KR20230058094A - 세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 공급 전략 - Google Patents

세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 공급 전략 Download PDF

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세라노 샌드라 베넌
숀 엠. 로렌스
에이미 에스. 존슨
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

개선된 세포 배양 성능을 위한 진핵 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서; 여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충 세포 배양 배지에서 상기 세포를 유지하는 단계를 포함하며; 여기서 세포 배양의 성능은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 아스파라긴 영양보충에 의해 개선된다.

Description

세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 공급 전략
관련된 출원에 대한 교차-참조
이 출원은 2020년 8월 31일 출원된 미국 가출원 번호 63/072,740 및 2020년 8월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 63/072,745의 출원일의 이익을 주장하며, 그의 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
발명은 세포 배양 성능을 개선하는 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 발명은 구체적으로, 아스파라긴 영양보충을 사용하여 세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위해 세포를 배양하는 방법 및 단백질 바이오약품을 생산하는 방법에 관한 것이다.
생물학적 작용제, 특히 단백질 및 폴리펩티드는 종종 새로운 바이오약품 생성물로 개발된다. 높은 수준의 특정 관심있는 단백질을 생산하는 조작된 세포는 이들 바이오약품 생성물의 성공적인 상업적 생산에 극히 중요해졌다. 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 다양하고 세포 배양에서 생성된 치료 단백질의 수준과 품질에 큰 영향을 미친다.
배치 또는 유가식 공정에서 세포 배양을 통해 단백질을 제조하는 것이 관례적이다. 바이알 해동 후 접종 성장의 초기 단계는 종자 배양에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 전형적으로, 세포는 세포 모집단의 크기 및/또는 부피를 점차적으로 증가시키기 위해, 예컨대 종자 트레인 생물반응기에서, 지수 성장 속도로 성장한다. 세포 질량이 여러 생물반응기 단계를 통해 스케일업된 후, 세포는 그 다음 세포가 여전히 지수 성장(대수기)에 있는 동안 생산 생물반응기인, 유가식으로 이전된다(Gambhir, A. 등, 2003, J Bioscience Bioeng 95(4):317-327).
유가식 배양으로의 이전 후, 세포는 일정 기간 동안 배양되는 반면 배지의 조성물은 관심있는 단백질 또는 폴리펩티드의 생성을 허용하도록 모니터링되고 제어된다. 특정 수율에 도달하거나 세포 생존력, 폐기물 축적 또는 영양소 고갈이 배양이 종료되어야한다는 것을 결정한 후, 생성된 단백질 또는 폴리펩티드가 단리된다. 현재 리터당 다중 그램의 역가에 도달하는 유의한 진보가 지난 10년에 걸쳐 재조합 단백질 수율을 개선하기 위한 의도로 이루어졌다. 단백질 제조 공정에서 뿐만 아니라 세포주 공학 및 세포 배양 배지 및 공급 발달에서의 진보는 단백질 수율에서의 이득에 기여했다. 예를 들어, 세포 배양 배지 및 공급을 최적화하는 계획은 연속적인 세포 성장 및 최적의 생성물 분비를 지원하는 영양분 영양보충 및 화학적으로 정의된 무-혈청 배지의 설계를 포함한다.
그러나, 세포를 배양하기 위한 배지 및 방법에 대한 당업계에서의 요구가 여전히 있으며, 여기서 배지는 건강하고 강력한 세포 성장과 유지, 및 재조합 단백질의 높은-역가 생산을 허용한다.
일 양태에서, 개선된 세포 배양 성능을 위한 진핵 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서; 여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충 세포 배양 배지에서 상기 세포를 유지하는 단계로서; 여기서 적어도 하나의 세포 배양 성능 매개변수는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 적은 양의 아스파라긴 영양보충 또는 무 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 아스파라긴 영양보충에 의해 개선되는, 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 볼루스 공급 보충(예를 들어, 초기 단계 동안 하나의 볼루스 공급 보충 및 후기 단계 동안 하나의 볼루스 공급 보충), 세포 배양의 적어도 일부의 과정에 걸쳐 다중 볼루스 공급 보충(예를 들어, 초기 단계 동안 2, 3, 4 또는 5회의 볼루스 공급 보충 및 후기 단계 동안 2, 3, 4 또는 5회의 볼루스 공급 보충), 또는 세포 배양의 적어도 일부의 과정에 걸쳐 연속적으로 세포 배양(초기 단계 및 후기 단계 둘 모두)에 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 배양 성능 매개변수는 증가된 세포 생존율, 증가된 세포 성장 속도, 증가된 세포 밀도, 관심있는 재조합 단백질의 증가된 역가, 관심있는 재조합 단백질의 증가된 수율, 세포 배양의 적어도 일부에서 필수 아미노산의 고갈에서 감소, 세포 배양의 적어도 일부에서 적어도 하나의 세포 배양 부산물 형성의 감소, 및 단백질 품질의 적어도 하나의 지표의 개선으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 세포 배양 부산물은 암모늄 이온 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 단백질 품질의 적어도 하나의 지표는 단백질 서열 변이체의 감소이다.
특정 실시형태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 진핵 세포는 CHO 세포일 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 항체, 항체 단편, 또는 ScFv-Fc 융합 단백질에서 선택될 수 있다.
다른 양태에서, 세포 배양에서 포유동물 세포로부터 발현되는 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체를 방지하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은 정의된 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서; 여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및 관심있는 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 초기 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충 세포 배양 배지에 상기 세포를 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포외 아스파라긴 수준은 포유동물 세포에 의해 발현되는 관심있는 폴리펩티드가 모든 개별 서열 변이체 유전자좌에서 0.30% 미만의 아스파라긴 서열 변이체를 포함하도록 약 0.1mM의 고갈 한계 초과의 적어도 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 세포 배양 배지에서 유지된다.
다른 양태에서, 세포 배양물에서 진핵 세포로부터 발현된 관심있는 재조합 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은, 정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계; 진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 정의된 세포 배양 배지에서 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 및/또는 세포외 농도를 측정하는 단계; 및 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도를 발현된 관심있는 재조합 단백질에 존재하는 아스파라긴 서열 변이체의 양과 상호관련시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도는 아스파라긴 서열 변이체의 양과 역으로 상호관련된다.
또 다른 양태에서, 세포 배양 배지 조건을 모니터링하고 제어하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만분광법 중 하나 이상을 사용하여 세포 배양에서 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 제자리에서(in situ) 측정하는 것을 사용하는 세포 배양에서 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 측정하는 단계; 측정된 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 세포 배양 매개변수에 대한 사전결정된 세트 포인트 값과 비교하여 하나 이상의 세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위 내에 있는지를 결정하는 단계; 및 세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위를 벗어나는 것으로 결정되면 세포 배양 매개변수 중 하나 이상을 조정하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 암모늄 이온 농도를 모니터링할 수 있고, 암모늄 이온 농도가 특정 세포 배양에 대한 사전결정된 임계 범위 밖에 있는 것으로 결정되면, 아스파라긴 보충 공급은 세포 배양이 암모늄을 적게 생성하면서 여전히 적절한 아스파라긴을 수용하도록 조정될 수 있다.
다수의 실시형태가 개시되지만, 본 개시내용의 또 다른 실시형태는 개시내용의 예시적인 실시형태를 나타내고 기술하는 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이해되는 바와 같이, 발명은 본 개시내용의 사상 및 범주를 모두 벗어나지 않고 다양일 양태에서 변형될 수 있다. 따라서, 상세한 설명은 본질적으로 예시를 위한 것이고 한정하는 것이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
도 1a는 표준 공급 전략을 사용하여 유가식 세포 배양 동안 세포외 필수 아미노산 소비를 예시하는 반면, 도 1b는 표준 공급 전략을 사용하여 유가식 세포 배양 동안 아스파라긴의 소비를 예시한다.
도 2a 및 2b는 개시내용의 실시형태에 따른 다양한 공급 전략을 사용하는 유가식 세포 배양 동안 세포외 아미노산(도 2a) 및 아스파라긴(도 2b) 소비를 예시한다.
도 3a는 개시내용의 실시형태에 따라 낮은, 중간 및 높은 양 보충을 갖는 일련의 초기 유가식 아스파라긴 보충을 예시한다. 도 3b는 아스파라긴 보충의 양이 증가함에 따른 세포 배양 성장에서 증가를 예시하는 반면, 도 3c는 개시내용의 실시형태에 따라, 증가하는 아스파라긴 보충에 따른 세포 배양 역가에서 증가를 예시한다.
도 4a는 개시내용의 실시형태에 따라 후기 공급에서 낮은 및 높은 아스파라긴 보충을 예시한다. 도 4b는 개시내용의 실시형태에 따른 부산물 형성에서 증가를 예시하는 반면에, 도 4c는 전반적인 세포 배양 생산성이 부정적으로 영향을 받지 않음을 예시한다.
도 5a-5d는 개시내용의 실시형태에 따른 개선된 아스파라긴 영양보충 공급 전략을 예시한다. 도 5a는 유가 배치 세포 배양에서 세포외 필수 아미노산 농도를 예시하고 도 5b는 개시내용의 실시형태에 따른 유가 배치 세포 배양에서의 세포외 아스파라긴 농도를 예시한다. 도 5c는 세포 배양 성장에서 증가를 예시하는 반면, 도 5d는 개시내용의 실시형태에 따른 세포 배양 역가에서 증가를 예시한다.
도 5e-5g는 개시내용의 실시형태에 따른, 또 다른 예시적인 세포주에서 아스파라긴 보충 후 세포 역가(도 5e), 생존 세포 수(도 5f) 및 세포 생존율(도 5g)을 예시한다.
도 6a는 초기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 보충 후 아스파라긴 소비를 예시하는 반면, 도 6b는 개시내용의 실시형태에 따른 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 보충 후 아스파라긴 소비를 예시한다.
도 7은 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 높은 소비 세포주에 대한 아스파라긴 공급하는 전략의 범위에 걸친 아스파라긴 소비율을 예시한다.
도 8은 아스파르테이트 및 글루타메이트를 이용하는 아스파라긴의 합성 경로를 예시한다.
도 9a-9d는 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 높은 소비 세포주의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 것으로, 도 9a-9b는 세포외 아스파라긴(도 9a) 및 세포외 글루타메이트(도 9b) 농도를 나타내고, 도 9c-9d는 세포내 아스파라긴(도 9c) 및 세포내 글루타메이트(도 9d) 농도를 나타낸다.
도 10a-10d는 개시내용의 실시형태에 따른 또 다른 예시적인 높은 소비 세포주의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 것으로, 도 10a-10b는 세포외 아스파라긴(도 10a) 및 세포외 글루타메이트(도 10b) 농도를 나타내고, 도 10c-10d는 세포내 아스파라긴(도 10c) 및 세포내 글루타메이트(도 10d) 농도를 나타낸다.
도 11a-11d는 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 낮은 소비 세포주의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 것으로, 도 11a-11b는 세포외 아스파라긴(도 11a) 및 세포외 글루타메이트(도 11b) 농도를 나타내고, 도 11c-11d는 세포내 아스파라긴(도 11c) 및 세포내 글루타메이트(도 11d) 농도를 나타낸다.
도 12a-12f는 개시내용의 실시형태에 따라, 유가식 세포 배양에서 높은(3X 초기 단계, 1.5X 후기 단계) 및 매우 높은(6X 초기 단계, 3X 후기 단계) 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 것으로, 도 12a는 아스파라긴 농도를 나타내고, 도 12b는 아스파테이트 농도를 나타내고 도 12c는 역가를 나타내고, 도 12d는 글루타메이트 농도를 나타내고, 도 12e는 글루타민 농도를 나타내고, 도 12f는 암모늄 농도를 나타낸다.
도 13a-13d는 개시내용의 실시형태에 따른 볼루스 및 연속 아스파라긴 공급의 효과를 예시하는 것으로, 도 13a는 생존 세포 계수를 나타내고, 도 13b는 역가를 나타내고, 도 13c는 암모늄 형성을 나타내고, 도 13d는 알라닌 형성을 나타낸다. 도 13e-13g는 개시내용의 실시형태에 따른 동일한 총 아스파라긴 보충량을 갖는 볼루스 아스파라긴 보충 공급과 비교하여 연속 아스파라긴 보충 공급이 세포외 아스파라긴(도 13e), 아스파테이트(도 13f) 및 글루타메이트(도 13g) 고갈을 지연시킨다는 것을 보여준다.
도 14a-14d는 개시내용의 실시형태에 따른 볼루스 및 연속 아스파라긴 공급의 효과를 예시한다. 도 14a는 아스파라긴의 소비를 나타내는 반면, 도 14b-14c는 아스파라긴 관련 대사산물의 소비를 보여준다(아스파르테이트, 도 14b 및 글루타메이트 도 14c). 도 14d는 세포 배양 부산물인 암모늄의 형성을 보여준다.
도 15a-15g는 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 세포주에서 혼성 공급 접근법(볼루스 아스파라긴 보충 공급과 조합된 연속 아스파라긴 보충 공급)을 예시하는 것으로, 도 15a는 세포외 아스파라긴을 예시하고, 도 15b는 세포외 아스파르테이트를 예시하고, 도 15c는 세포외 글루타메이트를 예시하고, 도 15d는 생존 세포 계수를 예시하고, 도 15e는 역가를 예시하고, 도 15f는 암모늄 형성을 예시하고, 도 15g는 알라닌 형성을 예시한다.
도 16a-16e는 개시내용의 실시형태에 따른 또 다른 예시적인 세포주에서 혼성 공급 접근법(볼루스 아스파라긴 보충 공급과 조합된 연속 아스파라긴 보충 공급)을 예시하는 것으로, 도 16a는 세포외 아스파라긴을 예시하고, 도 16b는 생존 세포 계수를 예시하고, 도 16c는 역가를 예시하고, 도 16d는 암모늄 형성을 예시하고, 도 16e는 알라닌 형성을 예시한다.
도 17a는 개시내용의 실시형태에 따른 아스파라긴 공급 전략에 따른 유가식 세포 배양에서의 아스파라긴 소비를 예시하는 것으로, 도 17b는 아스파라긴 서열 변이체 형성의 완화를 보여준다.
도 18a는 개시내용의 실시형태에 따른 아스파라긴 공급 전략에 따른 유가식 세포 배양에서의 아스파라긴 소비를 예시한다. 도 18b는 개시내용의 실시형태에 따른, 세포내 글루타메이트 수준을 예시하며, 도 18c는 아스파라긴 서열 변이체의 형성의 완화를 보여준다.
도 19a-19g는 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 세포주에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 상관관계를 예시한다. 도 19b-19d는 세포외 아스파라긴(도 19b), 아스파르테이트(도 19c) 및 글루타메이트(도 19d)를 예시하는 반면, 도 19e-19g는 예시적인 세포내 아스파라긴(도 19e), 아스파르테이트(도 19f) 및 글루타메이트(도 19g)를 예시한다.
도 20a-20d는 개시내용의 실시형태에 따른 또 다른 예시적인 세포주(높은 소비 세포주)에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 상관관계를 예시한다. 도 20b-20d는 세포외 아스파라긴(도 20b), 세포내 아스파르테이트(도 20c) 및 세포내 글루타메이트(도 20d)를 예시한다.
도 21a-21f는 개시내용의 실시형태에 따른 예시적인 세포주에 대한 아스파라긴 서열 변이 경향을 예시한다. 도 21a 및 21c는 높은 아스파라긴 초기 공급 전략을 예시한다(도 21a, 질량 분석에 의해 결정된 서열 변이체 양, 도 21c, 세포내 글루타메이트의 농도). 도 21b 및 21d는 낮은 아스파라긴 초기 공급 전략을 예시한다(도 21b, 질량 분석에 의해 결정된 서열 변이체 양, 도 21d, 세포내 글루타메이트의 농도). 도 21e는 하나의 예시적인 세포주에 대한 세포내 글루타메이트 수준을 나타내며, 도 21f는 또 다른 예시적인 세포주에 대한 세포내 글루타메이트 프로필을 나타낸다.
도 22a-22h는 예시적인 세포주에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 상관관계를 예시한다. 도 22a-22d는 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략을 위한 예시적인 세포주에 대한 세포외 아스파라긴(도 22a), 세포외 아스파르테이트(도 22b), 세포외 글루타메이트(도 22c) 및 세포외 글루타민(도 22d)을 예시한다. 도 22e-22h는 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략을 위한 또 다른 예시적인 세포주에 대한 세포외 아스파라긴(도 22e), 세포외 아스파르테이트(도 22f), 세포외 글루타메이트(도 22g) 및 세포외 글루타민(도 22h)을 예시한다.
