semana, uma vez cada duas semanas, uma vez cada três semanas, uma vez por mês, uma vez cada dois meses, etc.), seguido por administração de duas ou mais doses de manutenção para o paciente em uma base menos frequente. Por exemplo, de acordo com este aspecto da invenção, se as doses de carga são administradas em uma frequência de, uma vez por mês (por exemplo, duas, três, quatro, ou mais doses de carga administradas uma vez por mês), então as doses de manutenção podem ser administradas ao paciente uma vez a cada cinco semanas, uma vez em seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez em dez semanas, uma vez a cada doze semanas, etc.).

Usos diagnósticos dos anticorpos

[00110] Os anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção também podem ser usados para detecção e/ou medição PDGFR-beta ou de células expressando PDGFR-beta em uma amostra, por exemplo, para propósitos diagnósticos. Por exemplo, um anticorpo anti-PDGFR-beta, ou seu fragmento, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada por expressão aberrante (por exemplo, superexpressão, subexpressão, falta de expressão, etc.) de PDGFR-beta. Ensaios diagnósticos exemplares para PDGFR-beta podem compreender, por exemplo, contato de uma amostra, obtida de um paciente, com um anticorpo anti-PDGFR-beta da invenção, onde o anticorpo anti-PDGFR-beta é marcado com uma molécula repórter ou marcador detectável. Alternativamente, um anticorpo anti-PDGFR-beta não marcado pode ser usado em aplicações diagnósticas em combinação com um anticorpo secundário que é ele próprio detectavelmente marcado. O marcador detectável ou molécula repórter pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma metade fluorescente ou quimioluminescente tal como isotiocianato de fluoresceína, ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, beta galactosidase, peroxidase de rábano silvestre, ou luciferase. Específicos ensaios exemplares que podem ser usados para detectar ou medir PDGFR-bea em uma amostra incluem imunoensaio sorvente ligado à enzima (ELISA), rádio-imunoensaio (RIA), e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

[00111] Amostras que podem ser usadas nos ensaios diagnósticos de PDGFR-beta de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou fluido obtenível de um paciente que contenha quantidades detectáveis de proteína PDGFR-beta, ou seus fragmentos, sob condições normais ou patológicas. Genericamente, níveis de PDGFR-beta em uma particular amostra obtida de um paciente saudável (por exemplo, um paciente não afligido com uma doença ou condição associada com níveis ou atividade anormal de PDGFR-beta) serão medidos para estabelecer inicialmente um nível de linha base, ou padrão, de PDGFR-beta. Este nível de linha base de PDGFR-beta então pode ser comparado contra os níveis de PDGFR- beta medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de ter uma doença ou condição relacionada a PDGFR-beta.

Exemplos

[00112] Os exemplos que se seguem são mostrados de modo a proverem aqueles versados na técnica com uma completa exposição e descrição de como obter e usar os processos e composições da invenção, e não são pretendidos para limitarem o escopo do que os inventores vêm como sua invenção. Foram feitos esforços para assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que de outro modo indicado, partes são em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura está em graus Celsius, e pressão é, ou próxima de, atmosférica.

Exemplo 1: Geração de anticorpos humanos para PDGFR-beta

[00113] Um imunógeno compreendendo o domínio ecto PDGFR- beta foi diretamente administrado, com um adjuvante para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE compreendendo DNA codificando regiões variáveis de cadeia leve capa e pesada de imunoglobulina humana. A resposta imune de anticorpo foi monitorada através de um ensaio imunoespecífico de PDGFR-beta. Quando uma desejada resposta imune foi obtida esplenócitos foram colhidos e fundidos com células mieloma de camundongo para preservar sua vialibilidade e formar linhas de células hibridomas. As linhas de células hibridomas foram separadas e selecionadas para identificar linhas de células que produzem anticorpos específicos para PDGFR-beta. Usando esta técnica vários anticorpos quiméricos anti-PDGFR-beta (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta maneira foram designados como se segue: H1M3299N, H1M3305N, H1M3310N, H1M3361N, H2M3363N, H2M3365N, H2M3368N, H2M3373N e H2M3374N. Os domínios variáveis humanos dos anticorpos quiméricos foram subsequentemente clonados sobre domínios constantes humanos para obter anticorpos anti-PDGFR-beta inteiramente humanos como aqui descritos.

[00114] Anticorpos anti-PDGFR-beta também foram isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão a células mieloma, como descrito em US 2007/0280945A1. Usando este processo, vários anticorpos anti-PDGFR-beta inteiramente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta maneira foram designados como se segue:

[00115] H4H3394P, H4H3095S, H4H3096S, H4H3097S, H4H3098S, H4H3099S, H4H3102S, H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S.

