KR20150103682A - 항-ｐｄｇｆｒ-베타 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타)에 결합하는 항체들 및 상기 항체들을 사용하는 방법들을 제공한다. 본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 상기 항체들은, 사람 PDGFR-베타에 높은 친화도로 결합하는 완전 사람 항체들이다. 본 발명의 항체들은, 안구 질환, 섬유증 질환, 혈관성 질환 및 암과 같은 PDGFR-베타 신호전달 및/또는 PDGFR-베타 세포 발현과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 유용하다.

Description

항-ＰＤＧＦＲ-베타 항체 및 이의 용도{ANTI-PDGFR-BETA ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은, 사람 PDGFR-베타에 특이적인 항체들 및 이들의 항원-결합 단편들, 및 이들의 사용 방법들에 관한 것이다.
혈소판-유도된 성장 인자(PDGF)들은 4개의 상이한 이소타입(isotype) 서브유닛(subunit)들: A, B, C 및 D로 구성된 5개의 상이한 이량체성 입체배치(configuration)들로서 존재하는 강력한 미토겐(mitogen)들이다. PDGF들의 상기 5개의 이량체성 형태들은 AA, BB, AB, CC 및 DD이고, 이들은 상응하는 개별 PDGF 단량체들의 디설파이드 링크(linkage)에 의해 형성된다. PDGF 리간드들은, PDGF 리간드들과 PDGF 수용체(PDGFR)들의 상호작용을 통해 이들의 생물학적 효과들을 발휘한다. PDGFR들은, 알파(α) 수용체 쇄(PDGFR-알파) 및/또는 베타(β) 수용체 쇄(PDGFR-베타)의 이종이량체성 또는 동종이량체성 회합(association)으로 구성된 단일-통과 막관통 티로신 키나제 수용체들이다. 따라서, 활성 PDGFR들은 αα, ββ 또는 αβ 수용체 쇄 쌍들로 이루어질 수 있다. PDGFR들은, 5개의 세포외 면역글로불린(Ig) 루프(loop)들, 막관통 도메인 및 스플릿(split) 세포내 티로신 키나제(TK) 도메인을 포함하는 공통의 도메인 구조를 공유한다. 이량체성 PDGF 리간드들과 PDGFR들 사이의 상호작용은 수용체 쇄 이량체화, 수용체 자가 인산화 및 세포내 신호 전달을 초래한다. 시험관 내에서, ββ 수용체들은 PDGF-BB 및 -DD에 의해 활성화되는 반면, αβ 수용체들은 PDGF-BB, -CC, -DD 및 -AB에 의해 활성화되고, αα 수용체들은 PDGF-AA, -BB, -CC 및 -AB에 의해 활성화됨이 입증되었다(문헌[Andrae et al. (2008) Genes Dev 22(10):1276-1312] 참조).
PDGF 신호전달은, 병리학적 혈관신생 관련 질환, 혈관성 질환 및 섬유증 질환, 종양 성장 및 안 질환을 포함하는 각종 사람 질환들에 연루되어 왔다. 따라서, PDGF 신호전달의 억제제는 다양한 치료 환경에서의 사용에 제안되어 왔다. 예를 들면, PDGFR-베타의 억제제는 각종 질환 및 장애의 치료에서의 사용에 제안되어 왔다[참조: Andrae et al. (2008) Genes Dev 22(10):1276-1312]. PDGFR-베타 억제제로는 이마티닙 메실레이트, 수니티닙 말레이트 및 CP-673451과 같은 비-특이적 소분자 티로신 키나제 억제제뿐만 아니라 항-PDGFR-베타 항체(예를 들면, 미국 특허 제7,060,271호; 제5,882,644호; 제7,740,850호; 및 미국 특허출원 공보 제2011/0177074호 참조)가 포함된다. 항-리간드 압타머(aptamer)(예를 들면, 항-PDGF-B)도 치료학적 적용들에 제안되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 당해 분야에서는 PDGF 신호전달의 고도로 특이적이고 강력한 신규 억제제들에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명은, 사람 혈소판-유도된 성장 인자 수용체 베타("PDGFR-베타")에 결합하는 항체들을 제공한다. 본 발명의 항체들은, 특히, PDGFR-베타-매개된 신호전달을 억제하는데에, 그리고, PDGFR-베타 활성 및/또는 신호전달에 의해 야기되거나 이들과 관련된 질환 및 장애를 치료하는데에 유용하다. 또한, 본 발명의 항체들은, 항체의 표면 상에서 높은 수준의 PDGFR-베타를 발현하는 세포에서의 세포 사멸을 유도하는데에도 유용하다.
본 발명의 항체들은 전장 항체(예를 들면, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수 있거나 항원-결합부(예를 들면, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 관능성(functionability)에 영향을 주기 위해, 예를 들면, 남아 있는 이펙터(effector) 기능들을 제거하기 위해 변형될 수 있다[참조: Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933].
본 발명은, 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306 및 322로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는, 항체들 또는 이들의 항원-결합 단편들을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314 및 330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는, 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR(HCVR/LCVR) 서열 쌍을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312 및 328로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320 및 336으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함하는, 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
소정 실시형태에서, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원-결합부는, 서열번호 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/112, 120/128, 136/144, 152/160, 168/176, 184/192, 200/208, 216/224, 232/240, 248/256, 264/272, 280/288, 296/304, 312/320 및 328/336으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308 및 324로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310 및 326으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316 및 332로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318 및 334로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 소정의 비-제한적 예시 항체들 및 항원-결합 단편들은, 각각, 서열번호 4-6-8-12-14-16(예를 들면, H1M3299N); 20-22-24-28-30-32(예를 들면, H1M3305N); 36-38-40-44-46-48(예를 들면, H1M3310N); 52-54-56-60-62-64(예를 들면, H1M3361N); 68-70-72-76-78-80(예를 들면, H2M3363N); 84-86-88-92-94-96(예를 들면, H2M3365N); 100-102-104-108-110-112(예를 들면, H2M3368N); 116-118-120-124-126-128(예를 들면, H2M3373N); 132-134-136-140-142-144(예를 들면, H2M3374N); 148-150-152-156-158-160(예를 들면, H4H3094P); 164-166-168-172-174-176(예를 들면, H4H3095S); 180-182-184-188-190-192(예를 들면, H4H3096S); 196-198-200-204-206-208(예를 들면, H4H3097S); 212-214-216-220-222-224(예를 들면, H4H3098S); 228-230-232-236-238-240(예를 들면, H4H3099S); 244-246-248-252-254-256(예를 들면, H4H3102S); 260-262-264-268-270-272(예를 들면, H4H3103S); 276-278-280-284-286-288(예를 들면, H4H3104S); 292-294-296-300-302-304(예를 들면, H4H3105S); 308-310-312-316-318-320(예를 들면, H4H3106S); 및 324-326-328-332-334-336(예를 들면, H4H3107S)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열들을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함한다.
이와 관련된 실시형태에서, 본 발명은, PDGFR-베타에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서, 상기 항체 또는 단편은, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열들 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인들을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정하는 방법들 및 기술들은 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 상기 방법들 및 기술들을 사용하여, 본원에 개시되는 특정된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 동정할 수 있다. CDR의 경계선(boundaries)을 동정하는데 사용될 수 있는 예시적인 관례로는, 예를 들면, 캐뱃 정의(Kabat definition), 초티아 정의(Chothia definition) 및 에이비엠 정의(AbM definition)가 포함된다. 일반적으로 말해, 캐뱃 정의는 서열 가변성에 기초하고, 초티아 정의는 구조적 루프 영역들의 위치에 기초하며, 에이비엠 정의는 캐뱃 접근법과 초티아 접근법의 절충적 방법이다. 예를 들면, 문헌[Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)]을 참조한다. 공용 데이터베이스도 항체 내의 CDR 서열들을 동정하는데 이용될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, 항-PDGFR-베타 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 암호화하는 핵산 분자들을 제공한다. 본 발명의 핵산을 운반하는 재조합 발현 벡터들, 및 상기 벡터들이 도입된 숙주 세포들도 본 발명에 포함되고, 상기 항체들의 제조를 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고 상기 제조된 항체들을 회수함으로써 상기 항체들을 제조하는 방법들도 본 발명에 포함된다.
한 실시형태에서, 본 발명은, 서열번호 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305 및 321로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313 및 329로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열, 또는 상기 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCVR을 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311 및 327로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR3 도메인; 및 서열번호 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319 및 335로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR3 도메인을 포함하는, 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307 및 323으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR1 도메인; 서열번호 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309 및 325로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 HCDR2 도메인; 서열번호 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315 및 331로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR1 도메인; 및 서열번호 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317 및 333으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 LCDR2 도메인을 추가로 포함하는, 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
소정 실시형태에 따르면, 상기 항체 또는 이의 단편은, 서열번호 1 및 9(예를 들면, H1M3299N), 17 및 25(예를 들면, H1M3305N), 33 및 41(예를 들면, H1M3310N), 49 및 57(예를 들면, H1M3361N), 65 및 73(예를 들면, H2M3363N), 81 및 89(예를 들면, H2M3365N), 97 및 105(예를 들면, H2M3368N), 113 및 121(예를 들면, H2M3373N), 129 및 137(예를 들면, H2M3374N), 145 및 153(예를 들면, H4H3094P), 161 및 169(예를 들면, H4H3095S), 177 및 185(예를 들면, H4H3096S), 193 및 201(예를 들면, H4H3097S), 209 및 217(예를 들면, H4H3098S), 225 및 233(예를 들면, H4H3099S), 241 및 249(예를 들면, H4H3102S), 257 및 265(예를 들면, H4H3103S), 273 및 281(예를 들면, H4H3104S), 289 및 297(예를 들면, H4H3105S), 305 및 313(예를 들면, H4H3106S), 또는 321 및 329(예를 들면, H4H3107S)의 핵산 서열에 의해 암호화된 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 발명은, 변형된 당화 패턴을 갖는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 몇몇의 적용에서는, 바람직하지 않은 당화 부위들을 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 올리고사카라이드 쇄에 존재하는 푸코스 모이어티(moiety)가 결여된 항체는, 예를 들면, 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키는데 유용할 수 있다[참조: Shield et al. (2002) JBC 277:26733]. 다른 적용에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위한 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은, PDGFR-베타에 특이적으로 결합하는 재조합 사람 항체 또는 이의 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다. 이와 관련된 양상에서, 본 발명은, 항-PDGFR-베타 항체와 제2 치료제의 배합물인 조성물을 특징으로 한다. 한 실시형태에서, 상기 제2 치료제는, 항-PDGFR-베타 항체와 유리하게 병용되는 임의의 제제(agent)이다. 항-PDGFR-베타 항체와 유리하게 병용될 수 있는 예시 제제들로는, PDGFR-베타 활성을 억제하는 다른 제제들(다른 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들, 펩티드 억제제, 소분자 길항제 등을 포함함) 및/또는 PDGFR-베타에 직접 결합하지는 않지만 그럼에도 PDGFR-베타-매개된 신호전달을 방해하거나 차단하거나 약화시키는 제제들이 제한 없이 포함된다. 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들을 포함하는 추가의 병용 치료요법들 및 공동-제형(co-formulation)들이 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체 또는 상기 항체의 항원-결합부를 사용하여 PDGFR-베타 활성을 억제시키는 치료학적 방법들을 제공하고, 여기서, 상기 치료학적 방법들은, 본 발명의 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함한다. 치료되는 장애는, PDGFR-베타 활성 또는 신호전달의 제거, 억제 또는 감소에 의해 개선되거나, 호전되거나, 억제되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다. 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들 또는 항체 단편들은, PDGFR-베타와 PDGFR-베타 결합 파트너(예를 들면, PDGF 리간드) 사이의 상호작용을 차단하도록, 또는 그렇지 않으면 PDGFR-베타의 신호전달 활성을 억제하도록 기능할 수 있다.
또한, 본 발명은, 환자에서의 PDGFR-베타 활성과 관련되거나 이에 의해 야기되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약(medicament)의 제조시의 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체 또는 상기 항체의 항원 결합부의 용도를 포함한다.
기타 실시형태들은 후속하는 상세한 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.
도 1은, PDGF 리간드 차단 검정의 결과들을 도시하는 히스토그램이고, 당해 검정에서는, PDGFR-베타를 바이오센서 표면 상에 포획하고, PDGF 리간드(BB, DD 또는 AB)를 상기 표면에 적용시킨 후에 본 발명의 각종 항-PDGFR-베타 항체들 또는 대조군 항체로 처리하였다. 결과들은 RU로서 도시되어 있다.
도 2는, 항체 교차-경쟁 검정의 결과들을 도시한 매트릭스이며, 당해 검정에서는, 제1 항-PDGFR-베타 항체(mAb#1)를 PDGFR-베타-코팅된 센서 팁(sensor tip)에 적용시킨 후에 제2 항-PDGFR-베타 항체(mAb#2)로 처리하였다. 시험된 각각의 항체 조합에 대한 결합 반응들(수치 -0.01 내지 0.36)이 도시되어 있다. 흑색의 숫자가 적힌 연회색 박스들은 자가-경쟁에 대한 결합 반응을 나타낸다. 양쪽 방향 둘 다에서 경쟁하는 항체들은 항원 결합의 순서와 관계없이 백색 숫자가 적힌 흑색 박스들로 강조되어 있다. 뚜렷한 결합 영역들을 나타내는 경쟁의 부재는 흑색 숫자가 적힌 백색 박스들로서 나타나 있다.
상세한 설명
본 발명을 기술하기 전에, 기술되는 특정 방법들 및 실험 조건들이 달라질 수 있으므로, 본 발명은, 이러한 방법들 및 조건들에 한정되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이므로, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 기술하는 목적을 위한 것이고, 한정되는 것으로 의도되지 않음이 이해되어야만 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은, 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 용어 "약"은, 인용된 특정 수치와 관련하여 사용되는 경우, 상기 값이 상기 인용된 값으로부터 1% 이하 만큼 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 본원에서 사용된 표현 "약 100"은 99와 101, 그리고 이들 사이의 모든 값들(예를 들면, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법들 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 재료들이 이하에 기술된다.
정의
본원에서 사용된 표현들 "혈소판-유도된 성장 인자 수용체 베타", "PDGFRβ", "PDGFR-베타", 및 "PDGFRb" 등은, 서열번호 341의 아미노산 서열을 갖는 사람 PDGFR-베타 단백질을 나타낸다(또한, UniProt 수탁 번호 P09619를 참조한다). 본원에서 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 참조는, 비-사람 종으로부터의 것(예를 들면, "마우스 PDGFR-베타", "원숭이 PDGFR-베타" 등)이라 명백하게 특정되지 않는 한, 각각 사람 버젼의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편을 나타내는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "PDGFR-베타에 결합하는 항체" 또는 "항-PDGFR-베타 항체"는, PDGFR-베타 단백질의 가용성 단편(예를 들면, PDGFR-베타의 세포외 도메인의 전부 또는 일부) 및/또는 세포 표면-발현된 PDGFR-베타에 결합하는 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 표현 "세포 표면-발현된 PDGFR-베타"는, 상기 PDGFR-베타 단백질의 적어도 일부(예를 들면, 서열번호 341의 이마노산 33 내지 532)가 세포막의 세포외 측에 노출되어 항체의 항원-결합부에 접근가능하도록 시험관내에서 또는 생체내에서 세포 표면 상에 발현되는 PDGFR-베타 단백질 또는 이의 부분을 의미한다. "세포 표면-발현된 PDGFR-베타"는, ββ 수용체 동종이량체의 맥락에서의 PDGFR-베타 분자들뿐만 아니라 αβ 이종이량체의 맥락에서의 PDGFR-베타 분자들도 포함한다. 가용성 PDGFR-베타 분자들은, 예를 들면, 본원에서 실시예 3에 기술된 바와 같은 단량체성 및 이량체성 PDGFR-베타 작제물(construct)들(예를 들면, "PDGFRb.mmh", 서열번호 337[단량체], "PDGFRb.mFc", 서열번호 338[이량체] 및 "PDGFRb.hFc", 서열번호 339[이량체]) 또는 이와 실질적으로 유사한 작제물들을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는, 특정한 항원(예를 들면, PDGFR-베타)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는, 디설파이드 결합들에 의해 상호-연결된, 4개의 폴리펩티드 쇄들인, 2개의 중(H)쇄들 및 2개의 경(L)쇄들을 포함하는 면역글로불린 분자들뿐만 아니라, 이들의 다량체(multimer)(예를 들면, IgM)들도 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인들, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는, 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. 상기 VH 및 VL 영역들은, 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 보다 보존된 영역들 사이에 개재된 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하는 초가변성(hypervariability) 영역들로 추가로 세분될 수 있다. VH 및 VL 각각은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 실시형태들에서, 상기 항-PDGFR-베타 항체(또는 이의 항원-결합부)의 FR들은 사람 생식선 서열들과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스(consensus) 서열은, 2개 이상의 CDR들의 병렬식 분석(side-by-side analysis)에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는, 또한, 완전한 항체 분자들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합부", 및 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는, 임의의 천연 발생의, 효소적으로 수득가능한, 합성의, 또는 유전자 조작된, 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편들은, 예를 들면, 완전한 항체 분자들로부터, 단백질 분해 소화, 또는 항체의 가변 도메인 및 임의로는 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기술들과 같은 임의의 적합한 표준 기술들을 사용하여 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들면, 상업적 공급원, DNA 라이브러리(예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 입수가능하거나, 합성될 수 있다. 상기 DNA는, 예를 들면, 하나 이상의 가변 도메인들 및/또는 불변 도메인들을 적합한 입체배치로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하기 위해, 시스테인 잔기를 생성하기 위해, 아미노산을 변형시키거나 부가하거나 결실시키기 등을 위해, 화학적으로 또는 분자 생물학 기술들을 사용하여 서열분석하고 조작할 수 있다.