도 23a-23c는 세포외 글루타민이 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 서열 변이체의 대용물로서 작용할 수 있음을 추가로 예시한다. 도 23a는 예시적인 세포주에서 높은 아스파라긴 공급 전략을 통한 글루타민 생산을 보여준다. 유사하게, 도 23b는 예시적인 세포주에서 높은 아스파라긴 공급 전략을 통한 글루타민 생산을 보여준다. 그리고 마지막으로, 도 23c는 6 및 8일차에 아스파라긴이 보충되지 않은 경우 아스파라긴 서열 변이체가 검출되고 세포외 글루타민이 고갈 한계 미만으로 떨어진다(즉, 아스파라긴 공급 전략을 통해 불충분한 글루타민이 생성된다)는 것을 보여준다.
개시내용의 양태에 따르면, 최적화된 아스파라긴 공급 전략으로 세포 배양 작업을 수행하면 이러한 최적화된 아스파라긴 공급 전략 없는 세포 배양 작업에 비해 세포 배양에서 세포에 의한 세포 성장 및 단백질 생산에서 개선을 포함하여 세포 배양 성능을 개선시킬 수 있다는 것이 예상외로 밝혀졌다.
비-제한적 예로서, 세포 배양 성능에서의 개선은 세포 성장 속도, 세포 밀도, 세포 생존력, 단백질 생산, 세포 성장 부산물의 생산(예를 들어, 암모늄 이온 농도, 알라닌 농도 등) 및 이의 다양한 조합의 평가를 통해 결정될 수 있다. 개선은 본 명세서에 개시된 바와 같이 최적화된 아스파라긴 공급 전략 없는 세포 배양 작업과 비교하여 평가될 수 있다.
아스파라긴은 비-필수 아미노산으로, 종종 배양 중인 세포에 의해 높은 수준으로 소비되며, 세포 배양 대사에서 중심 역할을 수행한다. 개시내용의 특정 양태에서, 유가식 세포 배양의 세포 배양 성능에서 아스파라긴의 역할을 세포내 및 세포외 아스파라긴 및 관련 대사산물의 대사의 조사와 함께 조사하였다.
도 1a 및 도 1b에 예시된 바와 같이, 세포외 필수 아미노산(도 1a)은 유가식 세포 배양의 종료 시에 고도로 소비되고 주로 고갈되는 반면, 비-필수 아미노산인 세포외 아스파라긴(도 1b)은 표준 볼루스 아스파라긴 공급 전략에 따라 유가식 세포 배양의 타임라인에 걸쳐 고갈되었다.
본 개시내용의 실시형태는 세포 배양 성능을 개선하면서 아미노산 고갈을 최소화, 지연 및 방지하기 위해 아스파라긴 보충을 이용하는 세포 배양 방법에 대한 것이다. 예를 들어, 도 2a-2b를 참조하면, 세포외 필수 아미노산 고갈은 필수 아미노산 영양보충에 의해 예방될 수 있지만(도 2a), 유가식 세포 배양의 생산 단계 중 성장기(초기 단계) 및 정지/쇠퇴기(후기 단계) 동안 아스파라긴 영양보충의 더 높은 양은 예시적인 높은 생산 세포주에서 세포외 아스파라긴 고갈을 방지하지 않으며, 이는 아스파라긴 소비율이 화학양론적 요구를 초과함을 시사한다(도 2b)는 것이 밝혀졌다. 이와 같이, 개시내용의 실시형태에 따라, 유가식 세포 배양의 초기 단계, 성장기 및 후기 단계, 정지/쇠퇴기 동안 및 이후에 아스파라긴 영양보충의 영향을 평가하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 균형잡힌 아스파라긴을 공급하는 전략을 선택하였다.
본 명세서에 사용된 섹션 제목은 구성적 목적만을 위한 것이고 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), 및 Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998), 및 Dieffenbach 및 Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995)를 참고한다. 본 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 물질이 기술된다.
용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 전체적으로 상호교환적으로 사용되고 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 단백질-기반 약물을 포함하여 과학적 또는 상업적 관심있는 것일 수 있다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 특히 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포주에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종 폴리뉴클레오티드 서열"은 바이오의약품 약물 물질로 생성되는 키메라 단백질(트랩 분자와 유사), 항체 또는 항체 부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)과 같은 관심있는 단백질을 코딩하는 핵산 중합체를 지칭한다. 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 유전 공학 기술(예를 들어, 예컨대 키메라 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 코돈-최적화된 서열, 무인트론(intronless) 서열 등등)에 의해 제작되고 세포 내로 도입될 수 있으며, 여기서 그것은 에피솜으로 잔류할 수 있거나 또는 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 생산 세포 게놈 내의 이소성 부위 안으로 도입되는 자연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 이종 폴리펩티드 서열은 인간 오르소로그를 인코딩하는 서열과 같은 다른 유기체로부터 자연적으로 발생하는 서열일 수 있다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩티드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각 중쇄에는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH)과 중쇄 불변 영역이 있다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 세 도메인을 함유한다. 각 경쇄에는 경쇄 가변 영역과 경쇄 불변 영역이 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있으며, 이는 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역에 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화된 면역글로불린 및 비-글리코실화된 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 헤테로테트라머 면역글로불린을 포함하는, 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0331527에 기술되어 있으며, 이는 본 출원에 참조로 포함된다.
항체(또는 "항체 단편")의 "항원-결합 부분"이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포괄되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward 등 (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하도록 합성 링커에 의해 접합된, Fv 단편의 두 도메인 VL 및 VH로 구성되는 scFv를 포함한다. 디아바디와 같은 단일 사슬 항체의 다른 형태도 용어 "항체"에 포괄된다(예를 들어, Holliger 등 (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak 등 (1994) Structure 2:1121-1123 참고.)
더 더욱이, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov 등 (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 비오티닐화된 scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov 등 (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체의 파파인 또는 펩신 단리를 통한 것과 같은 통상의 기술을 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 당업계에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다(Sambrook 등, 1989 참조).
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 숙주 세포 안으로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합의 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor 등 (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같이 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 특정 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 형질전환된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)되고 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만, 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"Fc 융합 단백질"은 2개 이상의 단백질 중 일부 또는 전부를 포함하며, 그 중 하나는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이며, 이는 자연에서 함께 발견되지 않는 이다. 항체-유래된 폴리펩티드(Fc 도메인 포함)의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어, Ashkenazi 등, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn 등, Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh 등, "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992에 의해 기술되었다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 이는 일부 실시형태에서 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인에 이어진 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 미국 특허 번호 6,927,004 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하는 애플리버셉트; 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159 참조)과 같은 트랩이다.
아스파라긴 영양보충
개시내용의 특정 양태에서, 유가식 세포 배양을 아스파라긴으로 보충하는 것이 세포 배양 성능에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 아스파라긴 영양보충의 양에 관계없이, 유가식 세포 배양 동안 아스파라긴의 고갈을 피할 수 없다는 것도 밝혀졌다. 이와 관련하여, 제한 없이, 개시내용의 특정 양태에서, 유가식 세포 배양 동안 아스파라긴 고갈이 세포 배양 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 반면, 너무 높은 수준으로 공급된 아스파라긴은 또한, 예를 들어, 암모늄과 같은 부산물 형성의 형태에서 세포 배양 성능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다는 것이 예상외로 밝혀졌다.
특정 실시형태에서, 개선된 세포 배양 성능을 위한 진핵 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서; 여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 28.6mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충된 세포 배양 배지에서 상기 세포를 유지하는 단계로서; 여기서 세포 배양의 성능은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 아스파라긴 영양보충에 의해 개선되는, 단계를 포함한다.
본 명세서에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 아스파라긴 보충은 볼루스 공급 보충(예를 들어, 초기 단계 동안 하나의 볼루스 공급 보충 및 후기 단계 동안 하나의 볼루스 공급 보충), 세포 배양의 적어도 일부의 과정에 걸쳐 다중 볼루스 공급 보충(예를 들어, 초기 단계 동안 2, 3, 4 또는 5회의 볼루스 공급 보충 및 후기 단계 동안 2, 3, 4 또는 5회의 볼루스 공급 보충), 또는 세포 배양의 적어도 일부의 과정에 걸쳐 연속적으로 세포 배양(초기 단계 및 후기 단계 둘 모두)에 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 벌크 공급의 일부로서 또는 벌크 공급에 대한 별도의 보충 공급로서 제공될 수 있다. 보다 구체적으로, 보충은 벌크 공급의 일부로서 또는 벌크 공급에 대한 별도의 보충 공급로서 볼루스 또는 연속 공급에서 세포 배양(초기 단계 및 후기 단계 둘 모두)에 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 밀도 및/또는 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 증가된다. 특정 양태에서, 세포 배양은 아스파라긴 영양보충 후 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 약 10-50M 세포/ml, 예를 들어 약 10-35M 세포/ml의 생존 세포 계수를 유지할 수 있다.
특정 실시형태에서, 진핵 세포는 세포가 적어도 약 1.8mM/일 내지 약 9.3mM/일의 아스파라긴을 소비하는 높은 아스파라긴 소비 세포주이다. 다른 실시형태에서, 진핵 세포는 세포가 적어도 약 0.32mM/일 내지 약 1.8mM/일의 아스파라긴을 소비하는 낮은 아스파라긴 소비 세포주이다.
특정 실시형태에서, 방법은 유가식 세포 배양 동안 진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 것을 추가로 포함한다. 관심있는 재조합 단백질의 역가는 비-아스파라긴 보충된 배양에서 배양된 세포(들)와 비교한 역가보다 적어도 3%, 5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 적어도 20% 더 높을 수 있다. 관심있는 재조합 단백질의 수율은 세포(들)가 비-아스파라긴 보충된 배양에서 배양된 유사한 방법에 비하여 적어도 0.1g/L, 적어도 0.5g/L, 적어도 1g/L, 적어도 1.2g/L, 적어도 1.4g/L, 적어도 1.6g/L, 적어도 1.8g/L, 적어도 2g/L, 적어도 2.2g/L, 적어도 2.4g/L, 또는 적어도 2.5g/L 만큼 증가될 수 있다. 특정 실시형태에서, 진핵 세포는 관심있는 재조합 단백질이 적어도 4g/L, 적어도 5g/L, 적어도 6g/L, 적어도 7g/L, 적어도 8g/L, 적어도 9g/L, 적어도 10g/L, 적어도 11g/L, 적어도 12g/L, 적어도 13g/L, 적어도 14g/L의 수율로 생산되는 높은 생산 세포주이다.
특정 실시형태에서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 28.6mM, 약 3.0mM 내지 약 25.0mM, 약 5.0mM 내지 약 23.0mM, 약 6.0mM 내지 약 22.0mM, 약 7.2mM 내지 약 21.6mM, 약 10.6mM 등, 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 21.6mM, 약 2.6mM 내지 약 20.0mM, 약 2.6mM 내지 약 18.0mM, 약 2.6mM 내지 약 16.0mM, 약 2.6mM 내지 약 14.4mM, 약 5.3mM 등의 양인 아스파라긴으로 보충된다. 다른 실시형태에서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 동안 약 7.2mM 내지 약 21.6mM 및 후기 유가식 동안 약 2.6mM 내지 약 14.4mM 양의 아스파라긴으로 보충된다. 다른 실시형태에서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 단계 유가식 동안 약 10.6mM 및 후기 단계 유가식 동안 약 5.3mM 양의 아스파라긴으로 보충된다.
특정 실시형태에서, 세포는 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 유가식 세포 배양의 기간 동안 아스파라긴 보충된 세포 배양 조건 하에 유지될 수 있다. 아스파라긴 보충은 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공될 수 있다. 유사하게, 아스파라긴 보충은 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포는 적어도 500리터, 적어도 750리터, 적어도 1,000리터, 적어도 1,500리터, 적어도 2,000리터, 적어도 2,500리터, 적어도 5,000리터, 적어도 7,500리터, 적어도 10,000리터, 적어도 12,500리터, 적어도 15,000리터, 적어도 20,000리터, 적어도 25,000리터, 500리터 내지 25,000리터 등의 부피를 갖는 세포 배양에서 아스파라긴 보충된 세포 배양 조건 하에 유지될 수 있다.
특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 연속적으로 제공될 수 있다. 특정 양태에서, 세포 배양에서 연속적인 아스파라긴 영양보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 볼루스 공급으로서 제공되는 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일 또는 적어도 4일 이상의 아스파라긴, 아스파르트산 및 글루탐산의 세포외 아미노산 고갈의 지연을 초래한다.
보다 구체적으로, 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 초기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공될 수 있다. 유사하게, 특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 후기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공될 수 있다.
제한 없이, 특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 유가식 세포 배양의 2일차에 또는 그 후에 시작하고, 그 후 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안, 또는 유가식 세포 배양의 5일차에 또는 그 후에 시작하고, 그 후 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 연속적으로 제공될 수 있다. 이러한 후기 유가식 연속 아스파라긴 보충은 후기 유가식 세포 배양의 10일차에 또는 그 후에 중단될 수 있다.
아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 영양보충
다른 양태에서, 유가식 세포 배양 동안 아스파라긴(Asn) 고갈은 세포 배양에서 포유동물 세포로부터 발현된 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체(SV)의 발생을 초래할 수 있음이 밝혀졌다. 배경으로, 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 번호 9,096,879에 개시된 바와 같이, 포유동물 세포에서 관심있는 폴리펩티드의 재조합 발현 동안 특정 아미노산의 고갈이 아미노산의 오혼입을 촉발할 수 있다는 것이 알려져 있다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 관심있는 폴리펩티드의 재조합 발현 동안 특정 아미노산의 고갈은 포유동물 세포에서 관심있는 폴리펩티드의 번역 동안 아미노산이 제2 아미노산으로 치환되는 결과를 초래할 수 있다. Asn→Ser 아스파라긴 서열 변이체(즉, 관심있는 폴리펩티드의 번역 동안 아스파라긴 대신에 세린의 오혼입)가 관찰되지만, 아스파라긴으로 세포 배양 배지를 보충함에 의해 최소화될 수 있다.
이와 관련하여, 아스파라긴으로 유가식 세포 배양의 영양보충이 아스파라긴 SV의 형성을 최소화할 수 있음을 밝혀졌다. 개시내용의 실시형태에 따르면, 아스파라긴 SV는 적어도 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 세포 배양 배지에서 세포외 아스파라긴 수준을 약 1.0mM, 약 0.5mM, 약 0.5mM, 약 0.25mM, 약 0.2mM, 약 0.1mM 등의 고갈 한계 초과로 유지함에 의해 최소화될 수 있음을 예상외로 밝혀졌다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지 중 세포외 아스파라긴 수준은 초기 단계 유가식 세포 배양의 적어도 처음 6일, 초기 단계 유가식 세포 배양의 적어도 처음 5일, 초기 유가식 세포 배양의 적어도 처음 4일, 초기 단계 유가식 세포 배양의 적어도 처음 3일, 초기 단계 유가식 세포 배양의 적어도 처음 2일 등 동안 그러한 고갈 한계 초과로 유지될 수 있다. 예로서, 그러한 고갈 한계 초과로 유지하는 기간은 아스파라긴 보충을 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 매일, 연속적으로, 등으로 제공하는 것을 포함할 수 있다.
개시내용의 특정 실시형태에 따르면, 아스파라긴으로 유가식 세포 배양의 영양보충은 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.50% 미만의 양, 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.45% 미만의 양, 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.40% 미만의 양, 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.35% 미만의 양, 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.30% 미만의 양, 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.25% 미만의 양, 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.20% 미만의 양, 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.15% 미만의 양, 폴리펩티드에서 아스파라긴 SV의 약 0.10% 미만의 양, 아스파라긴 SV 양이 검출되지 않음 등으로 아스파라긴 SV의 발생을 완화, 즉 방지할 수 있다.
특정 실시형태에서, 아스파라긴으로 유가식 세포 배양의 보충은, 예를 들어, 후기 유가식 세포 배양 동안 세포 배양 4일차, 세포 배양 5일차, 세포 배양 6일차, 세포 배양 7일차, 세포 배양 8일차, 세포 배양 9일차, 세포 배양 10일차, 세포 배양 11일차, 세포 배양 12일차, 세포 배양 13일차, 세포 배양 14일차 등 후에 그러한 수준으로 아스파라긴 SV 형성을 완화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 배양은, 예를 들어, 초기 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 28.6mM, 예를 들어 약 7.2mM 내지 약 21.6mM, 약 10.6mM 등, 및 후기 단계 유가식 세포 배양 동안 약 2.6mM 내지 약 21.6mM, 예를 들어, 약 2.6mM 내지 약 14.4mM, 약 5.3mM 등의 양인 본 명세서에 일반적으로 기재된 바와 같은 아스파라긴으로 보충될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아스파라긴 보충은 벌크 공급의 일부로서 또는 별도의 아스파라긴 보충 공급으로서 제공될 수 있다.