[00116] Certas propriedades biológicas dos anticorpos anti-PDGFR- beta exemplares gerados de acordo com os processos deste exemplos são descritas em detalhes nos Exemplos mostrados abaixo.

Exemplo 2: Sequências de aminoácidos de região variável de cadeia leve e pesada

[00117] A Tabela 1 mostra os pares de sequências de aminoácidos de região variável de cadeia leve e pesada de anticorpos anti-PDGFR- beta selecionados e seus correspondentes identificadores de anticorpos. Tabela 1

[00118] Anticorpos são tipicamente aqui referidos de acordo com a seguinte nomenclatura: prefixo Fc (por exemplo, “H1M”, “H2M”, “H4M”), seguido por um identificador numérico (por exemplo, “3299”, “3363”, ou “3094” como mostrado na Tabela 1), seguido por um sufixo “P”, “N”, ou “S”. Assim, de acordo com esta nomenclatura, um anticorpo pode ser aqui referido como, por exemplo, “H1M3299N”, “H2M3363N”, “H4H3094”, etc. Os prefixos H1M, H2M e H4H sobre as designações de anticorpo aqui usadas indicam o particular isotipo de região Fc do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo “H1M” tem Fc Igg1 de camundongo, enquanto um anticorpo “H4H” tem Fc IgG4 humana. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, um anticorpo tendo um particular isotipo Fc pode ser convertido a um anticorpo com um diferente isotipo Fc (por exemplo, um anticorpo com Fc IgG1 de camundongo pode ser convertido a um anticorpo com uma IGG4 humana, etc.), mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo as CDRs) - que são indicadas pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1 - permanecerão os mesmos, e as propriedades ligantes são esperadas serem idênticas ou substancialmente similares independente da natureza do domínio Fc. Construção controle

usada nos exemplos que se segue

[00119] Um anticorpo controle anti-PDGFR-beta foi incluído nos exemplos que se seguem para propósitos comparativos. O anticorpo controle é aqui designado como Controle I: um anticorpo anti-PDGFR- beta humana com sequências de domínio variável de cadeia leve e pesada de “2C5” como mostrado em US 7 740 850.

Exemplo 3. Ligação de anticorpo a PDGFR-beta humana como determinada por ressonância plásmon de superfície

[00120] Afinidades de ligação e constantes cinéticas para ligação de antígeno para anticorpos monoclonais PDGFR-beta ati-humanos purificadosforam determinadas usando um ensaio de biossensor de ressonância plásmon de superfície de tempo real (Biacore T100, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) a 25oC e 37°C anticorpos, expressos como Fc camundongo (prefixo H1M; H2M) ou Fc humano (prefixo H4H), foram capturados sobre suas respectivas superfícies sensoras anti-Fc (formato de captura Mab). Diferentes concentrações de construções de PDGFR-beta monoméricas solúveis (hPDGFRb.mmh [SEQ ID NO: 337], PDGFRb.mmh de Macaca fascicularis [SEQ ID NO: 340] ou construções de PDGFR-beta diméricas (PDGFRb.mFc humana [SEQ ID NO: 338] ou PDGFRb.hFc humana [SEQ ID NO: 339]) foram injetadas sobre a superfície capturada de anticorpo monoclonal anti-PDGFR-beta em uma taxa de fluxo de 50 microlitros / minuto. Constantes de taxa de dissociação (Kd) e associação (Ka) foram determinadas através de processamento e adaptação de dados para um modelo de ligação 1:1 usando suporte lógico de adaptação de curva Scrubber 2.0. Constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meias-vidas dissociativas (t1/2) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: KD(M) = kd/ka; e t1/2 (minutos) = (ln2/60*kd). Parâmetros de ligação cinética para diferentes anticorpos monoclonais anti-PDGFR-beta são mostrados em Tabelas 2 a 5. (NB = nenhuma ligação observada sob as condições usadas; NT = não testado).

[00121] Tabela 2: Características de ligação de anticorpos anti- PDGFR-beta (formato Fc camundongo) para construtos de PDGFR- beta monoméricas e diméricas a 25oC

[00122] Tabela 3: Características de ligação de anticorpos anti- PDGFR-beta (formato Fc humano) para construtos de PDGFR-beta monoméricas e diméricas a 25oC

[00123] Tabela 4: Características de ligação de anticorpos anti- PDGFR-beta (formato Fc camundongo) para construtos de PDGFR- beta monoméricas e diméricas a 37oC

[00124] Tabela 5: Características de ligação de anticorpos anti- PDGFR-beta (formato Fc humano) para construtos de PDGFR-beta monoméricas e diméricas a 37oC

