KR20230134117A - 세포 배양물에서 단백질 역가를 개선시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
불순물이 감소된 세포 배양 배지를 사용하여 세포 배양물에서 재조합 단백질 역가 및 세포 역가를 개선시키는 방법뿐만 아니라, 역가가 개선된 재조합 단백질 및 세포의 생산에 사용될 수 있는 불순물이 감소된 세포 배양 배지가 제공된다. 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 HEPES 완충제를 포함하고, 감소된 불순물은 HEPES 관련 불순물이다. 특정 양태에서, 방법 및 배지는 단백질 역가, 세포 성장 및/또는 생존 세포 밀도를 개선시킨다.
Description
본 출원은 2021년 1월 20일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 제63/139,494호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 참조에 의해 원용된다.
본 발명의 분야
본 발명은 역가를 개선시키기 위한 세포의 배양 방법 및 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 불순물이 감소된 배지를 사용하여 역가를 개선시키기 위해 세포를 배양하는 방법 및 단백질 바이오의약품(biopharmaceutical)을 생산하기 위한 방법뿐만 아니라, 방법에 따라 성장된 세포와 세포 배양물 및 세포와 세포 배양물에 의해 생산된 단백질에 관한 것이다.
생물학 작용제, 특히 단백질 및 폴리펩타이드는 종종 신규 바이오의약 제품으로 개발된다. 관심 특정 단백질을 높은 수준으로 생산하는 조작된 세포는 이러한 바이오의약 제품의 성공적인 상업적 생산을 위해 결정적으로 중요하게 되었다. 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 다양하며 세포 배양에서 생산된 치료용 단백질의 수준 및 품질에 큰 영향을 미친다.
회분식(batch) 또는 유가식(fed-batch) 공정에서 세포 배양을 통해 단백질을 제조하는 것이 통상적이다. 바이알 해동 후 접종물 성장의 초기 단계는 종자 배양에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 전형적으로, 세포 개체군의 크기 및/또는 부피를 점진적으로 증가시키기 위해 세포는 시드 트레인 생물반응기에서와 같이 기하급수적인 성장 속도로 성장된다. 세포 덩어리가 여러 생물반응기 단계를 통해 규모가 커진 후, 세포는 여전히 기하급수적 성장(로그 단계)에 있으면서 유가식의 생산 생물반응기로 옮겨진다(Gambhir, A. et al., 2003, J Bioscience Bioeng 95(4):317-327).
유가식 배양으로 옮긴 후, 세포는 일정 기간 동안 배양되는 반면, 배지의 조성은 관심 단백질 또는 폴리펩타이드의 생산을 가능하게 하도록 모니터링되고 제어된다. 특정 수율에 도달하거나 세포 생존능, 폐기물 축적 또는 영양소 고갈로 인해 배양이 종결되어야 한다고 결정한 후, 생산된 단백질 또는 폴리펩타이드가 단리된다. 재조합 단백질 수율을 개선시키고자 지난 10년에 걸쳐 많은 중요한 발전이 이루어졌으며, 이는 현재 리터당 수 그램의 역가에 도달한다. 단백질 제조 공정뿐만 아니라 세포주 공학, 및 세포 배양 배지 및 사료 개발의 발전은 단백질 수율의 증가에 기여하였다. 예를 들어, 세포 배양 배지 및 사료를 최적화하기 위한 계획은 지속적인 세포 성장 및 최적의 생성물 분비를 지원하기 위해 화학적으로 규정된 무혈청 배지의 설계 및 영양소 보충을 포함한다.
그러나, 배지가 건강하고 강건한 세포 성장 및 유지, 및 재조합 단백질의 고역가 생산을 가능하게 하는 배지 및 세포를 배양하는 방법에 대한 필요성이 당업계에 여전히 존재한다.
일 양태에서, 재조합 진핵 세포를 배양함으로써 재조합 단백질의 생산 시 재조합 단백질 역가를 개선시키는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은 (a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 규정된 세포 배양 배지는 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하고, 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 갖는, 단계; (b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가된다.
특정 실시형태에서, 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 또는 효모 세포일 수 있다. 특정 실시형태에서, 진핵 세포는 CHO 세포일 수 있다. 다른 실시형태에서, 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질, 트랩형 단백질, 예컨대, 트랩 단백질 또는 미니-트랩 단백질, 항체, 항체 단편, 또는 ScFv-Fc 융합 단백질, 또는 본 출원에 개시된 것을 포함하는 임의의 다른 재조합 단백질로부터 선택될 수 있다.
특정 실시형태에서, 관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어날 수 있다. 다른 실시형태에서, 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어난다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 세포 성장의 개선을 포함하여 세포 배양 성능을 개선시키며, 여기서 재조합 진핵 세포의 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 높다.
본 발명의 다른 양태에서, 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지가 제공된다. 특정 실시형태에서, 배지는 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 포함하며, 규정된 세포 배양 배지는 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하고, 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 800 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(800 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 80 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(80 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 규정된 세포 배양 배지를 선택하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은 일반적으로 (a) 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계; (b) HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 분석하여 규정된 세포 배양 배지에 존재하는 분자량(MW)이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량(MW)이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계; (c) HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지가 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에서 사용하기 위해 HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 선택하는 단계를 포함하며; 여기서, 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 배지 중 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 갖는 HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지의 사용이 비-HEPES 관련 불순물 감소 배지에서의 세포 배양 성능과 비교하여, 세포 배양 성능을 개선시킨다. 특정 실시형태에서, 개선된 세포 배양 성능은 개선된 세포 배양 역가 및/또는 세포 성장을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 HEPES 완충제를 선택하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은 일반적으로 (a) 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 제공하는 단계; (b) HEPES 완충제를 분석하여 HEPES 완충제에 존재하는 분자량(MW)이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량(MW)이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계; (c) HEPES 완충제가 세포 배양과 관련하여 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 세포 배양과 관련하여 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에서 사용하기 위해 HEPES 완충제를 선택하는 단계를 포함하며; 여기서, 세포 배양과 관련하여 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 세포 배양과 관련하여 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 갖는 HEPES 완충제의 사용은, 더 많은 양의 상기 불순물을 갖는 HEPES 완충제의 존재 하의 세포 배양 성능과 비교하여, 세포 배양 성능을 개선시킨다. 특정 실시형태에서, 개선된 세포 배양 성능은 개선된 세포 배양 역가 및/또는 세포 성장을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 (i) 재조합 단백질을 발현할 수 있는 적어도 하나의 재조합 진핵 세포 및 (ii) 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물을 제공하되, 여기서 세포 배양물은 (a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 규정된 세포 배양 배지는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는, 단계; (b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포는 CHO 세포일 수 있다.
관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어날 수 있다. 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어날 수 있다. 재조합 진핵 세포의 상기 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 높을 수 있다. 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가될 수 있다.
재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디(diabody), 트라이아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody), Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체일 수 있다. 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체, 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 재조합 단백질은 알리로쿠맙(alirocumab), 아톨티비맙(atoltivimab), 마프티비맙(maftivimab), 오데시비맙(odesivimab), 오데시빕맙(odesivivmab)-ebgn, 카시리비맙(casirivimab), 임데비맙(imdevimab), 세미플리맙(cemiplimab), 셈플리맙(cemplimab)-rwlc, 두필루맙(dupilumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙(fasimumab), 네스바쿠맙(nesvacumab), 트레보그루맙(trevogrumab), 리누쿠맙(rinucumab) 및 사릴루맙(sarilumab)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
재조합 단백질은 또한 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 미니-트랩 단백질 및 ScFv-Fc 융합 단백질 또는 임의의 다른 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 (i) 상기 재조합 단백질을 발현할 수 있는 적어도 하나의 재조합 진핵 세포 및 (ii) 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 생산되는 재조합 단백질을 제공하되, 여기서 재조합 단백질은 (a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 규정된 세포 배양 배지는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는, 단계; (b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계; (c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및 (d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포는 CHO 세포일 수 있다.
관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어날 수 있다. 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어날 수 있다. 재조합 진핵 세포의 상기 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 높을 수 있다. 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가될 수 있다.
재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체일 수 있다. 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체, 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 재조합 단백질은 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
재조합 단백질은 또한 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 미니-트랩 단백질 및 ScFv-Fc 융합 단백질, 또는 임의의 다른 재조합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 세포, 세포 배양물, 재조합 단백질 및 방법이 제공된다.
다수의 실시형태가 본 출원 전반에 걸쳐 개시되지만, 본 발명의 또 다른 실시형태가 본 발명의 예시적인 실시형태를 나타내고 기재하는 다음 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이다. 이해되는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 사상 및 범주를 모두 벗어나지 않으면서 다양한 양태에서 변형될 수 있다. 따라서, 상세한 설명은 사실상 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 관계를 예시한다.
도 2A 내지 도 2B는 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 음의 상관관계를 예시한다. 도 2A는 위치 1의 데이터를 기반으로 한다. 도 2B는 위치 2의 데이터를 기반으로 한다. 도 2A는 오른쪽으로 중첩되는 데이터 포인트를 가지며, 이는 또한 도 1에서 로트 1117000128 및 로트 1117000130에 도시되어 있다.
도 3은 위치 1 및 2에서 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 관계를 예시한다.
도 4A 내지 도 4B는 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 음의 상관관계를 예시한다. 도 4A는 위치 1의 데이터를 기반으로 한다. 도 4B는 위치 2의 데이터를 기반으로 한다. 도 4A는 중첩되는 2개 데이터 포인트를 갖는다. 첫 번째 오버랩은 중간 근처에 있으며, 이는 또한 도 3에서 로트 1117000129 및 로트 1117000138에 도시되어 있다. 두 번째 오버랩은 오른쪽을 향하며, 이는 또한 도 3에서 로트 1117000128 및 로트 1117000130에 도시되어 있다.
도 5A는 HEPES 불순물의 HILIC 분리를 예시한다.
도 5B는 혼합 모드 컬럼 분리에 의한 HEPES 불순물의 분리를 예시한다.
도 6A는 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4](또한 "221"로 지칭함)의 RP-LCMS 플롯이다.
도 6B는 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4]의 HILIC-LCMS 플롯이다.
도 7은 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4](또한 "221"로 지칭함)의 MS/MS 단편화를 나타낸다.
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 2A 내지 도 2B는 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 음의 상관관계를 예시한다. 도 2A는 위치 1의 데이터를 기반으로 한다. 도 2B는 위치 2의 데이터를 기반으로 한다. 도 2A는 오른쪽으로 중첩되는 데이터 포인트를 가지며, 이는 또한 도 1에서 로트 1117000128 및 로트 1117000130에 도시되어 있다.
도 3은 위치 1 및 2에서 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 관계를 예시한다.
도 4A 내지 도 4B는 본 발명의 일 실시형태에 따른 HEPES 관련 불순물과 단백질 역가 사이의 음의 상관관계를 예시한다. 도 4A는 위치 1의 데이터를 기반으로 한다. 도 4B는 위치 2의 데이터를 기반으로 한다. 도 4A는 중첩되는 2개 데이터 포인트를 갖는다. 첫 번째 오버랩은 중간 근처에 있으며, 이는 또한 도 3에서 로트 1117000129 및 로트 1117000138에 도시되어 있다. 두 번째 오버랩은 오른쪽을 향하며, 이는 또한 도 3에서 로트 1117000128 및 로트 1117000130에 도시되어 있다.
도 5A는 HEPES 불순물의 HILIC 분리를 예시한다.
도 5B는 혼합 모드 컬럼 분리에 의한 HEPES 불순물의 분리를 예시한다.
도 6A는 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4](또한 "221"로 지칭함)의 RP-LCMS 플롯이다.
도 6B는 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4]의 HILIC-LCMS 플롯이다.
도 7은 HEPES 원료로부터의 HEPES-[CH4](또한 "221"로 지칭함)의 MS/MS 단편화를 나타낸다.
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 양태에 따르면, 불순물이 감소된 세포 배양 배지의 사용이, 그러한 불순물이 감소되지 않은 세포 배양 배지에 비해 세포 배양물에서 세포 성장 및 세포에 의한 단백질 생산의 개선을 포함하여, 세포 배양 성능을 개선시킨다는 것이 예상치 않게 발견되었다.