특정 양태에서, 유가식 세포 배양의 적어도 4일에 걸쳐 아스파라긴 고갈을 방지하기 위해 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 충분한 아스파라긴 영양보충이 제공되는 경우(예를 들어, 특정 실시형태에서, 제2 볼루스 공급) 아스파라긴 SV 형성이 완화될 수 있음을 예상외로 밝혀졌다. 특정 실시형태에서, 초기 단계 유가식 세포 배양에서 영양보충은 아스파라긴 SV의 최적화된 완화를 위해 제공된 과잉의 암모늄의 형성을 균형 유지하면서 아스파르테이트(Asp) 및 글루타메이트(Glu) 고갈을 방지하기 위해(또는 충분한 글루타민(Gln), 즉, >100mg/L를 생산하기 위해) 후기 단계 유가식 세포 배양 이후 및 그 동안 충분한 아스파라긴 영양보충이 이어졌다.
특정 실시형태에서, (예를 들어, 유가식 세포 배양의 적어도 4일에 걸쳐) 고갈 한계 초과의 수준을 유지하기 위해 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 충분한 아스파라긴 영양보충을 제공하고, 그 후에 바람직하지 않은 부산물 형성(예를 들어, 암모늄)을 최소화하기 위해 후기 단계 유가식 세포 배양 동안 충분한 아스파라긴 영양보충을 제공하는 것이 예상외로 밝혀졌다. 비-제한적 예로서, 초기 단계 및 후기 단계 유가식 세포 배양 동안 아스파라긴 영양보충은 아스파라긴 SV에 대한 낮은 위험을 제공하기 위해 다음 기준 중 임의의 것을 충족시킬 수 있다.
비-제한적 예시적인 초기 단계 유가 배치 조건
Figure pct00001
비-제한적 예시적인 후기 단계 유가 배치 조건
Figure pct00002
아스파라긴 관련 아미노산
개시내용의 다른 양태에서, 표적화된 아스파라긴 고갈이 세포 대사 경로를 통해 아스파라긴과 관련된 비-필수 아미노산에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다. 배경으로, 아스파라긴(Asn), 아스파르테이트(Asp), 글루타메이트(Glu) 및 글루타민(Gln)은 세포 대사 경로를 통해 서로 간에 상호전환될 수 있다. 아스파라긴이 필요한 경우, 세포는 보충의 아스파라긴을 합성하기 위해 아스파르테이트 및 글루타메이트의 그 활용을 증가시킬 수 있다. 아스파르테이트, 글루타메이트 및 글루타민의 더 높은 세포내/세포외 농도는 세포가 세포 요구를 지원하기에 충분한 세포내 아스파라긴을 가지고 있음을 나타낼 수 있다. 그러나, 아스파르테이트, 글루타메이트, 글루타민의 농도에서의 감소는 아스파라긴 제한을 나타낼 수 있다.
아스파라긴 서열 변이체(SV)에 대한 대용 마커로서의 아스파라긴 관련 아미노산
다른 양태에서, 아스파르테이트(Asp), 글루타메이트(Glu) 및 글루타민(Gln)을 포함하는 아스파라긴 관련 아미노산이 관심있는 폴리펩티드의 생산 동안 형성된 아스파라긴 서열 변이체의 대용 마커로 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 개시내용의 특정 실시형태에 따르면, 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 및 세포외 농도가 아스파라긴 서열 변이체의 형성의 정성적 지표로서 작용할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
이론에 의해 제한되기를 의도하지 않고, 아스파라긴 관련 아미노산의 더 높은 수준의 세포내 및/또는 세포외 농도는 일반적으로 세포가 세포 요구를 지원하기에 적절한 세포내 아스파라긴을 갖는다는 것을 나타낼 것이다. 그러한 적절한 세포내 아스파라긴은 생성된 관심있는 폴리펩티드에서 최소 아스파라긴 서열 변이체를 야기할 것이다. 반대로, 아스파라긴 관련 아미노산의 더 낮은 수준의 세포내 및/또는 세포외 농도는 일반적으로 세포가 세포 요구를 지원하기에 부적절한 세포내 아스파라긴을 갖는다는 것을 나타낼 것이다. 이러한 부적절한 세포내 아스파라긴은 생성된 관심있는 폴리펩티드에서 증가된 아스파라긴 서열 변이체를 야기할 것이다. 이와 같이, 아스파라긴 관련 아미노산은 일반적인 역상관관계에 기초하여 아스파라긴 서열 변이체의 대용 마커로 사용될 수 있다. 이들 대용물의 상관관계 강도는 관련된 아미노산의 세포외 및 세포내 아미노산 프로필에 대한 표적화된 아스파라긴 영양보충의 영향에 의존하며, 이는 차례로 부분적으로 세포주 및 아스파라긴 농도에 의해 좌우될 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포내 및 세포외 아스파라긴 및 아스파라긴 관련 아미노산 농도는 아스파라긴 서열 변이체에 대한 대용 마커로 사용될 수 있다. 제한하고자 하는 것은 아니지만, 아스파라긴 SV는 초기 단계 유가식 세포 배양에서 충분한 아스파라긴을 보충함에 의해 특히 최소화될 수 있고, 아스파라긴 SV의 형성은 세포내 및 세포외 아스파라긴 및 아스파라긴 관련 아미노산 농도를 사용하여 모니터링될 수 있다는 것이 예상외로 밝혀졌다. 예로서, 아스파라긴 SV의 형성은 아스파라긴 또는 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 또는 세포외 농도를 모니터링함에 의해 제자리에서 모니터링될 수 있다. 특정 실시형태에서, 세포외 아스파라긴(Asn)은 아스파라긴 SV의 대용물로서 초기 단계 유가식 세포 배양에서 모니터링될 수 있는 반면, 세포외 아스파라긴(Asn), 아스파르테이트(Asp), 글루타메이트(Glu) 및 글루타민(Gln)은 후기 단계 유가식 세포 배양에서 모니터링될 수 있다. 대안적 실시형태에서, 세포내 Asn, Asp, Glu 및 Gln은 후기 단계 유가식 세포 배양에서 모니터링될 수 있다.
특정 실시형태에서, 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체를 검출, 측정 또는 스크리닝하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계; 진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 정의된 세포 배양 배지에서 아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 및/또는 세포외 농도를 측정하는 단계; 및 아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도를 발현된 관심있는 재조합 단백질에 존재하는 아스파라긴 서열 변이체의 존재와 상호관련시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도는 아스파라긴 서열 변이체의 존재와 역으로 상호관련된다.
특정 실시형태에서, 정의된 세포 배양 배지는 본 명세서에 기술된 바와 같이 아스파라긴으로 보충될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아스파라긴 관련 아미노산은 아스파르테이트(Asp), 글루타메이트(Glu), 글루타민(Gln) 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 아스파라긴 관련 아미노산은 글루타메이트이다. 일부 실시형태에서, 아스파라긴 관련 아미노산은 세포내에서 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 후기 유가식 세포 배양 동안, 예를 들어, 유가식 세포 배양의 5일차 후, 6일차 후, 7일차 후, 8일차 후, 9일차 후, 10일차 후 등에 측정될 수 있다.
특정 양태에서, 대용 마커로서 아스파라긴 관련 아미노산을 사용하여 아스파라긴 서열 변이체를 검출, 측정 또는 스크리닝하는 방법은 특정 관심있는 폴리펩티드에 대한 최적의 세포 배양 매개변수를 식별하기 위한 고처리량 스크리닝 및 최적화 기술을 제공할 수 있다. 예를 들어, 방법은 특정 관심있는 폴리펩티드에 대한 아스파라긴 서열 변이체를 최소화하는 최적의 아스파라긴 공급 수준을 표적화하는데 사용될 수 있다.
아스파라긴 영양보충의 최적화, 제자리 모니터링 및 제어
특정 실시형태에서, 아스파라긴 영양보충을 포함하는 세포 배양 매개변수를 모니터링하고 제어하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 표적 세포주 및/또는 관심있는 폴리펩티드에 대한 최적의 아스파라긴 영양보충을 제공하기 위해 다양한 세포 배양 공정 매개변수를 모니터링 및 제어할 수 있다. 모니터링 및 제어될 수 있는 예시적인 세포 배양 공정 매개변수는 아스파라긴 농도, 아스파라긴 관련 아미노산 농도, 생존 세포 계수, 죽은 세포 계수, 단백질 역가, 암모늄 이온, 알라닌, 삼투질농도 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 양태에서, 개시내용의 모니터링 및 제어 방법은 암모늄 이온 및 알라닌과 같은 세포 배양 부산물의 형성을 동시적으로 제어하면서 세포 배양 배지에서 아스파라긴 고갈을 최적화 및 방지하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 모니터링 및 제어는 이에 의해 세포 배양 성능 매개변수, 예를 들어 생존 세포 계수 및 단백질 역가의 개선된 제어를 제공할 수 있다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지 조건을 모니터링하고 제어하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 제자리 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만 분광법을 사용하여 세포 배양에서 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 측정하는 단계; 측정된 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 세포 배양 매개변수에 대한 사전결정된 세트 포인트 값과 비교하여 하나 이상의 세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위 내에 있는지를 결정하는 단계; 및 세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위를 벗어나는 것으로 결정되면 세포 배양 매개변수 중 하나 이상을 조정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 암모늄 이온 농도를 모니터링할 수 있고, 암모늄 이온 농도가 특정 세포 배양에 대한 사전결정된 임계 범위 밖에 있는 것으로 결정되면, 아스파라긴 보충 공급은 세포 배양이 여전히 적절한 아스파라긴을 수용하면서 더 적은 암모늄을 생성하도록 조정될 수 있다. 이러한 방법은 암모늄 이온 및 알라닌과 같은 세포 부산물의 생성을 최소화하면서 최적 및 최대량의 아스파라긴 영양보충을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 개시내용의 모니터링 및 제어 방법은 제자리 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만 분광법 또는 다른 적합한 제자리 세포 배양 매개변수 측정 방법론 및 화학측정 모델링 기술을, 신호 처리 기술과 조합된, 세포 배양 매개변수의 실시간 평가, 정확하고 지속적인 피드백 및 세포 배양 공정 매개변수의 모델 예측 제어를 위해 이용할 수 있다. 생물반응기 내용물의 제자리 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만 분광법은 시험하기 위해 샘플을 물리적으로 제거하지 않고도 하나 이상의 공정 매개변수의 분석을 허용한다. 이러한 기술은 아스파라긴 영양보충을 포함하여 세포 배양 공정 매개변수의 실시간 피드백 제어를 제공할 수 있다.
일 실시형태에서, 암모늄 이온 및/또는 알라닌에 대한 사전결정된 최대 세트 포인트 값이 설정될 수 있다. 마찬가지로, 아스파라긴 영양보충 연속 유량에 대한 사전결정된 세트 포인트 값이 설정될 수 있다. 유가식 세포 배양 동안 원하는 포인트(예를 들어, 초기 단계 유가식 시간 프레임, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 후기 단계 유가식 시간 프레임, 5일차, 6일차, 7일차, 8일차, 9일차, 10일차 등)에서 연속 공급 아스파라긴 영양보충이 시작될 수 있다. 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산, 암모늄 이온 및/또는 알라닌의 농도 중 하나 이상은 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만 분광법에 의해 세포 배양 작업 동안 모니터링될 수 있다. 특정 실시형태에서, 미가공 스펙트럼 데이터가 지속적으로 최신 상태임을 보장하기 위해 어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만 분광법으로부터의 데이터는 약 10분 내지 2시간마다 획득될 수 있다. 다른 실시형태에서, 데이터는 약 15분 내지 1시간마다 획득될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 데이터는 약 20분 내지 30분마다 획득될 수 있다.
하나 이상의 세포 배양 공정 매개변수의 모니터링은 제자리 분석을 허용하는 임의의 상업적으로 이용가능한 분석기에 의해 분석될 수 있다. 제자리 분석기는 세포 배양 내에서 미가공 데이터를 얻을 수 있어야 한다(예를 들어, 분석기는 생물반응기 안으로 삽입할 수 있는 프로브가 장착되어 있어야 한다). 적합한 분석기는 RamanRXN2 및 RamanRXN4 분석기(Kaiser Optical Systems, Inc. 미시간주 앤아버 소재) 또는 BioProfile Flex 자동화된 세포 배양 분석기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
제자리 분석기에 의해 얻어진 미가공 스펙트럼 데이터는 공정 매개변수 내의 데이터를 상관시키기 위해 모니터링되거나 제어될 특정 공정 매개변수의 오프라인 측정치(예를 들어, 오프라인 아스파라긴 농도 측정치)와 비교될 수 있다. 오프라인 측정 데이터는 임의의 적절한 분석 방법을 통해 수집될 수 있다. 부가적으로, 임의의 유형의 다변량 소프트웨어 패키지, 예를 들어 SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions, 스웨덴 우메아 소재)을 사용하여 데이터를 모니터링하거나 제어할 특정 공정 변수의 오프라인 측정치와 상관시킬 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서 임의의 가변 기준선을 제거하기 위해 필터로 미가공 데이터를 전처리하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 미가공 데이터는 임의의 유형의 포인트 평활화 기술 또는 정규화 기술로 전처리될 수 있다. 예를 들어, 임의의 전력 변동 및 노출 시간을 수정하기 위해 정규화가 필요할 수 있다. 일 실시형태에서, 미가공 데이터는 21cm-1 포인트 평활화로 1차 도함수와 같은 포인트 평활화 및 표준 정규 변량(SNV) 정규화와 같은 정규화로 처리될 수 있다.
화학적 모델링이 또한 얻어진 스펙트럼 데이터에 대해 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 부분 최소 제곱법(PLS), 주성분 분석(PCA), 직교 부분 최소 제곱법(OPLS), 다변량 회귀, 정규 상관관계, 인자 분석, 군집 분석, 그래픽 절차 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다변량 방법이 스펙트럼 데이터에 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 얻어진 스펙트럼 데이터는 PLS 회귀 모델을 생성하는데 사용된다. 예측된 변수와 관측된 변수를 새로운 공간에 투영하여 PLS 회귀 모델을 만들 수 있다. 이 양태에서, 라만 분석으로부터 얻은 측정값과 오프라인 측정값을 사용하여 PLS 회귀 모델을 생성할 수 있다. PLS 회귀 모델은 예측된 공정 값, 예를 들어 예측된 영양소 농도 값을 제공한다.
화학적 모델링 후, 예측된 공정 값(예를 들어, 예측된 아스파라긴 농도 값)에 신호 처리 기술이 적용될 수 있다. 일 실시형태에서, 신호 처리 기술은 노이즈 감소 기술을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 노이즈 감소 기술이 예측된 공정 매개변수에 적용될 수 있다. 당업자에게 공지된 임의의 노이즈 감소 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 노이즈 감소 기술은 데이터 평활화 및/또는 신호 거부를 포함할 수 있다. 평활화는 일련의 평활화 알고리즘과 필터를 통해 달성되는 반면 신호 거부는 신호 특성을 사용하여 분석된 스펙트럼 데이터에 포함되어서는 안되는 데이터를 식별한다. 일 실시형태에서, 예측된 공정 값은 노이즈 감소 필터에 의해 완화된 노이즈이다. 노이즈 감소 필터는 최종 필터링된 공정 값(예를 들어 최종 필터링된 영양소 농도 값)을 제공한다. 이 양태에서 노이즈 감소 기술은 모델에 따라 측정이 산출해야 하는 것에 대한 모델-기반 추정과 미가공 측정을 결합한다. 일 실시형태에서, 노이즈 감소 기술은 현재 예측된 공정 값을 그 불확실성과 조합한다. 불확실성은 예측된 공정 값과 현재 공정 조건의 반복성에 의해 결정될 수 있다. 다음 예측된 공정 값이 관찰되면 예상된 공정 값(예를 들어 예측된 영양소 농도 값)의 추정치는 확실성이 더 높은 추정치에 더 많은 가중치가 부여되는 가중 평균을 사용하여 업데이트된다. 반복적인 접근법을 사용하여 이전 측정 및 현재 공정 조건을 기반으로 최종 공정 값을 업데이트할 수 있다. 이 양태에서 알고리즘은 재귀적이어야 하고 현재 예측된 공정 값, 이전 값 및 실험적으로 결정된 상수를 이용하기 위해 실시간으로 실행될 수 있어야 한다. 노이즈 감소 기술은 자동 피드백 제어기가 작동하는 노이즈를 감소시킴에 의해 라만 분석 및 PLS 예측에서 수신된 측정의 견고성을 개선한다.