항원-결합 단편들의 비제한적인 예로는: (i) Fab 단편들; (ii) F(ab')2 단편들; (iii) Fd 단편들; (iv) Fv 단편들; (v) 단일-쇄 Fv(scFv) 분자들; (vi) dAb 단편들; 및 (vii) 항체의 초가변성 영역(예를 들면, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR)) 또는 제약된(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩티드를 모방하는 아미노산 잔기들로 이루어진 최소 인식 단위들이 포함된다. 　도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-절편이식된 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody)(예를 들면, 1가의 나노바디, 2가의 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제(SMIP: small modular immunopharmaceutical), 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 조작된 분자들도, 본원에서 사용된 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로, 하나 이상의 가변 도메인을 포함할 것이다. 상기 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성으로 이루어질 수 있으며, 일반적으로, 하나 이상의 프레임워크 서열들을 갖는 프레임에 인접하거나 상기 프레임 내에 있는 하나 이상의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편들에서, 상기 VH 도메인과 상기 VL 도메인은 서로에 대해 임의의 적합한 배열로 위치될 수 있다. 예를 들면, 상기 가변 영역은 이량체일 수 있으며, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 하나 이상의 불변 도메인에 공유결합적으로 커플링된 하나 이상의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 도메인과 불변 도메인의 비제한적인 예시적 입체배치로는: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL이 포함된다. 상기에 열거된 예시적 입체배치들 중의 임의의 것을 포함하는, 가변 도메인과 불변 도메인의 임의의 입체배치에서, 상기 가변 도메인과 상기 불변 도메인은 서로 직접 링크될 수 있거나, 완전 또는 부분 힌지(hinge) 또는 링커(linker) 영역에 의해 링크될 수 있다. 힌지 영역은, 단일 폴리펩티드 분자 내의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인들 사이에 가요성 또는 반-가요성 링크를 초래하는 2개 이상(예를 들면, 5개, 10개, 15개, 20개, 40개, 60개 또는 그 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은, (예를 들면, 디설파이드 결합(들)에 의해) 서로 비-공유결합적으로 회합되고/되거나 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인과 비-공유결합적으로 회합된, 상기에 열거된 가변 및 불변 도메인 입체배치들 중 어느 것의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전한 항체 분자들과 같이, 항원-결합 단편들은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들면, 이특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 2개 이상의 상이한 가변 도메인들을 포함할 것이고, 여기서, 각각의 가변 도메인은, 별개의 항원에 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시되는 예시적인 이특이적 항체 포맷(format)들을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷은, 당해 분야에서 이용가능한 일상적 기술들을 사용하여, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 개조될 수 있다.
본 발명의 항체들은, 보체-의존적 세포독성(CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 통해 기능할 수 있다. "보체-의존적 세포독성(CDC)"은, 보체의 존재 하의 본 발명의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 나타낸다. "항체-의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)"은, Fc 수용체(FcR)들을 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들면, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 이에 의해 상기 표적 세포의 용해를 초래하는 세포-매개된 반응을 나타낸다. CDC 및 ADCC는, 당해 분야에 익히 공지되어 있고 이용가능한 검정들을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,500,362호 및 제5,821,337호 및 문헌[Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 참조). 항체의 불변 영역은, 보체를 고정시키고 세포-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소타입은, 상기 항체가 세포독성을 매개하는 것이 바람직한지의 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
본 발명의 소정 실시형태에서, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 사람 항체들이다. 본원에서 사용된 용어 "사람 항체"는, 사람 생식선 면역글로불린 서열들로부터 유도된 가변 및 불변 영역들을 갖는 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 사람 항체들은, 예를 들면, CDR, 특히, CDR3에서, 사람 생식선 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기들(예를 들면, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "사람 항체"는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열들이 사람 프레임워크 서열들 상에 절편이식된 항체들은 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 항체는 재조합 사람 항체들일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 사람 항체"는, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체들(하기에 추가로 기술됨), 재조합 조합적 사람 항체 라이브러리로부터 단리된 항체들(하기에 추가로 기술됨), 사람 면역글로불린 유전자에 대해 유전자 전이된 동물(예를 들면, 마우스)로부터 단리된 항체들(예를 들면, 문헌[Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 사람 면역글로불린 유전자 서열들을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱(splicing)함을 포함하는 임의의 다른 수단들에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체들과 같은, 재조합 수단들에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 사람 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 사람 항체들은, 사람 생식선 면역글로불린 서열들로부터 유도된 가변 및 불변 영역들을 갖는다. 그러나, 소정 실시형태에서, 이러한 재조합 사람 항체들은 시험관내 돌연변이유발에(또는, 사람 Ig 서열들에 대해 유전자 전이된 동물을 사용하는 경우에는 생체내 체세포 돌연변이에) 적용되며, 따라서, 상기 재조합 항체들의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열들은, 사람 생식선 VH 및 VL 서열들로부터 유도되었지만 생체내 사람 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열들이다.
사람 항체들은 힌지 이질성과 연관된 2개의 형태들로 존재할 수 있다. 한 형태에서, 면역글로불린 분자는, 이량체들이 쇄간 중쇄 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 대략 150 내지 160kDa의 안정한 4개의 쇄 작제물을 포함한다. 제2 형태에서는, 이량체들이 쇄간 디설파이드 결합을 통해 링크되는 것이 아니라, 공유결합적으로 커플링된 경쇄와 중쇄로 구성된 약 75 내지 80kDa의 분자가 형성된다(절반-항체(half-antibody)). 이들 형태는, 심지어 친화성 정제 후에도 분리하기가 매우 어렵다.
각종의 온전한 IgG 이소타입들 내에서의 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소타입과 관련된 구조적 차이에 기인하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 사람 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 제2 형태의 출현을 사람 IgG1 힌지 사용시 전형적으로 관찰되는 수준까지 유의하게 감소시킬 수 있다[참조: Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30:105]. 본 발명은, 힌지 영역, CH2 영역 또는 CH3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체들을 포함하며, 이는, 예를 들면, 제조시에 원하는 항체 형태의 수율을 개선시키는데 바람직할 수 있다.
본 발명의 항체들은 단리된 항체들일 수 있다. 본원에서 사용된 "단리된 항체"는 이의 자연 환경 중의 하나 이상의 구성성분으로부터 동정되고 분리되고/되거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들면, 유기체의 하나 이상의 구성성분으로부터 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생성되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는, 본 발명의 목적을 위해 "단리된 항체"이다. 또한, 단리된 항체로는 재조합 세포 내의 동일 반응계내(in situ) 항체도 포함된다. 단리된 항체들은, 하나 이상의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체들이다. 소정 실시형태에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학 물질들을 실질적으로 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 중화성 및/또는 차단성 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 본원에서 사용된 "중화성" 또는 "차단성" 항체는, PDGFR-베타에 대한 결합이 (ⅰ) PDGFR-베타 또는 PDGFR-베타 단편과 PDGF 리간드(예를 들면, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-AB 등) 사이의 상호작용을 방해하고/하거나; (ii) ββ 및/또는 αβ 수용체 이량체들의 형성을 방해하고/하거나; (ii) PDGFR-베타의 하나 이상의 생물학적 기능의 억제를 초래하는 항체를 나타내는 것으로 의도된다. PDGFR-베타 중화성 또는 차단성 항체에 의해 야기되는 억제는 적절한 검정을 사용하여 검출할 수 있는 한 완벽할 필요는 없다. PDGFR-베타 억제를 검출하기 위한 예시적인 검정은 본원의 작용 실시예에 기술되어 있다.
본원에 개시된 항-PDGFR-베타 항체들은, 당해 항체들이 유도된 상응하는 생식선 서열들에 비교할 때, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들의 프레임워크 및/또는 CDR 영역들에서의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이들은, 본원에 개시된 아미노산 서열들을, 예를 들면, 공용 항체 서열 데이터베이스로부터 입수가능한 생식선 서열들과 비교함으로써 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명은, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역들 내의 하나 이상의 아미노산들이, 당해 항체가 유도된 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 다른 사람 생식선 서열의 상응하는 잔기(들)에 대해, 또는 상응하는 생식선 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환에 대해 돌연변이된, 본원에 개시된 아미노산 서열들 중 어느 것으로부터 유도된 항체, 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다(이러한 서열 변화들을 본원에서는 총체적으로 "생식선 돌연변이(germline mutation)"라 칭한다). 당해 분야의 통상의 숙련가는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열들로부터 출발하여, 하나 이상의 개별 생식선 돌연변이들 또는 이들의 조합들을 포함하는 다수의 항체들 및 항원-결합 단편들을 용이하게 생산할 수 있다. 소정 실시형태에서는, 상기 VH 및/또는 VL 도메인들 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기들이, 당해 항체가 유도된 원래의 생식선 서열에서 발견된 잔기들에 대해 역 돌연변이된다. 다른 실시형태에서는, 소정 잔기들만이, 예를 들면, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기들만이 원래의 생식선 서열에 대해 역 돌연변이된다. 다른 실시형태에서는, 상기 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상이, 상이한 생식선 서열(즉, 당해 항체가 원래 유도된 생식선 서열과는 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)에 대해 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체들은 상기 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식선 돌연변이들의 임의의 조합을 함유할 수 있고, 예를 들면, 소정 개별 잔기들은 특정한 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이되는 한편, 원래의 생식선 서열과 상이한 소정 다른 잔기들은 유지되거나, 상이한 생식선 서열의 상응하는 잔기에 대해 돌연변이된다. 일단 수득되면, 하나 이상의 생식선 돌연변이들을 함유하는 항체들 및 항원-결합 단편들은 하나 이상의 목적하는 특성, 예를 들면, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, (경우에 따라서는) 개선되거나 향상된 길항적 또는 작용적 생물학 특성들, 감소된 면역원성 등에 대해 용이하게 시험될 수 있다. 이러한 일반적 방식으로 수득된 항체들 및 항원-결합 단편들은 본 발명 내에 포함된다.
또한, 본 발명은, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 어느 것의 변이체들을 포함하는 항-PDGFR-베타 항체들도 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 본원에 개시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열들 중 어느 것에 비해, 예를 들면, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열들을 갖는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다.
용어 "에피토프"는, 파라토프로서 공지되어 있는 항체 분자의 가변 영역 내의 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원성 결정인자(antigenic determinant)를 나타낸다. 단일 항원이 1개 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체들이 항원의 상이한 영역들에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과들을 가질 수 있다. 에피토프들은 입체구조일(conformational) 수 있거나 선형일 수 있다. 입체구조 에피토프는, 선형 폴리펩티드 쇄의 상이한 절편들로부터 공간적으로 병치된(spatially juxtaposed) 아미노산들에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기들에 의해 생성된 것이다. 소정 환경에서, 에피토프는 항원 상에 사카라이드, 포스포릴 그룹들 또는 설포닐 그룹들의 모이어티들을 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 나타낼 때의 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"이란, 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 함께 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 하기에 논의된 바와 같은 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 임의의 익히 공지되어 있는 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정시, 뉴클레오티드 염기들의 약 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재한다는 것을 나타낸다. 참조 핵산 분자에 대해 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자는, 소정 예에서, 상기 참조 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
폴리펩티드에 적용되는 용어 "실직적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"이란, 2개의 펩티드 서열들이 디폴트 갭 중량(default gap weight)을 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램 등에 의해 최적으로 정렬되었을 때 95% 이상의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 차이가 난다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 화학적 성질들(예를 들면, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄(R 그룹)를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질들을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열들이 보존적 치환에 의해 서로 차이가 나는 경우, 서열 동일성 비율(%) 또는 유사성 정도를 상향 조정하여 상기 치환의 보존적 속성을 교정할 수 있다. 이러한 조정을 달성하기 위한 수단들은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331]을 참조한다. 화학적 성질들이 유사한 측쇄들을 갖는 아미노산 그룹들의 예로는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌이 포함된다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹들은 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존적 대체는, 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Sciences 256:1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "중간 정도의 보존적(moderately conservative)" 대체는, PAM250 로그-우도 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성이라고도 칭하는, 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 각종 치환, 결실 및 기타 변형에 할당된 유사성 척도들을 사용하여, 유사한 서열들을 매칭시킨다. 예를 들면, GCG 소프트웨어는, 상이한 종의 유기체들로부터의 상동성 폴리펩티드들과 같은 밀접하게 관련된 폴리펩티드들 사이의 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해, 디폴트 매개변수들과 함께 사용될 수 있는, Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램들을 함유한다. 예를 들면, GCG 버전 6.1을 참조한다. 또한, 폴리펩티드 서열들은, GCG 버전 6.1 내의 프로그램인, 디폴트 매개변수들 또는 권장된 매개변수들을 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수도 있다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 질의 서열과 검색 서열 사이의 최상의 중첩 영역들의 정렬 및 서열 동일성 비율(%)을 제공한다(상기 [Pearson (2000)]). 본 발명의 서열을 상이한 유기체들로부터의 다수의 서열들을 함유한 데이터베이스에 비교하는 경우의 다른 바람직한 알고리즘은, 디폴트 매개변수들을 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히, BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들면, 문헌[Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410] 및 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]를 참조한다.
pH-의존적 결합
본 발명은, pH-의존적 결합 특성들을 갖는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체는, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 PDGFR-베타에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안으로, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체는 중성 pH에 비해 산성 pH에서 이의 항원에 대해 향상된 결합을 나타낼 수 있다. 표현 "산성 pH"는, 약 6.2 미만, 예를 들면, 약 6.0, 5.95, 5,9, 5.85, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 또는 그 미만의 pH 값을 포함한다. 본원에서 사용된 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
소정 예에서, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 PDGFR-베타에 대해 감소된 결합"은, 산성 pH에서의 PDGFR-베타에 대한 항체 결합의 KD 값과, 중성 pH에서의 PDGFR-베타에 대한 항체 결합의 KD 값의 비(또는 이의 역)로서 표현된다. 예를 들면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 본 발명의 목적을 위해, 당해 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 약 3.0 이상의 산성 KD/중성 KD 비를 나타내는 경우, "중성 pH에 비해 산성 pH에서 PDGFR-베타에 대해 감소된 결합"을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 소정 예시적 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 대한 산성 KD/중성 KD 비는 약 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 20.0. 25.0, 30.0, 40.0, 50.0, 60.0, 70.0, 100.0 또는 그 이상일 수 있다.
pH-의존적 결합 특성들을 갖는 항체들은, 예를 들면, 항체들의 군집을, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 특정 항원에 대해 감소된(또는 향상된) 결합에 대해 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 추가로, 아미노산 수준에서의 항원-결합 도메인의 변형들도 pH-의존성 특성들을 갖는 항체들을 수득할 수 있다. 예를 들면, (예를 들어, CDR 내의) 항원-결합 도메인의 하나 이상의 아미노산들을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 감소된 항원-결합을 갖는 항체가 수득될 수 있다.