[00125] Como mostrado em Tabelas 2-5, vários anticorpos anti- PDGFR-beta da presente invenção mostraram afinidade subnanomolar para os construtos de PDGFR-beta de M. fascicularis e humanas. Em adição, vários clones mostraram ligação mais forte (menor KD) às construções de PDGFR-beta que o anticorpo referência (Controle 1). Exemplo 4. Anticorpos anti-PDGFR-beta bloqueiam ligação de ligantes de PDGF a PDGFR-beta A. Bloqueio de receptor / ligante avaliado usando um imunoensaio baseado em ELISA

[00126] A habilidade de certos anticorpos PDGFR-beta anti- humanos da invenção para bloquear ligação de receptor a seu ligante PDGF-BB foi primeiro avaliada com um ensaio i mune baseado em ELISA. Em resumo, placas foram revestidas com PDGF-BB humana (2 microgramas / mL). Separadamente, 250 pM de hPDGFR-beta.mmh solúvel biotinilada (“biot-hPDGFR-beta-mmh”, SEQ ID NO 337) foram pré-misturados com anticorpos anti-PDGFR-beta diluídos serialmente (0-100 nM) por 1 hora em temperatura ambiente (25oC). As soluções de anticorpo / PDGFR-beta equilibradas foram adicionadas a placas revestidas com ligante, deixadas incubar por 1 hora, e lavadas. Níveis de biot-hPDGFR-beta.mmh ligada foram detectados usando streptavidina conjugada com HRP. Dados foram analisados usando suporte lógico Prism e valores de IC50 foram calculados como a quantidade de anticorpo requerida para obter 50% de redução de hPDGFR-beta-mmh ligada a ligante. Valores de bloqueio máximos também foram calculados e refletem a habilidade ao anticorpo bloquear em relação à linha base. A absorbância medida na quantidade constante de 250 pM de biot-hPDGFR-beta-mmh sobre a curva de dose é definida como 0% de bloqueio e a absorbância sem nenhuma PDGFR-beta adicionada é definida como 100%. A absorbância das cavidades contendo a concentração mais alta de anticorpo determinou a porcentagem máxima de bloqueio. Resultados são mostrados na Tabela 6. (“E” indica que o anticorpo é um aperfeiçoador, isto é, sinal foi maior na presença de algumas concentrações do anticorpo do que na ausência do anticorpo).

[00127] Tabela 6: Bloqueio de anticorpo anti-PDGFR-beta de ligação de PDGF-BB a PDGFR-beta

*Representa a IC50 média de três experimentos separados.

[00128] Como mostrado na Tabela 6, vários anticorpos da invenção bloqueiam potencialmente a interação de PDGFR-beta com seu ligante natural PDGF-BB, com valores IC50 variando de cerca de 7,6 nM (H1M3299N) a cerca de 66 pM (H4H3107S), e certas interações de ligante – receptor aperfeiçoadas de anticorpos (por exemplo, H4H3097S, H4H3098S e H4H3102S). B. Bloqueio de receptor / ligante avaliado usando um ensaio de bios-sensor de tempo real

[00129] A habilidade de selecionar anticorpos PDGFR-beta anti humanos para bloquear ligação de ligante (PDGF-BB, PDGF-DD e PDGF-AB) a PDGFR-beta humana também foi avaliada usando um ensaio de biossensor SPR de tempo real (Biacore 3000).

[00130] Em resumo, 400 Rus de PDGFR-beta.mFC humana solúvel (SEQ ID NO: 338) foi capturadas sobre uma superfície sensora Biacore derivada (acoplada covalentemente) com anticorpo Fc anti camundongo coelho policlonal (GE Healthcare Life sciences, Piscataway, NJ). A superfície capturada foi saturada com 300 nM de anticorpos anti-PDGFR-beta selecionados por 4 minutos seguido por uma injeção 30 nM de ligante (PDGF-BB, PDGF-DD ou PDGF-AB) por 4 minutos adicionais a 25oC. Resposta de ligação de tempo real foi monitorada por todo o curso do ensaio e foi comparada à resposta de ligação medida quando ligante PDGF foi aplicado sobre a superfície controle capturada derivada na ausência de anticorpo capturado. Resultados são ilustrados na Figura 1.

[00131] Como visto na Figura 1, todos os anticorpos mostraram a habilidade para bloquear ligantes PDGF-BB e PDGF-AB com menos anticorpos permitindo eficiente bloqueio de PDGF-DD quando comparados ao controle sem anticorpo. De nota foram anticorpos H4H3094P, H4H3374N, e Controle I, que mostraram a menor quantidade de resposta RU quando ligante foi aplicado sobre a superfície sensora Biacore. Exemplo 5. Análise de competição cruzada de anticorpos anti-PDGFR- beta