최종 필터링된 공정 값(예를 들어, 최종 필터링된 영양분 농도 값)을 얻을 때, 최종 값은 자동 피드백 제어기로 전송될 수 있다. 자동화된 피드백 제어기는 사전정의된 세트 포인트 이하에서 공정 매개변수(예를 들어, 암모늄 농도의 모니터링 및 아스파라긴 농도의 제어)를 제어하고 유지하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 최대 세트 포인트 값을 초과하는 암모늄 농도가 검출되면, 자동화된 피드백 제어기는 임계 범위 내에서 아스파라긴 공급량을 감소시키도록 촉발될 수 있다. 자동화된 피드백 제어기는 원하는 세트 포인트(예를 들어, 사전정의된 세트 포인트)와 측정된 공정 매개변수 사이의 차이로서 오류 값을 계산할 수 있는 임의의 유형의 제어기를 포함할 수 있고 자동적으로 정확하고 반응성인 보정을 적용할 수 있다. 자동화된 피드백 제어기는 또한 플랫폼 인터페이스에서 실시간으로 변경할 수 있는 제어도 가져야 한다. 예를 들어, 자동화된 피드백 제어기는 사전정의된 세트 포인트의 조정을 허용하는 사용자 인터페이스를 가져야 한다. 자동화된 피드백 제어기는 사전정의된 세트 포인트에서 변화에 대응할 수 있어야 한다.
일 실시형태에서, 자동화된 피드백 제어기는 비례-적분-미분(PID) 제어기일 수 있다. 이 양태에서, PID 제어기는 사전정의된 세트 포인트와 측정된 공정 변수(예를 들어, 측정된 아스파라긴 농도) 사이의 차이를 계산하고 자동적으로 정확한 보정을 적용하도록 작동가능하다. 예를 들어, 세포 배양의 영양분 농도가 제어되어야 할 때, PID 제어기는 필터링된 영양분 값과 사전정의된 세트 포인트 사이의 차이를 계산하고 영양분 양에서 보정을 제공하도록 작동가능할 수 있다. 이 양태에서, PID 제어기는 교정 영양분 양이 생물반응기로 펌핑될 수 있도록 생물반응기 상의 영양분 펌프에 작동가능하게 연결될 수 있다.
실시간 분석 및 피드백 제어의 사용을 통해, 개시내용의 방법은 표적 세포주 및/또는 관심있는 폴리펩티드에 대한 최적의 아스파라긴 영양보충을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 유해한 세포 배양 부산물을 포함하는 세포 배양 부산물의 생성을 최소화하면서 세포 배양에 최적의 아스파라긴 영양보충을 제공할 수 있다.
세포 배양 배지
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 전형적으로 탄수화물 에너지원, 필수(예를 들어 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 이소류신, 라이신 및 히스티딘) 및 비필수(예를 들어 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신) 아미노산, 미량 원소, 에너지원, 지질, 비타민 등과 같은 세포의 성장을 향상시키는데 필요한 영양소를 제공하는 세포, 예를 들어 진핵 세포를 성장시키는데 사용되는 영양 용액을 지칭한다. 세포 배양 배지는 추출물, 예를 들어 세포 성장을 지원하는 미가공 물질을 공급하는 혈청 또는 펩톤(가수분해물)을 함유할 수 있다. 배지는 동물-유래된 추출물 대신 효모-유래된 또는 콩 추출물을 함유할 수 있다. 화학적으로 정의된 배지는 모든 화학 성분이 알려진(즉, 알려진 화학 구조를 가짐) 세포 배양 배지를 지칭한다. 일반적으로, 화학적으로 정의된 배지에는 혈청- 또는 동물-유래된 펩톤, 효모 및 대두 추출물과 같은 동물-유래된 성분이 없다. 일 실시형태에서, 배지는 화학적으로 정의된 배지이다.
배지는 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함하여 최소 속도 초과로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 함유할 수 있다. 배지는 바람직하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청일 수 있다. "무혈청"은 태아 소 혈청과 같은 동물 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 무혈청 배지는 대두 가수분해물과 같은 가수분해물 ≤16g/L를 함유할 수 있다. 본 개시내용은 또한 무혈청일 뿐만 아니라 무가수분해물인 화학적으로 정의된 배지를 제공한다. "무가수분해물"은 예를 들어 펩톤, 트립톤 등과 같은 동물 또는 식물 단백질 가수분해물과 같은 외인성 단백질 가수분해물을 함유하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다.
"기본 배지"는 세포가 증식되고, 아미노산의 기본 혼합물을 포함하는 필요한 모든 영양소를 함유하는 초기 배지(예를 들어, 시드 트레인 및/또는 세포 배양 생산의 0일차에 존재함)이다. 기본 배지에 대한 다양한 레시피(즉, 제형)는 상업적으로 이용가능한 로트에서 제조 또는 구매할 수 있다. 마찬가지로 "기본 공급 배지"는 생산 배양 동안 일반적으로 소비되고 공급하는 전략(소위 "유가식" 배양의 경우)에서 이용되는 보충 영양소의 혼합물을 함유한다. 다양한 기본 공급 배지가 상업적으로 이용가능한다. "공급"은 항성분배양조에서와 같이 연속적인 공급 배양 시스템을 포함하는 프로토콜에 따른 것(C. Altamirano 등, Biotechnol Prog. 2001 November-December; 17(6):1032-41 참조), 또는 유가식 공정에 따른 것(Y. M. Huang 등, Biotechnol Prog. 2010 September-October; 26(5): 1400-10)과 같이 규칙적인 간격으로 배지에 예정된 추가 또는 추가를 포함한다. 예를 들어, 배양은 하루에 한 번, 격일로, 3일마다 공급될 수 있거나, 모니터링되는 특정 배지 성분의 농도가 원하는 범위를 벗어날 때 공급될 수 있다.
제한하려는 의도 없이, 개시내용은 다양한 기본 배지 또는 이의 조합 중 임의의 하나 이상으로 실시될 수 있다. 기본 배지는 일반적으로 당업계에 알려져 있고 특히 이글 MEME(최소 필수 배지)(Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), Ham's F12(Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), F-12 K 배지, 둘베코 배지, 둘베코 변형된 이글 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), DMEM/Ham's F12 1:1, Trowell's T8, A2 배지(Holmes and Wolf, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), 웨이머스 배지(Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2):188-199), 윌리암스 E 배지(William's 등, Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640 (Moore 등, J. Amer. Med. Assoc., 1967, 199:519-524), MCDB 104/110 배지(Bettger 등, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):5588-5592), Ventrex HL-1 배지, 알부민-글로불린 배지(Orr 등, Appl. Microbiol., 1973, 25(1):49-54), RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 이스코브 변형된 둘베코 배지, McCoy의 5A 배지, 레보비츠의 L-15 배지 및 무혈청 배지 예컨대 EX-CELL™ 300 시리즈(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.), 프로타민-아연-인슐린 배지(Weiss 등, 1974, 미국 특허 번호 4,072,565), 비오틴-엽산 배지(Cartaya, 1978, US Re30,985), 트랜스페린-지방산 배지(Baker, 1982, 미국 특허 번호 4,560,655), 트랜스페린-EGF 배지(Hasegawa, 1982, 미국 특허 번호 4,615,977; Chessebeuf, 1984, 미국 특허 번호 4,786,599), 및 기타 배지 순열(Inlow, 미국 특허 번호 6,048,728; Drapeau, 미국 특허 번호 7,294,484; Mather, 미국 특허 번호 5,122,469; Furukawa, 미국 특허 번호 5,976,833; Chen, 미국 특허 번호 6,180,401; Chen, 미국 특허 번호 5,856,179; Etcheverry, 미국 특허 번호 5,705,364; Etcheverry, 미국 특허 번호 7,666,416; Ryll, 미국 특허 번호 6,528,286; Singh, 미국 특허 번호 6,924,124; Luan, 미국 특허 번호 7,429,491; 등 참조)을 포함한다.
세포 배양 배지는 또한 배양되는 세포의 요구사항 또는 원하는 세포 배양 매개변수에 의존하여, 폴리아민과 같은 추가 성분 또는 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충액, 항생제, 지질, 미량 원소 등 같은 성분의 증가된 농도와 함께 또는 없이 주기적으로(소위 "유가식" 배양에서처럼) 공급될 수 있다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지는 추가 아미노산 영양보충이 제공되지 않는 재조합 단백질 생산의 과정에 걸쳐 아미노산이 고갈될 수 있거나, 세포 배양 배지는 "비-고갈"될 수 있으며, 여기서 아미노산 영양보충이 (아래에 기술된 바와 같이) 고갈된 아미노산에 대해 제공된다.
일 실시형태에서, 배지는 100μM ± 15μM 오르니틴, 또는 300μM ± 45μM 오르니틴, 또는 600μM ± 90μM 오르니틴, 또는 심지어 900μM ± 135μM 오르니틴을 추가로 함유한다. 다른 실시형태에서, 배지는 적어도 약 29μM ±1μM 오르니틴, 또는 적어도 약 59μM ±12μM 오르니틴, 80μM ±13μM 오르니틴, 또는 적어도 약 296μM ±44μM 오르니틴, 또는 적어도 약 593μM ±89μM 오르니틴, 또는 적어도 약 889μM ±133μM 오르니틴을 함유한다.
퓨트레신은 선택적으로 보충된 배지에 첨가될 수 있다. 퓨트레신은 일부 세포 배양 배지 제형에서 성분으로서 낮은 농도, 예를 들어 0.01-120mg/L로 포함되어 있다; 예를 들어, 0.02-0.08mg/L 퓨트레신을 기술하는 WO 2005/028626; 미국 특허 번호 5,426,699(0.08mg/L); 미국 특허 번호 RE30,985(0.16mg/L); 미국 특허 번호 5,811,299호(0.27mg/L); 미국 특허 번호 5,122,469(0.5635mg/L); 미국 특허 번호 5,063,157(1mg/L); WO 2008/154014(~100 82 M-~1000μM); 미국 특허 출원 번호 2007/0212770(0.5-30mg/L 폴리아민; 2mg/L 퓨트레신; 2mg/L 퓨트레신 + 2mg/L 오르니틴; 2mg/L 퓨트레신 + 10mg/L 오르니틴).
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 오르니틴 및 퓨트레신의 조합으로 추가로 보충되며, 여기서 퓨트레신은 적어도 약 150 내지 720μM의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 170 내지 230μM의 농도에서 퓨트레신으로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지는 ≥90μM±15μM 오르니틴에 더하여 200μM±30μM 퓨트레신을 함유한다. 일 실시형태에서, 배지는 ≤89μM ±13μM 오르니틴에 더하여 ≤186μM±28μM 퓨트레신을 함유한다. 다른 실시형태에서, 배지는 ≥89μM±13μM 오르니틴에 더하여 ≥186μM±28μM 퓨트레신을 함유한다. (2014년 9월 18일 공개된 국제 공개 번호 WO2014/144198A1을 참조하며, 이는 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다).
또 다른 실시형태에서, 오르니틴은 0.09±0.014mM 내지 0.9±0.14mM, 예컨대 0.09±0.014mM, 0.3±0.05mM, 0.6±0.09mM, 또는 0.9±0.14mM 오르니틴의 범위인 농도로 배지에 존재한다. 일부 실시형태에서, 배지는 또한 적어도 0.20±0.03mM 퓨트레신을 함유한다. 일부 실시형태에서, 추가의 퓨트레신은 0.20±0.03mM 내지 0.714±0.11mM, 예컨대 0.20±0.03mM, 0.35±0.06, 또는 0.714±0.11mM 퓨트레신 범위의 농도이다.
또 다른 실시형태에서, 배지는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10mM의 농도(리터당 밀리몰로 표현됨)에서 타우린으로 보충될 수 있다.
다양한 다른 보충이 배양 배지에 첨가될 수 있고, 당업자의 기술 내에 있어 추가적으로 적절한 조건을 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 보충은 본 명세서에 기재된 바와 같은 아스파라긴 보충일 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 고갈되지 않도록 하거나 요구되는 보충 영양소(즉, 벌크 공급)로서, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글리신, 라이신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 티로신 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산의 혼합물로 보충된다.
일 실시형태에서, 배지는 약 170μM 내지 175μM 뉴클레오시드로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지는 적어도 40μM, 적어도 45μM, 적어도 50μM, 적어도 55μM, 적어도 60μM, 적어도 65μM, 적어도 70μM, 적어도 75μM, 적어도 80μM, 적어도 85μM, 적어도 90μM, 적어도 95μM, 적어도 100μM, 또는 적어도 105μM의 누적 농도로 퓨린 유도체를 함유한다. 일 실시형태에서, 배지는 약 100μM 내지 110μM의 퓨린 유도체를 함유한다. 퓨린 유도체는 하이포크산틴과 뉴클레오시드 아데노신 및 구아노신을 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 적어도 30μM, 적어도 35μM, 적어도 40μM, 적어도 45μM, 적어도 50μM, 적어도 55μM, 적어도 60μM, 또는 적어도 65μM의 누적 농도로 피리미딘 유도체를 함유한다. 일 실시형태에서, 배지는 약 65μM 내지 75μM의 피리미딘 유도체를 함유한다. 피리미딘 유도체는 뉴클레오시드 티미딘, 우리딘 및 시티딘을 포함한다. 하나의 특정 실시형태에서, 배지는 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 티미딘 및 하이포크산틴을 함유한다.
임의의 상기 첨가제의 포함에 부가하여, 일 실시형태에서, 배지는 마이크로몰량의 지방산(또는 지방산 유도체) 및 토코페롤로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 지방산은 리놀레산, 리놀렌산, 티옥트산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 아라키돈산, 라우르산, 베헨산, 데칸산, 도데칸산, 헥산산, 리그노세르산, 미리스트산 및 옥탄산 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 토코페롤, 리놀레산 및 티옥트산을 함유한다.
일 실시형태에서, 배지는 또한 적어도 약 700μM 또는 적어도 약 2mM의 누적 농도에서 다른 영양소 및 필수 영양소를 포함하는 비타민의 혼합물로 추가로 보충될 수 있다. 일 실시형태에서, 비타민의 혼합물은 D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 나이아신아미드, 피리독신 HCl, D-판토텐산(hemiCa), 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12 등 중 하나 이상을 함유한다. 일 실시형태에서, 비타민의 혼합물은 D-비오틴, 염화콜린, 엽산, 미오-이노시톨, 나이아신아미드, 피리독신 HCl, D-판토텐산(hemiCa), 리보플라빈, 티아민 HCl 및 비타민 B12를 모두 포함한다.
특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 화학적으로 정의될 수 있고, 본 명세서에서 논의된 바와 같은 아미노산 혼합물, CaCl2 2H2O; KCl; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 또는 기타 인산염; 피루베이트; D-비오틴; 염화콜린; 엽산; 미오-이노시톨; 나이아신아미드; 피리독신 HCl; D-판토텐산; 리보플라빈; 티아민 HCl; 비타민 B12; ρ-아미노벤조산; 에탄올아민 HCl; 폴록사머 188; DL-a-토코페롤 포스페이트; 리놀레산; Na2SeO3; 티옥트산; 하나 이상의 완충액, 및 글루코스; 및 선택적으로 아데노신; 구아노신; 시티딘; 우리딘; 티미딘; 및 하이포크산틴 2Na를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 개시내용의 배지의 시작 오스몰농도는 200-500, 250-400, 275-350, 또는 약 300mOsm이다. 개시내용의 배지에서 세포의 성장 동안, 그리고 특히 유가식 프로토콜에 따른 임의의 공급 후에, 배양물의 오스몰농도는 약 350, 400, 450, 500까지 또는 약 550mOsm까지 증가할 수 있다.
배지의 오스몰농도가 약 300 미만인 일부 실시형태에서, 오스몰농도는 특정된 양을 초과하는 하나 이상의 염의 첨가로 약 300으로 조정될 수 있다. 일 실시형태에서, 오스몰농도는 염화나트륨, 염화칼륨, 마그네슘 염, 칼슘 염, 아미노산 염, 지방산의 염, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 염인 킬레이트제, 당(예를 들어, 갈락토스, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 푸코스 등), 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 삼투질을 추가함에 의해 원하는 수준으로 증가된다. 일 실시형태에서, 삼투질은 정의된 배지에 이미 존재하는 성분의 그 농도를 넘어 그 초과로 첨가된다(예를 들어, 당은 당 성분에 대해 특정된 농도를 넘어 그 초과로 첨가된다).