Fc 변이체를 포함하는 항-PDGFR-베타 항체
본 발명의 소정 실시형태에 따르면, FcRn 수용체에 대한 항체 결합을, 예를 들면, 중성 pH에 비해 산성 pH에서, 향상시키거나 감소시키는 하나 이상의 돌연변이들을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PDGFR-베타 항체들이 제공된다. 예를 들면, 본 발명은, Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 영역에서의 돌연변이를 포함하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함하고, 여기서, 상기 돌연변이(들)는, 산성 환경에서의(예를 들면, pH가 약 5.5 내지 약 6.0 범위인 엔도솜(endosome) 내에서의) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화성을 증가시킨다. 이러한 돌연변이들은, 동물에게 투여시, 당해 항체의 혈청 반감기의 증가를 초래할 수 있다. 이러한 Fc 변형들의 비-제한적인 예로는, 예를 들면, 위치 250(예를 들면, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들면, L 또는 F); 252(예를 들면, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들면, S 또는 T) 및 256(예를 들면, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들면, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들면, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들면, 308F, V308F) 및 434에서의 변형이 포함된다. 한 실시형태에서, 상기 변형은 428L(예를 들면, M428L) 및 434S(예를 들면, N434S) 변형; 428L, 259I(예를 들면, V259I) 및 308F(예를 들면, V308F) 변형; 433K(예를 들면, H433K) 및 434(예를 들면, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들면, 252Y, 254T 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들면, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들면, 308F 또는 308P)을 포함한다.
예를 들면, 본 발명은, 250Q 및 248L(예를 들면, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예를 들면, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예를 들면, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예를 들면, H433K 및 N434F)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이들 중 하나 이상의 쌍들 또는 그룹들을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 상기된 Fc 도메인 돌연변이들과, 본원에 개시된 항체 가변 도메인들 내의 다른 돌연변이들의 모든 가능한 조합들이 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
항체의 생물학적 특성
본 발명은, 가용성의 단량체성 또는 이량체성 PDGFR-베타 분자들에 높은 친화도로 결합하는 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, (예를 들면, 25℃ 또는 37℃에서) 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 30nM 미만의 KD로 단량체성 PDGFR-베타에 결합하는 항체들 및 상기 항체들의 항원-결합 단편들을 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 표면 플라스몬 공명 또는 이와 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시, 약 25nM 미만, 약 20nM 미만, 약 15nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 2nM 미만, 또는 약 1nM 미만의 KD로 단량체성 PDGFR-베타에 결합한다.
또한, 본 발명은, (예를 들면, 25℃ 또는 37℃에서) 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 250pM 미만의 KD로 이량체성 PDGFR-베타에 결합하는 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 표면 플라스몬 공명 또는 이와 실질적으로 유사한 검정에 의해 측정시, 약 240pM 미만, 약 230pM 미만, 약 220pM 미만, 약 210pM 미만, 약 200pM 미만, 약 190pM 미만, 약 180pM 미만, 약 170pM 미만, 약 160pM 미만, 약 150pM 미만, 약 140pM 미만, 약 130pM 미만, 약 120pM 미만, 약 110pM 미만, 또는 약 100pM 미만의 KD로 이량체성 PDGFR-베타에 결합한다.
또한, 본 발명은, PDGFR-베타에 대한 하나 이상의 PDGF 리간드(들)(예를 들면, PDGF-BB, -AB, -CC, 또는 -DD)의 결합을 차단하는 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, ELISA-기반 면역검정, 예를 들면, 본원의 실시예 4(A)에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 ELISA-기반 면역검정, 또는 실시간 생물학적 검정, 예를 들면, 실시예 4(B)에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 실시간 생물학적 검정 또는 이와 유사한 검정에 의해 측정시, 시험관내 단량체성 PDGFR-베타에 대한 PDGF-BB의 결합을 약 300pM 미만의 IC50 값으로 차단하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체들 또는 항원-결합 단편들은, ELISA-기반 면역검정, 예를 들면, 본원의 실시예 4(A)에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 ELISA-기반 면역검정, 또는 실시간 생물학적 검정, 예를 들면 실시예 4(B)에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 실시간 생물학적 검정 또는 이와 유사한 검정에 의해 측정시, 시험관내 단량체성 PDGFR-베타에 대한 PDGF-BB의 결합을 약 280pM 미만, 약 260pM 미만, 약 240pM 미만, 약 220pM 미만, 약 200pM 미만, 약 180pM 미만, 약 160pM 미만, 약 150pM 미만, 약 140pM 미만, 약 130pM 미만, 약 120pM 미만, 약 110pM 미만, 약 100pM 미만, 약 90pM 미만, 약 80pM 미만, 또는 약 75pM 미만의 IC50 값으로 차단한다.
또한, 본 발명은, 세포 표면-발현된 PDGFR-베타의 PDGF 리간드-매개된 활성화를 억제하는 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 세포-기반 차단 생물학적 검정, 예를 들면, 본원의 실시예 6에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 세포-기반 차단 생물학적 검정 또는 이와 실질적으로 유사한 검정에 의한 측정시, 세포 표면-발현된 PDGFR-베타의 PDGF-BB- 또는 PDGF-DD-매개된 활성화를 약 500pM 미만의 IC50 값으로 차단하는 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 소정 실시형태에서, 본 발명의 항체들 또는 항원-결합 단편들은, 세포-기반 차단 생물학적 검정, 예를 들면, 본원의 실시예 6에 정의된 바와 같은 검정 방식을 사용하는 세포-기반 차단 생물학적 검정 또는 이와 실질적으로 유사한 검정에 의한 측정시, 세포 표면 발현된 PDGFR-베타의 PDGF-BB- 또는 PDGF-DD-매개된 활성화를 약 400pM 미만, 약 350pM 미만, 약 300pM 미만, 약 250pM 미만, 약 200pM 미만, 약 150pM 미만, 약 100pM 미만, 약 90pM 미만, 약 80pM 미만, 약 70pM 미만, 약 60pM 미만, 약 50pM 미만, 약 40pM 미만, 또는 약 30pM 미만의 IC50 값으로 차단한다.
또한, 본 발명은, PDGFR-베타를 발현하는 세포 내로 내재화(internalized)된 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 세포-기반 항체 내재화 검정 또는 이와 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 측정시, PDGFR-베타-발현 세포 내에 효과적으로 내재된 항-PDGFR-베타 항체들 및 이의 항원-결합 단편들을 포함한다.
본 발명의 항체들은 상기에 언급된 생물학적 특성들 중 하나 이상 또는 이의 임의의 조합들을 가질 수 있다. 본 발명의 항체들의 기타 생물학적 특성들은 본원에서 수행되는 실시예를 포함하는 본 기재 내용을 검토함으로써 당해 분야의 통상의 숙련가에게 자명해질 것이다.
에피토프 맵핑(epitope mapping) 및 관련 기술
본 발명은, 사람 PDGFR-베타의 세포외 도메인 내에서(예를 들면, PDGFR-베타의 세포외 도메인의 Ig 도메인 1, 2, 3, 4 및/또는 5 내에서) 발견되는 하나 이상의 아미노산들과 상호작용하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. Ig 도메인 1 내지 3(예를 들면, 서열번호 337의 아미노산 1 내지 277)은, 리간드 결합에 관련된 것으로 공지되어 있다. 본 발명은, Ig 도메인 1 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산들(예를 들면, 서열번호 337의 아미노산 1 내지 88), Ig 도메인 2 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산들(예를 들면, 서열번호 337의 아미노산 97 내지 178) 및/또는 Ig 도메인 3 내에서 발견되는 하나 이상의 아미노산들(예를 들면, 서열번호 337의 아미노산 182 내지 277)과 상호작용하고, 이에 의해 상기 수용체/리간드 상호작용을 효과적으로 차단하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 본 발명의 소정 예시적 실시형태에서, Ig 도메인 2(예를 들면, 서열번호 337의 아미노산 97 내지 178; 예를 들면, 실시예 8 참조)와 특이적으로 상호작용하는 항체들이 제공된다. 상기 항체들이 결합하는 에피토프는, PDGFR-베타의 세포외 도메인 내에 위치하는 3개 이상(예를 들면, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상)의 아미노산들의 단일 인접 서열로 이루어질 수 있다. 대안으로, 상기 에피토프는 PDGFR-베타의 세포외 도메인 내에 위치하는 복수개의 비-인접 아미노산들(또는 아미노산 서열들)로 이루어질 수 있다.
항체가 폴리펩티드 또는 단백질 내의 "하나 이상의 아미노산과 상호작용하는"지의 여부를 결정하기 위해, 당해 분야의 통상의 숙련가들에게 공지된 각종 기술들을 사용할 수 있다. 예시적인 기술들로는, 예를 들면, 문헌[참조: Antibodies, Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)]에 기술된 바와 같은 일상적인 교차-차단 검정, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석[참조: Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463] 및 펩티드 개열 분석이 포함된다. 또한, 항원들의 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 화학적 변형과 같은 방법들도 사용될 수 있다[참조: Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496]. 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산들을 동정하는데 사용될 수 있는 다른 방법은 질량 분광법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말해, 상기 수소/중수소 교환 방법은, 관심 단백질을 중수소-표지한 다음 상기 중수소-표지된 단백질에 항체를 결합시킴을 포함한다. 이어서, 상기 단백질/항체 복합체를 물로 이동시켜서, 상기 항체에 의해 보호된 잔기들(상기 잔기들은 중수소-표지된 상태로 남아있다)을 제외한 모든 잔기들에서 수소-중수소 교환이 일어나도록 한다. 상기 항체를 해리시킨 후, 상기 표적 단백질을 프로테아제 개열 및 질량 분광 분석에 적용시켜, 상기 항체가 상호작용하는 특정 아미노산들에 상응하는 중수소-표지된 잔기들을 나타낸다. 예를 들면, 문헌[Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A]를 참조한다.
본 발명은 추가로, 본원에 기재된 특정한 예시 항체들(예를 들면, H1M3299N, H1M3305N, H1M3310N, H1M3361N, H2M3363N, H2M3365N, H2M3368N, H2M3373N, H2M3374N, H4H3094P, H4H3095S, H4H3096S, H4H3097S, H4H3098S, H4H3099S, H4H3102S, H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S 등) 중 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은, 또한, PDGFR-베타에의 결합에 대해, 본원에 기재된 특정한 예시 항체들(예를 들면, H1M3299N, H1M3305N, H1M3310N, H1M3361N, H2M3363N, H2M3365N, H2M3368N, H2M3373N, H2M3374N, H4H3094P, H4H3095S, H4H3096S, H4H3097S, H4H3098S, H4H3099S, H4H3102S, H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S 등) 중 어느 것과 경쟁하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명은, PDGFR-베타에의 결합에 대해, 본원의 실시예 5에 정의된 바와 같은 "Bin 1"의 하나 이상의 항체들(예를 들면, H4H3365N, H4H3374N, H4H3103S 및 H4H3094P)과 교차-경쟁하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 또한, 본 발명은, PDGFR-베타에의 결합에 대해, 본원의 실시예 5에 정의된 바와 같은 "Bin 2"의 하나 이상의 항체들(예를 들면, H4H3099S, H4H3107S, H4H3305N 및 H4H3310N)과 교차-경쟁하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다.
항체가 참조 항-PDGFR-베타 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 또는 결합에 대해 참조 항-PDGFR-베타 항체와 경쟁하는지의 여부는, 당해 분야에 공지되고 본원에 예시된 일상적 방법들을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 시험 항체가 본 발명의 참조 항-PDGFR-베타 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해서는, 상기 참조 항체를 PDGFR-베타 단백질(예를 들면, PDGFR-베타 세포외 도메인의 가용성 부분 또는 세포 표면-발현된 PDGFR-베타)에 결합하도록 한다. 이어서, 상기 PDGFR-베타 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 상기 참조 항-PDGFR-베타 항체와의 포화 결합 후에 상기 시험 항체가 PDGFR-베타에 결합할 수 있다면, 상기 시험 항체는 상기 참조 항-PDGFR-베타 항체와는 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론지을 수 있다. 반면, 상기 참조 항-PDGFR-베타 항체와의 포화 결합 후에 상기 시험 항체가 PDGFR-베타 분자에 결합하지 못한다면, 상기 시험 항체는 본 발명의 참조 항-PDGFR-베타 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 것일 수 있다. 이어서, 관찰된 시험 항체의 결합 부족이 실제로 참조 항체와의 동일한 에피토프에의 결합에 기인하는 것인지 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 상기 관찰된 결합 부족의 원인인지를 확인하기 위해, 추가의 일상적 실험(예를 들면, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행할 수 있다. 이러한 유형의 실험들은 ELISA, RIA, 바이아코어(Biacore), 유동 세포 분석법, 또는 당해 분야에서 이용가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 소정 실시형태에 따르면, 경쟁 결합 검정(예를 들면, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조)으로 측정시, 예를 들면, 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과량의 하나의 항체가 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99% 억제한다면, 2개의 항체들은 동일한(또는 중첩되는) 에피토프에 결합하는 것이다. 대안으로, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이들이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 2개의 항체들은 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이들의 하위집단만이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면, 2개의 항체들은 "중첩되는 에피토프들"을 갖는 것으로 간주된다.
항체가 참조 항-PDGFR-베타 항체와 결합에 대해 경쟁하는지(또는 결합에 대해 교차-경쟁하는지)의 여부를 결정하기 위해서는, 위에 기술된 결합 방법을 두 방향으로 수행한다: 제1 방향에서는, 상기 참조 항체를 포화 조건 하에서 PDGFR-베타 단백질(예를 들면, PDGFR-베타 세포외 도메인의 가용성 부분 또는 세포 표면-발현된 PDGFR-베타)에 결합하도록 한 다음, 상기 PDGFR-베타 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서는, 상기 시험 항체를 포화 조건 하에서 PDGFR-베타 분자에 결합하도록 한 다음, 상기 PDGFR-베타 분자에 대한 참조 항체의 결합을 평가한다. 상기 방향들 둘 다에서, 첫 번째 (포화시키는) 항체만이 PDGFR-베타 분자에 결합할 수 있다면, 상기 시험 항체와 상기 참조 항체는 PDGFR-베타에의 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론짓는다(예를 들면, 본원의 실시예 5에 기술된 검정 방식을 참조하기 바라며, 상기 검정 방식에서는, 가용성 PDGFR-베타 단백질을 센서 팁들 위에 포획하고, 상기 PDGFR-베타-코팅된 센서 팁들을 참조 항체[mAb#1]와 시험 항-PDGFR-베타 항체[mAb#2]로 두 가지 결합 순서 둘 다에 따라 순차적으로 처리한다). 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 결합에 대해 참조 항체와 경쟁하는 항체는 반드시 상기 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하지 않을 수 있지만, 중첩되거나 인접하는 에피토프에 결합함으로써 상기 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
사람 항체의 제조
완전한 사람 모노클로날 항체들을 포함하는 모노클로날 항체들의 생성 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 이러한 공지된 방법들을 본 발명의 맥락에서 사용하여, 사람 PDGFR-베타에 특이적으로 결합하는 사람 항체들을 제조할 수 있다.
예를 들면, VELOCIMMUNE™ 기술 또는 완전한 사람 모노클로날 항체들을 생성하기 위한 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여, 먼저 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 PDGFR-베타에 대한 고 친화도의 키메라 항체들을 단리한다. 아래의 실험 항목에서와 같이, 상기 항체들은 친화도, 선택성, 에피토프 등을 포함하는 목적하는 특성들에 대해 확인되고 선택된다. 필요에 따라, 마우스 불변 영역들을 목적하는 사람 불변 영역, 예를 들면, 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4로 대체하여 완전한 사람 항-PDGFR-베타 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특정 용도에 따라 달라질 수 있지만, 고 친화도의 항원-결합 및 표적 특이도 특성들은 가변 영역에 의해 초래된다. 소정 예에서, 완전한 사람 항-PDGFR-베타 항체들은 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리된다.
생물학적 등가물
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들 및 항체 단편들은, 상기 기술된 항체들의 아미노산 서열들로부터는 벗어나지만 사람 PDGFR-베타에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열들을 갖는 단백질들을 포함한다. 이러한 변이체 항체들 및 항체 단편들은 모 서열(parent sequence)과 비교할 때 아미노산들의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만 상기 기술된 항체들의 생물학적 활성과 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체-암호화 DNA 서열들은, 상기 기재된 서열과 비교할 때 뉴클레오티드들의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 등가인 항-PDGFR-베타 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열들을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열들의 예는 위에 논의되어 있다.