보다 특히, 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하는 세포 배양 배지 중 불순물이 세포 배양 성능에 영향을 미친다는 것이 예상치 않게 발견되었다. 본 발명에 따르면, 세포 배양 성능(예를 들어, 단백질 역가)에 영향을 미치는, 즉 강한 음의 상관관계를 나타내는 HEPES 관련 불순물이 확인되었다. 일 실시형태에서, HEPES 관련 불순물은 분자량(MW)이 267.07인 HEPES 관련 불순물, 분자량이 221.06인 HEPES 관련 불순물, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시형태에서, 감소된 양의 이러한 HEPES 관련 불순물을 갖는 세포 배양 배지의 사용은, 그러한 감소된 양의 HEPES 관련 불순물을 갖지 않는 세포 배양 배지와 비교하여, 세포 배양 성능을 개선시킨다는 것이 발견되었다.
본 명세서에서 사용되는 섹션 표제는 구성 목적만을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 기법은 일반적으로 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 그리고 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), Julio E. Celis, Cell Biology: A Laboratory Handbook, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1998), 및 Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1995)]을 참조한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 기재된다.
숫자 값 및 범위의 맥락에서 용어 "약"은 본 명세서에 포함된 교시내용으로부터 명백한 바와 같이 발현의 원하는 속도, 양, 정도, 증가, 감소, 또는 범위, 농도, 또는 시간을 갖는 것과 같이 본 발명이 의도한 바와 같이 수행될 수 있도록 인용된 값 또는 범위에 근사하거나 이에 근접한 값 또는 범위를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단순히 시스템상 오류로 인한 것 이상의 값을 포함한다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 전반에 걸쳐 호환 가능하게 사용되고 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 또한 글라이코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카복실화, 알킬화, 하이드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형을 포함할 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 단백질-기반 약물을 포함하여 과학적 또는 상업적 관심 대상이 될 수 있다. 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질은 특히 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 펩타이드, 폴리펩타이드, 및 단백질은 세포 배양 방법을 사용하여 재조합 동물 세포에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "이종 뉴클레오타이드 서열"은 바이오의약품 약물 물질로서 생산되는 관심 단백질, 예컨대, 키메라 단백질(트랩 분자와 유사), 항체 또는 항체 부분(예를 들어, VH, VL, CDR3)을 인코딩하는 핵산 중합체를 지칭한다. 이종 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 조작 기법(예를 들어, 키메라 단백질을 인코딩하는 서열, 또는 코돈-최적화 서열, 인트론이 없는 서열 등)에 의해 제조될 수 있고 세포 내로 도입될 수 있으며, 여기서 상기 서열은 에피솜으로 존재하거나 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드 서열은 생산 세포 게놈 내의 이소성 부위 내로 도입되는 자연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 이종 폴리펩타이드 서열은 또 다른 유기체 유래의 자연적으로 발생하는 서열, 예컨대 인간 동원체(ortholog)를 인코딩하는 서열일 수 있다.
"항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 하위부류의 글리코실화 면역글로불린 및 비-글리코실화 면역글로불린 둘 다에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 형성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는, 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 제2010/0331527호에 기재되어 있다.
항체의 "항원-결합 부분"(또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 연결되는 Fv 단편의 2개의 도메인, 즉 VL 및 VH로 이루어져서 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하는 scFv를 포함한다. 단일 사슬 항체의 다른 형태, 예컨대, 다이아바디는 또한 용어 "항체" 하에 포함된다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조).
또한, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드의 공유 또는 비공유 회합에 의해 형성된, 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 그러한 면역어드헤신(immunoadhesin) 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 만들기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) 및 2가 및 바이오티닐화 scFv 분자를 만들기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용 (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)을 포함한다. 항체 부분, 예컨대, Fab 및 F(ab')2 단편은 통상적인 기법을 사용하여, 예컨대, 전체 항체의 파파인 또는 펩신 소화를 통해 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 더욱이, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 당업계에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 얻을 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 및 구체적으로 CDR3에서, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열은 인간 프레임워크 서열에 그래프팅된 항체를 포함하고자 하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 형성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대, 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자이식된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295]) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 형성 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 그러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 서열을 갖는다. 그러나 특정 실시형태에서, 그러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자이식된 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거쳐서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
"Fc 융합 단백질"은 2가지 이상의 단백질 중 일부 또는 전부를 포함하며, 이 중 하나는 그렇지 않으면 자연에서 함께 발견되지 않는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. 항체-유래 폴리펩타이드(Fc 도메인을 포함함)의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; 및 Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992]에 의해 기재되었다. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하며, 이는 일부 실시형태에서 힌지 영역, 이에 이어 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 Fc를 포함하는 트랩, 예컨대, IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 포함하는, 릴로나셉트(rilonacept); 미국 특허 제6,927,044호 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는, 애플리버셉트(aflibercept); 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호)이다.
추가적으로, 미니-트랩이 포함되는데, 이는 Fc 부분 대신 다량체화 구성요소(MC)를 사용하는 트랩 단백질이며, 미국 특허 제7,279,159호 및 제7,087,411호에 개시되어 있다.
상기 유도체, 구성요소, 도메인, 사슬 및 단편도 또한 포함된다.
본 명세서에 제시된 모든 수치 한계 및 범위는 범위 또는 한계의 수치 사이의 모든 숫자 또는 값 또는 그 근처의 모든 숫자 또는 값을 포함한다. 본 명세서에 기재된 범위 및 한계는 범위 또는 한계에 의해 정의되고 포함되는 모든 정수, 소수 및 분수 값을 명시적으로 명명하고 제시한다. 따라서, 본 명세서에서 값의 범위의 열거는 단지 본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법의 역할을 하는 것으로 의도되고, 각각의 별개 값은 해당 값이 본 명세서에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
세포 배양 배지
일 양태에서, 본 발명은 불순물이 감소된 세포 배양 배지를 제공한다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하고, 감소된 불순물은 HEPES 관련 불순물이다. 특정 실시형태에서, 세포 배양 배지는 본 명세서에서 논의된 바와 같이 화학적으로 규정된 세포 배양 배지일 수 있다.
보다 특히, 본 발명에 따르면, 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 포함한다.
대부분의 생물학적 pH에서, HEPES는 양쪽이온성 설폰산 완충제이며, 일반적으로 pH 6.8 내지 8.2에서 완충제로서 효과적이다. HEPES는 부분적으로는 중탄산염 완충제와 비교할 때 이산화탄소 농도의 변화에도 불구하고 생리학적 pH를 유지하는 능력으로 인해 세포 배양에서 널리 사용된다. 세포 배양 적용을 위한 완충제 강도는 보통 10 내지 25mM의 범위이다. HEPES의 완충 용액은 여러 가지 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, HEPES 유리산은 물에 첨가된 다음, 대략 0.5 몰 당량의 수산화나트륨 또는 수산화칼륨으로 원하는 pH로 적정될 수 있으며, 0.05 M HEPES/NaOH를 제조하기 위한 간단한 혼합 표가 공개되었다. 대안적으로, 등몰 농도의 HEPES 유리산 및 소듐 HEPES가 대략 동일한 부피로 혼합되어, 이들 용액 중 어느 하나를 이용하여 적절한 pH로 역적정될 수 있다. 다른 형태의 HEPES는 포타슘 HEPES 및 헤미소듐 HEPES를 포함한다. 임의의 적합한 HEPES 완충제는 HEPES 완충제가 본 명세서에 논의된 감소된 불순물을 갖도록 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다.
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 전형적으로 탄수화물 에너지원, 필수(예를 들어, 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 아이소류신, 라이신, 및 히스티딘) 및 비필수(예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 및 타이로신) 아미노산, 미량 원소, 에너지원, 지질, 비타민 등과 같은 세포의 성장을 향상시키기 위해 필요한 영양소를 제공하는 세포, 예를 들어 진핵 세포를 성장시키는 데 사용되는 영양 용액을 지칭한다. 세포 배양 배지는 세포 성장을 지원하는 원료를 공급하는 추출물, 예를 들어 혈청 또는 펩톤(가수분해물)을 포함할 수 있다. 배지는 동물-유래 추출물 대신에 효모-유래 추출물 또는 대두 추출물을 포함할 수 있다. 화학적으로 규정된 배지는 모든 화학적 구성요소가 알려진(즉, 알려진 화학 구조를 갖는) 세포 배양 배지를 지칭한다. 화학적으로 규정된 배지에는 동물-유래 구성요소, 예컨대, 혈청-유래 또는 동물-유래 펩톤이 전혀 없다. 일 실시형태에서, 배지는 화학적으로 규정된 배지이다.
배지는 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함하여, 최소 속도 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 구성요소를 포함할 수 있다. 배지는 바람직하게는 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지는 무혈청일 수 있다. "무혈청"은 동물 혈청, 예컨대, 소태아혈청을 포함하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다. 무혈청 배지는 16 g/L 이하의 가수분해물, 예컨대, 대두 가수분해물을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 불순물이 감소된 화학적으로 규정된 배지를 제공하며, 상기 배지는 무혈청일 뿐만 아니라, 무가수분해물이다. "무가수분해물"은, 예를 들어, 펩톤, 트립톤 등과 같은 외인성 단백질 가수분해물, 예컨대, 동물 또는 식물 단백질 가수분해물을 포함하지 않는 세포 배양 배지에 적용된다.
"기본 배지"는 세포가 증식되고 모든 필요한 영양소를 포함하는 초기 배지(예를 들어, 시드 트레인 및/또는 세포 배양 생산의 0일째에 존재함)이며, 이는 아미노산의 기본 혼합물을 포함한다. 기본 배지에 대한 다양한 처방(즉, 제형)은 상업적으로 이용 가능한 로트에서 제조 또는 구입될 수 있다. 마찬가지로 "기본 공급 배지"는 생산 배양 동안 일반적으로 소비되고 (소위 "유가식" 배양을 위한) 공급 전략에서 이용되는 보충 영양소의 혼합물을 포함한다. 다양한 기본 공급 배지가 상업적으로 이용 가능하다. "공급"은 케모스타트(chemostat)에서와 같이(문헌[C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. 2001 November-December; 17(6):1032-41] 참조), 또는 유가식 공정에 따르는(Y. M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 September-October; 26(5): 1400-10) 연속적인 공급 배양 시스템을 포함하는 프로토콜에 따르는 것과 같은 규칙적인 간격으로 배지에의 첨가 또는 예정된 첨가를 포함한다. 예를 들어, 배양물은 하루에 1회, 격일로, 3일마다 공급될 수 있거나, 모니터링되는 특정 배지 구성요소의 농도가 원하는 범위를 벗어날 때 공급될 수 있다.