세포 배양
개시내용의 일 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같이 아스파라긴 보충으로 배양된 관심있는 재조합 단백질을 발현하는 세포주를 포함하는 세포 배양을 제공한다. 재조합 단백질을 생산하는데 일상적으로 사용되는 세포주의 예는 특히 1차 세포, BSC 세포, HeLa 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, 3T3 세포, 293 세포, Per.C6 세포 및 닭 배아 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포주는 CHO 세포주 또는 대규모 단백질 생산에 최적화된 여러 특정 CHO 세포 변이체 중 하나 이상, 예를 들어 CHO-K1이다.
개시내용의 또 다른 양태는 본 명세서에 기술된 바와 같이 아스파라긴 보충을 사용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이며, 여기서 이러한 아스파라긴 보충의 사용은 진핵 세포의 성장을 향상시키면서, 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여, 그러한 세포에 의해 관심있는 하나 이상의 재조합 단백질의 역가를 개선하고, 특히 초기 유가식 세포 배양 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 사용함에 의해 세포 생존력을 유지한다.
일부 양태에서, 재조합 단백질 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 성장한 세포에 비해 개선된다. 일부 실시형태에서, 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 성장한 세포 배양으로부터 생성된 단백질 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포로부터의 단백질 역가(수율)보다 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22% 초과, 적어도 약 23% 초과, 적어도 약 24% 초과, 적어도 약 25% 초과, 적어도 약 26% 초과, 적어도 약 27% 초과, 적어도 약 28% 초과, 또는 적어도 약 29% 초과이다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충을 갖는 세포 배양으로부터 생성된 단백질 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 유사하거나 동일한 세포의 것보다 더 크다.
일부 양태에서, 세포 성장(예를 들어, 배가율), 생존 세포 밀도, 세포 생존율 및 이의 조합은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 성장한 세포에 비해 개선된다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 생존 세포의 배가율은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포의 배가율보다 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20% , 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 적어도 3-배수 더 크다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 생존 세포의 배가율은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 생존 세포의 배가율보다 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% 또는 30% 더 크다.
일부 실시형태에서, 능동적으로 순환하는 포유동물 세포의 배가 시간은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포에 비하여 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양될 때 30시간 미만, 29시간 미만, 28시간 미만, 27시간 미만, 26시간 미만, 25시간 미만, 24시간 미만, 23시간 미만, 22시간 미만, 21시간 미만, 20시간 미만, 19시간 미만, 또는 18시간 미만이다. 일부 실시형태에서, 능동적으로 성장하는 포유동물 세포의 배가 시간은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포에 비하여 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양될 때 28시간 미만이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포의 배가 시간은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포에 비하여 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양될 때 약 27±1시간, 약 26±1시간, 약 25±1시간, 약 24±1시간, 약 23±1시간, 약 22±1시간, 또는 약 21±1시간이다. 일부 실시형태에서, 능동적으로 순환하는 포유동물 세포의 배가 시간은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포에 비하여 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양될 때 약 24±1시간이다. 일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양될 때 능동적으로 분열하는 세포의 배가 시간은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 능동적으로 순환하는 세포의 배가 시간보다 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 또는 적어도 25% 더 짧다.
세포 생존력에 관하여, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 세포는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포의 생존율보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도, 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 또는 적어도 3-배수 더 큰 생존율을 나타낸다.
생산 배양 용기 또는 생물반응기에서, 기초 배양 배지 및 세포는 종자 배양 또는 성장 단계 후에 배양 용기에 공급된다. 특정 실시형태에서, 세포 상등액 또는 세포 용리물은 생산 배양 후에 수확된다. 다른 실시형태에서, 관심있는 폴리펩티드 또는 단백질은 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여, 배양 배지 또는 세포 용리물로부터, 또는 경우에 따라 관심있는 단백질의 위치에 의존하여 회수된다.
"세포주"는 세포의 일련의 계대 또는 이차배양을 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 지칭한다. 용어 "세포"는 "세포 모집단"과 상호교환적으로 사용된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 비-인간 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 세포 융합체 예컨대, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 진핵생물의 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, 예를 들어 Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포 및 앞서 언급한 세포에서 유래된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어 PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
재조합 단백질 생산 단계에서 "유가식 세포 배양" 또는 "유가식 배양"은 동물 세포와 배양 배지가 초기에 배양하는 용기에 공급되고 추가 배양 영양분이 배양의 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수확이 있거나 없이 배양하는 동안 배양에 연속적으로 또는 별도의 증분으로 천천히 공급되는 배치 배양을 지칭한다. 유가식 배양은 주기적으로 전체 배양(세포 및 배지를 포함할 수 있음)을 제거하고 새로운 배지로 대체하는 "반-연속 유가식 배양"을 포함한다. 유가식 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분(동물 세포 및 모든 배양 영양분 포함)이 배치 배양에서 배양하는 공정의 시작 시 배양하는 용기에 공급되는 단순 "배치 배양"과 구별된다. 유가식 배양은 공정 동안 배양하는 용기에서 상등액이 제거되지 않는다는 점에서 관류 배양과 더 구별될 수 있는 반면, 관류 배양에서는 세포가 예를 들어 여과에 의해 배양에 구속되고 배양 배지가 지속적으로 또는 간헐적으로 배양 용기에 도입되고 이로부터 제거된다. 그러나, 유가식 세포 배양 동안 시험 목적을 위한 샘플의 제거가 고려된다. 유가식 공정은 최대 작업 부피 및/또는 단백질 생산에 도달했다고 결정될 때까지 계속된다.
본 명세서에서 사용될 때 "연속 세포 배양"이라는 어구는 일반적으로 특정 성장 단계에서 세포를 연속적으로 성장시키는데 사용되는 기술에 관한 것이다. 예를 들어, 세포의 지속적인 공급이 필요하거나 관심있는 특정 폴리펩티드 또는 단백질의 생산이 필요한 경우, 세포 배양은 성장의 특정 단계에서 유지관리를 요할 수 있다. 따라서 그 특정 단계에서 세포를 유지하기 위해서는 조건을 지속적으로 모니터링하고 적절하게 조정해야 한다.
개시내용의 일 양태는 단백질이 생산되고 수확되는 유가식, 생산 세포 배양에 관한 것이다. 생산 단계 이전에 전형적으로 세포를 배양하기 위한 모든 성분이 배양 공정의 시작 시 배양하는 용기에 공급된 다음 생산 규모로 준비가 될 때까지 세포 모집단이 확장되는 성장 단계(종자 트레인 또는 종자 배양으로도 공지됨)가 있다. 이와 같이, 배양하는 용기에는 시작하는 세포주에 따라 초기 세포 성장 단계에 대해 적합한 파종 밀도에서의 세포가 접종된다. 일부 양태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충은 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 유가식 생산 세포 배양으로 사용될 수 있다.
배양하는 용기는 웰 플레이트, T-플라스크, 진탕 플라스크, 교반 용기, 스피너 플라스크, 중공 섬유, 에어 리프트 생물반응기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 세포 배양하는 용기는 생물반응기이다. 생물반응기는 환경 조건을 조작하거나 제어하도록 제작 또는 조작된 임의의 배양하는 용기를 지칭한다. 이러한 배양하는 용기는 당업계에 잘 알려져 있다.
생물반응기 공정 및 시스템은 가스 교환을 최적화하고, 세포 성장 및 생산성을 유지하기 위해 충분한 산소를 공급하고, CO2를 제거하기 위해 개발되었다. 가스 교환의 효율성을 유지하는 것은 세포 배양 및 단백질 생산의 성공적인 확장을 보장하기 위한 중요한 기준이다. 이러한 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, 배지는 유가식 공정에 따라 세포 배양 동안 간격을 두고 보충된다. 유가식 배양은 일반적으로 당업계에 공지되어 있고 단백질 생산을 최적화하기 위해 이용된다(Y. M. Huang 등, Biotechnol Prog. 2010 September-October; 26(5): 1400-10 참조). 유가식 공정은 전형적으로 생산 단계 동안 사용된다.
보충의 공급은 생산 배양의 기간 동안 매일 또는 2-3일 마다의 빈도에서의 간격으로 비타민, 아미노산 및 상기 본 명세서에 기술된 다른 영양소와 같은 추가 영양소를 포함하도록 수행될 수 있다. 2주 이상 배양을 위하여 생산 배양의 기간에 걸쳐서 적어도 2회, 또는 적어도 8회의 보충된 공급(영양소를 함유한 보충된 배지 첨가)이 수행될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 보충의 공급은 배양의 기간 동안 매일 수행될 수 있다. 대안적인 배양 공급 일정도 구상된다.
추가의 아미노산 영양보충이 또한 비-고갈된 배지를 제공하기 위해 수행될 수 있으며, 여기서 고갈된 아미노산은 당업계에 공지되고 본 명세서에 기술된 방법에 따라 결정된다. 이 요법을 이용하는 경우, 추가 아미노산이 아미노산 고갈의 결정에 따라 생산 배양의 기간 동안 간격을 두고, 바람직하게는 매일 또는 2-3일마다의 빈도로 보충되거나 추가된다. 일 실시형태에서, 비-고갈된 세포 배양 배지를 유지하기 위한 추가 아미노산의 혼합물을 2주 이상의 배양을 위해 대략 1일차, 대략 2일차, 대략 3일차, 대략 4일차, 대략 5일차, 대략 6일차, 대략 7일차, 대략 8일차, 대략 9일차, 대략 10일차, 대략 11일차, 대략 12일차, 대략 13일차, 및 대략 14일차에 배양에 첨가한다. 대안적인 배양 공급 일정도 구상된다.
CHO 세포와 같은 진핵 세포는 약 25mL의 배지를 갖는 125ml 용기, 약 50 내지 100mL의 배지를 갖는 250mL 용기, 약 150 내지 240mL의 배지를 갖는 250mL 용기, 약 100 내지 200mL의 배지를 갖는 500mL 용기와 같은 소규모 배양에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 배양은 예를 들어 약 300 내지 1000mL의 배지를 갖는 1000mL 용기, 약 500mL 내지 3000mL의 배지를 갖는 3000mL 용기, 약 2000mL 내지 8000mL의 배지를 갖는 8000mL 용기 및 약 4000mL 내지 15000mL의 배지를 갖는 15000mL 용기와 같은 대규모일 수 있다. 제조용 배양은 10,000L 이상의 배지를 함유할 수 있다. 단백질 치료제의 임상 제조를 위한 것과 같은 대규모 세포 배양은 전형적으로 세포가 원하는 단백질(들)을 생산하는 동안 며칠 또는 심지어 몇 주 동안 유지된다. 이 시간 동안 배양은 배양의 과정 동안 소비되는 영양분 및 아미노산과 같은 성분을 함유하는 농축된 공급 배지로 보충될 수 있다. 농축된 공급 배지는 임의의 세포 배양 배지 제형을 기반으로 할 수 있다. 이러한 농축된 공급 배지는, 예를 들어, 그 정상적인 유용한 양의 약 5Х, 6Х, 7Х, 8Х, 9Х, 10Х, 12Х, 14Х, 16Х, 20Х, 30Х, 50Х, 100Х, 200Х, 400Х, 600Х, 800Х, 또는 심지어 약 1000Х에서 세포 배양 배지의 대부분의 성분을 함유할 수 있다. 농축된 공급 배지는 종종 유가식 배양 공정에 사용된다.
일부 실시형태에서, 세포 배양은 세포 성장 또는 단백질 생산의 과정 동안 첨가물, 사용 지점 성분 또는 사용 지점 화학물질로도 알려진 "사용 지점 첨가물"로 추가로 보충될 수 있다. 사용 지점 첨가물은 성장 인자 또는 기타 단백질, 완충액, 에너지원, 염, 아미노산, 금속 및 킬레이트제 중 하나 이상을 포함한다. 다른 단백질은 트랜스페린과 알부민을 포함한다. 사이토카인 및 케모카인을 포함하는 성장 인자는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고 세포 성장 또는 일부 경우에 세포 분화를 자극하는 것으로 알려져 있다. 성장 인자는 일반적으로 단백질(예를 들어 인슐린), 작은 펩티드 또는 스테로이드 호르몬, 예컨대 에스트로겐, DHEA, 테스토스테론 등이다. 일부 경우에, 성장 인자는, 예를 들어, 테트라하이드로폴레이트(THF), 메토트렉세이트 등과 같이 세포 증식 또는 단백질 생산을 촉진하는 비-천연 화학물질일 수 있다. 단백질 및 펩티드 성장 인자의 비-제한적 예는 안지오포이에틴, 골 형성 단백질(BMP), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경교 세포주-유래된 신경영양 인자(GDNF), 과립구 집락-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 집락-자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암-유래된 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 이동-자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 기타 뉴로트로핀, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), wnt 시그널링 경로 작용제, 태반 성장 인자(PIGF), 태아 소 소마토트로핀(FBS), 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 사용 지점 부가 성장 인자 인슐린으로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지 내 인슐린의 농도, 즉 첨가 후 세포 배양 배지 내 인슐린의 양은 약 0.1μM 내지 10μM이다.
완충액은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 발명은 임의의 특정 완충액 또는 완충액들에 제한되지 않고, 당업자는 특정 단백질을 생산하는 특정 세포주로 사용하기 위한 적절한 완충액 또는 완충액 시스템을 선택할 수 있다. 일 실시형태에서, 사용 지점 첨가 완충액은 NaHCO3이다. 또 다른 실시형태에서, 완충액은 HEPES이다. 다른 실시형태에서, 사용 지점 첨가 완충액은 NaHCO3 및 HEPES 둘 모두를 포함한다.
세포 배양에서 사용 지점 추가로 사용하기 위한 에너지원도 당업계에 잘 알려져 있다. 제한 없이, 일 실시형태에서, 사용 지점 추가 에너지원은 글루코스이다. 특정 세포주 및 생성될 단백질의 특별하고 특정한 요건이 주어지면, 일 실시형태에서 글루코스는 배지에서 약 1 내지 20mM의 농도로 첨가될 수 있다. 일부 경우에 글루코스는 20g/L 이상의 높은 수준으로 첨가될 수 있다.
킬레이트제는 마찬가지로 세포 배양 및 단백질 생산의 분야에서 잘 알려져 있다. 테트라나트륨 EDTA 탈수화물 및 시트레이트는 당업계에서 사용되는 2개의 일반적인 킬레이트제이지만, 본 발명의 실시에 다른 킬레이트제가 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 사용 지점 부가 킬레이트제는 테트라나트륨 EDTA 이수화물이다. 일 실시형태에서, 사용 지점 부가 킬레이트제는 Na3C6H5O7과 같은 시트레이트이다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 예를 들어 글루타민과 같은 에너지원으로서 하나 이상의 사용 지점 부가 아미노산으로 추가로 보충될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1mM 내지 13mM의 최종 농도로 사용 지점 부가 글루타민으로 보충된다.
다른 사용 지점 부가는 철, 니켈, 아연 및 구리의 염과 같은 하나 이상의 다양한 금속 염을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 황산구리, 황산아연, 염화제이철 및 황산니켈 중 임의의 하나 이상으로 보충된다.
단백질 생산
특정 양태에서, 본 개시내용은 진핵 세포를 배양함에 의해 재조합 단백질의 생산에서 재조합 단백질 역가를 개선하는 것을 포함하는 세포 배양 성능을 개선하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 진핵 세포는 재조합 단백질을 인코딩하는 안정적으로 통합된 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 개시내용의 방법은 개선된 세포 성장(예를 들어, 배가율), 생존 세포 밀도, 세포 생존력 및 이들의 조합을 제공한다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 방법은 개시내용의 아스파라긴 보충을 제공하는 단계; 아스파라긴 보충에서 진핵 세포를 배양하는 단계; 진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현하는 단계, 및 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충 또는 비-아스파라긴 영양보충으로 배양된 유사하거나 동일한 진핵 세포에 비하여, 아스파라긴 보충에서 배양된 진핵 세포로부터 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 세포로부터의 배양 배지 리터당 단백질 생성물의 그램으로 표현될 수 있는 단백질 생산 수율 또는 역가는 적어도 100mg/L, 적어도 1g/L, 적어도 1.2g/L, 적어도 1.4g/L, 적어도 1.6g/L, 적어도 1.8g/L, 적어도 2g/L, 적어도 2.5g/L, 적어도 3g/L, at least, 3.5g/L, 적어도 4g/L, 적어도 4.5g/L, 적어도 5g/L, 적어도 5.5g/L, 적어도 6g/L, 적어도 6.5g/L, 적어도 7g/L, 적어도 7.5g/L, 적어도 8g/L, 적어도 8.5g/L, 적어도 9g/L, 적어도 9.5g/L, 적어도 10g/L, 적어도 15g/L, 또는 적어도 20g/L이다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 세포로부터 생산된 단백질 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충 또는 비-아스파라긴 영양보충으로 배양된 유사하거나 동일한 세포로부터의 단백질 역가(수율)보다 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23% 초과, 적어도 약 24% 초과, 적어도 약 25% 초과, 적어도 약 26% 초과, 적어도 약 27% 초과, 적어도 약 28% 초과, 또는 적어도 약 29% 초과이다.