두 가지 항원-결합 단백질들 또는 항체들은, 예를 들면, 이들이 유사한 실험 조건 하에서 단일 용량 또는 다중 용량으로서 동일 몰 용량으로 투여될 때 흡수 속도 및 흡수 정도에서 현저한 차이를 나타내지 않는 약제학적 등가물 또는 약제학적 대체물이라면 생물학적 등가물인 것으로 간주된다. 몇몇 항체들은, 이들이 이들의 흡수 정도에서는 동등하지만 이들의 흡수 속도에서는 그렇지 않다면 등가물 또는 약제학적 대체물인 것으로 간주될 것이며, 이러한 흡수 속도의 차이는 의도적이고 라벨링에 반영되며, 예를 들면 만성적 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 달성에 필수적이지 않고, 연구된 특정 약물 제품에 대해 의학적으로 중요하지 않은 것으로 간주되기 때문에, 여전히 생물학적 등가물인 것으로 간주될 수 있다.
한 실시형태에서, 두 가지 항원-결합 단백질들은 이들의 안전성, 순도 및 효력(potency)에 있어서 임상적으로 유의한 차이가 존재하지 않는다면 생물학적 등가물이다.
한 실시형태에서, 참조 생성물과 생물학적 생성물을 교체 없이 지속한 치료요법에 비해, 임상적으로 유의한 면역원성 변화 또는 효율성 감소를 포함하는 유해 효과들의 위험 증가가 예상되지 않으면서 환자가 참조 생성물과 생물학적 생성물을 1회 이상 교체할 수 있다면, 상기 두 가지 항원-결합 단백질들은 생물학적 등가물이다.
한 실시형태에서, 두 가지 항원-결합 단백질들은, 이들이 둘 다 사용 조건 또는 조건들에 대해 공통의 작용 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해 상기 메커니즘들이 공지된 정도까지 작용한다면 생물학적 등가물이다.
생물학적 등가성은 생체내 및 시험관내 방법들에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 등가성 측정에는, 예를 들면, (a) 항체 또는 이의 대사산물의 농도를 혈액, 혈장, 혈청 또는 다른 생물학적 체액 내에서 시간 함수로 측정하는, 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; (b) 사람 생체내 생체이용률 데이터와 연관시켜 상기 데이터를 합리적으로 예측하는 시험관내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과를 시간 함수로 측정하는, 사람 또는 다른 포유동물에서의 생체내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능 또는 생체이용률 또는 생물학적 등가성을 확립하는 잘 제어된 임상 시험이 포함된다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들의 생물학적 등가성 변이체들은, 예를 들면, 잔기들 또는 서열들의 다양한 치환을 수행하거나, 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단의 또는 내부의 잔기들 또는 서열들을 결실시킴으로써 구성될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기들을 결실시키거나 다른 아미노산들로 대체하여, 복원시 불필요하거나 부정확한 분자내 디설파이드 브릿지(bridge)들의 형성을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적 등가성 항체들에는, 항체들의 당화 특성들을 변경하는 아미노산 변화들, 예를 들면, 당화를 배제시키거나 제거하는 돌연변이들을 포함하는 항-PDGFR-베타 항체 변이체들이 포함될 수 있다.
종 선택성 및 종 교차-반응성
특정 실시형태에 따르면, 본 발명은, 사람 PDGFR-베타에는 결합하지만 다른 종으로부터의 PDGFR-베타에는 결합하지 않는 항-PDGFR-베타 항체들을 제공한다. 본 발명은 또한, 사람 PDGFR-베타에 그리고 하나 이상의 사람이 아닌 종으로부터의 PDGFR-베타에 결합하는 항-PDGFR-베타 항체들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 사람 PDGFR-베타에 결합할 수 있고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 게르빌(gerbil), 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 사이노몰거스(cynomologous), 마모셋(marmoset), 레수스(rhesus) 또는 침팬지 PDGFR-베타 중의 하나 이상에 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있다. 본 발명의 특정한 예시적 실시형태에 따르면, 사람 PDGFR-베타(예를 들면, 단량체성 및/또는 이량체성 hPDGFR-베타 작제물들) 및 사이노몰거스 원숭이(예를 들면, 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)) PDGFR-베타(예를 들면, 단량체성 및/또는 이량체성 mfPDGFR-베타 작제물들)에 특이적으로 결합하는 항-PDGFR-베타 항체들이 제공된다. (예를 들면, 본원의 실시예 3 참조).
면역 접합체
본 발명은 세포독소, 화학요법 약물, 면역억제제 또는 방사성동위원소와 같은 치료학적 구성성분에 접합된 항-PDGFR-베타 모노클로날 항체("면역 접합체")들을 포함한다. 세포독성제에는 세포에 해로운 임의의 제제가 포함된다. 면역 접합체를 형성하기 위한 적합한 세포독성제 및 화학요법제의 예는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, WO 제05/103081호 참조).
다중특이적 항체
본 발명의 항체들은 단일특이적, 이특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체들은 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프들에 특이적일 수 있거나, 둘 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원-결합 도메인들을 함유할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244]을 참조한다. 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 다른 기능성 분자, 예를 들면, 다른 펩티드 또는 단백질에 연결될 수 있거나 이와 공동-발현될 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들면, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유결합적 회합 등에 의해) 다른 항체 또는 항체 단편과 같은 하나 이상의 다른 분자 실체(entity)들에 관능적으로 연결되어, 제2 결합 특이성을 갖는 이특이적 또는 다중특이적 항체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은, 면역글로불린의 하나의 아암(arm)은 사람 PDGFR-베타 또는 이의 단편에 특이적이고, 상기 면역글로불린의 다른 아암은 제2 치료 표적에 특이적이거나 치료학적 구성성분에 접합되는, 이특이적 항체들을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인의 사용을 포함하며, 상기 제1 CH3 도메인과 상기 제2 CH3 도메인은 하나 이상의 아미노산에 의해 서로 차이가 나고, 하나 이상의 아미노산 차이는, 상기 아미노산 차이가 결여된 이특이적 항체에 비해, 단백질 A에 대한 상기 이특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 실시형태에서, 상기 제1 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 상기 제2 Ig CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소시키거나 무효화시키는 돌연변이, 예를 들면, H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해서는 H435R)을 함유한다. 상기 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가의 변형들에는, IgG1 항체들의 경우, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체들의 경우, N44S, K52N 및 V82I(IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체들의 경우, Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I)가 포함된다. 위에 기술된 이특이적 항체 포맷에 대한 변이체들은 본 발명의 범위 내에서 고려된다.
본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 기타 예시적인 이특이적 포맷에는, 예를 들면, scFv-기반 또는 디아바디 이특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 쿼드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예를 들면, 놉-인투-홀과의 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, 류신 지퍼(leucine zipper), 듀오바디(Duobody), IgG1/IgG2, 이중 작용성 Fab(DAF)-IgG, 및 Mab2 이특이적 포맷이 비제한적으로 포함된다(예를 들면, 전술된 포맷들의 검토를 위해 문헌[Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11] 및 상기 문헌에 인용된 참조문헌들을 참조한다). 이특이적 항체들은 또한 펩티드/핵산 접합을 사용하여 구성될 수 있는데, 예를 들면, 직교 화학 반응성을 갖는 비정상적인 아미노산들을 사용하여 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오티드 접합체들을 생성한 다음, 상기 접합체들을 한정된 조성, 원자가 및 기하구조를 갖는 다량체성 복합체들로 되도록 자가-조립한다. (예를 들면, 문헌[Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012]] 참조).
치료학적 제형 및 투여
본 발명은 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들을 포함하는 약제학적 조성물들을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물들은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 이동, 전달, 허용도 등을 제공하는 기타 제제와 함께 제형화된다. 모든 약사들에게 공지된 처방집에서 다수의 적절한 제형들을 발견할 수 있다[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]. 이들 제형에는, 예를 들면, 산제, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 액포(vesicle)(예를 들면, LIPOFECTIN™, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 유액제, 유액제 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카르보왁스 함유 반고체 혼합물이 포함된다. 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 추가 참조한다.
환자에게 투여되는 항체의 용량은 환자의 연령과 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 산출된다. 본 발명의 항체가 성인 환자에서 PDGFR-베타 활성과 관련된 병태 또는 질환을 치료하는데 사용되는 경우, 본 발명의 항체를 체중 ㎏당 보통 약 0.01 내지 약 20㎎, 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7㎎, 약 0.03 내지 약 5㎎, 또는 약 0.05 내지 약 3㎎의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간을 조정할 수 있다. 항-PDGFR-베타 항체를 투여하기 위한 효과적인 투여량 및 투여 계획은 경험적으로 결정될 수 있는데, 예를 들면, 환자의 진행 상황을 주기적 평가에 의해 모니터링하고 이에 따라 용량을 조정할 수 있다. 추가로, 당해 분야에 익히 공지된 방법들을 사용하여 투여량의 종간 스케일링(interspecies scaling)을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351] 참조).
각종 전달 시스템들, 예를 들면, 리포좀내 캡슐, 미세입자, 미세캡슐, 본 발명의 항체 또는 다른 치료 단백질을 발현할 수 있는 재조합세포, 수용체 매개된 엔도사이토시스가 공지되어 있으며, 이들은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 문헌[Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 본 발명의 항체들 및 다른 치료학적 활성 구성성분들은 또한 유전자 치료요법 기술들에 의해 전달될 수 있다. 도입 방법들에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 당해 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내벽(예를 들면, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 시린지를 사용하여 피하 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 디바이스(pen delivery device)는 본 발명의 약제학적 조성물을 전달하는데 용이하게 적용될 수 있다. 이러한 펜 전달 디바이스는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 디바이스는 일반적으로 약제학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 사용한다. 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비워지면, 빈 카트리지를 손쉽게 폐기하고 상기 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 상기 펜 전달 디바이스는 이후 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 디바이스 내에는 교체 가능 카트리지가 존재하지 않는다. 대신에, 일회용 펜 전달 디바이스는 약제학적 조성물로 미리 충전되며 상기 조성물은 당해 디바이스 내의 저장소에 유지된다. 저장소에서 약학적 조성물이 비워지면 디바이스 전체를 폐기한다.
다수의 재사용 가능한 펜 및 자가주사 전달 디바이스가 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용될 수 있다. 이의 예에는, 몇 가지만 들자면, AUTOPEN™(영국 우드스톡 소재의 오웬 멈퍼드, 인크.(Owen Mumford, Inc.)), DISETRONIC™ 펜(스위스 베르그도르프 소재의 디세트로닉 메디컬 시스템즈(Disetronic Medical Systems)), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 엘리 릴리 앤드 코.(Eli Lilly and Co.)), NOVOPEN™ I, II 및 III(덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노디스크(Novo Nordisk)), NOVOPEN JUNIOR™(덴마크 코펜하겐 소재의 노보 노디스크), BD™ 펜(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ 및 OPTICLIK™(독일 프랑크푸르트 소재의 사노피-아벤티스(sanofi-aventis))가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용가능한 일회용 펜 전달 디바이스의 예에는, 몇 가지만 들자면, SOLOSTAR™ 펜(사노피-아벤티스), FLEXPEN™(노보 노디스크) 및 KWIKPEN™(엘리 릴리), SURECLICK™ 자가주사기(미국 캘리포니아주 사우전드 옥스 소재의 암젠(Amgen)), PENLET™(독일 스투트가르트 소재의 하셀마이어(Haselmeier)), EPIPEN(데이, 엘.피.(Dey, L.P.)) 및 HUMIRA™ 펜(미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 랩스(Abbott Labs))이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
소정 상황에서, 당해 약제학적 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 실시형태에서는, 펌프가 사용될 수 있다[참조: Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201]. 다른 실시형태에서는, 중합체성 물질들이 사용될 수 있다[참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida]. 추가의 다른 실시형태에서, 제어된 방출 시스템은 당해 조성물의 표적에 근접하여 위치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만이 필요할 수 있다(예를 들면, 문헌[Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 제어된 방출 시스템들은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 논의된다.
주사 가능 제제에는 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입 등을 위한 용량형이 포함될 수 있다. 이들 주사 가능 제제는 대중적으로 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 주사 가능 제제는, 예를 들면, 위에 기술된 항체 또는 이의 염을, 주사에 통상적으로 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 용해시키거나, 현탁시키거나 유화시켜서 제조할 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 글루코스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장 용액이 있으며, 이들은 알코올(예를 들면, 에탄올), 폴리알코올(예를 들면, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들면, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50mol) 부가물)] 등과 같은 적절한 가용화제와 조합되어 사용될 수 있다. 유성 매질로서는, 예를 들면, 참깨유, 대두유 등이 사용되며, 이들은 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합되어 사용될 수 있다. 이렇게 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰풀 내에 충전된다.
유리하게는, 위에 기술된 경구용 또는 비경구용의 약제학적 조성물은 소정 용량의 활성 구성성분을 고정시키기에 적합한 단위 용량의 용량형으로서 제조된다. 이러한 단위 용량의 용량형에는, 예를 들면, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰풀), 좌제 등이 포함된다. 상기에 언급된 항체의 함유량은 일반적으로 단위 용량의 용량형 1개당 약 5 내지 약 500㎎이며, 특히 주사 형태에서는, 상기에 언급된 항체가 약 5 내지 약 100㎎으로 함유되고, 다른 용량형 경우에는 약 10 내지 약 250㎎으로 함유되는 것이 바람직하다
항체의 치료학적 용도
본 발명의 항체들은, 여러가지 중에서도 특히, PDGFR-베타 발현, 신호전달 또는 활성과 관련이 있거나 그에 의해 매개되는, 또는 PDGFR-베타와 PDGFR-베타 리간드(예를 들면, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD, PDGF-AB 등) 사이의 상호작용을 차단하거나 그렇지 않으면 PDGFR-베타 활성 및/또는 신호전달을 억제함으로써 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 완화에 유용하다. 예를 들면, 본 발명은 안 질환, 섬유증 질환(섬유증), 혈관성 질환 및/또는 암(종양 성장 억제)의 치료 방법들을 제공하며, 상기 방법들은, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 항-PDGFR-베타 항체(또는 항-PDGFR-베타 항체를 포함하는 약제학적 조성물)를 투여함을 포함한다. 본원에 기술된 치료 방법들의 맥락에서, 상기 항-PDGFR-베타 항체는 단일요법으로서(즉, 유일한 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가 치료제(이의 예시는 본원의 별항에 기술되어 있음)와 병용되어 투여될 수 있다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들을 투여함으로써 치료될 수 있는 예시적인 안 질환에는 노화-관련 황반 변성(예를 들면, "습윤" AMD), 삼출성 AMD, 당뇨병성 망막병증(예를 들면, 증식성 당뇨병성 망막병증), 망막 정맥 폐쇄 질환, 예를 들면, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 홍채 혈관신생, 신생혈관성 녹내장, 녹내장에서의 수술후 섬유증, 증식성 유리체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 판누스, 익상편, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종(DME), 혈관성 망막병증, 망막 변성, 포도막염 및 염증성 안 질환이 포함된다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들을 투여함으로써 치료될 수 있는 예시적인 섬유증 질환에는 폐 섬유증(예를 들면, 특발성 폐 섬유증, 블레오마이신-유발성 폐 섬유증, 석면-유발성 폐 섬유증 및 폐색성 세기관지염 증후군), 만성 천식, 급성 폐 손상 및 급성 호흡 곤란 관련 섬유증(예를 들면, 세균성 폐렴 유발성 섬유증, 외상 유발성 섬유증, 바이러스성 폐렴 유발성 섬유증, 호흡장치 유발성 섬유증, 비-폐 패혈증 유발성 섬유증 및 흡인 유발성 섬유증), 규폐증, 방사선-유발성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 안구 섬유증(예를 들면, 안구 섬유성 반흔), 피부 섬유증(예를 들면, 경피증), 간 섬유증(예를 들면, 간경변, 알코올-유발성 간 섬유증, 비-알코올성 지방간염(NASH), 담관 손상, 원발성 담즙성 간경변, 감염- 또는 바이러스-유발성 간 섬유증(예를 들면, 만성 HCV 감염), 자가면역성 간염, 신장(콩팥) 섬유증, 심장 섬유증, 죽상 동맥경화증, 스텐트 재협착증 및 골수섬유증이 포함된다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들을 투여함으로써 치료될 수 있는 예시적인 혈관성 질환에는 혈관증식성 질환, 폐동맥 고혈압, 재협착증, 혈관 반흔 등이 포함된다.