제한하려는 의도 없이, 본 발명은 다양한 기본 배지 중 임의의 하나 이상 또는 이의 조합으로 실시될 수 있다. 기본 배지는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며 특히 이글(Eagle) MEME(최소 필수 배지)(Eagle, Science, 1955, 112(3168):501-504), 햄(Ham) F12(Ham, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1965, 53:288-293), F-12 K 배지, 둘베코(Dulbecco) 배지, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1952 August; 38(8): 747-752), DMEM/햄 F12 1:1, 트로웰(Trowell) T8, A2 배지(Holmes and Wolf, Biophys. Biochem. Cytol., 1961, 10:389-401), 웨이마우스(Waymouth) 배지(Davidson and Waymouth, Biochem. J., 1945, 39(2):188-199), 윌리엄스(Williams) E 배지(William's et al., Exp. Cell Res., 1971, 69:105 et seq.), RPMI 1640(Moore et al., J. Amer. Med. Assoc., 1967, 199:519-524), MCDB 104/110 배지(Bettger et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1981, 78(9):5588-5592), 벤트렉스(Ventrex) HL-1 배지, 알부민-글로불린 배지(Orr et al., Appl. Microbiol., 1973, 25(1):49-54), RPMI-1640 배지, RPMI-1641 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), 맥코이(McCoy) 5 A 배지, 라이보비츠(Leibovitz) L-15 배지, 및 무혈청 배지, 예컨대, EX-CELL™ 300 시리즈(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.), 프로타민-아연-인슐린 배지(Weiss et al., 1974, 미국 특허 제4,072,565호), 바이오틴-폴레이트 배지(Cartaya, 1978, US Re30,985), 트랜스페린-지방산 배지(Baker, 1982, 미국 특허 제4,560,655호), 트랜스페린-EGF 배지(Hasegawa, 1982, 미국 특허 제4,615,977호; Chessebeuf, 1984, 미국 특허 제4,786,599호), 및 다른 배지 치환물(media permutation)(예를 들어, Inlow, 미국 특허 제6,048,728호; Drapeau, 미국 특허 제7,294,484호; Mather, 미국 특허 제5,122,469호; Furukawa, 미국 특허 제5,976,833호; Chen, 미국 특허 제6,180,401호; Chen, 미국 특허 제5,856,179호; Etcheverry, 미국 특허 제5,705,364호; Etcheverry, 미국 특허 제7,666,416호; Ryll, 미국 특허 제6,528,286호; Singh, 미국 특허 제6,924,124호; Luan, 미국 특허 제7,429,491호; 등 참조)을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 생존 세포 배양에 필요한 모든 영양소 및 HEPES 완충제를 포함하는 기본 배지를 포함한다. HEPES 완충제는 기본 배지의 구성요소일 수 있거나, 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 양태에 따르면, 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 포함한다.
예로서, 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대한 HEPES 관련 불순물의 양은 일반적으로 배지에서 HEPES에 대해 정규화된 불순물의 존재비(abundance)와 관련된다. 예를 들어, 상대량은 표준 분석 기법, 예컨대, HPLC, LC-MS 등을 사용하여 결정될 수 있으며, 여기서 상대량(불순물, ppm)= 피크 면적(불순물)/피크 면적(HEPES +HEPES 이량체+ HEPES 부가물)×1,000,000이다.
특정 실시형태에서, 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만, 약 3500 ppm 미만, 약 3200 ppm 미만, 약 3000 ppm 미만, 약 2900 ppm 미만, 약 2500 ppm 미만, 약 2200 ppm 미만, 약 2000 ppm 미만, 약 1800 ppm 미만, 약 1500 ppm 미만, 약 1200 ppm 미만, 약 1000 ppm 미만, 약 800 ppm 미만 등의 HEPES 관련 불순물을 포함한다. 다시 말하면, 총 HEPES의 몰당 MW가 267.07인 약 4000 μmol 미만, 약 3500 μmol 미만, 약 3200 μmol 미만, 약 3000 μmol 미만, 약 2900 μmol 미만, 약 2500 μmol 미만, 약 2200 μmol 미만, 약 2000 μmol 미만, 약 1800 μmol 미만, 약 1500 μmol 미만, 약 1200 μmol 미만, 약 1000 μmol 미만, 약 800 μmol 미만 등의 HEPES 불순물. 특정 실시형태에서, 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 500 ppm 미만, 약 450 ppm 미만, 약 400 ppm 미만, 약 390 ppm 미만, 약 370 ppm 미만, 약 350 ppm 미만, 약 320 ppm 미만, 약 300 ppm 미만, 약 250 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 약 150 ppm 미만, 약 100 ppm 미만, 약 80 ppm 미만, 약 75 ppm 미만, 약 70 ppm 미만 등의 HEPES 관련 불순물을 포함한다. 다시 말하면, 총 HEPES의 몰당 MW가 221.06인 약 500 μmol 미만, 약 450 μmol 미만, 약 400 μmol 미만, 약 390 μmol 미만, 약 370 μmol 미만, 약 350 μmol 미만, 약 320 μmol 미만, 약 300 μmol 미만, 약 250 μmol 미만, 약 200 μmol 미만, 약 150 μmol 미만, 약 100 μmol 미만, 약 80 μmol 미만, 약 75 μmol 미만, 약 70 μmol 미만 등의 HEPES 불순물.
특정 실시형태에서, 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(4000 μmol HEPES 불순물 MW 267.07/총 HEPES의 몰수), 및 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 400 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물(400 μmol HEPES 불순물 MW 221.06/총 HEPES의 몰수)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 3900 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 390 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 800 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 세포 배양 배지에 존재하는 HEPES 완충제의 양에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 80 ppm 미만의 HEPES 관련 불순물을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 1 ppm HEPES 불순물 = 1 μmol HEPES 불순물/총 HEPES 몰수이다.
다른 실시형태에서, HEPES 완충제 그 자체는 본 명세서에 기재된 바와 같이 감소된 HEPES 관련 불순물을 갖는다. 예를 들어, HEPES 완충제는 세포 배양과 관련하여 (예를 들어, 배지에서) 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 267.07인 약 4000 ppm 미만, 약 3500 ppm 미만, 약 3200 ppm 미만, 약 3000 ppm 미만, 약 2900 ppm 미만, 약 2500 ppm 미만, 약 2200 ppm 미만, 약 2000 ppm 미만, 약 1800 ppm 미만, 약 1500 ppm 미만, 약 1200 ppm 미만, 약 1000 ppm 미만, 약 800 ppm 미만 등의 HEPES 관련 불순물을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 총 HEPES의 몰당 MW가 267.07인 약 4000 μmol 미만, 약 3500 μmol 미만, 약 3200 μmol 미만, 약 3000 μmol 미만, 약 2900 μmol 미만, 약 2500 μmol 미만, 약 2200 μmol 미만, 약 2000 μmol 미만, 약 1800 μmol 미만, 약 1500 μmol 미만, 약 1200 μmol 미만, 약 1000 μmol 미만, 약 800 μmol 미만 등의 HEPES 불순물. 특정 실시형태에서, 배지는 세포 배양과 관련하여 (예를 들어, 배지에서) 사용되는 HEPES 완충제의 총량에 대해 분자량(MW)이 221.06인 약 500 ppm 미만, 약 450 ppm 미만, 약 400 ppm 미만, 약 390 ppm 미만, 약 370 ppm 미만, 약 350 ppm 미만, 약 320 ppm 미만, 약 300 ppm 미만, 약 250 ppm 미만, 약 200 ppm 미만, 약 150 ppm 미만, 약 100 ppm 미만, 약 80 ppm 미만, 약 75 ppm 미만, 약 70 ppm 미만 등의 HEPES 관련 불순물을 포함한다. 다시 말하면, 총 HEPES의 몰당 MW가 221.06인 약 500 μmol 미만, 약 450 μmol 미만, 약 400 μmol 미만, 약 390 μmol 미만, 약 370 μmol 미만, 약 350 μmol 미만, 약 320 μmol 미만, 약 300 μmol 미만, 약 250 μmol 미만, 약 200 μmol 미만, 약 150 μmol 미만, 약 100 μmol 미만, 약 80 μmol 미만, 약 75 μmol 미만, 약 70 μmol 미만 등의 HEPES 불순물.
보다 구체적으로, 본 발명의 양태에 따르면, HEPES 관련 불순물은 표 1에 제시된 화학식 및 분자량(MW)을 갖는다.
이론에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 화학식 및 분자량(MW)에 기반하여, HEPES 관련 불순물에 대해 다음 화학 구조가 제안된다. 그러나, 본 발명은 이러한 제안된 화학 구조의 제시에 제한되지 않으며, HEPES 관련 불순물의 화학식 및 분자량(MW)에 상응하는 다른 화학 구조는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 구상된다.
세포 배양 배지는 또한 배양할 세포의 요구 사항 또는 원하는 세포 배양 매개변수에 따라 폴리아민과 같은 추가적인 성분 또는 아미노산, 염, 당, 비타민, 호르몬, 성장 인자, 완충제, 항생제, 지질, 미량 원소 등의 농도 증가와 함께 또는 없이 주기적으로 (소위 "유가식" 배양에서와 같이) 공급될 수 있다.
특정 양태에서, 세포 배양 배지 배지는 추가적인 아미노산 보충이 제공되지 않는 경우에 재조합 단백질 생산 과정에 걸쳐 아미노산이 고갈될 수 있거나, 세포 배양 배지는 (하기 기재된 바와 같이) 고갈된 아미노산에 대해 아미노산 보충이 제공되는 경우에 "비-고갈"될 수 있다.
일 실시형태에서, 배지는 추가적으로 100μM±15μM 오르니틴, 또는 300μM±45μM 오르니틴, 또는 600μM±90μM 오르니틴, 또는 심지어 900μM±135μM 오르니틴을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 적어도 약 5 mg/L±1 mg/L 오르니틴.HCl, 또는 적어도 약, 10 mg/L±2 mg/L 오르니틴.HCl, 15 mg/L±2.25 mg/L 오르니틴.HCl, 또는 적어도 약 50 mg/L±7.5 mg/L 오르니틴.HCl, 또는 적어도 약 100 mg/L±15 mg/L 오르니틴.HCl, 또는 적어도 약 150 mg/L±22.5 mg/L 오르니틴.HCl을 포함한다.
퓨트레신(putrescine)은 선택적으로 보충 배지에 첨가될 수 있다. 퓨트레신은 구성요소로서 매우 낮은 농도로 일부 세포 배양 배지 제형에서 포함될 수 있으며; 예를 들어 WO 2005/028626(0.02 내지 0.08 mg/L 퓨트레신을 기재함); 미국 특허 제5,426,699호(0.08 mg/L); 미국 특허 제RE30,985호(0.16 mg/L); 미국 특허 제5,811,299호(0.27 mg/L); 미국 특허 제5,122,469호(0.5635 mg/L); 미국 특허 제5,063,157호(1 mg/L); WO 2008/154014(대략 100 82M 내지 대략 1000μM); 미국 특허 출원 제2007/0212770호(0.5 내지 30 mg/L 폴리아민; 2 mg/L 퓨트레신; 2 mg/L 퓨트레신+2 mg/L 오르니틴; 2 mg/L 퓨트레신+10 mg/L 오르니틴)를 참조한다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 배지는 오르니틴과 퓨트레신의 조합으로 추가로 보충되며, 여기서 퓨트레신은 적어도 약 150 내지 720μM의 농도일 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 약 170 내지 230μM의 농도의 퓨트레신으로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지는 90μM±15μM 이상의 오르니틴에 추가적으로 200μM±30μM 퓨트레신을 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 15 mg/L±2.25 mg/L 이하의 오르니틴에 추가적으로 30 mg/L±4.5 mg/L 이하의 퓨트레신.2HCl을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 15 mg/L±2.25 mg/L 이상의 오르니틴.HCl에 추가적으로 30 mg/L±4.5 mg/L 이상의 퓨트레신.2HCl을 포함한다. (2014년 9월 18일에 공개된 국제 공개 WO2014/144198A1 참조)
또 다른 실시형태에서, 오르니틴은 0.09±0.014mM 내지 0.9±0.14mM, 예컨대, 0.09±0.014mM, 0.3±0.05mM, 0.6±0.09mM, 또는 0.9±0.14mM 오르니틴 범위 농도로 배지에 존재한다. 일 실시형태에서, 배지는 또한 적어도 0.20±0.03mM 퓨트레신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 퓨트레신은 0.20±0.03mM 내지 0.714±0.11mM, 예컨대, 0.20±0.03mM, 0.35±0.06, 또는 0.714±0.11mM 퓨트레신 범위 농도이다.
또 다른 실시형태에서, 배지는 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10mM의 농도(리터당 밀리몰 단위로 표현됨)의 타우린으로 보충될 수 있다.
다양한 다른 보충제가 배양 배지에 첨가될 수 있으며, 추가적으로 적절한 조건을 결정하기 위해 당업자의 기술 범위 내에 있다. 일부 실시형태에서, 고갈되지 않도록 하기 위해 또는 보충 영양소가 필요하기 때문에 배지는 아스파르트산, 시스테인 글루탐산, 글라이신, 라이신, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 발린, 아르기닌, 히스티딘, 아스파라긴, 글루타민, 알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 타이로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산의 혼합물로 보충된다.