일부 실시형태에서, 개시내용의 아스파라긴 보충으로 배양된 포유동물 세포에 의한 단백질의 역가(수율)는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충 또는 비-아스파라긴 영양보충으로 배양된 유사하거나 동일한 세포에 의한 단백질의 역가보다 적어도 100mg/L, 적어도 0.5g/L, 적어도 1g/L, 적어도 1.2g/L, 적어도 1.4g/L, 적어도 1.6g/L, 적어도 1.8g/L, 적어도 2g/L, 적어도 2.5g/L 더 크다.
개시내용의 방법은 세포 배양 공정을 통한 단백질 생산을 개선하는데 유용하다. 발명에 사용된 세포주는 상업적 또는 과학적 관심있는 재조합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 세포주를 유전적으로 조작하는 것은 숙주 세포가 원하는 재조합 폴리펩티드를 발현하도록 하기 위해 재조합 폴리뉴클레오티드 분자로 세포를 형질감염, 형질전환 또는 형질도입하는 것, 또는 그렇지 않으면 변형하는 것(예를 들어, 동종 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포의 비-재조합 세포로의 융합에 의함)을 포함한다. 관심있는 폴리펩티드를 발현하기 위해 세포 또는 세포주를 유전적으로 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며; 예를 들어, 분자 생물학의 현행 프로토콜에 다양한 기술이 예시되어 있다. Ausubel 등, eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, 및 분기별 업데이트); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69. 배양에서 성장에 적합한 아주 다양한 세포주가 American Type Culture Collection(버지니아주 매너서스 소재) 및 상업적 판매자로부터 이용가능하다.
일부 실시형태에서, 단백질 생성물(관심있는 단백질)은 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체 또는 이의 조합이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-프로그램된 세포 사멸 1 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0203579A1에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-프로그램된 세포 사멸 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0203580A1에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-DII4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,402,898에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 번호 9,018,356에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래된 성장 인자 수용체 항체(예를 들어 미국 특허 번호 9,265,827에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(예를 들어 미국 특허 번호 9,302,015에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0313194A1에 기재된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어 미국 특허 번호 9,132,192에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0259423A1에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로단백질 전환효소 서브틸리신 Kexin-9 항체(예를 들어 미국 특허 번호 8,062,640 또는 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0044730A1에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(예를 들어 미국 특허 번호 8,871,209 또는 9,260,515에 기재된 바와 같은 항-미오스타틴 항체로도 알려진 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0337045A1 또는 US2016/0075778A1에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271681A1 또는 미국 특허 번호 8,735,095 또는 8,945,559에 기재된 바와 같은 항-IL4R 항체). 항-인터루킨 6 수용체 항체(예를 들어 미국 특허 번호 7,582,298, 8,043,617 또는 9,173,880에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271658A1 또는 US2014/0271642A1에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 분화 3의 항-클러스터(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1, 및 미국 출원 번호 62/222,605에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 분화 20의 항-클러스터(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1, 및 미국 특허 번호 7,879,984에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 분화-48의 항-클러스터(예를 들어 미국 특허 번호 9,228,014에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어 미국 특허 번호 9,079,948에 기재된 바와 같음), 항-인플루엔자 바이러스 항체, 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271653A1에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0337029A1에 기재된 바와 같은 항-MERS-CoV 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0215040에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 항체(예를 들어 항-SARS-CoV 항체, 항-COVID-19 항체(예를 들어 항-SARS-CoV-2 항체), 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(예를 들어 미국 특허 공개 번호 US2016/0017029 및 미국 특허 번호 8,309,088 및 9,353,176에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3×항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1에 기재된 바와 같음), 항-CD3×항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3×항-Muc 16 이중특이적 항체), 및 항-CD3×항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3×항-PSMA 이중특이적 항체)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 관심있는 단백질은 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심있는 단백질은 항-인플루엔자 바이러스 항체, 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2014/0271653A1에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0337029A1에 기재된 바와 같은 항-MERS-CoV 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 US2016/0215040에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 항체(예를 들어 항-SARS-CoV 항체, 항-COVID-19 항체(예를 들어, 항-SARS-CoV-2 항체)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 관심있는 단백질은 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심있는 단백질은 알리로쿠맙, 사릴루맙, 파시누맙, 네스바쿠맙, 두필루맙, 트레보그루맙, 에비나쿠맙 및 리누쿠맙으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 관심있는 단백질은 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심있는 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인을 함유하는 재조합 단백질(예를 들어, Fc-융합 단백질)이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 함유하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 IgG의 CH2 및 CH3 도메인이 뒤따르는 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다중 리간드에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 함유한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 II-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 함유하는 릴로나셉트; 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된, 미국 특허 번호 6,927,004호 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 함유하는 애플리버셉트 또는 지브-애플리버셉트; 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159 참조)이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이며, 이는 Fc 모이어티에 커플링된 항체의 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편과 같은 하나 이상의 항원-결합 도메인(들) 중 하나 이상을 함유한다.
다시, 본 개시내용은 재조합 단백질 생산을 위한 임의의 특정 유형의 세포로 제한되지 않는다. 재조합 단백질 생산에 적합한 세포 유형의 예는 포유동물 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 박테리아 세포 및 효모 세포를 포함한다. 세포는 줄기세포 또는 재조합 유전자 발현을 위한 벡터로 형질전환된 재조합 세포, 또는 바이러스 생성물을 생산하기 위해 바이러스로 형질감염된 세포일 수 있다. 세포는 관심있는 단백질을 인코딩하는 재조합 이종 폴리뉴클레오티드 작제물을 함유할 수 있다. 그 작제물은 에피솜일 수 있거나 세포의 게놈 안으로 물리적으로 통합되는 요소일 수 있다. 세포는 또한 이종 폴리펩티드 작제물 상에 인코딩된 그 단백질을 갖지 않는 관심있는 단백질을 생산할 수 있다. 즉, 세포는 항체를 생산하는 B-세포와 같은 관심있는 단백질을 자연적으로 인코딩할 수 있다. 세포는 또한 닭 배아 세포 또는 1차 세포주와 같은 1차 세포일 수 있다.
유용한 세포의 예는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포주는 CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, 또는 CHO Iec 돌연변이주와 같은 CHO 세포 유도체이다.
생산 단계는 셰이커 플라스크 또는 웨이브 백에서 250mL 생물반응기, 1-리터 생물반응기 및 대규모 산업용 생물반응기까지 임의의 규모의 배양에서 수행될 수 있다. 마찬가지로, 종자 트레인 확장 단계는 셰이커 플라스크 또는 웨이브 백에서 250mL 생물반응기, 1-리터 이상의 생물반응기까지 임의의 규모의 배양에서 수행될 수 있다. 대규모 공정은 약 100 리터 내지 20,000 리터 이상의 부피에서 수행될 수 있다. 온도 전이 또는 화학적 유도와 같은 여러 수단 중 하나 이상이 단백질 생산을 제어하는데 사용될 수 있다. 성장 단계는 생산 단계보다 더 높은 온도에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35℃ 내지 38℃의 제1 온도에서 발생할 수 있고, 생성 단계는 약 29℃ 내지 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 36℃ 또는 약 30℃ 내지 34℃의 제2 온도에서 발생할 수 있다. 부가하여, 카페인, 부티레이트, 타목시펜, 에스트로겐, 테트라사이클린, 독시사이클린 및 헥사메틸렌 비스아세트아미드(HMBA)와 같은 단백질 생산의 화학적 유도제가 온도 전이와 동시에, 이전 또는 이후에 추가될 수 있다. 온도 전이 후 유도제를 추가하는 경우, 온도 전이 후 1시간에서 5일까지, 예컨대 온도 전이 후 1일에서 2일 사이에 추가될 수 있다. 생산 세포 배양은 항성분배양조(C. Altamirano 등, 2001 supra 참조)에서와 같이, 또는 유가식 공정(Huang, 2010 supra)에 따라 연속 공급 배양 시스템으로 실행될 수 있다.
본 개시내용은 발명의 개별 양태 또는 실시형태의 예시로서 의도된 본 명세서에 기술된 특정 실시형태에 의한 범주로 제한되지 않는다. 기능적으로 동등한 방법 및 구성요소는 발명의 범주 내에 있다. 본 명세서에 기술된 것 이외에 발명의 다양한 변형은 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백하다. 이러한 변형은 발명의 범주 내에 속한다.
본 개시내용 전반에 걸쳐 언급된 모든 간행물은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
실시예
다음 실시예는 예시 목적으로만 제공되고 발명의 범주를 제한하려는 의도가 아니다.
유가식 방법론
본 명세서에 기술된 바와 같이, 유가식 공급 전개는 자동화된 AMBR250, 24 방식, 병렬 생물반응기 시스템을 통해 수행된다. AMBR250 고처리량 워크스테이션은 24개 단일-사용 생물반응기의 통합된 병렬 제어를 제공한다. 보다 구체적으로, AMBR250(24 방식)은 24개 생물반응기로 구성된 완전하게 통합된 고처리량 시스템으로, 그 각각은 병렬인 세포 배양 공정을 갖는 완전하게 자동화된 제어 하에서 최대 250ml 작업 부피를 갖는다. 온도, 임펠러 속도, pH 및 용존 산소(DO), 오프-가스 분석을 포함하여 각 생물반응기 용기에 대한 개별적인 연속 제어 및 모니터링이 제공된다. 시스템은 완전히 자동화된 배지 충진, 접종, 샘플링 및 공급을 제공한다. 시스템은 임펠러, 스파저 또는 헤드스페이스 가스처리, pH 및 DO 프로브, 최대 4개의 공급 라인을 갖는 생물반응기를 사용한다.
본 개시내용의 공급 전략 전개를 수행함에 있어서, AMBR250 생물반응기(Sartorious Stedim)는 최대 250mL의 작업 부피로 가동된다. 독점의 화학적으로 정의된 기초 및 공급 배지가 사용된다. 공급 배지 및 공급하는 전략은 세포주마다 다르다. 글루코스는 매일 공급되고 수준은 목표에 따라 제어된다. 생물반응기는 세포 배양으로 접종된다. 산소는 제어에 의해 유지되고 순수 산소는 연구 동안 다양한 유속으로 스파저를 통해 추가된다. 유사하게, pH는 상위 pH 대역에 대한 CO2 살포로 제어에 의해 유지되며, 제어된 하위 대역 pH는 없다. 접종 세포 밀도, 용존 산소, 온도, pH 및 데드 밴드는 일정하게 유지된다. 공기와 산소의 교반 및 유속은 스케일에 따라 달라진다.
달리 나타내지 않는 한, 아스파라긴을 많이 소비하는 CHO 세포주 1이 예시적인 폴리펩티드 A를 발현하는 모든 실시예에서 이용된다.
세포외 아미노산 측정
본 명세서에 기재된 바와 같이, 아미노산의 세포외 수준이 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 수준은 다음 절차에 따라 측정된다. 소비된 세포 배양 배지 샘플은 Waters AccQㆍTag 방법 프로토콜 및 Waters AccQㆍTag 시약 키트(Waters, 매사추세츠주 밀포드 소재)를 사용하여 유도체화 및 준비되었다. 샘플을 10x 희석하고 유도체화 이전에 100mg/L 사르코신 내부 표준으로 스파이킹했다(Millipore Sigma, 매사추세츠주 벌링턴 소재). 유도체화된 아미노산의 분리 및 후속 측정은 AccQㆍTag Ultra C18 컬럼(1.7uM, 2.1 x 10mm)이 장착된 UPLC를 사용하여 수행되었으며, 데이터는 260nm 파장에서 수집되었다. 이동상 및 기울기는 Waters AccQㆍTag 방법 프로토콜을 따랐다.
세포내 아미노산 측정
본 명세서에 기재된 바와 같이, 아미노산의 세포내 수준이 측정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 수준은 다음 절차에 따라 측정된다. 세포는 생물반응기에서 수집되고 실온에서 원심분리되고, 상등액은 세포 펠릿에서 분리된다. 세포 펠릿을 1X PBS로 세정되고 원심분리된다. PBS를 제거하고 세포 펠릿을 액체 질소로 냉각 켄칭한다. 연구 샘플을 안정적으로 표지된 내부 표준으로 스파이킹하고 추출한 다음 유기 용매로 단백질을 침전시킨다. 원심분리 후, 상등액의 분취량을 희석하고 C18 역상 UHPLC 컬럼이 장착된 Agilent 1290/AB Sciex QTrap 5500 LC-MS/MS 시스템에 주입한다. 질량 분석계는 전자분무 이온화(ESI)를 사용하여 포지티브 모드에서 작동된다. 개별 분석물질 모 이온의 피크 면적은 슈도-MRM 모드에서 상응하는 내부 표준의 모 이온 피크 면적에 대해 측정된다. 정량화는 각 실행 직전에 준비된 강화된 보정 표준에서 생성된 가중 최소 자승 회귀 분석을 사용하여 수행된다. LC-MS/MS 미가공 데이터는 AB SCIEX 소프트웨어 Analyst 1.6.2를 사용하여 수집 및 처리된다. 데이터 축소는 Office 365 v.16용 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 수행된다.
아스파라긴 서열 변이체 분석
본 명세서에 기재된 바와 같이, 관심있는 폴리펩티드의 아스파라긴 서열 변이체가 측정될 수 있다. 그러한 서열 변이체의 임의의 적합한 측정 방법이 사용될 수 있지만, 아스파라긴 서열 변이체의 정량적 양은 다음과 같이 결정될 수 있다. ~50개 가능한 펩티드 중 3개의 펩티드에 초점을 맞춘 신속하고 민감한 LC-MS 기반 검정은 치환의 사례를 식별하고 치환의 정도의 정량적 추정치를 얻기 위한 스크리닝 도구로 사용될 수 있다. 관심있는 폴리펩티드는 적절한 정제 방법론을 사용하여 소규모로 정제될 수 있다. 관심있는 폴리펩티드는 그 다음 환원되고 변성될 수 있으며, 효소 단리가 뒤따를 수 있다. 이 방식으로, 관심있는 폴리펩티드의 트라이픽 지도가 생성될 수 있고 단백질 서열이 분석되어 예상된 서열로부터 임의의 변이가 있는지를 결정할 수 있다. HPLC 구배 기반 분리가 후속적으로 수행될 수 있고 개별 펩티드는 Q-TOF MS 시스템에 의해 분석될 수 있다. 특정 펩티드는 질량 분석법에 의해 자세히 분석될 수 있다. 펩티드 서열에서 변화가 분석될 수 있다. 예를 들어, 27 Da 전이가 아스파라긴에서 세린으로의 치환에 대해 관찰된다.
실시예 1 - 세포 배양 및 공급 전략 전개에 대한 아스파라긴 영향
유가식 세포 배양 성능 및 공급 전략은 예시적인 CHO 세포주 및 다양한 아스파라긴 영양보충을 사용하여 평가되었다. 유가식 세포 배양 성능 및 공급 전략 전개는 본 명세서에 기술된 바와 같이 AMBR250 생물반응기 시스템 및 아미노산 측정을 사용하여 수행될 수 있다.
도 3a-3c를 참조하면, 특정 양태에서, 초기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴을 증가시키면 세포 성장에서 증가를 초래하고 다른 세포 영양소 요구와 균형을 이룰 때 배양 생산성에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것이 밝혀졌다. 도 3a는 낮은, 중간 및 높은 양 보충(예를 들어, 공급당 약 1.8mM 내지 약 5.4mM 아르기닌의 범위)를 갖는 일련의 초기 유가식 아스파라긴 보충을 예시하지만, 이러한 아스파라긴 보충은 후기 유가식 아스파라긴 고갈을 방지하지 못한다. 도 3b는 아스파라긴 보충의 양이 증가함에 따라 세포 배양 성장에서 증가를 예시하는 반면, 도 3c는 일부 필수 아미노산의 고갈로 인해 고원에 도달할 때까지 아스파라긴 보충이 증가함에 따라 세포 배양 역가에서 증가를 예시한다.