[00132] Um ensaio de competição cruzada foi conduzido para avaliar a habilidade de selecionar anticorpos para competir uns com os outros para ligação a PDGFR-beta humana. Em resumo, PDGFR- beta.mmh humana solúvel (SEQ ID NO: 337), foi capturada sobre pontas sensoras anti-Penta-his Octet (ForteBio Corp., Menlo Park, CA). Cada ponta sensora revestida com PDGFR-beta.mmh foi saturada por 5 minutos com um primeiro anticorpo anti-PDGFR-beta (Mab#1; 50 ug/mL). A seguir, cada ponta sensora foi saturada com uma solução de um segundo anticorpo anti-PDGFR-beta (Mab#2). A resposta em tempo real de ligação de Mab#2 a PDGFR-beta.mmh pré- complexado com Mab#1 foi então monitorado. Todos os ensaios foram realizados a 25oC com uma taxa de fluxo de 1000 rpm (??) sobre um biossensor Octet RED384 em tampão Octet HBST de acordo com instruções de fabricante (ForteBio Corp., Menlo Park, CA). Os resultados são ilustrados na Figura 2.

[00133] Respostas de ligação de menos que 0,1 nM são mostradas na Figura 2 em sombreado negro ou cinza e indicam que os correspondentes pares de anticorpos competem uns com os outros por ligação a PDGFR-beta. Respostas de ligação maiores que 0,2 nM (mostradas em caixas brancas na Figura 2) representam pares de anticorpos eu não competem uns com os outros por ligação a PDGFR- beta.

[00134] Os resultados deste exemplo indicam que os anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção podem ser agrupados em dois “bins” distintos sobre características de ligação de epítopo: Bin 1 inclui Controle I, H4H3365N, H4H3374N, H4H3103S, e H4H3094P. Bin 2 inclui H4H3099S, H4H3107S, H4H3305N e H4H3310N. Os resultados deste exemplo sugerem que os anticorpos de Bin 1 ligam distintas regiões sobre PDGFR-beta que os anticorpos de Bin 2. Exemplo 6. Inibição de ativação de receptor mediada por ligante e sinalização MAPK com anticorpos anti-PDGFR-beta

[00135] Para ainda caracterizar anticorpos anti-PDGFR-beta da presente invenção, foi desenvolvido um bioensaio para detectar a ativação de PDGFR-beta através de seus ligantes de ligação conhecidos, PDGF BB e DD. A interação entre receptores de PDGFR- beta e seus ligantes é necessária para a indução de diversos processos celulares incluindo proliferação, sobrevivência, migração e morfogênese (Hoch and Soriano, 2003, Development 130:5769-4784). Receptores de PDGF são receptores tirosina cinase e são formados por homo- ou heterodimerização de receptores alfa e beta com ativação por PDGF BB e DD. Com ativação, autofosforilação é induzida e várias cascatas de caminhos de transdução de sinal são disparadas, incluindo o caminho Ras-MAPK (proteína cinase ativado com mitógeno).

[00136] Para detectar a ativação do caminho de transdução de sinla MAPK via ligação de ligante a PDGFR beta, uma linha de células HEK293 estável foi gerada para expressar PDGFR-beta humana de inteiro comprimento junto com um repórter luciferase (Elemento Responsivo - Soro [SER-luciferase]). Células HEK293/hPDGFR-beta foram semeadas em uma placa de 96 cavidades e mantidas em meios de baixo soro contendo FBS 0,1 % por toda noite. Seguindo incubação, PDGF BB ou DD, diluída serialmente 1:3, foi adicionada a células em concentrações variando de 100 nM a 0,002 nM, para determinar resposta de dose. Para examinar a inibição de cascata de sinalização MAPK ativada por ligante, anticorpos foram diluídos serialmente em 1:3 e adicionados a células em uma concentração variando de 100 nM a 0,002 nM. Concentrações de PDGF BB e DD permaneceram constantes em 250 pM e 400 pM respectivamente e atividade de luciferase foi detectada após 5,5 horas. PDGF BBe DD ativaram PDGFRb humana com ECs50 de 0,04-1,11 nM e 0,34-1,82 nM respectivamente. A concentração de anticorpo requerida para inibir 50% de sinalização mediada por PDGFR-beta (IC50) foi determinada para cada anticorpo. Os resultados são resumidos na Tabela 7. (NB = nenhum bloqueio; isotipo 1 = anticorpo irrelevante controle negativo IgG de camundongo; isotipo 2 = anticorpo irrelevante controle negativo IgG humana).