본 발명은 또한, 암의 치료, 종양 성장의 억제, 종양 퇴화의 촉진, 전이의 억제 및/또는 병리학적 혈관형성(예를 들면, 종양 성장과 관련된 혈관형성)의 억제를 위한 방법들을 포함하며, 상기 방법들은 이러한 처치를 필요로 하는 환자에게 본원에 기술된 바와 같은 항-PDGFR-베타 항체를 투여한다. 예를 들면, 본 발명의 항체들 및 항원-결합 단편들은, 예를 들면, 뇌 및 뇌막, 구인두, 폐 및 기관지 수상구조, 위장관, 남성 및 여성 생식관, 근육, 뼈, 피부 및 부속기관, 결합 조직, 비장, 면역계, 조혈 세포 및 골수, 간 및 요로, 및 눈과 같은 특수 감각 기관에서 발생하는 원발성 및/또는 전이성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체들 및 항원-결합 단편들은 다음의 암들 중 하나 이상을 치료하는데 사용된다: 신세포 암종, 췌장 암종, 유방암, 두경부암(예를 들면, 뇌, 구강, 구인두, 비인두, 하인두, 비강, 부비강, 후두, 입술 등의 암), 전립선암, 비뇨기 방광암, 악성 신경교종, 골육종, 골아세포종, 골연골종, 대장암, 위암(예를 들면, MET 증폭을 동반한 위암), 악성 중피종, 성상세포종, 교아종, 수모세포종, 망막아세포종, 다발성 골수종, 난소암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 활막 육종, 갑상선암, 결합 조직 신생물, 카포시 육종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 또는 흑색종.
병용 치료요법 및 제형
본 발명은, 본원에 기술된 항-PDGFR-베타 항체들 중 어느 것을 하나 이상의 추가의 치료학적 활성 구성성분들과 조합하여 포함하는 조성물들 및 치료학적 제형들, 및 이러한 병용물들을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 치료 방법들을 포함한다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은, 예를 들면, VEGF 길항제, 예를 들면, 아플리버셉트와 같은 "VEGF-trap" 또는 US 제7,087,411호에 언급된 바와 같은 다른 VEGF-억제 융합 단백질, 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 베바시주맙, 라니비주맙), VEGF 수용체의 소분자 키나제 억제제(예를 들면, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙) 또는 항-VEGF 수용체 항체와 함께 공동-제형화될 수 있고/있거나 이와 병용하여 투여될 수 있다. 당해 항-PDGFR-베타 항체는 또한 PDGF 리간드 길항제(예를 들면, 항-PDGF-BB 항체, 항-PDGF-DD 항체, 항-PDGF-CC 항체, 항-PDGF-AB 항체, 또는 다른 PDGF 리간드 길항제, 예를 들면, PDGF 리간드에 대항하는, 압타머[예를 들면, Fovista™(미국 뉴저지주 프린스톤 소재의 옵토테크 코프.(Ophthotech Corp.))와 같은 항-PDGF-B 압타머], 안티센스 분자, 리보자임, siRNA, 펩티바디(peptibody), 나노바디 또는 항체 단편)와 병용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 EGFR 길항제(예를 들면, 항-EGFR 항체[예를 들면, 세툭시맙 또는 파니투무맙] 또는 EGFR의 소분자 억제제[예를 들면, 게피티닙 또는 에를로티닙]), Her2/ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4와 같은 다른 EGFR 부류 구성원의 길항제(예를 들면, 항-ErbB2, 항-ErbB3 또는 항-ErbB4 항체, 또는 ErbB2, ErbB3 또는 ErbB4 활성의 소분자 억제제), EGFRvIII 특이적 길항제(예를 들면, EGFRvIII을 특이적으로 결합하는 항체), cMET 길항제(예를 들면, 항-cMET 항체), IGF1R 길항제(예를 들면, 항-IGF1R 항체), 또는 B-raf 억제제(예를 들면, 베무라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720)와 함께 공동-제형화될 수 있고/있거나 이와 병용하여 투여될 수 있다. 소정 예에서, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 PDGFR-알파 억제제(예를 들면, 항-PDGFR-알파 항체), DLL4 길항제(예를 들면, REGN421과 같은, US 제2009/0142354호에 기재된 항-DLL4 항체), Ang2 길항제(예를 들면, H1H685P와 같은 US 제2011/0027286호에 기재된 항-Ang2 항체) 등과 함께 조합되고/되거나, 공동-제형화되고/되거나 병용 투여된다. 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들과 병용하여 유리하게 투여될 수 있는 다른 제제에는 소분자 사이토킨 억제제, 및 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18과 같은 사이토킨에 또는 이들의 수용체에 결합하는 항체를 포함하는 사이토킨 억제제가 포함된다.
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 또한, 항바이러스제, 항생제, 진통제, 코르티코스테로이드, 스테로이드, 산소, 산화방지제, 금속 킬레이터, IFN-감마 및/또는 NSAID와 병용하여 투여될 수 있고/있거나 공동-제형화될 수 있다. 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 또한, (예를 들면, 암 치료 또는 종양 성장 억제 방법들의 맥락에서) 방사선 치료 및/또는 통상적인 화학요법을 추가로 포함하는 치료 용법의 부분으로서 투여될 수 있다.
상기에 언급된 추가의 치료학적 활성 구성성분들 중 어느 것은, 예를 들면, 본원에 언급된 안 질환, 섬유증 질환, 혈관성 질환 및/또는 암 중 어느 것을 포함하는, 항-PDGFR-베타 항체의 투여가 유리한 임의의 질환 또는 장애의 치료를 위해, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들 중 어느 것과 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 안 질환(예를 들면, 습윤 AMD, 당뇨병성 망막병증, CRVO, 또는 본원에 기술된 다른 안 질환들 중 어느 것) 치료의 맥락에서, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체는 VEGF 길항제, 예를 들면, 아플리버셉트와 같은 "VEGF-trap" 또는 US 제7,087,411호에 언급된 바와 같은 다른 VEGF-억제 융합 단백질, 또는 항-VEGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 베바시주맙 또는 라니비주맙)과 함께 공동-제형화될 수 있고/있거나 이와 병용하여 투여될 수 있다.
항-PDGFR-베타 항체 및 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제형의 투여를 포함하여, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체가 VEGF 길항제(예를 들면, 아플리버셉트와 같은 VEGF trap)와 병용되어 투여되는 예시적인 실시형태에서, 상기 개별 구성성분들은 다양한 투여량 조합들을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있고/있거나 공동-제형화될 수 있다. 예를 들면, 상기 항-PDGFR-베타 항체는 0.05㎎, 0.1㎎, 0.2㎎, 0.3㎎, 0.4㎎, 0.5㎎, 0.6㎎, 0.7㎎, 0.8㎎, 0.9㎎, 1.0㎎, 1.5㎎, 2.0㎎, 2.5㎎, 3.0㎎, 3.5㎎, 4.0㎎, 4.5㎎, 5.0㎎ 및 5.5㎎으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양으로 대상체에게 투여될 수 있고/있거나 공동-제형에 함유될 수 있고; 상기 VEGF 길항제(예를 들면, 아플리버셉트와 같은 VEGF trap)는 1.0㎎, 1.1㎎, 1.2㎎, 1.3㎎, 1.4㎎, 1.5㎎, 1.6㎎, 1.7㎎, 1.8㎎, 1.9㎎, 2.0㎎, 2.1㎎, 2.2㎎, 2.3㎎, 2.4㎎, 2.5㎎, 2.6㎎, 2.7㎎, 2.8㎎, 2.9㎎ 및 3.0㎎으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양으로 상기 대상체에게 투여될 수 있고/있거나 공동-제형에 함유될 수 있다. 본 발명의 예시적인 항-PDGFR-베타 항체/아플리버셉트 투여 병용물에는, 예를 들면: (i) 0.2㎎의 항-PDGFR-베타 항체 + 2㎎의 아플리버셉트; (ii) 0.5㎎의 항-PDGFR-베타 항체 + 2㎎의 아플리버셉트; (iii) 1㎎의 항-PDGFR-베타 항체 + 2㎎의 아플리버셉트; (iv) 3㎎의 항-PDGFR-베타 항체 + 2㎎의 아플리버셉트; 및 (v) 4㎎의 항-PDGFR-베타 항체 + 2㎎의 아플리버셉트가 포함된다. 상기 병용물들/공동-제형들은, 예를 들면, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 월 1회, 2개월에 한 번, 3개월에 한번, 4개월에 한 번, 5개월에 한 번, 6개월에 한 번 등을 포함하여, 본원의 별항에 기재된 투여 용법들 중 어느 것에 따라 대상체에게 투여될 수 있다.
상기 추가의 치료학적 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체가 투여되기 전에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 구성성분이, 제2 구성성분이 투여되기 1주 전에, 72시간 전에, 60시간 전에, 48시간 전에, 36시간 전에, 24시간 전에, 12시간 전에, 6시간 전에, 5시간 전에, 4시간 전에, 3시간 전에, 2시간 전에, 1시간 전에, 30분 전에, 15분 전에, 10분 전에, 5분 전에 또는 1분 미만 전에 투여되는 경우, 제1 구성성분은 제2 구성성분이 투여되기 "전에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 치료학적 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체가 투여된 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들면, 제1 구성성분이, 제2 구성성분이 투여된 지 1분 후, 5분 후, 10분 후, 15분 후, 30분 후, 1시간 후, 2시간 후, 3시간 후, 4시간 후, 5시간 후, 6시간 후, 12시간 후, 24시간 후, 36시간 후, 48시간 후, 60시간 후, 72시간 후에 투여되는 경우, 제1 구성성분은 제2 구성성분이 투여된 "후에" 투여되는 것으로 간주될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 추가의 치료학적 활성 구성성분(들)은 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체의 투여와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, "동시에" 투여함에는, 예를 들면, 항-PDGFR-베타 항체와 추가의 치료학적 활성 구성성분을 단일 용량형으로서 대상체에게 투여하거나(예를 들면, 공동-제형화하거나), 개별 용량형들로서 대상체에게 약 30분 내에 또는 그보다 더 단시간 내에 대상체에게 투여하는 것이 포함된다. 개별 용량형들로서 투여하는 경우, 각각의 용량형을 동일한 경로를 통해 투여할 수 있거나(예를 들면, 상기 항-PDGFR-베타 항체와 상기 추가의 치료학적 활성 구성성분을 둘 다 유리체내, 피내 등으로 투여할 수 있거나); 대안으로, 각각의 용량형을 상이한 경로를 통해 투여할 수 있다(예를 들면, 상기 항-PDGFR-베타 항체는 유리체내로 투여할 수 있고, 상기 추가의 치료학적 활성 구성성분은 전신 투여할 수 있다). 모든 사례에서, 상기 구성성분들을 단일 용량형으로서, 동일한 경로에 의한 개별 용량형들로서, 또는 상이한 경로들에 의한 개별 용량형들로서 투여하는 것 모두가 본 명세서의 목적상 "동시 투여"로서 간주된다. 본 명세서의 목적상, 항-PDGFR-베타 항체를 추가의 치료학적 활성 구성성분을 투여하기 "전에", 추가의 치료학적 활성 구성성분을 투여함과 "동시에" 또는 추가의 치료학적 활성 구성성분을 투여한 "후에" 투여하는 것(이들 용어는 위에 정의되어 있음)을, 항-PDGFR-베타 항체를 추가의 치료학적 활성 구성성분과 "병용하여" 투여하는 것으로 간주한다.
본 발명은, 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체를 본원의 별항에 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료학적 활성 구성성분(들)과 공동-제형화한 약제학적 조성물들을 포함한다.
본 발명은 또한, PDGF 길항제와 VEGF 길항제의 병용물을 포함하는 추가의 치료학적 조성물들을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 PDGF 길항제에는 PDGF 수용체 길항제 뿐만 아니라 PDGF 리간드 길항제가 포함된다. 마찬가지로, 본 발명의 이러한 양상에 따른 VEGF 길항제에는 VEGF 수용체 길항제 뿐만 아니라 VEGF 리간드 길항제가 포함된다.
투여 용법
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 다중 용량의 항-PDGFR-베타 항체(또는 항-PDGFR-베타 항체 및 본원에 언급된 추가의 치료학적 활성제들 중 어느 것의 병용물을 포함하는 약제학적 조성물)를 한정된 시간에 걸쳐 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 이러한 양상에 따른 방법들은 다중 용량의 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체를 대상체에게 순차적으로 투여함을 포함한다. 본원에서 사용되는 "순차적으로 투여하는"이란 각각의 용량의 항-PDGFR-베타 항체를 상이한 시점에, 예를 들면, 소정의 간격(예를 들면, 시간, 일, 주 또는 개월)에 의해 분리된 상이한 날짜에 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 본 발명은, 항-PDGFR-베타 항체의 단일 최초 용량, 이어서 상기 항-PDGFR-베타 항체의 하나 이상의 2차 용량, 그리고 임의로 이어서 상기 항-PDGFR-베타 항체의 하나 이상의 3차 용량을 환자에게 순차적으로 투여함을 포함하는 방법들을 포함한다.
용어 "최초 용량", "2차 용량" 및 "3차 용량"은 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체의 시간적 투여 순서를 나타낸다. 따라서, "최초 용량"은 치료 용법의 시작시에 투여되는 용량("기저선 용량"이라고도 칭함)이고; "2차 용량"은 상기 최초 용량 후에 투여되는 용량이며; "3차 용량"은 상기 2차 용량 후에 투여되는 용량이다. 최초 용량, 2차 용량 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항-PDGFR-베타 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도 면에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 특정 실시형태에서, 최초 용량, 2차 용량 및/또는 3차 용량에 함유되는 항-PDGFR-베타 항체의 양은 치료 과정 동안에 서로 달라진다(예를 들면, 적절하게 상향 또는 하향 조정된다). 특정 실시형태에서, 2개 이상(예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 용량을 "부하 용량(loading dose)"으로서 치료 용법 시작시 투여한 다음, 이보다 더 적은 빈도 기준으로 후속 용량(예를 들면, "유지 용량(maintenance dose)")을 투여한다.
본 발명의 특정한 예시적 실시형태에서, 2차 용량 및/또는 3차 용량 각각은 직전의 선행된 용량이 투여된 지 1 내지 26주(예를 들면, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½, 15, 15½, 16, 16½, 17, 17½, 18, 18½, 19, 19½, 20, 20½, 21, 21½, 22, 22½, 23, 23½, 24, 24½, 25, 25½, 26, 26½주 또는 그 이상) 후에 투여된다. 본원에서 사용되는 "직전의 선행된 용량"이란 표현은, 다중 투여의 순서에 있어서 중간에 용량을 개재시키지 않고서 상기 순서대로 바로 다음 용량을 투여하기 전에 환자에게 투여된 항-PDGFR-베타 항체의 용량을 의미한다.
본 발명의 이러한 양상에 따른 방법들은 항-PDGFR-베타 항체의 제2 및/또는 3차 용량을 임의의 갯수로 환자에게 투여함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서는, 오로지 단일 2차 용량만을 상기 환자에게 투여한다. 다른 실시형태에서는, 2개 이상(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상)의 2차 용량들을 상기 환자에게 투여한다. 마찬가지로, 특정 실시형태에서는, 오로지 단일 3차 용량만을 상기 환자에게 투여한다. 다른 실시형태에서는, 2개 이상(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 그 이상)의 3차 용량들을 상기 환자에게 투여한다.
복수개의 2차 용량들을 포함하는 실시형태에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량들과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 2차 용량은 직전의 선행된 용량이 투여된 지 1 내지 2주 또는 1 내지 2개월 후에 상기 환자에게 투여될 수 있다. 마찬가지로, 복수개의 3차 용량들을 포함하는 실시형태에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량들과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들면, 각각의 3차 용량은 직전의 선행된 용량이 투여된 지 2 내지 12주 후에 상기 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 제2 및/또는 3차 용량이 환자에게 투여되는 빈도는 치료 용법의 과정에 걸쳐 달라질 수 있다. 투여 빈도는 또한 개개의 환자의 요구에 따라 주치의에 의해 치료 과정 동안에 임상 검사 후 조정될 수 있다.