일 실시형태에서, 배지는 약 170μM 내지 175μM 뉴클레오사이드로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지는 적어도 40μM, 적어도 45μM, 적어도 50μM, 적어도 55μM, 적어도 60μM, 적어도 65μM, 적어도 70μM, 적어도 75μM, 적어도 80μM, 적어도 85μM, 적어도 90μM, 적어도 95μM, 적어도 100μM, 또는 적어도 105μM의 누적 농도로 퓨린 유도체를 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 약 100μM 내지 110μM의 퓨린 유도체를 포함한다. 퓨린 유도체는 하이포잔틴 및 뉴클레오사이드 아데노신 및 구아노신을 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 적어도 30μM, 적어도 35μM, 적어도 40μM, 적어도 45μM, 적어도 50μM, 적어도 55μM, 적어도 60μM, 또는 적어도 65μM의 누적 농도로 피리미딘 유도체를 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 약 65μM 내지 75μM의 피리미딘 유도체를 포함한다. 피리미딘 유도체는 뉴클레오사이드 티미딘, 우리딘, 및 사이티딘을 포함한다. 일 특정 실시형태에서, 배지는 아데노신, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 티미딘 및 하이포잔틴을 포함한다.
상기 첨가제 중 임의의 것의 포함에 추가적으로, 일 실시형태에서, 배지는 마이크로몰량의 지방산(또는 지방산 유도체) 및 토코페롤로 추가로 보충된다. 일 실시형태에서, 지방산은 리놀레산, 리놀렌산, 티옥트산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 아라키돈산, 라우르산, 베헨산, 데칸산, 도데칸산, 헥산산, 리그노세르산, 미리스트산 및 옥탄산 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 배지는 토코페롤, 리놀레산 및 티옥트산을 포함한다.
일 실시형태에서, 배지는 또한 적어도 약 700μM 또는 적어도 약 2mM의 누적 농도로 다른 영양소 및 필수 영양소를 포함하는 비타민의 혼합물로 추가로 보충될 수 있다. 일 실시형태에서, 비타민의 혼합물은 D-바이오틴, 콜린 클로라이드, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아마이드, 피리독신 HCl, D-판토텐산(헤미Ca(hemiCa)), 리보플라빈, 티아민 HCl, 비타민 B12 등 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 비타민의 혼합물은 D-바이오틴, 콜린 클로라이드, 엽산, 미오-이노시톨, 니아신아마이드, 피리독신 HCl, D-판토텐산(헤미Ca), 리보플라빈, 티아민 HCl 및 비타민 B12를 모두 포함한다.
불순물이 감소된 본 발명의 배지의 다양한 실시형태는 화학적으로 규정된 배지, HEPES 완충제, 및 특히 (a) 아미노산; (b) 선택적으로 뉴클레오사이드; (c) 2가 양이온의 염; (d) 지방산 및 토코페롤; 및 (e) 비타민을 포함하여 상기 기재된 실시형태의 조합 중 임의의 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 화학적으로 규정될 수 있으며, HEPES 완충제, 본 명세서에 논의된 바와 같은 아미노산 혼합물, CaCl2 2H2O; KCl; MgSO4; NaCl; Na2HPO4 또는 다른 포스페이트 염; 피루베이트; D-바이오틴; 콜린 클로라이드; 엽산; 미오-이노시톨; 니아신아마이드; 피리독신 HCl; D-판토텐산; 리보플라빈; 티아민 HCl; 비타민 B12; ρ-아미노벤조산; 에탄올아민 HCl; 폴록사머 188; DL-a-토코페롤 포스페이트; 리놀레산; Na2SeO3; 티옥트산; 및 글루코스; 및 선택적으로 아데노신; 구아노신; 사이티딘; 우리딘; 티미딘; 및 하이포잔틴 2Na를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 배지의 출발 삼투압농도는 200 내지 500, 250 내지 400, 275 내지 350, 또는 약 300 mOsm이다. 본 발명의 배지에서 세포의 성장 동안, 그리고 특히 유가식 프로토콜에 따른 임의의 공급 후, 배양물의 삼투압농도는 최대 약 350, 400, 450, 500 또는 최대 약 550 mOsm까지 증가할 수 있다.
배지의 삼투압농도가 약 300 미만인 일부 실시형태에서, 삼투압농도는 명시된 양을 초과하는 하나 이상의 염을 첨가하여 약 300으로 조정될 수 있다. 일 실시형태에서, 삼투압농도는 염화나트륨, 염화칼륨, 마그네슘염, 칼슘염, 아미노산염, 지방산의 염, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 염인 킬레이트제, 당(예를 들어, 갈락토스, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 푸코스 등), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 삼투물질 중 하나 이상을 첨가함으로써 원하는 수준으로 증가된다. 일 실시형태에서, 삼투물질은 규정된 배지에 이미 존재하는 구성요소의 농도 이상으로 첨가된다(예를 들어, 당은 당 구성요소에 대해 명시된 농도 초과로 첨가됨).
상기 기재된 배지의 각각 및 모든 실시형태뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 바와 같은 감소된 양의 HEPES 관련 불순물을 포함하는 임의의 다른 배지는 불순물이 감소된 배지 또는 HEPES 관련 불순물이 감소된 배지로 지칭된다. 역으로, 본 명세서에 논의된 수준을 초과하는 HEPES 관련 불순물의 양을 포함하는 배지는 이하에서 비-불순물 감소 배지 또는 비-HEPES 관련 불순물 감소 배지로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 비-불순물 감소 배지는 본 명세서에 논의된 불순물의 존재 이외에, 불순물이 감소된 배지와 동일한 기본 배지 및 보충제를 포함한다.
세포 배양물
본 발명의 일 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 불순물이 감소된 배지에서 관심 재조합 단백질을 발현하는 세포주를 포함하는 세포 배양물을 제공한다. 재조합 단백질을 생산하는 데 일상적으로 사용되는 세포주의 예는 특히 1차 세포, BSC 세포, HeLa 세포, HepG2 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, COS 세포, VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, RK 세포, TCMK-1 세포, LLCPK 세포, PK15 세포, LLC-RK 세포, MDOK 세포, BHK 세포, BHK-21 세포, CHO 세포, CHO-K1 세포, NS-1 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, 3T3 세포, 293 세포, Per.C6 세포 및 닭 배아 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포주는 CHO 세포주 또는 대규모단백질 생산에 최적화된 여러 특정 CHO 세포 변이체 중 하나 이상, 예를 들어 CHO-K1이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 불순물이 감소된 배지를 사용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이며, 그러한 배지의 사용은 비-불순물 감소 배지에서 그러한 세포의 배양과 비교하여 구체적으로 생산 배양 및/또는 시드 트레인 배양에서의 사용에 의해 그러한 세포에 의해 관심 하나 이상의 재조합 단백질의 역가를 개선시키고 세포 생존능을 유지하면서 재조합 진핵 세포의 성장을 향상시킨다.
일부 양태에서, 재조합 단백질 역가는 비-불순물 감소 배지에서 성장된 세포에 비해 개선된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 불순물이 감소된 배지에서 세포 배양물로부터 산출된 단백질 역가는 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포로부터의 단백질 역가(수율)보다 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22% 초과, 적어도 약 23% 초과, 적어도 약 24% 초과, 적어도 약 25% 초과, 적어도 약 26% 초과, 적어도 약 27% 초과, 적어도 약 28% 초과, 적어도 약 29% 초과, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 초과, 적어도 약 40% 초과, 또는 적어도 약 50% 더 크다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 불순물이 감소된 배지에서 세포 배양물로부터 산출된 단백질 역가는 비-불순물 감소 배지에서 배양된 동일하거나 동일한 세포보다 더 크다.
일부 양태에서, 세포 성장(예를 들어, 배가율), 생존 세포 밀도, 세포 생존능, 및 이들의 조합은 비-불순물 감소 배지에서 성장된 세포에 비해 개선된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포의 배가율보다 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 11%, 적어도 12%, 적어도 13%, 적어도 14%, 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 또는 적어도 3배 더 크다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 생존 세포의 배가율보다 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% 더 크다.
일부 실시형태에서, 능동적으로 순환하는 포유동물 세포의 배가 시간은 불순물이 감소된 배지에서 30시간 미만, 29시간 미만, 28시간 미만, 27시간 미만, 26시간 미만, 25시간 미만, 24시간 미만, 23시간 미만, 22시간 미만, 21시간 미만, 20시간 미만, 19시간 미만, 또는 18시간 미만이다. 일부 실시형태에서, 능동적으로 성장하는 포유동물 세포의 배가 시간은 불순물이 감소된 배지에서 28시간 미만이다. 일부 실시형태에서, 포유동물 세포의 배가 시간은 불순물이 감소된 배지에서 약 27±1시간, 약 26±1시간, 약 25±1시간, 약 24±1시간, 약 23±1시간, 약 22±1시간, 또는 약 21±1시간이다. 일부 실시형태에서, 능동적으로 순환하는 포유동물 세포의 배가 시간은 불순물이 감소된 배지에서 약 24±1시간이다. 일부 실시형태에서, 불순물이 감소된 배지에서 배양된 능동적으로 분열하는 세포의 배가 시간은 비-감소 불순물 배지에서 배양된 능동적으로 순환하는 세포의 배가 시간보다 적어도 15%, 적어도 16%, 적어도 17%, 적어도 18%, 적어도 19%, 적어도 20%, 또는 적어도 25% 더 짧다.
세포 생존능과 관련하여, 불순물이 감소된 배지에서 성장된 세포는 비-불순물 감소 배지에서 성장된 세포의 생존능보다 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도, 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%, 또는 적어도 3배 더 큰 생존능을 나타낸다.
생산 배양 용기 또는 생물반응기에서, 기본 배양 배지 및 세포는 종자 배양 또는 성장 단계 후에 배양 배지에 공급된다. 특정 실시형태에서, 세포 상청액 또는 세포 용해물은 생산 배양 후 수확된다. 다른 실시형태에서, 관심 폴리펩타이드 또는 단백질은 배양 배지 또는 세포 용해물로부터 회수되거나, 당업계에 잘 알려진 기법을 사용하여 관심 단백질의 위치에 따라 경우에 따라 다를 수 있다.
"세포주"는 세포의 연속 계대배양 또는 계대배양을 통해 특정 계통으로부터 유래된 세포 또는 세포들을 지칭한다. 용어 "세포"는 "세포 개체군"과 호환 가능하게 사용된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 진핵생물의 세포, 예컨대, 비-인간 동물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, 예를 들어 Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6®세포)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
재조합 단백질 생산 단계에서, "유가식 세포 배양" 또는 "유가식 배양"은 동물 세포와 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고 배양 동안 배양물에 연속적으로 또는 개별 증분으로 배양 종료 전에 주기적인 세포 및/또는 생산 수확 여부에 관계 없이 추가적인 배양 영양소가 서서히 공급되는 회분식 배양을 지칭한다. 유가식 배양은 주기적으로 전체 배양물(세포 및 배지를 포함할 수 있음)은 제거되고 새로운 배지로 대체되는 "반-연속 유가식 배양"을 포함한다. 회분식 배양에서는 세포 배양을 위한 모든 구성요소(동물 세포 및 모든 배양 영양소를 포함함)가 배양 공정의 시작 시 배양 용기에 공급되는 반면, 유가식 배양은 단순한 "회분식 배양"과 구별된다. 유가식 배양은 공정 동안 상청액이 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 관류 배양과 추가로 구별될 수 있는 반면, 관류 배양에서 세포는, 예를 들어 여과에 의해 배양물로 제한되고, 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 배양 용기에 도입되고 배양 용기로부터 제거된다. 그러나, 유가식 세포 배양 동안 테스트 목적을 위한 샘플의 제거가 고려된다. 유가식 공정은 최대 작업량 및/또는 단백질 생산에 도달한 것으로 결정될 때까지 계속된다.