도 4a-4c를 참조하면, 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴을 증가시키는 것은, 암모늄과 같은 부산물 형성을 증가시키기는 하지만, 세포 배양 생산성에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 것이 또한 밝혀졌다. 보다 구체적으로, 도 4a는 후기 공급에서 낮은 및 높은 아스파라긴 보충(공급당 약 1.8mM 내지 약 7.2mM의 범위)을 예시하지만, 이러한 아스파라긴 보충은 후기 유가식 아스파라긴 고갈을 방지하지 못한다. 전반적인 세포 배양 생산성은 부정적으로 영향을 받지 않지만(도 4c) 후기 유가식 세포 배양에서 더 높은 양의 아스파라긴 보충은 과도한 부산물 형성을 유발할 수 있으며(도 4b), 이는 더 많은 아스파라긴이 필요한 경우 세포 배양에 공급될 수 있지만 고갈은 여전히 방지하기 어렵다는 것을 시사한다.
개시내용의 실시형태에 따르면, 초기 유가식 세포 배양에서 필수 아미노산과 아스파라긴의 고갈을 방지하고, 전반적 세포 배양 성능에서 증가를 제공하는 개선된 아스파라긴 영양보충 공급 전략(즉, 초기 유가식 공급에서 3X 아스파라긴 및 후기 유가식 공급에서 1.5X 아스파라긴을 갖는 "새로운 공급 플랫폼")이 개발되었다. 도 5a-5d에 도시된 바와 같이, 초기 유가식 아스파라긴 영양보충은 초기 유가식 아스파라긴 고갈을 방지하고 세포 배양 성장을 증가시켰다. 더욱이, 도시된 바와 같이, 필수 아미노산 고갈의 제거로 세포 배양 성장에서 아스파라긴과 관련된 증가는, 연장된 생산적인 유가식 시간과 더 높은 역가를 초래함으로 세포 배양 생산성을 향상시켰다. 그러나, 후기 유가식 세포 배양에서 더 높은 아스파라긴 영양보충은 여전히 후기 유가식에서 아스파라긴 고갈을 피할 수 없다. 도 5e-5g를 참조하면, 세포 역가, 생존 세포 계수 및 세포 생존력은 모두 또 다른 예시적인 세포주에서 더 높은 아스파라긴 보충으로 개선되었다.
도 6a을 참조하면, 초기 유가식 세포 배양에서 다양한 양의 아스파라긴을 보충하는 것은 비슷한 시간에서 고갈을 초래한다. 그러나, 아스파라긴 보충량의 증가는 아스파라긴 소비율을 증가시키며(도 7 참조), 이는 세포가 아스파라긴을 효율적으로 이용하지 못하고 있음을 시사한다. 도 6b를 참조하면, 후기 유가식 세포 배양에서 증가된 아스파라긴 양을 보충하는 것은 후기 유가식 아스파라긴 고갈을 방지하지 못하며, 과도한 부산물 형성을 초래할 수 있으며, 이는 다시 세포가 아스파라긴을 효율적으로 이용하지 못하고 있음을 시사한다.
이와 관련하여, 도 7은 예시적인 높은 소비 세포주에 대한 아스파라긴 공급 전략의 범위에 걸친 아스파라긴 소비율을 예시한다. 도시된 바와 같이, 개시내용의 새로운 플랫폼 공급 전략은 이전의 공지된 플랫폼 공급 전략과 비교하여 세포 배양 기간에 걸쳐 더 적은 아스파라긴을 소비하는 유가식 세포 배양을 초래한다. 더욱이, 도시된 바와 같이, 높은 아스파라긴 공급 전략은 낮은 아스파라긴 공급 전략과 비교할 때 더 높은 아스파라긴 소비율을 초래한다. 이 데이터는 개시내용의 새로운 플랫폼 공급 전략이 아스파라긴의 가장 효율적인 사용을 제공한다는 것을 시사한다.
요약하면, 아스파라긴은 높은 소비 세포주에서 고갈되는 것으로 식별되었다. 초기 유가식 세포 배양에서 영양보충은 세포 배양 성능에 영향을 미친다. 후기 유가식 세포 배양에서 영양보충은 부산물, 예를 들어 암모늄 생산을 증가시킨다. 필수 아미노산 고갈을 방지하고 초기 유가식에서 아스파라긴 고갈을 극복하고 암모늄 영향을 최소화하는 균형 잡힌 아스파라긴 공급 전략이 증가된 세포 배양 생산성을 초래한다는 것이 예상외로 밝혀졌다.
실시예 2 - 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 관련 아미노산에 대한 아스파라긴의 영향
아스파라긴과 대사 경로를 통한 아스파라긴과 관련된 비-필수 아미노산 사이의 상호-관계는 본 명세서에 기술된 바와 같이, AMBR250 생물반응기 시스템 및 아미노산 측정을 사용하여 조사될 수 있다.
도 8을 참조하면, 아스파라긴이 필요한 경우 세포는 보충의 아스파라긴을 합성하기 위해 아스파르테이트 및 글루타메이트의 그 활용을 증가시킬 수 있다. 아스파르테이트, 글루타메이트 및 글루타민의 더 높은 세포내/세포외 농도는 세포가 세포 요구를 지원하기에 충분한 세포내 아스파라긴을 가지고 있음을 나타낼 수 있다. 그러나, 아스파르테이트, 글루타메이트, 글루타민의 농도에서의 감소는 아스파라긴 제한을 나타낼 수 있다.
도 9a-9d를 참조하면, 예시적인 높은 소비 세포주 1의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과가 예시된다. 도시된 바와 같이, 낮은 아스파라긴은 관련된 비-필수 아미노산의 세포내 프로필에 영향을 미친다(세포내 글루타메이트는 낮은 아스파라긴으로 감소한다).
도 10a-10d를 참조하면, 또 다른 예시적인 높은 소비 세포주 2의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과가 예시된다. 도시된 바와 같이, 낮은 아스파라긴은 관련된 비-필수 아미노산의 세포내 프로필에 영향을 미치지만(세포내 글루타메이트는 낮은 아스파라긴으로 감소한다), 예시적인 높은 소비 세포주 1에서 관찰되는 것보다 적은 정도로 영향을 미친다.
도 11a-11d를 참조하면, 예시적인 낮은 소비 세포주의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과가 예시된다. 도시된 바와 같이, 낮은 아스파라긴은 이 예시적인 세포주에 대한 관련된 비-필수 아미노산의 세포외 또는 세포내 프로필에 영향을 미치지 않는다(글루타메이트에 대한 세포내 프로필은 낮은 아스파라긴으로 감소하지 않는다). 도시된 바와 같이, 유가식 사이클의 말단에서 높은 수준의 세포내 아스파라긴 및 글루타메이트가 있다.
마지막으로, 도 12a-12f에 도시된 바와 같이, 높음(3X 초기 단계, 1.5X 후기 단계) 및 매우 높음(6X 초기 단계, 3X 후기 단계)의 효과로, 이는 세포외 아스파라긴에서 증가가 아스파라긴 관련 아미노산을 증가시킬 수 있지만, 역가 및 암모늄 수준에 또한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다. 도시된 바와 같이, 더 높은 수준의 보충 아스파라긴(도 12a)은 아스파라긴 관련 아미노산의 증가를 초래할 수 있지만(도 12b, 12d 및 12e), 바람직하지 않은 세포 배양 부산물에서의 결과적인 증가(즉, 도 12f, 암모늄)가 세포 배양 성능에서 저하를 초래할 수 있다(즉, 도 12c, 역가).
도 9a-9d, 도 10a-10d, 도 11a-11d, 및 도 12a-12f는 함께 상이한 아스파라긴 공급 수준에 대한 아스파라긴 관련 아미노산 프로필 및 세포 배양 성능이 세포주에 따라 달라지는 것을 예시하며, 이는 아스파라긴 공급 요건이 세포주의 특정 요구에 표적화될 수 있음을 시사한다.
요약하면, 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 농도는 특정 세포주에 대한 특정한 아스파라긴 요건을 제시한다. 보다 구체적으로, 관련된 아미노산의 세포외 및 세포내 아미노산 프로필에 대한 아스파라긴 영양보충의 영향은 세포주의 특정 요구에 표적화될 수 있다.
실시예 3 - 아스파라긴 고갈 극복
세포 배양 성능을 유지하면서 아스파라긴 고갈을 극복하도록 최적화된 개선된 아스파라긴 공급 전략 및 플랫폼이 본 명세서에 기재된 바와 같이 AMBR250 생물반응기 시스템 및 아미노산 측정을 사용하여 전개될 수 있다.
하기 표 1은 조사된 예시적인 아스파라긴 공급 전략을 예시한다.
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표 1
표 1에 나타낸 바와 같이, 표준 유가식 볼루스 아스파라긴 공급을 여러 아스파라긴 공급 전략, 즉 연속적 아스파라긴 보충 공급(볼루스 세포 배양 벌크 공급과는 별개임), 연속적 조합된 벌크 플러스 아스파라긴 공급, 및 총 아스파라긴 보충량의 2배가 세포 배양에 제공되도록, 볼루스 아스파라긴 공급과 연속적 아스파라긴 보충 공급(볼루스 세포 배양 벌크 공급과는 별개임) 둘 모두를 이용하는 혼성 공급 전략과 비교하였다.
도 13a-13d을 참조하면, 볼루스 및 연속 아스파라긴 공급은 동일한 총 아스파라긴 보충량에 대해 필적할만한 세포 배양 성능(도 13a에 예시된 생존 세포 계수, 도 13b에 예시된 배양 생산성)을 갖는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 세포 배양 부산물 형성(도 13c는 암모늄 형성을 예시하고, 도 13d는 알라닌 형성을 예시함)은 볼루스 및 연속 아스파라긴 공급에서 비교적 일정하다. 그러나, 도 13e-13g를 참조하면, 연속 아스파라긴 보충 공급은 동일한 총 아스파라긴 보충량을 갖는 볼루스 아스파라긴 보충 공급과 비교하여 세포외 아스파라긴(도 13e), 아스파르테이트(도 13f) 및 글루타메이트(도 13g) 고갈을 지연시킨다. 개시내용의 양태에 따르면, 연속적으로 공급될 때 동일한 총 아스파라긴 보충량이 아스파라긴, 아스파르테이트 및 글루타메이트의 소비율을 감소시킨다는 것이 예상외로 밝혀졌다. 이와 관련하여 필적할만한 세포 배양 성능을 갖는 개선된 아미노산 고갈 프로필은 세포 배양에 의한 보다 효율적인 아스파라긴 소비를 시사한다.
도 14a-14d을 참조하면, 연속적 대량 공급 및 표준 볼루스 영양보충을 통한 아스파라긴의 연속적 보충과 비교하여, 연속적인 독립적 아스파라긴 공급(볼루스 벌크 공급과는 별개임)을 통한 아스파라긴의 영양보충은 동일한 총 아스파라긴 보충량에 대해 세포외 아스파라긴 고갈을 방지하지 못하지만(도 14a), 세포 배양 부산물 형성을 감소시키고(도 14d) 아스파라긴 관련 대사산물의 소비율을 조절한다(도 14b 및 도 14c)는 것이 밝혀졌다. 예시된 모든 공급 전략은 필적할만한 세포 배양 성능을 갖는다.
하이브리드 공급 접근법(볼루스 아스파라긴 보충 공급과 조합된 연속적 아스파라긴 보충 공급)은 아미노산 고갈을 지연시키지만, 볼루스 아스파라긴 영양보충과 비교하여 다수의 예시적인 세포주에 걸쳐 부산물 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.
도 15a-15g을 참조하면, 첫 번째 예시적인 세포주에서, 혼성 공급 접근법이 아스파라긴 및 관련된 대사산물 고갈을 지연시키고(도 15a는 세포외 아스파라긴을 예시하고, 도 15b는 세포외 아스파르테이트를 예시하고, 도 15c는 세포외 글루타메이트를 예시함), 필적할만한 세포 배양 성능(도 15d에 예시된 생존 세포 계수, 도 15e에 예시된 배양 생산성)을 초래한 것으로 밝혀졌으나, 또한 부산물 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 15f는 암모늄 형성을 예시하고, 도 15g는 알라닌 형성을 예시한다).
도 16a-16e을 참조하면, 두 번째 예시적인 세포주에서, 혼성 공급 접근법이 아스파라긴을 지연시키는 것으로 밝혀졌지만(도 16a는 세포외 아스파라긴을 예시함), 세포 배양 생산성에서 감소를 초래했다(도 16b에 예시된 생존 세포 계수, 도 16c에 예시된 배양 생산성). 혼성 공급 접근법은 또한 부산물 형성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 16d는 암모늄 형성을 예시하고, 도 16e는 알라닌 형성을 예시한다).
요약하면, 후기 유가식에서 세포외 아스파라긴 고갈의 영향은 새로운 아스파라긴 보충 공급 전략을 식별함에 의해 다루어졌다. 연속적 아스파라긴 영양보충이 아스파라긴을 공급하기 위한 보다 효율적인 플랫폼이다는 것이 예상외로 밝혀졌다. 특히 독립적인, 별도의 아스파라긴 공급으로 연속적 아스파라긴 보충은 아스파라긴 및 관련된 대사산물의 소비율을 감소시킨다.
실시예 4 - 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 서열 변이체를 완화하고 제어하는 것 및 아스파라긴 서열 변이체의 대용 마커로서 아스파라긴 관련 아미노산의 사용
아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 보충의 사용 및 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체에 대한 대용 마커로서 아스파라긴 관련 아미노산의 사용은 본 명세서에 기재된 바와 같이 AMBR250 생물반응기 시스템 및 아미노산 측정을 사용하여 조사될 수 있다.
예시적인 높은 소비 세포주 2의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 도 10a-10d를 다시 참조하면, 아스파라긴 서열 변이체는 유가 배치 세포 배양의 마지막 날에 질량 분석에 의해 분석되었다. 낮은 아스파라긴 보충 세포 배양은 0.30% 아스파라긴 서열 변이체가 존재하는 것으로 밝혀졌고, 높은 아스파라긴 보충 세포 배양은 0.24% 아스파라긴 서열 변이체가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들 SV 값은 상대적으로 낮고, 도 10d에 예시된 바와 같이 세포 배양에서 관찰되는 더 높은 수준의 세포내 글루타메이트와 일치한다.
유사하게, 예시적인 낮은 소비 세포주의 후기 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 수준의 효과를 예시하는 도 11a-11d를 참조하면, 아스파라긴 서열 변이체는 유가 배치 세포 배양의 마지막 날에 질량 분석에 의해 분석되었다. 낮은 아스파라긴 보충 세포 배양은 0.11% 아스파라긴 서열 변이체가 존재하는 것으로 밝혀졌고, 높은 아스파라긴 보충 세포 배양은 0.04% 아스파라긴 서열 변이체가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 다시, 이들 SV 값은 상대적으로 낮고, 도 11d에 예시된 바와 같이 세포 배양에서 관찰되는 더 높은 수준의 세포내 글루타메이트와 일치한다.
도 17a-17b를 참조하면, 초기 단계 유가식에서 세포외 아스파라긴 고갈이 Asn→Ser, 아스파라긴 서열 변이체 형성의 지표일 수 있음이 밝혀졌다. 도 17a에 도시된 바와 같이, (예를 들어, 공급 2를 통해) 초기 단계 세포 배양의 적어도 4일차까지 0.1mM(15mg/L)의 고갈 한계 초과로 세포외 아스파라긴 수준을 유지하는 높은 아스파라긴 공급 전략(3X 초기 단계 @ 10.8mM, 1.5X 후기 단계)은 약 0.20% SV 아래의 수준으로 아스파라긴 서열 변이체의 형성을 완화할 수 있다(도 17b).
도 18a을 참조하면, 후기 공급에서 더 낮은 아스파라긴 수준은 특히 최고 생존 세포 농도 후에 Asn→Ser, 아스파라긴 서열 변이체를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 도 18a에 도시된 실험에서, 초기 공급에서 아스파라긴 수준은 동일하였다. 도 18b는 낮은 아스파라긴 후기 공급 전략과 비교하여 높은 아스파라긴 후기 공급 전략에 대한 세포내 글루타메이트(Glu) 수준을 예시한다. 더욱이, 세포 배양 배지에 대한 Gln의 첨가가 아스파라긴 서열 변이체의 형성을 추가로 완화시킨다는 것이 예상외로 밝혀졌다(도 18c).