본 발명은, 2 내지 6개의 부하 용량들을 제1 빈도(예를 들면, 주 1회, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 월 1회, 2개월에 한 번 등)로 환자에게 투여한 다음, 이보다 더 적은 빈도 기준으로 2개 이상의 유지 용량들을 상기 환자에게 투여하는 투여 용법들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 이러한 양상에 따르면, 상기 부하 용량들을, 예를 들면, 월 1회(예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 부하 용량들을 월 1회 투여함) 투여하는 경우, 상기 유지 용량들은 5주에 한 번, 6주에 한 번, 7주에 한 번, 8주에 한 번, 10주에 한 번, 12주에 한 번 등으로 투여될 수 있다.
항체의 진단 용도
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들은 또한, 예를 들면, 진단 목적을 위해, 샘플 중의 PDGFR-베타를 또는 PDGFR-베타-발현 세포를 검출하고/하거나 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항-PDGFR-베타 항체 또는 이의 단편은 PDGFR-베타의 비정상적인 발현(예를 들면, 과발현, 저발현, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. PDGFR-베타를 위한 예시적인 진단 검정은, 예를 들면, 환자로부터 얻은 샘플을 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체와 접촉시킴을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 항-PDGFR-베타 항체는 검출가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안으로, 비표지된 항-PDGFR-베타 항체는 그 자체가 검출가능하게 표지된 제2 항체와 조합하여 진단 적용분야들에 사용될 수 있다. 상기 검출가능한 표지 또는 리포터 분자는 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I와 같은 방사성동위원소; 플루오레세인, 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광 또는 화학발광 모이어티; 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 루시페라제와 같은 효소일 수 있다. 샘플 중의 PDGFR-베타를 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있는 특정한 예시적 검정에는 효소-결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사선 면역 검정(RIA) 및 형광-활성화 세포 분류(FACS)가 포함된다.
본 발명에 따른 PDGFR-베타 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플에는, 정상적 또는 병리학적 조건 하에서, 검출가능한 양의 PDGFR-베타 단백질 또는 이의 단편들을 함유하는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 체액 샘플이 포함된다. 일반적으로, 먼저 PDGFR-베타의 기저선 또는 표준 수준을 확립하기 위해, 건강한 환자(예를 들면, 비정상적인 PDGFR-베타 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태를 앓고 있지 않은 환자)로부터 얻어진 특정 샘플 중의 PDGFR-베타의 수준을 측정할 것이다. 그런 다음, PDGFR-베타의 상기 기저선 수준을 PDGFR-베타 관련 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 얻어진 샘플 중에서 측정된 PDGFR-베타의 수준과 비교할 수 있다.
실시예
하기 실시예는, 본 발명의 방법들 및 조성물들을 제조하고 사용하는 방법의 완벽한 개시 및 설명을 당해 기술 분야의 통상의 숙련가들에게 제공하기 위한 것이고, 본 발명자들이 본 발명자들의 발명이라고 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치(예를 들면, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위한 노력이 이루어져 왔지만, 약간의 실험적 오차 및 편차를 고려해야만 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다.
실시예 1. PDGFR-베타에 대한 사람 항체의 생성
PDGFR-베타 엑토 도메인을 포함하는 면역원을, 면역 반응을 자극하기 위한 항원 보강제(adjuvant)와 함께, 사람 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스에게 직접 투여하였다. 상기 항체 면역 반응을 PDGFR-베타-특이적 면역검정에 의해 모니터링하였다. 목적하는 면역 반응이 달성되었을 때, 비장세포를 수거하고 마우스 골수종 세포와 융합시켜 이들의 생존력을 보존하고 하이브리도마 세포주를 형성하였다. PDGFR-베타-특이적 항체들을 생산하는 세포주를 동정하기 위해 상기 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선별하였다. 이러한 기술을 사용하여 몇몇의 항-PDGFR-베타 키메라 항체들(즉, 사람 가변 도메인들과 마우스 불변 도메인들을 갖는 항체들)을 수득하였고; 이러한 방식으로 생성된 예시적인 항체들을 다음과 같이 명명하였다: H1M3299N, H1M3305N, H1M3310N, H1M3361N, H2M3363N, H2M3365N, H2M3368N, H2M3373N 및 H2M3374N. 후속적으로, 상기 키메라 항체들로부터의 사람 가변 도메인들을 사람 불변 도메인들 상에 클로닝하여 본원에 기술되는 바와 같은 완전 사람 항-PDGFR-베타 항체들을 제조하였다.
또한, US 2007/0280945A1에 기술되어 있는 바와 같이, 골수종 세포에 융합시키지 않고 항원-양성 B 세포로부터 항-PDGFR-베타 항체들을 직접 단리하였다. 이러한 방법을 사용하여, 몇몇의 완전한 사람 항-PDGFR-베타 항체들(즉, 사람 가변 도메인들 및 사람 불변 도메인들을 갖는 항체들)을 수득하였고; 이러한 방식으로 생성된 예시적인 항체들을 다음과 같이 명명하였다: H4H3394P, H4H3095S, H4H3096S, H4H3097S, H4H3098S, H4H3099S, H4H3102S, H4H3103S, H4H3104S, H4H3105S, H4H3106S, H4H3107S.
당해 실시예의 방법들에 따라 생성된 예시적인 항-PDGFR-베타 항체들의 소정 생물학적 특성들은, 하기에 제시되는 실시예에서 상세하게 기술된다.
실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열
표 1은, 선택된 항-PDGFR-베타 항체들 및 이들의 상응하는 항체 동정자(identifier)들의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 쌍들을 제시한다.
Figure pct00001
항체들은 본원에서 전형적으로 다음의 명명법에 따라 칭한다: Fc 접두어(예를 들면, "H1M", "H2M", "H4H")에 이어, 숫자로 나타낸 동정자(예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같은 "3299", "3363" 또는 "3094")에 이어, "P", "N" 또는 "S" 접미어. 따라서, 이러한 명명법에 따르면, 항체는, 본원에서, 예를 들면, "H1M3299N", "H2M3363N", "H4H3094" 등으로 칭할 수 있다. 본원에서 사용된 항체 명칭에서의 H1M, H2M 및 H4H 접두어는, 상기 항체의 특정한 Fc 영역 이소타입을 나타낸다. 예를 들면, "H1M" 항체는 마우스 IgG1 Fc를 갖는 반면, "H4H" 항체는 사람 IgG4 Fc를 갖는다. 당해 분야의 통상의 숙련가에 의해 이해될 것인 바와 같이, 특정한 Fc 이소타입을 갖는 항체는, 상이한 Fc 이소타입을 갖는 항체로 전환될 수 있지만(예를 들면, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 사람 IgG4를 갖는 항체 등으로 전환될 수 있지만), 어떠한 경우에서도, 가변 도메인들(CDR들을 포함함)은 - 상기 가변 도메인들은 표 1에 나타낸 숫자로 나타낸 동정자에 의해 명시됨 - 동일하게 유지될 것이며, 결합 특성들은 Fc 도메인의 속성과 관계없이 동일하거나 실질적으로 유사한 것으로 예상된다.
하기 실시예에서 사용된 대조군 작제물
항-PDGFR-베타 대조군 항체가 비교 목적을 위해 하기 실시예에 포함되었다. 상기 대조군 항체는 본원에서 대조군 I이라 명명된다: US 7,740,850에 제시되어 있는 바와 같은 "2C5"의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열들을 갖는 사람 항-PDGFR-베타 항체.
실시예 3. 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 사람 PDGFR -베타에 대한 항체 결합
선택된 정제된 항-사람 PDGFR-베타 모노클로날 항체들에 대한 항원 결합에 관한 결합 친화도 및 동력학적 상수(kinetic constant)를, 25℃ 및 37℃에서 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서(Biacore T100, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어 라이프 사이언시스(GE Healthcare Life Sciences)) 검정을 사용하여 측정하였다. 마우스 Fc(접두어 H1M; H2M) 또는 사람 Fc(접두어 H4H)로서 발현된 항체들을, 이들의 각각의 항-Fc 센서 표면 상에 포획하였다(Mab 포획 포맷). 상이한 농도들의 가용성 단량체성 PDGFR-베타 작제물들(hPDGFRb.mmh[서열번호 337], 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis) PDGFRb.mmh[서열번호 340]) 또는 이량체성 PDGFR-베타 작제물들(사람 PDGFRb.mFc[서열번호 338] 또는 사람 PDGFRb.hFc[서열번호 339])을 상기 항-PDFR-베타 모노클로날 항체가 포획된 표면 위로 50㎕/분의 유속으로 주사하였다. 동력학적 회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)는, 스크러버(Scrubber) 2.0 곡선 피팅 소프트웨어를 사용하여 1:1 결합 모델로 데이터를 프로세싱하고 피팅함으로써 결정되었다. 결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t1 /2)는 상기 동력학적 속도 상수들로부터: KD(M) = kd/ka; 및 t1/2(분) = (ln2/(60*kd)로서 산출되었다. 상이한 항-PDGFR-베타 모노클로날 항체들에 대한 동력학적 결합 매개변수들은 표 2 내지 표 5에 나타낸다(NB = 사용된 조건 하에서 결합이 관찰되지 않음; NT = 시험하지 않음).
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
표 2 내지 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 몇몇의 항-PDGFR-베타 항체들은, 사람 및 엠. 파스시쿨라리스(M. fascicularis) PDGFR-베타 작제물들에 대해 나노몰 미만의 친화도를 나타냈다. 또한, 몇몇의 클론들은, 상기 PDGFR-베타 작제물들에 대해 참조(대조군 I) 항체보다 더 단단한 결합(더 낮은 KD)을 나타냈다.
실시예 4. 항-PDGFR-베타 항체들은 PDGFR-베타에 대한 PDGF 리간드들의 결합을 차단한다
A. ELISA-기반 면역검정을 사용하여 평가된 수용체/리간드 차단
본 발명의 소정 항-사람 PDGFR-베타 항체들의 리간드 PDGF-BB에 대한 수용체 결합을 차단하는 상기 항체들의 능력을 우선 ELISA-기반 면역검정으로 평가하였다. 간략하게, 플레이트들을 사람 PDGF-BB(2㎍/㎖)로 코팅하였다. 별도로, 250pM의 비오티닐화된 가용성 hPDGFR-베타.mmh("biot-hPDGFR-베타-mmh", 서열번호 337)를, 일련의 희석된 항-PDGFR-베타 항체들(0 내지 100nM)과 실온(25℃)에서 1시간 동안 미리 혼합하였다. 상기 평형화된 PDGFR-베타/항체 용액들을 리간드-코팅된 플레이트들에 첨가하여 1시간 동안 항온배양되도록 하고, 세척하였다. 결합된 biot-hPDGFR-베타.mmh의 수준을, HRP 접합된 스트렙트아비딘을 사용하여 검출하였다. 프리즘(Prism) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 리간드에 결합된 hPDGFR-베타-mmh의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 양으로서의 IC50 값을 산출하였다. 최대 차단 값도 산출하였으며, 이는, 기저선에 대한 항체의 차단 능력을 반영한다. 용량 곡선 상에서 일정량의 250pM biot-hPDGFR-베타-mmh에서 측정된 흡광도를 0% 차단으로서 정의하고, PDGFR-베타가 첨가되지 않은 흡광도를 100%로서 정의한다. 가장 높은 항체 농도를 함유하는 웰의 흡광도가 최대 차단율(%)을 결정하였다. 결과들은 표 6에 나타낸다. ("E"는 당해 항체가 인핸서(enhancer)임을 나타내고, 즉, 항체 부재시보다 소정 농도의 항체 존재시에 신호가 더 높았다.)
Figure pct00008
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 몇몇의 항체들은 PDGFR-베타와 이의 천연 리간드 PDGF-BB의 상호작용을 약 7.6nM(H1M3299N) 내지 약 66pM(H4H3107S) 범위의 IC50 값으로 강력하게 차단하였고, 소정 항체들은 수용체-리간드 상호작용을 증강시켰다(예를 들면, H4H3097S, H4H3098S 및 H4H3102S).
B. 실시간 바이오센서 검정을 사용하여 평가된 수용체/ 리간드 차단
또한, 사람 PDGFR-베타에 대한 리간드(PDGF-BB, PDGF-DD 및 PDGF-AB) 결합을 차단하는 선택된 항-사람 PDGFR-베타 항체들의 능력을, 실시간 SPR 바이오센서 검정(Biacore 3000)을 사용하여 평가하였다.
간략하게, 폴리클로날 토끼 항-마우스 Fc 항체(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬스케어 라이프 사이언시스)와 유도체화된(공유결합적으로 커플링된) 바이아코어 센서 표면 상에 400RU의 가용성 사람 PDGFR-베타.mFc(서열번호 338)를 포획하였다. 상기 포획된 표면을 300nM의 선택된 항-PDGFR-베타 항체들로 4분 동안 포화시킨 다음, 30nM의 리간드(PDGF-BB, PDGF-DD 또는 PDGF-AB)를 25℃에서 추가의 4분 동안 주사하였다. 실시간 결합 반응을 검정 과정에 걸쳐 모니터링하고, 이를, 포획된 항체의 부재 하에 상기 유도체화된 포획된 대조군 표면 위에 PDGF 리간드를 적용시켰을 때에 측정된 결합 반응과 비교하였다. 결과들은 도 1에 예시된다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 항체 부재의 대조군과 비교하는 경우, 모든 항체들이, PDGF-BB 및 PDGF-AB 리간드를 차단하는 능력을 나타냈고, 더 적은 항체들이 PDGF-DD를 효과적으로 차단할 수 있었다. 주목할 것은 항체 H4H3094P, H4H3374N 및 대조군 I이며, 이들은, 상기 바이아코어 센서 표면 위에 리간드를 적용했을 때 최소량의 RU 반응을 나타냈다.
실시예 5. 항-PDGFR-베타 항체들의 교차-경쟁 분석
사람 PDGFR-베타에 결합하기 위해 서로 경쟁하는 선택된 항체들의 능력을 평가하기 위해 교차-경쟁 검정을 수행하였다. 간략하게, 가용성 사람 PDGFR-베타.mmh(서열번호 337)를 anti-Penta-his Octet 센서 팁(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 포르테바이오 코프.(ForteBio Corp.))들 상에 포획하였다. 각각의 PDGFR-베타.mmh-코팅된 센서 팁을 제1 항-PDGFR-베타 항체(Mab #1; 50㎍/㎖)로 5분 동안 포화시켰다. 이어서, 각각의 센서 팁을 제2 항-PDGFR-베타 항체(Mab #2)의 용액으로 포화시켰다. 이어서, Mab #1과 미리 복합체화된 PDGR-베타.mmh에 대한 Mab #2 결합의 실시간 반응을 모니터링하였다. 모든 검정은, 제조업자(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재의 포르테바이오 코프.)의 지침에 따라 Octet HBST 완충액 중에서 Octet RED384 바이오센서 상에서 1000rpm의 유속으로 25℃에서 수행하였다. 결과들은 도 2에 예시된다.
0.1nM 미만의 결합 반응들은 도 2에 흑색 또는 회색 음영으로 나타내고, 이들은 상응하는 항체 쌍들이 PDGFR-베타에 결합하기 위해 서로 경쟁한다는 것을 나타낸다. 0.2nM을 초과하는 결합 반응들(도 2에서 백색 박스 안에 나타냄)은, PDGFR-베타에 결합하기 위해 서로 경쟁하지 않는 항체 쌍들을 나타낸다.
당해 실시예의 결과들은, 본 발명의 항-PDGFR 베타가 에피토프 결합 특성들에 기초하여 2개의 별개의 "bin"들로 그룹핑될 수 있음을 나타낸다: Bin 1로는 대조군 I, H4H3365N, H4H3374N, H4H3103S 및 H4H3094P가 포함된다. Bin 2로는 H4H3099S, H4H3107S, H4H3305N 및 H4H3310N이 포함된다. 당해 실시예의 결과들은, Bin 1의 항체들이 Bin 2의 항체들보다는 PDGFR-베타 상의 별개의 영역들에 결합한다는 것을 시사한다.