본 명세서에서 사용될 때 어구 "연속식 세포 배양"은 보통 특정 성장 단계에서 세포를 연속적으로 성장시키는 데 사용되는 기법에 관한 것이다. 예를 들어, 세포의 지속적인 공급이 요구되거나, 관심 특정 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산이 요구되는 경우, 세포 배양은 특정 성장 단계에서 유지가 필요할 수 있다. 따라서, 해당 특정 단계에서 세포를 유지하기 위하여 조건은 지속적으로 모니터링되고 이에 따라 조정되어야 한다.
본 발명의 일 양태는 생산 배양에서 단백질 생산 및 수확 이전에 세포 개체군이 확장되는 종자 배양에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 종자 세포 배양물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 단백질이 생산되고 수확되는 생산 배양에 관한 것이다. 생산 단계 이전에, 전형적으로 세포 배양을 위한 모든 구성요소가 배양 공정의 시작 시 배양 용기에 공급된 다음 세포 개체군은 생산 규모에 대한 준비가 될 때까지 확장되는 성장 단계(또한 시드 트레인 또는 종자 배양으로도 알려짐)가 있다. 이와 같이, 배양 용기는 시작 세포주에 따라 초기 세포 성장 단계에 적합한 파종 밀도로 세포로 접종된다. 일부 양태에서, 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 후속 생산 단계에서 세포의 생산을 추가로 개선 또는 향상시키기 위해 종자 세포 배양물과 함께 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 불순물이 감소된 세포 배양 배지는 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 생산 세포 배양물과 함께 사용될 수 있다.
배양 용기는 웰 플레이트, T-플라스크, 진탕 플라스크, 교반 용기, 스피너 플라스크, 중공 섬유, 공기 부양 생물반응기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 적합한 세포 배양 용기는 생물반응기이다. 생물반응기는 환경 조건을 조작 또는 제어하도록 제조 또는 엔지니어링된 임의의 배양 용기를 지칭한다. 그러한 배양 용기는 당업계에 잘 알려져 있다.
가스 교환을 최적화하고, 세포 성장 및 생산성을 유지하기에 충분한 산소를 공급하고, CO2를 제거하도록 생물반응기 공정 및 시스템을 개발하였다. 가스 교환의 효율성을 유지하는 것은 세포 배양 및 단백질 생산의 성공적인 규모 확장을 보장하기 위한 중요한 기준이다. 그러한 시스템은 당업자에게 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, 배지는 유가식 공정에 따른 세포 배양 동안 간격을 두고 보충된다. 유가식 배양은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 단백질 생산을 최적화하는 데 이용된다(문헌[Y. M. Huang et al., Biotechnol Prog. 2010 September-October; 26(5): 1400-10] 참조). 유가식 공정은 전형적으로 생산 단계 동안 사용된다.
생산 배양 기간 동안 매일, 또는 2 내지 3일 빈도의 간격으로, 비타민, 아미노산 및 상기 기재된 바와 같은 다른 영양소와 같은 추가적인 영양소를 포함하도록 보충 공급을 수행할 수 있다. 보충 공급은 2주 이상의 배양을 위해 생산 배양 기간 전체에 걸쳐 적어도 2회, 또는 적어도 8회 수행될 수 있다(영양소를 포함하는 보충 배지가 첨가됨). 또 다른 실시형태에서, 보충 공급은 배양 기간 동안 매일 수행될 수 있다. 대안적인 배양 공급 일정도 또한 구상된다.
비-고갈 배지를 제공하기 위해 추가적인 아미노산 보충이 또한 수행될 수 있으며, 여기서 고갈된 아미노산은 당업계에 알려지고 본 명세서에 기재된 방법에 따라 결정된다. 이러한 요법이 이용되는 경우, 아미노산 고갈의 결정에 따라 생산 배양의 기간 동안 간격을 두고, 바람직하게는 매일, 또는 2 내지 3일마다의 빈도로 추가적인 아미노산이 보충 또는 첨가된다. 일 실시형태에서, 비-고갈 세포 배양 배지를 유지하기 위한 추가적인 아미노산의 혼합물은 2주 이상의 배양을 위해 정확히 또는 대략 1일째, 정확히 또는 대략 2일째, 정확히 또는 대략 3일째, 정확히 또는 대략 4일째, 정확히 또는 대략 5일째, 정확히 또는 대략 6일째, 정확히 또는 대략 7일째, 정확히 또는 대략 8일째, 정확히 또는 대략 9일째, 정확히 또는 대략 10일째, 정확히 또는 대략 11일째, 정확히 또는 대략 12일째, 정확히 또는 대략 13일째, 및 정확히 또는 대략 14일째에 배양물에 첨가된다. 대안적인 배양 공급 일정도 또한 구상된다.
진핵 세포, 예컨대 CHO 세포는 약 25mL의 배지를 갖는 125ml 용기, 약 50 내지 100mL의 배지를 갖는 250mL 용기, 약 100 내지 200mL의 배지를 갖는 500mL 용기에서와 같은 소규모 배양물에서 배양될 수 있다. 대안적으로, 배양물은, 예를 들어, 약 300 내지 1000mL의 배지를 갖는 1000mL 용기, 약 500mL 내지 3000mL의 배지를 갖는 3000mL 용기, 약 2000mL 내지 8000mL의 배지를 갖는 8000mL 용기, 및 약 4000mL 내지 15000mL의 배지를 갖는 15000mL 용기와 같은 대규모일 수 있다. 제조용 배양물은 10,000L 이상의 배지를 포함할 수 있다. 단백질 치료제의 임상 제조용과 같은 대규모 세포 배양은 전형적으로 세포가 원하는 단백질(들)을 생산하는 동안 수일, 또는 심지어 수주 동안 유지된다. 이 시간 동안 배양물은 배양 과정 동안 소비되는 영양분 및 아미노산과 같은 구성요소를 포함하는 농축된 공급 배지로 보충될 수 있다. 농축된 공급 배지는 임의의 세포 배양 배지 제형에 기반할 수 있다. 그러한 농축된 공급 배지는, 예를 들어 정상적인 유용한 양의 약 5×, 6×, 7×, 8×, 9×, 10×, 12×, 14×, 16×, 20×, 30×, 50×, 100×, 200×, 400×, 600×, 800×, 또는 심지어 약 1000×로 세포 배양 배지의 대부분의 구성요소를 포함할 수 있다. 농축된 공급 배지는 종종 유가식 배양 공정에서 사용된다.
일부 실시형태에서, 세포 배양은 세포 성장 또는 단백질 생산 과정 동안 첨가물, 사용 지점(point-of-use) 성분, 또는 사용 지점 화학물질로도 알려진 "사용 지점 첨가물"로 추가로 보충될 수 있다. 사용 지점 첨가물은 성장 인자 또는 다른 단백질, 완충제, 에너지원, 염, 아미노산, 금속 및 킬레이트제 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 다른 단백질은 트랜스페린 및 알부민을 포함한다. 사이토카인 및 케모카인을 포함하는 성장 인자는 일반적으로 당업계에 알려져 있으며 세포 성장 또는 일부 경우에는 세포 분화를 자극하는 것으로 알려져 있다. 성장 인자는 보통 단백질(예를 들어, 인슐린), 작은 펩타이드, 또는 스테로이드 호르몬, 예컨대, 에스트로겐, DHEA, 테스토스테론 등이다. 일부 경우에, 성장 인자는 세포 증식 또는 단백질 생산을 촉진시키는 비-천연 화학물질, 예컨대, 테트라하이드로폴레이트(THF), 메토트렉세이트 등일 수 있다. 단백질 및 펩타이드 성장 인자의 비-제한적인 예는 안지오포이에틴 안지오포이에틴, 골 형성 단백질(BMP), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 표피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 아교세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 성장 분화 인자-9(GDF9), 간세포 성장 인자(HGF), 간암-유래 성장 인자(HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 이동-자극 인자, 미오스타틴(GDF-8), 신경 성장 인자(NGF) 및 기타 뉴로트로핀, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 트롬보포이에틴(TPO), 변형 성장 인자 알파(TGF-α), 변형 성장 인자 베타(TGF-β), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), wnt 신호전달 경로 효현제, 태반 성장 인자(PIGF), 태아소 소마토트로핀(FBS), 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 사용 지점 부가 성장 인자로 보충된다. 일 실시형태에서, 배지 내 인슐린의 농도, 즉 첨가 후 세포 배양 배지 내 인슐린의 양은 약 0.1μM 내지 10μM이다.
완충제는 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 본 발명은 임의의 특정 완충제 또는 완충제들로 제한되지 않으며, 당업자는 특정 단백질을 생산하는 특정 세포주와 함께 사용하기에 적절한 완충제 또는 완충 시스템을 선택할 수 있다. 일 실시형태에서, 사용 지점 첨가 완충제는 NaHCO3이다. 또 다른 실시형태에서, 완충제는 HEPES이다. 다른 실시형태에서, 사용 지점 첨가 완충제는 NaHCO3 및 HEPES를 둘 다 포함한다. 완충제가 HEPES를 포함하는 실시형태에서, HEPES 완충제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 감소된 양의 HEPES 관련 불순물을 포함한다.
세포 배양에서 사용 지점 첨가물로서 사용하기 위한 에너지원은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 제한 없이, 일 실시형태에서, 사용 지점 첨가 에너지원은 글루코스이다. 특정 세포주 및 생산될 단백질의 특정한 구체적인 요건이 주어지면, 일 실시형태에서 글루코스는 배지에 약 1 내지 20mM의 농도로 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 글루코스는 20 g/L 이상의 높은 수준으로 첨가될 수 있다.
킬레이트제는 마찬가지로 세포 배양 및 단백질 생산의 업계에서 잘 알려져 있다. 테트라소듐 EDTA 탈수화물 및 시트레이트는 당업계에서 사용되는 2가지 일반적인 킬레이트제이지만, 본 발명의 실시에서 다른 킬레이트제가 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 사용 지점 첨가 킬레이트제는 테트라소듐 EDTA 이수화물이다. 일 실시형태에서, 사용 지점 첨가 킬레이트제는 시트레이트, 예컨대, Na3C6H5O7이다.
일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 에너지원으로서 하나 이상의 사용 지점 첨가 아미노산, 예컨대, 글루타민으로 추가적으로 보충될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 약 1mM 내지 13mM의 최종 농도로 사용 지점 첨가 글루타민으로 보충된다.
다른 사용 지점 첨가물은 다양한 금속 염, 예컨대, 철, 니켈, 아연 및 구리의 염 중 하나 이상을 포함한다. 일 실시형태에서, 세포 배양 배지는 황산구리, 황산아연, 염화제2철, 및 황산니켈 중 임의의 하나 이상으로 보충된다.
단백질 생산
불순물이 감소된 배지 및 그러한 배지에서 세포를 배양하는 방법에 추가적으로, 본 발명은 재조합 진핵 세포를 배양함으로써 재조합 단백질의 생산에서 재조합 단백질 역가를 개선시키는 것을 포함하여, 세포 배양 성능을 개선시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 재조합 진핵 세포는 재조합 단백질을 인코딩하는 안정적으로 통합된 핵산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 개선된 세포 성장(예를 들어, 배가율), 생존 세포 밀도, 세포 생존능, 및 이들의 조합을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 불순물이 감소된 세포 배양 배지를 제공하는 단계, 배지에서 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계; 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계, 및 비-불순물 감소 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포에 비해 불순물이 감소된 배지에서 배양된 재조합 진핵 세포로부터 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 불순물이 감소된 배지에서 배양된 세포로부터 배양 배지 리터당 단백질 생성물의 그램으로 표현될 수 있는 단백질 생산 수율 또는 역가는 적어도 100 mg/L, 적어도 1 g/L, 적어도 1.2 g/L, 적어도 1.4 g/L, 적어도 1.6 g/L, 적어도 1.8 g/L, 적어도 2 g/L, 적어도 2.5 g/L, 적어도 3 g/L, 적어도, 3.5 g/L, 적어도 4 g/L, 적어도 4.5 g/L, 적어도 5 g/L, 적어도 5.5 g/L, 적어도 6 g/L, 적어도 6.5 g/L, 적어도 7 g/L, 적어도 7.5 g/L, 적어도 8 g/L, 적어도 8.5 g/L, 적어도 9 g/L, 적어도 9.5 g/L, 적어도 10 g/L, 적어도 15 g/L, 또는 적어도 20 g/L이다.