[00137] Tabela 7: Valores de IC50 para anticorpos anti-PDGFR-beta bloqueando ativação de ligante PDGF-BB e PDGF-DD

[00138] Como mostrado na Tabela 7, vários dos anticorpos anti- PDGFR-beta da presente invenção bloqueiam potencialmente ativação de PDGFR-beta dependente de ligante, com ICs50 na faixa subnanomolar. Adicionalmente, ambos controles negativos IgG de camundongo (Isotipo 1) e IgG humana (isotipo 2) não bloqueiam ativação de ligante do receptor. Exemplo 7. Internalização de anticorpos anti-PDGFR-beta sobre células expressando PGDFR-beta

[00139] Para estudar internalização de receptor mediada por anticorpo, foram realizados experimentos usando células engenheiras para expressão de PDGFR-beta humana (células HEK293/SER- luc/PDGFRb). Em resumo, 20 000 células HEK293/SRE Luc/PDGFRb / cavidade foram revestidas por toda noite em meios inteiros (FBS 10%, Pen/Strep/Glut, NEAA, e G418 em DMEM) e manchadas com anticorpos anti-PDGFR-beta em 10 ug/mL por 30 minutos a 4oC. Células foram lavadas duas vezes e manchadas com Dylight 488 conjugado Fab anticorpo secundário IgG anti-humano cabra (10 ug/mL; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) por 30 minutos a 4oC. A seguir, células foram incvubadas a 37oC por 2 horas para permitir internalização de receptor. Fluorescência Alexa-488 foi rapidamente resfriada através de incubação de células lavadas com anti-Alexa flúor 488 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) por 45 minutos a 4oC para diferenciar anticorpos ligados a superfície dos anticorpos internalizados. Imagens foram tomadas com ImageXpress Micro XL (Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA) e análise de ponto foi realizada usando suporte lógico Columbus (Perkin Elmer, Waltham, MA). Internalização relativa foi calculada através de comparação de manchamento de rápido resfriamento (isto é, anticorpo internalizado) de cada anticorpo àquele do anticorpo Controle 1. Resultados são resumidos na Tabela 8.

[00140] Tabela 8: Internalização de anticorpos anti-PDGFR-beta selecionados

[00141] Como mostrado na Tabela 8, todos os anticorpos anti- PDGFR-beta estudados mostraram robusta internalização neste formato de ensaio, refletindo a potencial habilidade dos anticorpos para alvejar efetivamente células expressando PDGFR-beta em vários contextos terapêuticos. Exemplo 8. Anticorpos anti-PDGFR-beta se ligam com distintos domínios sobre PDGFR-beta

[00142] A porção extracelular de PDGFR-beta consiste em 5 domínios tipo-C2 semelhantes a Ig, referidos como D1-D5. D1 até D3 são requeridos para alta afinidade de ligação de ligante. Neste exemplo, foram conduzidos experimentos para determinar que domínio(s) extracelular(es) de certos anticorpos anti-PDGFR-beta da invenção interagem.

[00143] Para este experimento, quatro diferentes construtos de domínio extracelular de PDGFR-beta foram usadas: D1 (SEQ ID NO:342), D1-D2 (SEQ ID NO:343), D1-D3 (SEQ ID NO:344), e D1-D4 (SEQ ID NO:345), assim como PDGFR-beta de inteiro comprimento. Quatro diferentes anticorpos anti-PDGFR-beta foram testados para ligação às várias construções através de ressonância plásmon de superfície (Biacore). Em resumo, 150-200 Rus de anticorpo anti- PDGFR-beta foram capturadas via um chip Fc CM5 anti-humano. A seguir, os construtos de domínio individuais, ou PDGFR beta de inteiro comprimento, foram aplicadas sobre a superfície ligada a anticorpo em uma concentração de 50 nM. A habilidade dos vários anticorpos para ligar aos vários construtos de domínios foi medida. Os resultados são mostrados na Tabela 9. (-) = nenhuma ligação observada; (+) = ligação observada; ND = não determinado.

[00144] Tabela 9. Ligação observada de selecionados anticorpos anti-PDGFR-beta para domínios PDGFR-beta e proteína PDGFR-beta de inteiro comprimento

[00145] Como resumido na Tabela 9, todos os anticorpos ligaram a PDGFR-beta de inteiro comprimento. Dois anticorpos, H4H3094P e H4H3374N, foram determinados por ligarem a domínio 2. Interessantemente, estes dois anticorpos também são bloqueadores de ligante baseado no imunoensaio ELISA, confirmando que domínio 2 é importante para ligação de ligante (PDGF-BB). Os dois outros anticorpos exemplares testados, H4H3099S e H4H3305N, não se ligam a qualquer das construções de domínio, sugerindo que estes anticorpos podem necessitar os aminoácidos entre domínios 4 e 5 e/ou o próprio domínio 5 para alta afinidade de ligação. Exemplo 9. Anticorpos anti-PDGFR-beta esgotam pericitos em um modelo de retina in vivo

[00146] Dois anticorpos anti-PDGFR exemplares, H4H3374N e H4H3094P, foram testados em u m modelo de esgotamento de pericito de retina in vivo. Pericitos são células semelhantes a músculo liso que expressam PDGFR-beta. PDGFR-B, expressa sobre células endoteliais, desempenha um papel no recrutamento de periquitos para vasos se formando recentemente, assim promovendo angiogênese e o estabelecimento de arquitetura vascular. Entretanto, a interação entre pericitos e o endotélio, e sinalização PDGF-B/PDGFR-beta, é interrompida durante angiogênese patogênica, contribuindo para descontrolada formação de vaso. Em doenças no olho, esta neovascularização pode conduzir a morbidez visual e cegueira.