실시예 6. 항- PDGFR -베타 항체들을 사용한 리간드 - 매개된 수용체 활성화 및 MAPK 신호전달의 억제
본 발명의 항-PDGFR-베타 항체들을 추가로 특성확인하기 위해, PDGFR-베타의 2개의 공지된 결합 리간드들인 PDGF BB 및 DD에 의한 PDGFR-베타의 활성화를 검출하기 위한 생물학적 검정을 진행하였다. PDGFR-베타 수용체들과 이의 리간드들 사이의 상호작용은, 증식, 생존, 이동 및 형태형성(morphogenesis)을 포함하는 다양한 세포 프로세스들의 유도에 필수적이다[참조: Hoch and Soriano, 2003, Development 130:5769-4784]. PDGF 수용체는 수용체 티로신 키나제이며, 이는, PDGF BB 및 DD에 의한 활성화시 알파 및 베타 수용체들의 동종이량체화 또는 이종이량체화에 의해 형성된다. 활성화시, 자가-인산화가 유도되고, Ras-MAPK(미토겐-활성화된 단백질 키나제) 경로를 포함하는 몇몇의 신호 전달 경로 캐스케이드들이 촉발된다.
PDGFR 베타에의 리간드 결합을 통한 MAPK 신호 전달 경로의 활성화를 검출하기 위해, 루시페라제 리포터(혈청-반응성 요소(Serum-Responsive Element)[SRE-루시페라제])에 따라 전장 사람 PDGFR-베타를 발현하도록 안정한 HEK293 세포주를 생성하였다. HEK293/hPDGFR-베타 세포를 96-웰 플레이트 내에 씨딩하고, 0.1% FBS를 함유하는 저-혈청 배지 중에서 밤새 유지하였다. 항온배양 후, 용량 반응을 측정하기 위해, 1:3 일련의 희석된 PDGF BB 또는 DD를 100nM 내지 0.002nM 범위의 농도로 세포에 첨가하였다. 리간드-활성화된 MAPK 신호전달 캐스케이드의 억제를 실험하기 위해, 항체들을 1:3으로 일련 희석하고, 100nM 내지 0.002nM 범위의 농도로 세포에 첨가하였다. PDGF BB 및 DD 농도는 각각 250pM 및 400pM로 일정하게 유지되었고, 5.5시간 후에 루시페라제 활성이 검출되었다. PDGF BB 및 DD는 사람 PDGFRb를 각각 0.04 내지 1.11nM 및 0.34 내지 1.82nM의 EC50으로 활성화시켰다. PDGFR-베타-매개된 신호전달을 50% 억제하는데 필요한 항체 농도(IC50)를 각각의 항체에 대해 측정하였다. 결과들은 표 7에 요약한다(NB = 차단하지 않음; 이소타입 1 = 항체에 무관한 마우스 IgG 음성 대조군; 이소타입 2 = 항체에 무관한 사람 IgG 음성 대조군).
Figure pct00009
표 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 몇몇의 항-PDGFR-베타 항체들은 리간드-의존적 PDGFR-베타 활성화를 나노몰 미만의 범위 내의 IC50으로 강력하게 차단하였다. 또한, 마우스 IgG 음성 대조군(이소타입 1)과 사람 IgG 음성 대조군(이소타입 2)은 둘 다 상기 수용체의 리간드 활성화를 차단하지 않았다.
실시예 7. PDGFR -베타-발현 세포 상에서의 항- PDGFR -베타 항체들의 내재화(internalization)
항체 매개된 수용체 내재화를 연구하기 위해, 사람 PDGFR-베타를 발현하도록 조작된(engineered) 세포(HEK293/SRE-luc/PDGFRb 세포)를 사용하여 실험을 수행하였다. 간략하게, 웰당 20,000개의 HEK293/SRE Luc/PDGFRb 세포를 완전 배지(DMEM 중의 10% FBS, Pen/Strep/Glut, NEAA 및 G418) 중에서 밤새 플레이팅하고, 4℃에서 30분 동안 10㎍/㎖의 항-PDGFR-베타 항체들로 염색하였다. 세포를 2회 세척하고, Dylight 488 접합된 Fab 염소 항-사람 IgG 2차 항체(10㎍/㎖; 미국 펜실베니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리서치 래보라토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories))로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 2시간 동안 항온배양하여 수용체 내재화를 허용하였다. 표면-결합된 항체들을 내재화된 항체들로부터 구별하기 위해, 세척된 세포를 4℃에서 45분 동안 항-Alexa fluor 488(미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코프.(Invitrogen Corp.))와 함께 항온배양함으로써 Alexa-488 형광성을 소광시켰다. ImageXpress Micro XL(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰큘러 디바이시스 엘엘씨(Molecular Devices LLC))를 사용하여 이미지를 촬상하고, 콜럼버스(Columbus) 소프트웨어(미국 매사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))를 사용하여 스팟 분석(spot analysis)을 수행하였다. 각각의 항체의 소광된 염색부위(즉, 내재화된 항체)를 대조군 1 항체의 소광된 염색부위와 비교함으로써 상대적 내재화를 산출하였다. 결과들은 표 8에 요약된다.
Figure pct00010
표 8에 나타낸 바와 같이, 연구된 모든 항-PDGFR-베타 항체들은 당해 검정 포맷에서 강건한 내재화를 나타냈으며, 이는, 다양한 치료학적 맥락에서 PDGFR-베타-발현 세포를 효과적으로 표적화하는 상기 항체들의 잠재적 능력을 반영한다.
실시예 8. 항-PDGFR-베타 항체들은 PDGFR-베타 상의 별개의 도메인들 내에서 결합한다
PDGFR-베타의 세포외 부분은, D1 내지 D5라고 칭하는 5개의 Ig-유사 C2-타입 도메인들로 이루어진다. D1 내지 D3은 고 친화도 리간드 결합을 위해 필요하다. 당해 실시예에서는, 본 발명의 소정 항-PDGFR-베타 항체들이 어떠한 세포외 도메인(들)과 상호작용하는지를 결정하기 위한 실험을 수행하였다.
당해 실험을 위해, 4개의 상이한 PDGFR-베타 세포외 도메인 작제물들: D1(서열번호 342), D1 내지 D2(서열번호 343), D1 내지 D3(서열번호 344), 및 D1 내지 D4(서열번호 345)뿐만 아니라 전장 PDGFR-베타를 사용하였다. 4개의 상이한 항-PDGFR-베타 항체들을 표면 플라스몬 공명(바이아코어)에 의해 상기 각종 작제물들에의 결합에 대해 시험하였다. 간략하게, 150 내지 200RU의 항-PDGFR 베타 항체를 항-사람 Fc CM5 칩(chip)을 통해 포획하였다. 이어서, 상기 개별 도메인 작제물들 또는 전장 PDGFR 베타를 50nM의 농도로 상기 항체-결합된 표면 위에 적용하였다. 상기 각종 항체들이 상기 각종 도메인 작제물들에 결합하는 능력을 평가하였다. 결과들은 표 9에 나타낸다. (-) = 결합이 관찰되지 않음; (+) = 결합이 관찰됨; ND = 측정하지 않음.
Figure pct00011
표 9에 요약된 바와 같이, 모든 항체들은 전장 PDGFR-베타에 결합하였다. 2개의 항체들 H4H3094P 및 H4H3374N은, 도메인 2에 결합하는 것으로 측정되었다. 흥미롭게도, 이들 2개의 항체는, 또한, ELISA 면역검정에 기초한 리간드 차단제이기도 하며, 이는, 도메인 2가 리간드(PDGF-BB) 결합에 중요함을 확인시켜 준다. 시험된 다른 2개의 예시 항체들 H4H3099S 및 H4H3305N은 상기 도메인 작제물들 중 어느 것에도 결합하지 않았으며, 이는, 이들 항체가 고 친화도 결합을 위해 도메인 4와 도메인 5 사이의 아미노산들 및/또는 도메인 5 자체를 필요로 할 수도 있음을 시사한다.
실시예 9. 항- PDGFR -베타 항체들은 생체내 망막 모델에서 혈관주위세포를 고갈시킨다
2개의 예시적 항-PDGFR 베타 항체들 H4H3374N 및 H4H3094P를 생체내 망막 혈관주위세포 고갈 모델에서 시험하였다. 혈관주위세포는, PDGFR-베타를 발현하는 평활근-유사 세포이다. 내피 세포 상에서 발현된 PDGF-B는 새로 형성되는 혈관으로의 혈관주위세포의 모집(recruitment)을 담당하며, 이에 의해 혈관형성 및 혈관 구조(architecture)의 확립을 촉진한다. 그러나, 혈관주위세포와 내피 사이의 상호작용, 및 PDGF-B/PDGFR-베타 신호전달은 병원성 혈관형성 동안에 파괴되어, 제어되지 않는 혈관 형성을 야기한다. 안 질환에서, 이러한 혈관신생은 시력 저하 및 실명을 초래할 수 있다.
제1 실험에서는, 새로 형성되는 혈관구조에서의 PDGF-B/PDGFR-베타 신호전달의 차단 효과를 확인하기 위해, 사람화된 PDGFR-베타 마우스 새끼에게 3㎎/㎏의 H4H3374N, H4H3094P, 대조군 I(2C5) 또는 사람 Fc(hFc)를 피하(s.c.) 주사하였다. 간략하게, 생후 2일째(P2)의 사람화된 PDGFR-베타 새끼에게 3㎎/㎏의 hFc 대조군 또는 PDGFR-베타 항체를 피하 주사하였다. 생후 5일째에, 새끼를 희생시켰다. 양쪽 안구를 수집하고 4% P.F.A 중에서 1시간 동안 고정시켰다. 안구를 PBS로 3회 세척하고, 망막을 절개하여 유리체 혈관을 제거하였다. 망막을, 항체 희석 혈청(ADS; PBS 중 0.05% 트리톤-X-100 중의 1% BSA) 중에서 제조된 토끼 항-NG2 콘드로이틴 설페이트 1차 항체로 실온에서 O/N 염색하였다. 항온배양 후, 모든 망막을 15분 동안 PBS 중에서 3회 세척한 다음, 플루오레세인 표지된 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia) 렉틴, 및 ADS 중에서 제조된 염소 항-토끼 alexa 594 표지된 2차 항체로 4℃에서 O/N 염색하였다. 항온배양 후, 모든 망막을 다시 15분 동안 PBS 중에서 3회 세척하였다. 망막을 슬라이드 위에 평면-장착(flat-mount)시키고, DAPI 없이 Fluoromount-G™를 사용하여 커버-슬립핑(cover-slipping)하였다.
망막을, 니콘(Nikon) 80i 형광 현미경을 사용하여 촬상하였다. 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) 및 포베아(Fovea)를 사용하여 이미지를 분석하였다. 각각의 처리군에 대해, hFc에 대해 정규화된 평균 NG2 양성 면적을 측정하였다. 촬상과 분석은 둘 다 맹검 방식으로 수행되었다. 프리즘 소프트웨어에서 일원 ANOVA를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 결과들은 표 10 및 표 11에 요약된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
표 10 및 표 11에 나타낸 바와 같이, 평균 망막 NG2 양성 면적은, hFc에 비해 상기 항-PDGFR-베타 항체들로 처리된 마우스에서 감소하였다. NG2 양성 면적은 hFc에 비해 항체들 H4H3374N 및 H4H3094P의 경우에 유의하게 감소하였다(p<0.001). 또한, H4H3374N은 H4H3094P와 대조군 I 항체 둘 다에 비해 NG2 양성 면적에서 가장 큰 감소를 나타냈다.
별도의 실험 세트에서, P2에 C57Bl/6 마우스 새끼에게 50㎎/㎏, 25㎎/㎏, 12.5㎎/㎏ 또는 6.25㎎/㎏ 용량의 항-마우스 PDGFR-베타 항체 "mAb39"(상기 항체는 APB5라 칭하는 항체의 가변 영역들을 가짐, 문헌[Uemura et al., J. Clin. Invest. 2002; 110(11):1619-1628] 참조) 또는 대조군으로서의 50㎎/㎏의 Fc를 피하(SC)로 주사하였다(연구 1). P5에 토끼 항-NG2 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 1차 항체를 사용하여 혈관주위세포 피복(coverage)에 대한 효과를 평가하였다. 망막 혈관의 발달에 있어서, ≥12.5㎎/㎏인 모든 mAb39 용량이 혈관의 혈관주위세포 피복을 억제시켰다.
다른 연구(연구 2)에서, P2 새끼에게 25㎎/㎏의 mAb39 또는 대조군을 SC로 주사하였다. P5에 망막을 수집하고, 그리포니아 심플리시폴리아(Griffonia Simplicifolia) 렉틴("GS 렉틴 I", 벡터 랩스(Vector Labs))으로 염색하였다. 25㎎/㎏ 용량에서, mAb39는, 대조군들에 비해 혈관발달된(vascularized) 망막 면적 및 혈관 밀도를 중간 정도로 감소시켰다.
별도의 실험 세트(연구 3)에서, P4에서 새끼의 좌측 안구에 5㎍(0.5㎕)의 mAb39 또는 대조군을 유리체내(IVT)로 주사하고, P6에서 수집하였다. 단일 유리체내 항-PDGFR-베타 항체 투여는 벽 세포(mural cell)를 거의 완전히 고갈시켰고, 망막 혈관 분화 및 형태(morphology)에 대한 현저한 효과들, 예를 들면, 불규칙적인 혈관 구경을 생성시켰다. 성체 마우스 안구에서의 PDGFR-베타 중화의 효과를 조사하기 위해 추가의 실험들을 수행하였다. 특히, 성체 마우스의 좌측 안구에 mAb39(5㎍ 또는 10㎍) 또는 대조군(5㎍ 또는 10㎍)을 IVT로 주사하였다. 48시간 후 안구를 수집하고 항-NG2 및 GS 렉틴 I로 염색하였다.　 성체 마우스에서, mAb39는 임의의 혈관주위세포 손실 또는 임의의 혈관 형태 변화들의 증거를 생성시키지 않았다.
이들 연구는, 총체적으로, PDGFR-베타의 선택적인 약리학적 중화는 혈관주위세포 고갈을 촉진시키는데 효과적이며, 망막 신생혈관의 발달에 있어서 혈관 형태 및 성장의 변화들에 기여한다는 것을 입증한다. 대조적으로, 상기 동일한 억제는, 성체 마우스 망막의 확립된 혈관구조 내의 성숙한 혈관주위세포 및 혈관에 대해서는 어떠한 효과도 갖지 않는 것으로 밝혀진다.
실시예 10. 노화-관련 황반 변성을 갖는 환자에서의 항-PDGFR-베타 항체 및 VEGF 길항제를 포함하는 병용 제형의 1단계 임상 시험
연구 개요
신생혈관성 노화-관련 황반 변성(AMD)을 갖는 환자에서 유리체내(IVT) 아플리버셉트와 함께 유리체내 주사에 의해 전달된 본 발명의 항-PDGFR-베타 항체의 안전성을 시험하기 위한 1단계 임상 시험을 수행한다. 아플리버셉트의 아미노산 서열(VEGFR1R2-FcΔC1(a)라고도 공지됨)뿐만 아니라 상기 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열도, 예를 들면, WO 2012/097019에 제시된다.
당해 연구의 1차적 목적은 신생혈관성 AMD를 갖는 환자에서의 유리체내(IVT) 항-PDGFR-베타 항체의 안전성을 조사하는 것이다. 2차적 목적은 신생혈관성 AMD를 갖는 환자에서의 각막 혈관신생(CNV)에 대한 IVT 항-PDGFR-베타의 해부학적 효과들을 탐색하는 것이고, 그리고, 사람에서의 항-PDGFR-베타 및 아플리버셉트의 약동학을 측정하는 것이다. 당해 연구의 다른 목적은 항-PDGFR-베타 항체 및/또는 아플리버셉트로 치료된 대상체에서 항-PDGFR-베타 항체 및/또는 아플리버셉트에 대항하는 항체의 존재를 측정하는 것이다.
표적 집단
당해 연구를 위한 표적 집단은, 신생혈관성 AMD를 갖는 50세 이상의 남성 및 여성이다. 4개의 계획된 코호트들에 대략 3 내지 6명의 환자들이 등재될 것이다. 총 15 내지 24명의 환자들이 계획된다. 6명의 환자들은 최대 허용 용량(MTD)으로, 또는, 확인된다면, 최고 용량 수준으로 등재될 것이다.
주요 포함/배제 기준
당해 연구를 위한 주요 포함 기준은 다음과 같다: (1) 50세 이상의 남성 또는 여성; 및 (2) 안 연구에서 FA에 의해 증명된 바와 같은, 중심와에 영향을 미치는 중심와부근 병변들을 포함하는, AMD에 후속하는 활성 중심와하 CNV.