일부 실시형태에서, 불순물이 감소된 배지에서 배양된 세포로부터 산출된 단백질 역가는 비-불순물 감소 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포로부터의 단백질 역가(수율)보다 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 11%, 적어도 약 12%, 적어도 약 13%, 적어도 약 14%, 적어도 약 15%, 적어도 약 16%, 적어도 약 17%, 적어도 약 18%, 적어도 약 19%, 적어도 약 20%, 적어도 약 21%, 적어도 약 22%, 적어도 약 23% 초과, 적어도 약 24% 초과, 적어도 약 25% 초과, 적어도 약 26% 초과, 적어도 약 27% 초과, 적어도 약 28% 초과 또는 적어도 약 29% 더 크다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 불순물이 감소된 배지에서 배양된 포유동물 세포에 의한 단백질의 역가(수율)는 비-불순물 감소 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 의한 단백질의 역가보다 적어도 100 mg/L, 적어도 0.5 g/L, 적어도 1 g/L, 적어도 1.2 g/L, 적어도 1.4 g/L, 적어도 1.6 g/L, 적어도 1.8 g/L, 적어도 2 g/L, 적어도 2.5 g/L 더 크다.
본 발명의 방법은 세포 배양 공정을 통해 단백질 생산을 개선시키는 데 유용하다. 본 발명에서 사용되는 세포주는 상업적 또는 과학적 관심의 재조합 단백질을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 세포주를 유전자 조작하는 것은 재조합 폴리뉴클레오타이드 분자로 세포를 형질감염, 형질전환 또는 형질도입하는 것, 또는 그렇지 않으면 (예를 들어, 동종 재조합 및 유전자 활성화 또는 재조합 세포와 비-재조합 세포의 융합에 의한) 변경을 포함하여 숙주 세포가 원하는 재조합 폴리펩타이드를 발현하도록 한다. 관심 폴리펩타이드를 발현하기 위해 세포 또는 세포주를 유전자 조작하기 위한 방법 및 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며; 예를 들어, 다양한 기법이 문헌[Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69]에 예시되어 있다. 배양에서의 성장에 적합한 매우 다양한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 매너서스 소재) 및 상업적 판매자로부터 이용 가능하다.
일부 실시형태에서, 단백질 생성물(관심 단백질)은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 항-세포예정사(Programmed Cell Death) 1 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0203579A1호에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-세포예정사 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0203580A1호에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-DII4 항체, 항-안지오포에틴(Angiopoetin)-2 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0313194A1호에 기재된 바와 같은 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 제US2015/0259423A1호에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로프로틴 컨버타제 서브틸리신 켁신-9(anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin-9) 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 출원 공개 제US2014/0044730A1호에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기재된 바와 같은 항-GDF8 항체, 또한 항-미오스타틴 항체로도 알려져 있음), 항-글루카곤 수용체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기재된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터류킨 33(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271658A1호 또는 제US2014/0271642A1호에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271653A1호에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 출원 제62/222,605호에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 제7,879,984호에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터-48(예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기재된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337029A1호에 기재된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0215040호에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어, 항-LAG3 항체, 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3×항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기재된 바와 같음), 항-CD3×항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3×항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3×항-프로스테이트-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3×항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 관심 단백질은 Fc 모이어티 및 또 다른 도메인(예를 들어, Fc-융합 단백질)을 포함하는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이에 이어 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다수 리간드에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대, IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 II-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 포함하는, 릴로나셉트(rilonacept); 미국 특허 제6,927,044호 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는, 애플리버셉트(aflibercept) 또는 ziv-애플리버셉트; 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호 참조)이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이며, 이는 Fc 모이어티에 커플링된 항체의 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예컨대, 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 포함한다.
추가적으로, 미니-트랩이 포함되는데, 이는 Fc 부분 대신 다량체화 구성요소(MC)를 사용하는 트랩 단백질이며, 미국 특허 제7,279,159호 및 제7,087,411호에 개시되어 있다.
상기 유도체, 구성요소, 도메인, 사슬 및 단편도 또한 포함된다.
본 발명은 재조합 단백질 생산을 위한 임의의 특정 유형의 세포에 제한되지 않는다. 재조합 단백질 생산에 적합한 세포 유형의 예는 포유동물 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 박테리아 세포 및 효모 세포를 포함한다. 세포는 줄기 세포 또는 재조합 유전자 발현을 위한 벡터로 형질전환된 재조합 세포, 또는 바이러스 생성물을 생산하기 위한 바이러스로 형질감염된 세포일 수 있다. 세포는 관심 단백질을 인코딩하는 재조합 이종 폴리뉴클레오타이드 작제물을 포함할 수 있다. 해당 작제물은 에피솜일 수 있거나 세포의 게놈 내로 물리적으로 통합되는 요소일 수 있다. 세포는 또한 이종 폴리펩타이드 작제물 상에 인코딩된 단백질을 갖지 않으면서 관심 단백질을 생산할 수 있다. 다시 말하면, 세포는 관심 단백질, 예컨대, 항체를 생산하는 B-세포를 자연적으로 인코딩할 수 있다. 세포는 또한 1차 세포, 예컨대, 닭 배아 세포, 또는 1차 세포주일 수 있다.
유용한 세포의 예는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 세포주는 CHO 세포 유도체, 예컨대, CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, 또는 CHO Iec 돌연변이 계통이다.
생산 단계는 쉐이커 플라스크 또는 웨이브 백으로부터 1-리터 생물반응기, 및 대규모 산업용 생물반응기로 임의의 규모의 배양에서 수행될 수 있다. 마찬가지로, 시드 트레인 확장 단계는 쉐이커 플라스크 또는 웨이브 백으로부터 1-리터 이상의 생물반응기로 임의의 규모의 배양에서 수행될 수 있다. 약 100 리터 내지 20,000 리터 이상의 부피로 대규모 방법이 수행될 수 있다. 온도 변화 또는 화학적 유도와 같은 여러 수단 중 하나 이상이 단백질 생산을 제어하는 데 사용될 수 있다. 성장 단계는 생산 단계보다 더 높은 온도에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 약 35℃ 내지 38℃의 제1 온도에서 일어날 수 있고, 생산 단계는 약 29℃ 내지 37℃, 선택적으로 약 30℃ 내지 36℃ 또는 약 30℃ 내지 34℃의 제2 온도에서 일어날 수 있다. 추가적으로, 단백질 생산의 화학적 유도제, 예컨대, 카페인, 뷰티레이트, 타목시펜, 에스트로겐, 테트라사이클린, 독시사이클린, 및 헥사메틸렌 비스아세트아마이드(HMBA)는 온도 변화와 동시에, 전에, 또는 후에 첨가될 수 있다. 유도제가 온도 변화 후에 첨가되는 경우, 유도제는 온도 변화 후 1시간 내지 5일, 예컨대, 온도 변화 후 1 내지 2일 후에 첨가될 수 있다. 생산 세포 배양은 케모스타트에서와 같이 연속 공급 배양 시스템으로(문헌[C. Altamirano et al., 2001, 상기함] 참조), 또는 유가식 방법에 따라서(Huang, 2010, 상기함) 실행될 수 있다.
배지 및 완충제 선택
본 발명의 또 다른 양태는 세포 배양에서 사용하기 위해 선택하기 위한 세포 배양 배지 또는 HEPES 완충제를 스크리닝하여 세포 배양 성능을 개선시키는, 예를 들어 개선된 단백질 역가, 개선된 세포 성장, 개선된 생존 세포 밀도 등을 위한 방법에 관한 것이다. 그러한 방법은 세포 배양에 사용하기 위해 본 발명에 따라 불순물이 감소된 배지를 선택하거나, 세포 배양에 사용하기 위해 불순물이 감소된 HEPES 완충제를 선택하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 세포 배양 배지를 선택하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 HEPES 완충제를 포함하는 세포 배양 배지를 제공하는 단계; HEPES 완충제를 포함하는 세포 배양 배지를 분석하여 세포 배양 배지에 존재하는 분자량(MW)이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량(MW)이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계; 및 HEPES 완충제를 포함하는 세포 배양 배지가 본 명세서에 논의된 감소된 HEPES 관련 불순물을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에 사용하기 위해 HEPES 완충제를 포함하는 세포 배양 배지를 선택하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 그러한 방법에 따라 선택된 세포 배양 배지의 사용은 비-HEPES 불순물 감소 세포 배양 배지에서의 세포 배양 성능에 비해, 세포 배양 성능을 개선시킨다.
다른 실시형태에서, 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 HEPES 완충제를 선택하는 방법이 제공된다. 방법은 일반적으로 HEPES 완충제를 제공하는 단계; HEPES 완충제를 분석하여 HEPES 완충제에 존재하는 분자량(MW)이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량(MW)이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계; 및 HEPES 완충제가 본 명세서에 논의된 감소된 HEPES 관련 불순물을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에 사용하기 위해 HEPES 완충제를 선택하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면, 그러한 방법에 따라 선택된 HEPES의 사용은 비-불순물 감소 HEPES 완충제를 이용하는 세포 배양 성능에 비해 세포 배양 성능을 개선시킨다.
HEPES 관련 불순물의 존재를 정량적으로 결정하기 위해 배지 또는 HEPES 완충제를 분석하기 위한 임의의 적합한 방법은 본 명세서에 개시된 방법과 관련하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 분석 방법은 본 명세서에 개시된 모든 분석, 분리 및 정제 방법을 포함하여 HPLC, LC-MS 및 다른 방법을 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범주가 제한되지 않으며, 이는 본 발명의 개별 양태 또는 실시형태의 예시인 것으로 의도된다. 기능적으로 동등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범주 내에 있다. 본 명세서에 기재된 것에 추가적으로 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백하다. 그러한 변형은 본 발명의 범주 내에 속한다.
실시예
다음 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - HEPES 관련 불순물의 확인
세포 배양 작업을 수행하는 "고역가" 및 세포 배양 작업을 수행하는 "저역가"에서 이용되는 로트 사이에서 화학적으로 규정된 배지의 53가지 상이한 구성요소의 로트 계보학의 ANOVA 분석을 수행하였다. HEPES 산 및 염은 "고위험" 구성요소인 것으로 밝혀졌으며, 이는 최종 역가와 가장 강한 상관관계를 나타내었다(상관관계는 역가와 배지 전체 간의 상관관계보다 더 강함). HEPES는 또한 배지 제형에서 구성요소의 중량 분율, 구성요소의 COA 순도 및 이의 제조 방법을 고려한 독립적인 위험-기반 분석에서 "고위험 구성요소"로 확인되었다.
후속 조치로서, 배지 로트의 FTIR 및 라만 분광 분석을 수행하였다. 배지의 FTIR 스펙트럼의 특정 영역에서의 흡수와 HEPES에 할당된 최종 역가 사이에 강한 상관관계가 확인되었으며(이는 HEPES 스펙트럼의 알려진 특징으로 기반으로 함), 나중에 HEPES 유지의 FTIR 스펙트럼과 비교하여 확인되었다. 관찰된 역가 결과와 정렬된 로트를 수행하는 "저역가"와 "고역가" 사이의 스펙트럼 차이. 추가적인 배지 로트에서 데이터를 획득하여 들어오는 배지 로트의 역가 성능에 대한 예측 모델을 구축하는 데 사용하였다.
CDM1B의 라만 스펙트럼에서 여러 밴드는 또한 최종 역과와 강한 상관관계를 갖는 것으로 밝혀졌다. FTIR 분석과 유사하게, HEPES 유지 샘플의 스펙트럼과 배지의 라만 스펙트럼을 일치시킴으로써 이들 밴드를 HEPES에 할당하였다.
HEPES를 최종 역가와 강한 상관관계가 있는 "고위험" 구성요소로 확인한 후, LC-MS 및 역가 상관관계 평가를 포함하여 HEPES 완충제 로트의 화학적 조성 분석을 수행하였다. 이러한 연구에 기반하여, 분석된 모든 생산 작업에 대해 역가와 음의 상관관계를 나타내는 2개의 HEPES 관련 불순물을 확인하였다.