[00147] Em um primeiro experimento, pupas de camundongos PDGFR-beta humanizada foram injetadas subcutaneamente (s.c.) com 3 mg/kg de H4H3374N, H4h3094P, controle I (2C5) ou Fc(hFc) humano para ver o efeito de bloqueio de sinalização PDGF-B/PDGFR- beta em vasculatura sendo recentemente formada. Em resumo, pupas PDGFR-beta humanizadas (P2) dia 2 pós-natal foram injetadas subcutaneamente com 3 mg/kg de controle hFc ou anticorpo PDGFR- beta. No dia 5 pós-natal, pupas foram sacrificadas. Ambos os olhos foram coletados e fixados em P.F.A. 4% por 1 h ora. Olhos foram lavados 3x com PBS e retinas foram dissecadas removendo vasos hialoides. Retinas foram manchadas O/N em temperatura ambiente com um anticorpo primário de sulfato de condroitina anti-NG2 coelho preparado em soro de diluição de anticorpo (ADS; BSA 1% em Triton- X-100 0,05% em PBS). Após incubação, todas as retinas foram lavadas 3x por 15 minutos em PBS e então manchadas O/N a 4oC com lectina de Griffonia Simplicifolia marcada com fluoresceína e um secundário marcado com alexa 594 anticoelho cabra preparado em ADS. Após incubação, todas as retinas foram novamente lavadas 3x por 15 minutos em PBS. Retinas foram montadas - planas sobre lâminas e cobertas - deslizantes usando Fluoromount-G sem DAPI.

[00148] Retinas foram feitas imagens usando um microscópio fluorescente Nikon 80i. Imagens foram analisadas usando Adobe Photoshop e Fovea. A área positiva NG2 média, normalizada para o hFc, foi medida para cada grupo de tratamento. Ambas, formação de imagem e análises foram realizadas em uma maneira cega. Análises estatísticas foram feitas usando ANOVA uma-via em suporte lógico prism. Os resultados são resumidos em Tabelas 10-11.

[00149] Tabela 10: Redução em área de retina positiva NG2 após tratamento com 3 mg/kg de H4H3374N, Controle I ou hFc

[00150] Tabela 11: Redução em área de retina positiva NG2 após tratamento com 3 mg/kg de H4H3094P, Controle I ou hFc

[00151] Como mostrado em Tabelas 10-11, a área positiva NG2 de retina média foi diminuída em camundongos tratados com os anticorpos anti-PDGFR-beta comparados a hFc. A área positiva NG2 foi significantemente diminuída (p<0,001) para anticorpos H4H3374N e H4H3094P em relação a hFc. Além disso, H4H3374N mostrou a mais alta redução em área positiva NG2 quando comparado a ambos H4H3094P e o anticorpo Controle I.

[00152] Em um conjunto de experimentos separado, pupas de camundongos C57BI/6 foram injetadas subcutaneamente (SC) em P2 com anticorpo PDGFR-beta anticamundongo “mAb39” (tendo as regiões variáveis do anticorpo referido como APB5, ver Uemura et al., J, Clin. Invest. 2002; 110(11):1619-1628) em doses de 50 mg/kg, 25 mg/kg, 12,5 mg/kg, ou 6,25 mg/kg, ou com Fc em 50 mg/kg como um controle (Estudo 1). O efeito sobre cobertura de periscito foi avaliado em P5 usando um anticorpo primário 4 proteoglicano sulfato de condroitina anti-NG2 coelho. No desenvolvimento de vasos de retina, todas as doses de mAb39 > 12,5 mg/kg inibiram cobertura de periscito de vaso de sangue.

[00153] Em um outro estudo (Estudo 2), pupas P2 foram injetadas SC com 25 mg/kg de mAb39 ou controle. Retinas foram coletadas em P5 e manchadas com lectinas Griffonia simplicifolia (“GS Lectin I”, Vector Labs). Em uma dose de 25 mg/kg, mAb39 diminuiu moderadamente áreas de retina vascularizadas e densidade de vasos comparado a controles.