주요 배제 기준은 다음과 같다: (1) 연구 시작일(1일째)의 8주 이내의 안 연구에서 IVT 항-VEGF 치료요법; (2) PDGF 또는 PDGFR 억제제를 사용한 임의의 선행 치료; (3) 안 연구에서 25㎜Hg 이상의 안압; (4) 어느 한쪽 눈에서의 감염성 안검염, 각막염, 공막염 또는 결막염의 증거; (5) 스크리닝 방문의 3개월 이내에 어느 한쪽 눈에서의 임의의 안내 염증/감염; (6) 안 연구에서 스크리닝 평가시 육안으로 볼 수 있는 현재의 홍채 혈관신생, 유리체 출혈 또는 견인 망막 분리(tractional retinal detachment); (7) 어느 한쪽 눈에서 AMD가 아닌 다른 임의의 원인으로 인한 CNV의 증거; (8) 어느 한쪽 눈에서의 당뇨병성 망막병증 또는 당뇨병성 황반 부종의 증거; (9) CNV를 문서화하기 위한 사진, FA 또는 OCT가, 예를 들면, 매체 불투명성, 플루오레세인 염료에 대한 알레르기, 또는 정맥 접근 결여로 인해 수득 불가능함; 그리고 (10) 1일째의 6주 이내에 전신적 (IV) 항-VEGF 투여.
연구 설계
환자들은 1일째/기저선(2회차 방문)의 2주 전까지의 스크리닝 방문시 연구 적격성(eligibility)에 대해 평가될 것이다. 1일째/기저선(2회차 방문)에, 환자들은 안전성 평가를 거친 후에 최초 용량의 연구 약물을 투여받을 것이다.
적격한 환자들은, 등재가 공개된 최신 코호트에 등재될 것이다. 초기 코호트는 항-PDGFR-베타/아플리버셉트(0.2㎎:2㎎으로 공동 제형화됨)를 투여받을 것이다. 1일째 및 29일(±3일)째에, 환자들은 항-PDGFR-베타/아플리버셉트의 주사를 투여받을 것이다.
항-PDGFR-베타/아플리버셉트의 용량은, 선행하는 코호트 동안에 평가된 안전성 및 허용도에 기초하여 상승될 것이다(최초 환자의 최초 용량으로부터 출발하여, 해당 코호트의 최종 환자의 2차 용량 후 2주까지, 또는 대략 6주째까지). 또한, 각각의 코호트에 등재된 최초 환자는, 추가의 환자들이 투약되기 전에, 최초 용량 후 1주 이상 동안 관찰될 것이다. 일단 데이터가 검토되면, 후속 용량 코호트로의 상승이 수행될 것이다. 환자내 용량 상승은 허용되지 않을 것이다.
환자들은 연구 방문시에 안구 및 전신 안전성(안과 검사, 실험실 평가 등을 포함함) 및 효능(OCT, FA/FP, CNV 면적, 전형적 CNV 크기, 전체 병변 크기, 황반 용적, 촬상, 및 4-미터 ETDRS 프로토콜을 사용하는 BCVA)에 대해 평가될 것이며, 24주째까지 이어질 것이다.
연구 약물 치료
4개의 상이한 항-PDGFR-베타/아플리버셉트 공동-제형들이 환자들에게 투여될 것이다. 상기 공동-제형들은 표 12에 요약된다.
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각각의 제형은 10mM 인산나트륨, pH 6.2, 0.03%(w/v) 폴리소르베이트 20, 5%(w/v) 수크로스, 및 40mM 염화나트륨으로 구성될 것이다.
각종 항-PDGFR-베타/아플리버셉트 공동-제형들은 IVT 주사를 통해 전달될 것이고, 주사 용적은 50㎕일 것이다. 상기에 언급된 바와 같이, 환자들은 상기 공동-제형의 2회 개별 투여를 받을 것이다. 제1 투여는 1일째에 이루어질 것이고, 제2 투여는 29일째에 이루어질 것이다.
1차 및 2차 종말점
당해 연구의 1차 종말점은 연구 약물의 안전성이다. 2차 종말점들은: (1) 8주째와 12주째에 (OCT에 의해 측정된) 기저선으로부터의 중심 망막 두께의 변화; (2) 8주째와 12주째에 (OCT에 의해 측정된) 망막 유체의 완전한 분해를 갖는 환자들의 비율; (3) 8주째와 12주째에 (OCT에 의해 측정된) 기저선으로부터의 CNV 면적의 변화; (4) 8주째와 12주째에 (FA에 의해 측정된) 기저선으로부터의 CNV 크기의 변화; (5) 8주째와 12주째에 (FA에 의해 측정된) 기저선으로부터의 누출 면적의 변화; (6) 기저선으로부터의 BCVA의 변화; 및 (7) 항-약물 항체들의 약동학 및 개발이다.
본 발명은, 본원에 기술되어 있는 특정 실시형태에 의해 범위가 한정되는 것은 아니다. 실제로, 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터, 본원에 기술된 것들 이외의 본 발명의 다양한 변형들이 당해 분야의 숙련가들에게 명백해질 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTI-PDGFR-BETA ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 9850A-WO <150> US 61/750,437 <151> 2013-01-09 <150> US 61/863,452 <151> 2013-08-08 <150> US 61/909,421 <151> 2013-11-27 <160> 345 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggct tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcactt atatcaaatg ttggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa ctcgctgttt 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaagggggcc 300 gactactact actacggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Leu His Trp Val 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Leu Asp Met Pro Tyr His Ile 225 230 235 240 Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr 245 250 255 Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys 260 265 270 Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly 275 280 285 Glu Val Gly Ala Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu 290 295 300 Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys 305 310 315 320 Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser 325 330 335 Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val 340 345 350 Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His 355 360 365 Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro 370 375 380 Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln 385 390 395 400 Thr Val Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp 405 410 415 Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Met 420 425 430 Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu 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Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu 115 120 125 Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu 130 135 140 Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu 145 150 155 160 His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln 165 170 175 Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr 180 185 190 Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg 195 200 205 Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val 210 215 220 Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn 225 230 235 240 Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser Gly Arg 245 250 255 Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile 260 265 270 Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr 275 280 285 Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys 290 295 300 Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly 305 310 315 320 Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu 325 330 335 Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys 340 345 350 Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser 355 360 365 Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val 370 375 380 Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His 385 390 395 400 Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro 405 410 415 Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln 420 425 430 Thr Val Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp 435 440 445 Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr 450 455 460 Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gln Leu Glu Thr Asn Val 465 470 475 480 Thr Tyr Trp Glu Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Val Ser Thr Leu Arg 485 490 495 Leu Gln His Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn 500 505 510 Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu 515 520 525 Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu 530 535 540 Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro 545 550 555 560 Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Ile Glu Ser Val Ser Ser Asp Gly 565 570 575 His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Thr 580 585 590 Trp Glu Leu Pro Arg Asp Gln Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser 595 600 605 Gly Ala Phe Gly Gln Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His 610 615 620 Ser Gln Ala Thr Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala 625 630 635 640 Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser 645 650 655 His Leu Gly Pro His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr 660 665 670 Lys Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Arg Tyr Gly Asp 675 680 685 Leu Val Asp Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gln His His 690 695 700 Ser Asp Lys Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ser Asn Ala Leu 705 710 715 720 Pro Val Gly Leu Pro Leu Pro Ser His Val Ser Leu Thr Gly Glu Ser 725 730 735 Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val 740 745 750 Pro Met Leu Asp Met Lys Gly Asp Val Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Ser 755 760 765 Ser Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Asp Asn Tyr Val Pro Ser Ala Pro Glu 770 775 780 Arg Thr Cys Arg Ala Thr Leu Ile Asn Glu Ser Pro Val Leu Ser Tyr 785 790 795 800 Met Asp Leu Val Gly Phe Ser Tyr Gln Val Ala Asn Gly Met Glu Phe 805 810 815 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val 820 825 830 Leu Ile Cys Glu Gly Lys Leu Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala 835 840 845 Arg Asp Ile Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys Gly Ser Thr Phe 850 855 860 Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Ser Leu Tyr 865 870 875 880 Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 885 890 895 Phe Thr Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gln 900 905 910 Phe Tyr Asn Ala Ile Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gln Pro Ala His 915 920 925 Ala Ser Asp Glu Ile Tyr Glu Ile Met Gln Lys Cys Trp Glu Glu Lys 930 935 940 Phe Glu Ile Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu Val Leu Leu Leu Glu Arg 945 950 955 960 Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu 965 970 975 Phe Leu Arg Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu 980 985 990 Pro Gly Phe His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu 995 1000 1005 Tyr Thr Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile Pro 1010 1015 1020 Leu Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu Glu Gly 1025 1030 1035 1040 Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn Thr Ser Ser 1045 1050 1055 Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp Glu Pro Glu Pro 1060 1065 1070 Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu Pro Glu Leu Glu Gln 1075 1080 1085 Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg Ala Glu Ala Glu Asp Ser 1090 1095 1100 Phe Leu 1105 <210> 342 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFR-beta D1.mmH <400> 342 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Leu Val Val 20 25 30 Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val 35 40 45 Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe 85 90 95 Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg 100 105 110 Leu Tyr Ile Phe Val Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly 115 120 125 Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His 130 135 140 His 145 <210> 343 <211> 227 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFR-beta D1-D2.mmH <400> 343 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Leu Val Val 20 25 30 Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val 35 40 45 Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe 85 90 95 Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg 100 105 110 Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu 115 120 125 Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln 130 135 140 Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val 145 150 155 160 Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe Phe Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser 165 170 175 Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala 180 185 190 Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 195 200 205 Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His 210 215 220 His His His 225 <210> 344 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFR-beta D1-D3.mmH <400> 344 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Leu Val Val 20 25 30 Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val 35 40 45 Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe 85 90 95 Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg 100 105 110 Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu 115 120 125 Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln 130 135 140 Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val 145 150 155 160 Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe Phe Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser 165 170 175 Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala 180 185 190 Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln 195 200 205 Thr Val Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile 210 215 220 Gly Asn Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser 225 230 235 240 Gly Arg Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr 245 250 255 His Ile Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser 260 265 270 Gly Thr Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp 275 280 285 Glu Lys Ala Ile Asn Ile Thr Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 290 295 300 Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His 305 310 315 320 His His His <210> 345 <211> 396 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hPDGFR-beta D1-D4.mmH <400> 345 Met His Arg Pro Arg Arg Arg Gly Thr Arg Pro Pro Pro Leu Ala Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Arg Gly Ala Asp Ala Leu Val Val 20 25 30 Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser Thr Phe Val 35 40 45 Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg Met Ser Gln 50 55 60 Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr Phe Ser Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly Glu Tyr Phe 85 90 95 Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu Arg Lys Arg 100 105 110 Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu 115 120 125 Thr Glu Ile Thr Glu Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln 130 135 140 Leu Val Val Thr Leu His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val 145 150 155 160 Pro Tyr Asp His Gln Arg Gly Phe Phe Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser 165 170 175 Tyr Ile Cys Lys Thr Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala 180 185 190 Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Gln Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln 195 200 205 Thr Val Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile 210 215 220 Gly Asn Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu Ser 225 230 235 240 Gly Arg Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr 245 250 255 His Ile Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser 260 265 270 Gly Thr Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp 275 280 285 Glu Lys Ala Ile Asn Ile Thr His Arg Ser Arg Thr Leu Gln Val Val 290 295 300 Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys Asp Asn Arg 305 310 315 320 Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser Thr Arg Asn 325 330 335 Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val Arg Val Lys 340 345 350 Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His Glu Asp Ala 355 360 365 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu 370 375 380 Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 385 390 395

Claims (31)

  1. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 측정시 약 30nM 미만의 결합 해리 평형 상수(KD)로 단량체성 사람 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타)에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 측정시 약 10nM 미만의 KD로 단량체성 PDGFR-베타에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 37℃에서 표면 플라스몬 공명 검정에 의한 측정시 약 200pM 미만의 결합 해리 평형 상수(KD)로 이량체성 사람 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타)에 특이적으로 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 PDGFR-베타에 대한 하나 이상의 PDGF 리간드의 결합을 차단하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 25℃에서 시험관내 수용체/리간드 결합 검정에 의한 측정시 약 300pM 미만의 IC50 값으로 가용성 단량체성 PDGFR-베타에 대한 PDGF-BB 리간드 결합을 차단하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 25℃에서 시험관내 수용체/리간드 결합 검정에 의한 측정시 약 150pM 미만의 IC50 값으로 가용성 단량체성 PDGFR-베타에 대한 PDGF-BB 리간드 결합을 차단하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, PDGFR-베타를 발현하는 세포에서의 PDGFR-베타 신호전달의 PDGF 리간드-매개된 활성화를 억제하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 PDGFR-베타의 세포외 도메인의 Ig 도메인 2 내의(서열번호 337의 아미노산 97 내지 178 내의) 하나 이상의 아미노산과 특이적으로 상호작용하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, PDGFR-베타에 결합하는 것에 대해, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 참조(reference) 항체와 경쟁하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 참조 항체와 PDGFR-베타 상의 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 사람 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이: (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306 및 322로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)들; 및 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314 및 330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR들을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR들을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 4-6-8-12-14-16; 20-22-24-28-30-32; 36-38-40-44-46-48; 52-54-56-60-62-64; 68-70-72-76-78-80; 84-86-88-92-94-96; 100-102-104-108-110-112; 116-118-120-124-126-128; 132-134-136-140-142-144; 148-150-152-156-158-160; 164-166-168-172-174-176; 180-182-184-188-190-192; 196-198-200-204-206-208; 212-214-216-220-222-224; 228-230-232-236-238-240; 244-246-248-252-254-256; 260-262-264-268-270-272; 276-278-280-284-286-288; 292-294-296-300-302-304; 308-310-312-316-318-320; 및 324-326-328-332-334-336으로 이루어진 그룹으로부터 각각 선택되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인들을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 사람 혈소판 유도된 성장 인자 수용체 베타(PDGFR-베타)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이: (a) 서열번호 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306 및 322로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR); 및 (b) 서열번호 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 및 330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제14항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 서열번호 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314 및 322/330으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 안 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법이, 안 질환에 걸린 대상체에게 제16항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 안 질환의 치료 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 안 질환이, 노화-관련 황반 변성(AMD), 삼출성 AMD, 당뇨병성 망막병증, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 홍채 혈관신생, 신생혈관성 녹내장, 녹내장에서의 수술후 섬유증, 증식성 유리체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 판누스, 익상편, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종(DME), 혈관성 망막병증, 망막 변성, 포도막염 및 염증성 안 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, VEGF 길항제 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 VEGF 길항제가 VEGF-억제 융합 단백질 또는 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 항체의 항원 결합 단편인, 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 VEGF 길항제가 아플리버셉트, 베바시주맙 또는 라니비주맙인, 약제학적 조성물.
  22. 안 질환의 치료 방법으로서, 상기 방법이, 안 질환에 걸린 대상체에게 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 안 질환의 치료 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 안 질환이, 노화-관련 황반 변성(AMD), 삼출성 AMD, 당뇨병성 망막병증, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 홍채 혈관신생, 신생혈관성 녹내장, 녹내장에서의 수술-후 섬유증, 증식성 유리체 망막병증(PVR), 맥락막 혈관신생, 시신경 유두 혈관신생, 각막 혈관신생, 망막 혈관신생, 유리체 혈관신생, 판누스, 익상편, 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종(DME), 혈관성 망막병증, 망막 변성, 포도막염 및 염증성 안 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  24. 노화-관련 황반 변성(AMD)의 치료 방법으로서, 상기 방법이, 노화-관련 황반 변성의 치료를 필요로 하는 대상체에게 (i) 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 (ii) 아플리버셉트를 투여함을 포함하는, 노화-관련 황반 변성(AMD)의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 상기 대상체에게 아플리버셉트를 투여하기 전에, 아플리버셉트를 투여함과 동시에, 또는 아플리버셉트를 투여한 후에 투여되는, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 아플리버셉트가, 단일 제형으로 함께 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 아플리버셉트가, 별개의 용량형(dosage form)들로 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  28. 종양 성장의 억제 방법으로서, 상기 방법이, 종양에 걸린 대상체에게 제16항 또는 제19항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 종양 성장의 억제 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 종양이, 신장 종양, 췌장 종양, 두경부 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 결장 종양, 위 종양, 및 난소 종양, 폐 종양, 및 피부 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  30. 섬유증의 치료 방법으로서, 상기 방법이, 섬유증 병태에 걸린 대상체에게 제16항 또는 제19항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 섬유증의 치료 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 섬유증 병태가 폐 섬유증, 안구 섬유증, 피부 섬유증, 신장 섬유증, 또는 간 섬유증인, 방법.
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