2개의 확인된 HEPES 관련 불순물은 하기 표 2에 제시된 화학식 및 분자량(MW)을 갖는 것으로 결정되었다.
하기 표 3은 HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]를 포함하여 확인된 모든 불순물을 나타낸다.
놀랍게도, 하기 표 4에서 확인된 불순물(표 4 화합물)은 많은 것들이 HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]보다 더 많이 존재했음에도 불구하고 세포 역가에 악영향을 미치지 않았다. 표 4의 화합물 중 하나 이상은 세포에 과도하게 악영향을 주지 않으면서 배양 배지에 존재할 수 있다.
이론에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않지만, 화학식 및 분자량(MW)에 기반하여, HEPES 관련 불순물에 대해 다음 화학 구조가 제안된다. 그러나, 본 발명은 이러한 제안된 화학 구조의 제시에 제한되지 않으며, HEPES 관련 불순물의 화학식 및 분자량에 상응하는 다른 화학 구조는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 구상된다.
실시예 2 - 역가와 음의 상관관계가 있는 HEPES 관련 불순물
두필루맙을 생산하기 위해 다수의 위치에서 대규모 생산 작업을 수행하였다. 본 발명에 따르면, 본 명세서에 논의된 바와 같이 HEPES 관련 불순물의 양은 단백질 역가에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 결과에 기반하여 그리고 본 발명에 따라, 개선된 단백질 역가는 본 발명에 따라 HEPES 관련 불순물이 감소된 배지를 사용함으로써 얻을 수 있다.
도 1은 HEPES+[O2]-[H2]의 상대적인 양과 단백질 역가 사이의 관계를 예시한다. 도 2A 및 2B는 2개의 상이한 위치에서 두필루맙의 다중 생산 작업에 대해 역가와 HEPES+[O2]-[H2] 사이의 음의 상관관계를 입증한다(도 2A, 위치 1에서 20개의 생산 작업; 도 2B, 위치 2에서 7개의 생산 작업). 피트 데이터의 개요는 도 2A 및 2B의 각각의 그래프 아래에 나타나 있다.
도 3은 HEPES-[CH4]의 상대적인 양과 단백질 역가 사이의 관계를 예시한다. 도 4A 및 4B는 2개의 상이한 위치에서 두필루맙의 다중 생산 작업에 대해 역가와 HEPES-[CH4] 사이의 음의 상관관계를 입증한다(도 4A, 위치 1에서 20개의 생산 작업; 도 4B, 위치 2에서 7개의 생산 작업). 피트 데이터의 개요는 도 4A 및 4B의 각각의 그래프 아래에 나타나 있다.
도면에 나타낸 바와 같이, 위치 1 및 위치 2 둘 다에서, HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]는 둘 다 더 낮은 역가 생산 작업에서 더 높은 존재비를 나타내었고, 역가와 음의 상관관계를 나타내었다. 상이한 생산 위치에서 보이는 유사한 결과는 HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]의 더 큰 존재비가 역가와 음의 상관관계를 갖는다는 결정의 신뢰도를 증가시킨다.
실시예 3 - HEPES 완충제에서 불순물의 구조 규명
HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]를 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 컬럼을 사용하여 HEPES로부터 분리하였다(도 5A가 나타내는 표적). 혼합 모드 컬럼을 사용하여 HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]를 HILIC 분리로부터의 분획에서 수집된 다른 HEPES 불순물과 함께 추가로 분리하였다(도 5B가 나타내는 표적). 두 컬럼의 조합을 사용하여 HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]를 추가로 정제할 수 있다.
HEPES+[O2]-[H2] 및 HEPES-[CH4]의 구조를 역상 액체-크로마토그래피 질량 분석법(RP-LCMS), 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피 질량 분석법(HILIC-LCMS), 및 MS/MS 단편화를 사용하여 확인하였다. 도 6A는 HEPES 원료로부터 유래된 HEPES-[CH4](또한 "221"으로 지칭함)의 RP-LCMS 플롯이다. 도 6B는 HEPES 원료로부터 유래된 HEPES-[CH4]의 HILIC-LCMS 플롯이다. 도 7은 HEPES 원료로부터 유래된 HEPES-[CH4]의 MS/MS 단편화를 나타낸다.
실시예 4 - 단백질
본 발명은 생물학적 및 약제학적 제품의 생산에 이용될 수 있고, 관심 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 세포의 증식에 적용될 수 있으며, 본 출원에 개시된 각각의 실시형태 및 실시예는 생물학적 및 약제학적 제품의 생산에서 하기 확인된 것과 함께 사용될 수 있다. 그러한 단백질은 항체, 수용체, 융합 단백질, 길항제, 저해제, 효소(예컨대, 효소 대체 요법에서 사용되는 것). 인자 및 보조 인자, 사인토카인, 케모카인, 억제제, 활성화제, 리간드, 리포터 단백질, 선택 단백질, 단백질 호르몬, 단백질 독소, 구조 단백질, 저장 단백질, 수송 단백질, 신경전달물질 및 수축성 단백질을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 생산될 수 있는 특정 유형의 단백질은 하기에서 더 상세하게 논의된다.
항체(또는 "면역글로불린"으로 지칭됨)는 다중 폴리펩타이드 사슬 및 광범위한 번역 후 변형을 갖는 단백질의 예이다. 표준 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgG)은 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 시스테인 이황화 결합을 통해 하나의 중쇄에 연결되고, 2개의 중쇄는 2개의 시스테인 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 포유동물 시스템에서 생산된 면역글로불린은 또한 다양한 다당류로 다양한 잔기(예를 들어, 아스파라긴 잔기)에서 글리코실화되고, 종마다 상이할 수 있으며, 이는 치료용 항체에 대한 항원성에 영향을 미칠 수 있다. Butler and Spearman, "The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering", Curr. Opin. Biotech. 30:107-112 (2014).
항체 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서는 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL)을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다(중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDRl, LCDR2 및 LCDR3으로 약칭될 수 있음). 용어 "고친화성" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™ 또는 용액-친화성 ELISA에 의해 측정될 때 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M; 적어도 10-11 M; 또는 적어도 10-12 M의 표적에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 지칭한다.
항체 경쇄는 임의의 유기체 유래의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은 달리 명시되지 않는 한 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 경쇄는, 예를 들어 항원-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합되는 제1 또는 제2 항원에 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 적합한 경쇄는 기존 항체 라이브러리(습식 라이브러리 또는 인실리코(in silico))에서 가장 일반적으로 이용되는 경쇄를 스크리닝함으로써 확인될 수 있는 것을 포함하며, 여기서 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 적합한 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 영역에 의해 결합되는 하나 또는 둘 다의 에피토프에 결합할 수 있는 것을 포함한다.
항체 가변 도메인은 (달리 표시되지 않는 한) N-말단에서 C-말단으로의 순서로 FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 아미노산 영역을 포함하는 (원하는 대로 변형된) 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 포함한다. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조를 갖는 표준 도메인(VH 또는 VL)으로 접힐 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 베타 시트는 제1 베타 시트의 잔기와 제2 베타 시트의 잔기 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다.
항체 상보성 결정 영역("CDR")은 일반적으로 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 2개의 프레임워크 영역 사이에 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식계열 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해, 예를 들어 미경험 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 상황에서(예를 들어, CDR3의 경우), CDR은 예를 들어 서열을 스플라이싱하거나 연결한 결과로서(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합), (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 인접하지 않지만 B 세포 핵산 서열에서 인접하는 2개 이상의 서열(예를 들어, 생식계열 서열)에 의해 인코딩될 수 있다. 항체의 상기 구성요소 각각은 본 발명에 따라 생산될 수 있다.
이중특이적 항체는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로, 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원) 상에 2개의 상이한 중쇄를 포함하며, 각각의 중쇄는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2, 3 또는 4 자릿수 더 낮을 것이거나, 그 반대이다. 이중특이적 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있으며, 그러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이적 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR을 갖는 2개의 중쇄와, 이어서 (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 및 항원-결합 특이성을 부여하지는 않지만 각각의 중쇄와 회합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합되는 에프토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 각각의 중쇄와 회합할 수 있고 하나 또는 둘 다의 에피토프에 대한 하나 또는 둘 다의 중쇄의 결합을 가능하게 하고, 본 발명에 따라 생산될 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다.
예를 들어, 항체 실시형태의 경우, 본 발명은 모든 주요 항체 부류, 즉 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE에 기반한 진단제 및 치료제를 위한 연구 및 생산 용도로 수정될 수 있다. IgG, 예컨대 IgG1(IgG1λ및 IgG1κ를 포함함), IgG2 및 IgG4가 바람직한 부류이다. 본 발명에 따라 생산되는 예시적인 항체는 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙을 포함한다. 추가 항체 실시형태는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
추가적인 실시형태에서, 항체는 항-세포예정사 1 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0203579A1호에 기재된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-세포예정사 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0203580A1호에 기재된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기재된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기재된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기재된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,302,015호에 기재된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0313194A1호에 기재된 바와 같은 25 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기재된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 제US2015/0259423A1호에 기재된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로프로틴 컨버타제 서브틸리신 켁신-9 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 출원 공개 제US2014/0044730A1호에 기재된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기재된 바와 같은 항-GDF8 항체, 또한 항-미오스타틴 항체로도 알려져 있음), 항-글루카곤 수용체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기재된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기재된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기재된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터류킨 33(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271658A1호 또는 제US2014/0271642A1호에 기재된 바와 같은 항-IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271653A1호에 기재된 바와 같은 항-RSV 항체), 항-분화 클러스터 3(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 출원 제62/222,605호에 기재된 바와 같은 항-CD3 항체), 항-분화 클러스터 20(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 제7,879,984호에 기재된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-분화 클러스터 48(예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기재된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기재된 바와 같음), SARS-CoV-2 치료제(카시리비맘 및 임데비맙을 포함하는 REGN-COV™),항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2015/0337029A1호에 기재된 바와 같은 항-MERS 항체), 에볼라에 대한 항체 칵테일(아톨티비맙, 마프티비맙 및 오데시비맙-ebgn을 포함하는 REGN-EB3(INMAZEB®)), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0215040호에 기재된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기재된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 출원 공개 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기재된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-프로스테이트-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 미국 특허 공개 제US 2019/0285580 A1호를 참조한다.
항체 유도체 및 단편은 본 발명에 따른 생산을 위해 수정될 수 있으며, 항체 단편(예를 들어, ScFv-Fc, dAB-Fc, 절반 항체), 다중특이적(예를 들어, IgG-ScFv, IgG-dab, ScFV-Fc-ScFV, 삼중-특이적) 및 Fc-융합 단백질(예를 들어, Fc-융합(N-말단), Fc-융합(C-말단), 단일 Fc-융합, 이중특이적 Fc-융합)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 어구 "Fc-포함 단백질"은 항체, 이중특이적 항체, Fc를 포함하는 항체 유도체, Fc를 포함하는 항체 단편, Fc-융합 단백질, 면역어드헤신, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 하나의 기능적 부분을 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부분"은 Fc 수용체(예를 들어, FcyR; 또는 FcRn, (신생아 Fc 수용체)에 결합할 수 있고/있거나 보체의 활성화에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 지칭한다. CH2 및 CH3 영역이 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없고 또한 보체를 활성화시킬 수 없게 만드는 다른 변형을 포함하는 경우, CH2 및 CH3 영역은 기능적이지 않다.
비-천연 형식, 예컨대 비-천연 구성의 Fab 도메인을 갖는 항원 결합 분자(ABM) 및 ABM 접합체는 본 발명에 따라 발현될 수 있고 WO 2021/026409 A1에 개시되어 있다. 다중특이적 결합 분자(MBM) 및 MBM 접합체는 본 발명에 따라 생산될 수 있고, WO 2021/091953A1 및 WO 2021/030680 A1에 개시되어 있다.