[00154] Em um conjunto de experimentos separados (Estudo 3), olhos deixados de pupas foram injetados intravitrealmente (IVT) com 5 microgramas (0,5 uL) de mAb39 ou controle em P4 e coletados em P6. Uma única administração de anticorpo anti-PDGFR-beta intravitreal esgotou quase completamente células murais e produziu efeitos marcados sobre diferenciação e morfologia vascular de retina, por exemplo, irregular calibre de vaso sanguíneo. Experimentos adicionais foram conduzidos para investigar o efeito de neutralização de PDGFR- beta nos olhos e camundongos adultos. Em particular, olhos esquerdos de camundongos adultos foram injetados IVT com mAb39 (5 microgramas ou 10 microgramas) ou controle (5 microgramas ou 10 microgramas). Olhos foram coletados 48 horas depois e manchados com anti-NG2 e GS Lectina I. Em camundongos adultos, mAb39 não produziu evidência de qualquer perda de pericito ou quaisquer mudanças morfológicas vascular.

[00155] Estes estudos demonstram coletivamente que seletiva neutralização farmacológica de PDGFR-beta é eficaz em promover esgotamento de pericito e contribui para mudanças em morfologia e crescimento vascular no desenvolvimento de neovasos de retina. Em contraste, esta mesma inibição não parece ter qualquer efeito sobre periscitos e vasos maduros na vasculatura estabelecida na retina de camundongo adulto. Exemplo 10. Um experimento clínico de Fase 1 de uma formulação de combinação compreendendo um anticorpo anti-PDGFR-beta e um antagonista de VEGF em pacientes com degeneração macular relacionada a idade

Visão geral de Estudo

[00156] Um experimento clínico de fase 1 é conduzido para testar a segurança de um anticorpo anti-PDGFR-beta da invenção liberado através de injeção intravitreal em pacientes com degeneração macular relacionada a idade neovascular (AMD) em conjunção com aflibercept intravitreal (IVT). A sequência de aminoácidos de aflibercept (também conhecido como VEGFR1R2-FcΔC1(a)), assim como a sequência de ácidos nucleicos codificando o mesmo, são mostradas, por exemplo, no WO2012/097019.

[00157] O objetivo primário deste estudo é investigar a segurança de anticorpo anti-PDGFR-beta intravitreal (IVT) em pacientes com AMD neovascular. Os objetivos secundários são explorar os efeitos anatômicos de anti-PDGFR-beta IVT sobre neovascularização de córnea (CNV) em pacientes com AMD neovascular, e determinar as farmaco cinéticas de anti-PDGFR-beta e aflibercept em seres humanos. Um outro objetivo deste estudo é determinar a presença de anticorpos contra o anticorpo anti-PDGFR-beta e/ou aflibercept em indivíduos tratados com estes agentes.

População Alvo

[00158] A população-alvo para este estudo é de homens e mulheres de 50 anos e mais velhos com AMD neovascular. Aproximadamente 3-6 pacientes serão arrolados em quatro coortes planejadas. Um total de 15-24 pacientes é planejado. Seis pacientes serão arrolados na dose máxima tolerada (MTD), se identificada, ou o nível mais alto de dose.

Inclusão Chave / Critérios de Exclusão

[00159] Os critérios de inclusão chaves para este estudo são como se seguem: (1) homens ou mulheres de 50 anos de idade ou mais velhos; e (2) CNV subfoveal ativa secundária para AMD, incluindo lesões justafoveais que afetam a fóvea como evidenciado por FA no olho de estudo.

[00160] Os critérios de exclusão chaves são como se seguem: (1) terapia anti-VEGF IVT no olho de estudo dentro de 8 semanas do início do estudo (Dia 1); (2) qualquer tratamento anterior com inibidores de PDGF ou PDGFR; (3) pressão intraocular maior que ou igual a 25 mmHg no olho de estudo; (4) evidência de blefarite infecciosa, ceratite, esclerite, ou conjuntivite em qualquer olho; (5) qualquer inflamação / infecção intraocular em qualquer olho dentro de 3 meses da visita de seleção; (6) corrente neovascularização de íris, hemorragia de vítreo, ou descolamento de retina de tração visível nas avaliações de seleção no olho de estudo; (7) evidência de CNV devido a qualquer outra causa que não AMD em qualquer olho; (8) evidência de retinopatia diabética ou edema macular diabético em qualquer olho; (9) inabilidade para obter fotografias, FA ou OCT para documentar CNV, por exemplo, devido a opacidade de meios, alergia a corante fluoresceína ou falta de acesso venoso; e (10) administração anti- VEGF sistêmica (IV) dentro de 6 semanas de Dia 1.

Desenho de Estudo

[00161] Pacientes serão avaliados para escolha de estudo na visita de seleção, até 2 semanas antes de Dia 1 / linha base (Visita 2). No Dia 1 / linha base (Visita 2), pacientes sofrerão avaliações de segurança antes de receberem a primeira dose de droga estudo.

[00162] Pacientes elegíveis serão arrolados na atual coorte que está aberta para arrolamento. A coorte inicial receberá anti-PDGFR- beta / aflibercept (coformulados em 0,2 mg : 2 mg). No Dia 1 e Dia 29 (+/- 3 dias), pacientes receberão uma injeção de anti-PDGFR-beta / aflibercept.