도시된 바와 같이, 세포내 글루타메이트 농도는 아스파라긴 서열 변이체의 존재와 반비례 관계에 있다. 더 높은 세포내 글루타메이트 수준은 아스파라긴 서열 변이체의 더 낮은 발생을 갖는 세포 배양에서 발견되고, 더 낮은 세포내 글루타메이트 수준은 아스파라긴 서열 변이체의 더 높은 발생을 갖는 세포 배양에서 발견된다. 이러한 방식으로, 세포내 글루타메이트는 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체 양의 대용 마커로서 사용될 수 있다.
도 19a-19g는 예시적인 세포주 1에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 상관관계를 예시한다. 도 19b-19d는 세포외 아스파라긴(도 19b), 아스파르테이트(도 19c) 및 글루타메이트(도 19d)를 예시하는 반면, 도 19e-19g는 예시적인 세포내 아스파라긴(도 19e), 아스파르테이트(도 19f) 및 글루타메이트(도 19g)를 예시한다. 도 19g는 후기 단계 유가식 세포내 글루타메이트(Glu)가 도 19a의 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략을 사용하여 생산된 폴리펩티드에 대한 아스파라긴 서열 변이체의 대용 마커로서 작용할 수 있음을 예시한다. 도시된 바와 같이, 높은 아스파라긴 보충 공급은 높은 후기 단계 유가식 세포내 글루타메이트 및 낮은 아스파라긴 서열 변이체를 초래한다. 낮은 아스파라긴 보충 공급은 낮은 후기 단계 세포내 글루타메이트 및 더 높은 아스파라긴 서열 변이체를 초래한다. 대용 세포내 글루타메이트 측정은 질량 분석 아스파라긴 서열 변이체 분석과 일치한다. 그러나, 이 특정 세포주에 대한 세포외 또는 세포내 아스파라긴 또는 아스파르테이트, 또는 세포외 글루타메이트에 관한 명확한 추세는 없다.
도 20a-20d는 또 다른 예시적인 세포주(높은 소비 세포주)에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 유사한 상관관계를 예시한다. 도 20b-20d는 세포외 아스파라긴(도 20b), 세포내 아스파르테이트(도 20c) 및 세포내 글루타메이트(도 20d)를 예시한다. 도 20c 및 20d는 후기 단계 유가식 세포내 아스파르테이트 및 세포내 글루타메이트 둘 모두가 도 20a의 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략을 사용하여 생산된 폴리펩티드에 대한 아스파라긴 서열 변이체의 대용 마커로서 작용할 수 있음을 예시한다. 도시된 바와 같이, 높은 아스파라긴 보충 공급은 높은 후기 단계 유가식 세포내 아스파르테이트 및 높은 후기 단계 유가식 세포내 글루타메이트, 및 낮은 아스파라긴 서열 변이체를 초래한다. 낮은 아스파라긴 보충 공급은 낮은 후기 단계 유가식 세포내 아스파르테이트 및 낮은 후기 단계 유가식 세포내 글루타메이트, 및 더 높은 아스파라긴 서열 변이체를 초래한다. 대용 세포내 아스파르테이트 및 세포내 글루타메이트 측정은 질량 분석 아스파라긴 서열 변이체 분석과 일치한다.
도 21a-21f는 예시적인 세포주 1에 대한 아스파라긴 서열 변이체 경향이 세포내 글루타메이트 경향과 일치함을 예시하며, 이는 세포내 아스파라긴 관련 아미노산이 아스파라긴 서열 변이체의 대용으로 사용될 수 있음을 도시한다. 도 21a 및 21c는 높은 아스파라긴 초기 공급 전략을 예시한다(도 21a, 질량 분석에 의해 결정된 서열 변이체 양, 도 21c, 세포내 글루타메이트의 농도). 도 21b 및 21d는 낮은 아스파라긴 초기 공급 전략을 예시한다(도 21b, 질량 분석에 의해 결정된 서열 변이체 양, 도 21d, 세포내 글루타메이트의 농도). 도 21e는 아스파라긴 서열 변이체의 더 높은 발생 및 더 낮은 발생과 상관관계가 있는 예시적인 세포주 4에 대한 세포내 글루타메이트 수준을 도시하며, 도 21f는 또 다른 예시적인 세포주 5에 대한 유사한 세포내 글루타메이트 프로필을 도시한다.
도 22a-22h는 예시적인 세포주에 대한 아스파라긴, 아스파라긴 관련 아미노산 및 아스파라긴 서열 변이체 사이의 상관관계를 예시한다. 도 22a-22d는 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략에 대한 예시적인 세포주 1에 대한 세포외 아스파라긴(도 22a), 세포외 아스파르테이트(도 22b), 세포외 글루타메이트(도 22c) 및 세포외 글루타민(도 22d)을 예시한다. 도시된 바와 같이, 세포외 아스파라긴, 아스파르테이트, 또는 글루타메이트 및 아스파라긴 서열 변이체 형성에 대해 관찰된 명확한 경향은 없다. 그러나, 후기 단계 유가식 세포외 글루타민과 아스파라긴 서열 변이체 형성 사이에는 상관관계가 있다(특히 초기 단계 유가식 세포 배양에서 고갈 한계 초과의 아스파라긴의 영양보충을 가정함). 유사한 경향이 높은 및 낮은 아스파라긴 공급 전략에 대한 세포외 아스파라긴(도 22e), 세포외 아스파르테이트(도 22f), 세포외 글루타메이트(도 22g) 및 세포외 글루타민(도 22h)을 예시하는, 예시적인 세포주 4에 대한 도 22e-22h에 도시되어 있다.
도 23a-23c는 세포외 글루타민이 후기 단계 유가식 세포 배양에서 아스파라긴 서열 변이체의 대용으로서 작용할 수 있음을 추가로 예시한다. 도 23a는 예시적인 세포주 1에서 높은 아스파라긴 공급 전략(예를 들어, 글루타민 고갈 한계 초과)을 통해 충분한 글루타민이 생산될 수 있음을 도시한다. 유사하게, 도 23b는 예시적인 세포주 1에서 높은 아스파라긴 공급 전략을 통해 충분한 글루타민이 생산될 수 있음을 나타내며, 이는 아스파라긴 서열 변이체가 질량 분석에 의해 검출되지 않은 실시형태와 상관관계가 있다. 그리고 마지막으로, 도 23c는 6일차 및 8일차에 아스파라긴이 보충되지 않은 경우 아스파라긴 서열 변이체가 검출되고 세포외 글루타민이 고갈 한계 미만으로 떨어진다는 것을 나타낸다(즉, 아스파라긴 공급 전략을 통해 불충분한 글루타민이 생산됨). 그러나, 높은 아스파라긴 공급 전략을 통해 충분한 글루타민이 생산되는 경우, 세포외 글루타민은 아스파라긴 서열 변이체 형성과 관련이 있다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 표시된 것처럼 본 명세서에 참고로 포함된다.
발명은 예시적인 실시형태를 참조하여 기술되었지만, 당업자는 발명의 범주를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고 등가물이 그 요소에 대해 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 그 본질적인 범주를 벗어나지 않고 특정 상황이나 자료를 교시에 적용하기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 발명은 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 최선의 방식으로서 개시된 특정 실시형태에 제한되지 않고, 발명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 있는 모든 실시형태를 포함할 것이라는 것이 의도된다.

Claims (62)

  1. 개선된 세포 배양 성능을 위한 진핵 세포를 배양하는 방법으로서, 상기 방법은,
    정의된 세포 배양 배지에서 진핵 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서;
    여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및
    초기 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충 세포 배양 배지에서 상기 세포를 유지하는 단계;
    를 포함하며,
    여기서 적어도 하나의 세포 배양 성능 매개변수는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 적은 양의 아스파라긴 영양보충 또는 무 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 아스파라긴 영양보충에 의해 개선되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 벌크 공급의 일부로서 또는 별도의 아스파라긴 보충 공급으로서 제공되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 연속적으로 또는 볼루스로서 제공되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 7.2mM 내지 약 21.6mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 10.8mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유가식 세포 배양 동안 진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 세포 배양 성능 매개변수는 증가된 세포 생존율, 증가된 세포 성장 속도, 증가된 세포 밀도, 관심있는 재조합 단백질의 증가된 역가, 관심있는 재조합 단백질의 증가된 수율, 세포 배양의 적어도 일부에서의 필수 아미노산 고갈의 감소, 세포 배양의 적어도 일부에서의 적어도 하나의 세포 배양 부산물 형성의 감소, 및 단백질 품질의 적어도 하나의 지표의 개선으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 세포 배양 부산물은 암모늄 이온 및 알라닌으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 단백질 품질의 적어도 하나의 지표는 단백질 서열 변이체의 감소인, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질의 역가는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양된 세포(들)와 비교된 역가보다 적어도 3%, 5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 적어도 20% 더 높은, 방법.
  10. 제6항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질의 수율은 세포(들)가 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 더 낮은 양의 아스파라긴 영양보충으로 배양되는 유사한 방법에 비하여 적어도 0.1g/L, 적어도 0.5g/L, 적어도 1g/L, 적어도 1.2g/L, 적어도 1.4g/L, 적어도 1.6g/L, 적어도 1.8g/L, 적어도 2g/L, 적어도 2.2g/L, 적어도 2.4g/L, 또는 적어도 2.5g/L까지 증가되는, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 세포 배양은 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 약 10-50M 세포/ml의 생존 세포 계수를 유지하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양의 기간 동안 아스파라긴 보충된 세포 배양 조건 하에서 유지되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 초기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 후기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 아스파라긴 보충은 유가식 세포 배양의 5일차 또는 그 이후에 시작하고, 이후에 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 연속적 아스파라긴 보충은 유가식의 세포 배양의 10일차 또는 그 이후에 중단되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 연속적으로 제공되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 아스파라긴 보충은 연속적 벌크 공급의 일부로서 제공되는, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 아스파라긴 보충은 별도의 연속적 아스파라긴 보충 공급의 일부로서 제공되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴, 아스파르트산 및 글루탐산의 세포 배양에서의 세포외 아미노산 고갈은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 볼루스 공급으로서 제공되는 아스파라긴 영양보충을 갖는 유사한 방법과 비교하여 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일 또는 적어도 4일 이상까지 지연되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 포유동물 세포인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 진핵 세포는 CHO 세포인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 세포가 적어도 약 1.8mM/일 내지 약 9.3mM/일의 아스파라긴을 소비하도록 하는 높은 아스파라긴 소비 세포주인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 세포가 적어도 약 0.32mM/일 내지 약 1.8mM/일의 아스파라긴을 소비하도록 하는 낮은 아스파라긴 소비 세포주인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 진핵 세포는 관심있는 재조합 단백질이 적어도 4g/L, 적어도 5g/L, 적어도 6g/L, 적어도 7g/L, 적어도 8g/L, 적어도 9g/L, 또는 적어도 10g/L, 적어도 11g/L, 적어도 12g/L, 적어도 13g/L, 적어도 14g/L의 수율로 생산되도록 하는 높은 생산성 세포주인, 방법.
  28. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체인, 방법.
  29. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
  30. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 항체, 항체 단편, 및 ScFv-Fc 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  31. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 항-인플루엔자 바이러스 항체, 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항체, 항-중동 호흡기 증후군(MERS) 바이러스, 항-에볼라 바이러스 항체, 항-지카 바이러스 항체, 항-중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 항체 및 항-COVID-19 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제5항에 있어서, 관심있는 재조합 단백질은 적어도 하나의 알리로쿠맙, 사릴루맙, 파시누맙, 네스바쿠맙, 두필루맙, 트레보그루맙, 에비나쿠맙, 리누쿠맙, 카시리비맙 또는 임데비맙으로부터 선택되는, 방법.
  34. 세포 배양에서 포유동물 세포로부터 발현되는 관심있는 폴리펩티드의 아스파라긴 서열 변이체를 방지하는 방법으로서, 상기 방법은,
    정의된 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계로서;
    여기서 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 단계; 및
    관심있는 폴리펩티드의 발현에 충분한 조건 하에서 초기 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충된 세포 배양 배지에서 상기 세포를 유지하는 단계;
    를 포함하며,
    여기서 세포외 아스파라긴 수준은, 포유동물 세포에 의해 발현되는 관심있는 폴리펩티드가 모든 개별 서열 변이체 유전자좌에서 0.30% 미만의 아스파라긴 서열 변이체를 포함하도록, 약 0.1mM의 고갈 한계 초과로 적어도 초기 단계 유가식 세포 배양 동안 세포 배양 배지에서 유지되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 포유동물 세포에 의해 발현되는 관심있는 폴리펩티드는 세포 배양의 12일차 후에 모든 개별 서열 변이체 유전자좌에서 0.30% 미만의 아스파라긴 서열 변이체를 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 벌크 공급의 일부로서 또는 별도의 아스파라긴 보충 공급으로서 제공되는, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 연속적으로 또는 볼루스로서 제공되는, 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 7.2mM 내지 약 21.6mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 10.8mM 양의 아스파라긴으로 보충되는, 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 아스파라긴 보충된 세포 배양 조건 하에서 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안, 또는 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양의 기간 동안 유지되는, 방법.
  40. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공되는, 방법.
  41. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 매일 또는 연속적으로 제공되는, 방법.
  42. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 초기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  43. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일 동안 또는 후기 유가식 세포 배양의 기간 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 아스파라긴 보충은 유가식 세포 배양의 5일차 또는 그 이후에 시작하고, 이후에 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 연속적으로 제공되는, 방법.
  45. 제43항에 있어서, 연속적 아스파라긴 보충은 유가식의 세포 배양의 10일차 또는 그 이후에 중단되는, 방법.
  46. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 보충은 초기 및/또는 후기 유가식 세포 배양에서 연속적으로 제공되는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 아스파라긴 보충은 연속적 벌크 공급의 일부로서 제공되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 아스파라긴 보충은 별도의 연속적 아스파라긴 보충 공급의 일부로서 제공되는, 방법.
  49. 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 아스파라긴 서열 변이체는 관심있는 폴리펩티드의 번역 동안 아스파라긴 대신에 세린이 오혼입되는 것인, 방법.
  50. 세포 배양에서 포유동물 세포로부터 발현된 관심있는 폴리펩티드에서 아스파라긴 서열 변이체를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    정의된 세포 배양 배지에서 포유동물 세포를 번식시키거나 유지시키는 단계;
    진핵 세포로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현시키는 단계;
    세포 배양 또는 정의된 세포 배양 배지에서 아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 세포내 및/또는 세포외 농도를 측정하는 단계; 및
    아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도를 관심있는 발현된 폴리펩티드 내 아스파라긴 서열 변이체의 존재와 상호관련시키는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 아스파라긴 또는 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산의 측정된 농도는 아스파라긴 서열 변이체의 존재와 역 상관관계인, 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 정의된 세포 배양 배지는 초기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 43.2mM 및 후기 유가식 세포 배양 동안 약 3.6mM 내지 약 21.6mM 양의 아스파라긴으로 보충되고; 세포는 초기 및 후기 유가식 세포 배양의 적어도 일부 동안 상기 아스파라긴 보충된 세포 배양 배지에서 유지되는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 아스파르테이트(Asp), 글루타메이트(Glu), 글루타민(Gln) 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 글루타메이트(Glu)인, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 후기 유가식 세포 배양 동안 측정될 수 있는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 세포 배양의 5일차 후, 6일차 후, 7일차 후, 8일차 후, 9일차 후, 또는 10일차 후에 측정될 수 있는, 방법.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 세포내에서 측정되는, 방법.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아스파라긴 관련 아미노산은 세포외에서 측정되는, 방법.
  59. 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 모니터링 및 제어하는 방법으로서, 상기 방법은
    어는점 내림, 전기화학, 디지털 이미징, 광도계, 바이오프로세스 분석기 또는 라만분광법 중 하나 이상을 사용하여 세포 배양에서 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 제자리에서(in situ) 측정하는 단계;
    측정된 하나 이상의 세포 배양 매개변수를 세포 배양 매개변수에 대한 사전결정된 세트 포인트 값과 비교하여 하나 이상의 세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위 내에 있는지를 결정하는 단계; 및
    세포 배양 매개변수가 사전결정된 임계 범위를 벗어나는 것으로 결정되면 세포 배양 매개변수 중 하나 이상을 조정하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 하나 이상의 세포 배양 매개변수는 세포 성장률, 세포 밀도, 세포 생존도, 아스파라긴 농도, 아스파라긴 관련 아미노산 농도, 암모늄 이온 농도 및 알라닌 농도로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 하나 이상의 세포 배양 매개변수는 아스파라긴 농도 및 암모늄 이온 농도로부터 선택되는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 암모늄 이온 농도가 사전결정된 임계 범위 밖에 있는 것으로 결정되면, 아스파라긴 공급 투입량이 조정되는, 방법.
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