Fc-포함 단백질은, 변형이 결합 단백질의 하나 이상의 이펙터 기능에 영향을 미치는 경우를 포함하여, 면역글로불린 도메인의 변형(예를 들어, FcyR 결합, FcRn 결합 및 이에 따른 반감기, 및/또는 CDC 활성에 영향을 미치는 변형)을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 면역글로불린 불변 영역의 EU 넘버링을 참조하여 하기 변형 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 및 439.
예를 들어, 비제한적으로, 결합 단백질은 Fc-포함 단백질이고 (인용된 변형(들) 없이 동일한 Fc-포함 단백질과 비교하여) 향상된 혈청 반감기를 나타내며 위치 250(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T), 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433(예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 갖는다. 또 다른 예에서, 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591(예를 들어, V259I) 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254 및 256(예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.
상기 진술한 바와 같이, 본 발명은 또한 융합 단백질을 포함하여 다른 분자의 생산에 적용될 수 있다. 이들 단백질은 2가지 이상의 단백질 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있으며, 이 중 하나는 자연 상태에서 융합되지 않는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. Fc-융합 단백질은 Fc-융합(N-말단), Fc-융합(C-말단), 단일 Fc-융합 및 이중특이적 Fc-융합을 포함한다. 항체-유래 폴리펩타이드(Fc 도메인을 포함함)의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어 문헌[Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 10535-39 (1991); Byrn et al., Nature 344:677-70, 1990; 및 Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11 (1992)]에 의해 기재되었다. 수용체 Fc-포함 단백질은 또한 문헌[C. Huang, "Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MFMETIBODY technology," 20(6) Curr. Opin. Biotechnol. 692-9 (2009)]에 기재되어 있다.
수용체 Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들) 중 하나 이상을 포함하며, 이는 일부 실시형태에서 힌지 영역, 이에 이어 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 단일 또는 하나 초과의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 일부 수용체 Fc-융합 단백질은 다수의 상이한 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 커플링된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이에 이어 IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다수 리간드에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은 TRAP 단백질, 예컨대, IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 포함하는, 릴로나셉트(rilonacept); 미국 특허 제6,927,044호 참조), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는, 애플리버셉트(aflibercept) 또는 ziv-애플리버셉트; 미국 특허 제7,087,411호 및 제7,279,159호)이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 ScFv-Fc-융합 단백질이며, 이는 Fc 모이어티에 커플링된 항체의 하나 이상의 항원 결합 도메인(들), 예컨대, 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편 중 하나 이상을 포함한다.
미니-트랩 단백질은 Fc 부분 대신 다량체화 구성요소(MC)를 사용하는 트랩 단백질이며, 미국 특허 제7,279,159호 및 제7,087,411호에 개시되어 있고, 본 발명에 따라 생산될 수 있다.
본 발명은 예시적인 실시형태를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 등가물이 그 요소에 대해 대체될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 추가적으로, 본 교시내용의 본질적인 범주를 벗어나지 않으면서 특정 상황 또는 재료를 본 교시내용에 적응시키기 위해 많은 수정이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명을 수행하기 위해 고려되는 최선의 모드로서 개시된 특정 실시형태에 제한되지 않고, 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 모든 실시형태를 포함할 것으로 의도된다.
Claims (80)
- 재조합 진핵 세포를 배양함으로써 재조합 단백질의 생산 시 재조합 단백질 역가를 개선시키는 방법으로서,
(a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 규정된 세포 배양 배지는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는, 상기 세포 배양 배지를 제공하는 단계;
(b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
(d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 방법.
- 제1항에 있어서, 재조합 진핵 세포의 상기 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 큰, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 항체, 항체 단편, 및 ScFv-Fc 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체, 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 두필루맙인, 방법.
- 불순물이 감소된 세포 배양 배지로서, 상기 배지는 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 포함하고, 상기 규정된 세포 배양 배지는 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하며, 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 800 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 80 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 상기 배지는 무가수분해물인, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 규정된, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 인슐린을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 0.09mM±0.014mM 이상의 오르니틴, 0.20±0.03mM 이상의 퓨트레신(putrescine), 또는 이들의 조합을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 40±6mM 이상의 아미노산 또는 이의 염의 혼합물을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제20항에 있어서, 상기 아미노산의 혼합물은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 및 발린으로 이루어진, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 하나 이상의 지방산 및 토코페롤을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 지방산은 리놀레산, 리놀렌산, 티옥트산, 올레산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 아라키돈산, 라우르산, 베헨산, 데칸산, 도데칸산, 헥산산, 리그노세르산, 미리스트산, 및 옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 뉴클레오사이드의 혼합물을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제24항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드의 혼합물은 아데노신, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 티미딘 및 하이포잔틴 중 하나 이상을 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제25항에 있어서, 아데노신, 구아노신, 사이티딘, 우리딘, 티미딘 및 하이포잔틴을 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 2가 양이온의 하나 이상의 염을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제27항에 있어서, 상기 2가 양이온은 마그네슘, 칼슘, 또는 둘 다인, 세포 배양 배지.
- 제28항에 있어서, Ca2+ 및 Mg2+를 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제15항에 있어서, 상기 배지는 화학적으로 규정된 배지이고, HEPES 완충제; 아미노산의 혼합물; 선택적으로 뉴클레오사이드의 혼합물; 하나 이상의 지방산 및 토코페롤; 2가 양이온의 하나 이상의 염; 및 하나 이상의 비타민을 포함하는, 세포 배양 배지.
- 제30항에 있어서, 인슐린을 더 포함하는, 세포 배양 배지.
- 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 규정된 세포 배양 배지를 선택하는 방법으로서,
(a) 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계;
(b) HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 분석하여 규정된 세포 배양 배지에 존재하는 분자량이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계;
(c) HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지가 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에서 사용하기 위해 HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지를 선택하는 단계
를 포함하되,
총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 HEPES 완충제를 포함하는 규정된 세포 배양 배지의 사용은, 비-HEPES 관련 불순물 감소 배지에서의 세포 배양 성능과 비교하여, 세포 배양 성능을 개선시키는, 방법. - 제32항에 있어서, 개선된 세포 배양 성능은 개선된 세포 배양 역가 및/또는 세포 성장을 포함하는, 방법.
- 세포 배양 성능을 개선시키기 위해 세포 배양에서 사용하기 위한 HEPES 완충제를 선택하는 방법으로서,
(a) 4-하이드록시에틸 피페라진 에탄설폰산(HEPES) 완충제를 제공하는 단계;
(b) HEPES 완충제를 분석하여 HEPES 완충제에 존재하는 분자량이 267.07인 HEPES 관련 불순물의 양 및 분자량이 221.06인 HEPES 관련 불순물의 양을 결정하는 단계;
(c) HEPES 완충제가 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 것으로 결정되는 경우 세포 배양에서 사용하기 위해 HEPES 완충제를 선택하는 단계
를 포함하되,
상기 세포 배양과 관련하여 사용되는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 HEPES 완충제의 사용은, 더 많은 양의 상기 불순물을 갖는 HEPES 완충제의 존재 하의 세포 배양 성능과 비교하여, 세포 배양 성능을 개선시키는, 방법. - 제34항에 있어서, 개선된 세포 배양 성능은 개선된 세포 배양 역가 및/또는 세포 성장을 포함하는, 방법.
- 세포 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물.
- 제36항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 세포 배양물.
- 제37항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제36항에 있어서, 상기 세포는 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 발현할 수 있는, 세포 배양물.
- 제39항에 있어서, 상기 세포는 두필루맙을 발현할 수 있는, 세포 배양물.
- 제8항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 10%만큼 증가되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 15%만큼 증가되는, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 25%만큼 증가되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포의 배가율보다 적어도 5% 더 큰, 방법.
- 제44항에 있어서, 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포의 배가율보다 적어도 10% 더 큰, 방법.
- 제44항에 있어서, 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포의 배가율보다 적어도 15% 더 큰, 방법.
- 제44항에 있어서, 불순물이 감소된 배지에서 생존 세포의 배가율은 비-불순물 감소 배지에서 배양된 세포의 배가율보다 적어도 25% 더 큰, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 세포 배양 배지는 비닐설폰산, HEPES+[O]-[H2], 아세트아미도메탄-설폰산, HEPES+[O], 2,2-다이하이드록시에탄-설폰산, HEPES-[C2H6]+[O] [SO3 포함] 종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는, 세포 배양 배지.
- (i) 재조합 단백질을 발현할 수 있는 적어도 하나의 재조합 진핵 세포 및 (ii) 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물로서, 상기 세포 배양물은,
(a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 상기 규정된 세포 배양 배지는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는, 상기 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계;
(b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
(d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생산되는, 세포 배양물. - 제49항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제50항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제51항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포인, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 상기 관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 상기 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서의 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 재조합 진핵 세포의 상기 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 높은, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가되는, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체인, 세포 배양물.
- 제49항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함하는, 세포 배양물.
- 제58항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 항체, 항체 단편, 및 ScFv-Fc 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제59항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체, 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제59항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 세포 배양물.
- 제61항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 두필루맙인, 세포 배양물.
- (i) 상기 재조합 단백질을 발현할 수 있는 적어도 하나의 재조합 진핵 세포 및 (ii) 세포 배양 배지를 포함하는 세포 배양물에서 생산되는 재조합 단백질로서, 상기 재조합 단백질은,
(a) 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지를 제공하는 단계로서, 상기 규정된 세포 배양 배지는 총 HEPES의 몰당 분자량이 267.07인 약 4000 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물, 및 총 HEPES의 몰당 분자량이 221.06인 약 400 μmol 미만의 HEPES 관련 불순물을 갖는 단계;
(b) 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 상기 재조합 진핵 세포를 배양하는 단계;
(c) 상기 재조합 진핵 세포로부터 관심 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
(d) 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포에 비해 불순물이 감소된 규정된 세포 배양 배지에서 더 높은 역가의 재조합 단백질을 생산하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생산되는, 재조합 단백질. - 제63항에 있어서, 상기 진핵 세포는 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포 및 효모 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 단백질.
- 제64항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO, COS, 망막 세포, Vero, CV1, 신장, HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림ㅍ구, A431, CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포, 및 상기 언급한 세포로부터 유래된 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 단백질.
- 제65항에 있어서, 상기 진핵 세포는 CHO 세포인, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 상기 관심 재조합 단백질의 발현은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 상기 불순물이 감소된 상기 규정된 세포 배양 배지에서 재조합 진핵 세포의 배양은 생산 단계, 성장 단계, 또는 둘 다 동안 일어나는, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 재조합 진핵 세포의 상기 배양 동안 세포 성장은 비-불순물이 감소된 배지에서의 유사하거나 동일한 재조합 진핵 세포의 세포 성장보다 더 높은, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 상기 재조합 단백질의 더 높은 역가는, 불순물이 감소되지 않은 배지에서 배양된 유사하거나 동일한 세포의 역가와 비교하여, 적어도 약 5%만큼 증가되는, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 다이아바디, 트라이아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체 또는 IgG4 항체인, 재조합 단백질.
- 제63항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc 도메인을 포함하는, 재조합 단백질.
- 제72항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 Fc-융합 단백질, 수용체-Fc-융합 단백질(TRAP), 항체, 항체 단편, 및 ScFv-Fc 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 단백질.
- 제73항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항-PD1 항체, 항-PDL-1 항체, 항-Dll4 항체, 항-ANG2 항체, 항-AngPtl3 항체, 항-PDGFR 항체, 항-Erb3 항체, 항-PRLR 항체, 항-TNF 항체, 항-EGFR 항체, 항-PCSK9 항체, 항-GDF8 항체, 항-GCGR 항체, 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 항-IL4R 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-RSV 항체, 항-NGF 항체, 항-CD3 항체, 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-CD48 항체, 항-CD3/항-CD20 이중특이적 항체, 항-CD3/항-MUC16 이중특이적 항체, 및 항-CD3/항-PSMA 이중특이적 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 단백질.
- 제73항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시빕맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙, 셈플리맙-rwlc, 두필루맙, 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시무맙, 네스바쿠맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙 및 사릴루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 단백질.
- 제75항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 두필루맙인, 재조합 단백질.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 따른 세포.
- 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양물.
- 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 따른 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질.
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