[00163] A dose de anti-PDGFR-beta / aflibercept será escalada baseado em segurança e tolerabilidade avaliada durante a coorte anterior (partindo do primeiro paciente, primeira dose 2 semanas seguindo a segunda dose de último paciente naquela coorte, ou aproximadamente Semana 6). Também, o primeiro paciente arrolado em cada coorte será observado por pelo menos 1 semana após a primeira dose antes de adicionais pacientes serem dosados. Escalada a coorte de dose seguinte ocorrerá uma vez os dados tenham sido revistos. Escada de dose intrapaciente não será permitida.

[00164] Pacientes serão avaliados em visitas de estudo para segurança ocular e sistêmica (incluindo exame oftálmico, avaliações de laboratório, etc.) e eficácia (OCT, FA/FP, área CNV , tamanho CNV clássico, tamanho total de lesão, volume macular, formação de imagem, e BCVA usando protocolo ETDRS de 4 metros0 e serão acompanhados para Semana 24.

Estudo de Tratamentos com Fármacos

[00165] Quatro diferentes coformulações de anti-PDGFR-beta / aflibercept serão administradas a pacientes. As coformulações são resumidas na Tabela 12.

[00166] Tabela 12

[00167] Cada formulação consistirá em fosfato de sódio 10 mM, pH 6,2, 0,03% (peso / volume) polisorbato 20, sucrose 5% (peso / volume), e cloreto de sódio 40 mM.

[00168] As várias coformulações de anti-PDGFR-beta / aflibercept serão liberadas via injeção IVT e o volume de injeção será de 50 microlitros. Como notado acima, pacientes receberão duas administrações separadas da coformulação. A primeira administração será no Dia 1, e a segunda administração será no Dia 29.

Pontos finais primário e secundário

[00169] O ponto final primário do estudo é segurança de droga de estudo. Pontos finais secundários são: (1) mudança em espessura retinal central a partir de linha base (medida por OCT) em Semana 8 e Semana 12; (2) proporção de pacientes com resolução completa de fluido retinal (medida por OCT) em Semana 8 e Semana 12; (3) mudança em área de CNV a partir de linha base (medida por OCT) em Semana 8 e Semana 12; (4) mudança em tamanho de CNV a partir de linha base (medida por FA) em Semana 8 e Semana 12; (5) mudança em área de vazamento a partir de linha base (medida por FA) em Semana 8 e semana 12; (6) mudança em BCVA a partir de linha base; e (7) fármaco cinéticas e desenvolvimento de anticorpos antifármaco.

[00170] A presente invenção não é limitada em escopo pelas específicas modalidades aqui descritas. Realmente, várias modificações da invenção em adição àquelas aqui descritas tornar-se- ão visíveis para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e as figuras acompanhantes. Tais modificações são pretendidas caírem dentro do escopo das reivindicações apostas.

Claims

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de ligar-se especificamente ao receptor beta de fator de crescimento derivado de plaqueta humano dimérico (PDGFR-beta) com uma constante de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) de menos que 200 pM medida em um ensaio de ressonância plásmon de superfície a 37°C, em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo bloqueia a ligação de pelo menos um ligante PDGF ao PDGFR-beta; o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo bloqueia a ligação de ligante PDGF-BB ao PDGFR-beta monomérica solúvel com um valor IC50 de menos que 150 pM medido em um ensaio de ligação de receptor / ligante in vitro a 25oC; e o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo inibe a ativação mediada por ligante PDGF de sinalização PDGFR- beta em células que expressam PDGFR-beta; em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende: três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) compreendendo SEQ ID NOs: 132, 134 e 136, respectivamente; e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) compreendendo SEQ ID NOs: 140, 142 e 144, respectivamente.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo uma SEQ ID NO: 130, e uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo uma SEQ ID NO: 138.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo IgG1 ou IgG4.

4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou um fragmento de ligação de antígeno, como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um antagonista de VEGF selecionado do grupo consistindo em aflibercept, bevacizumabe, ou ranibizumabe.

6. Uso de uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 4, caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratamento de uma doença ocular selecionada do grupo consistindo em degeneração macular relacionada com idade (AMD), AMD exsudativa, retinopatia diabética, oclusão de veia central de retina (CRVO), neovascularização de íris, glaucoma neovascular, fibrose pós-cirúrgica em glaucoma, vítreo-retinopatia proliferativa (PVR), neovascularização coroidal, neovascularização de disco ótico, neovascularização de córnea, neovascularização de retina, neovascularização de vítreo, pannus, pterygium, edema macular, edema macular diabético (DME), retinopatia vascular, degeneração de retina, uveíte, e doenças inflamatórias dos olhos.