JP7198868B2 - タウリン補足細胞培養培地およびその使用 - Google Patents
タウリン補足細胞培養培地およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7198868B2 JP7198868B2 JP2021080955A JP2021080955A JP7198868B2 JP 7198868 B2 JP7198868 B2 JP 7198868B2 JP 2021080955 A JP2021080955 A JP 2021080955A JP 2021080955 A JP2021080955 A JP 2021080955A JP 7198868 B2 JP7198868 B2 JP 7198868B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- taurine
- cell culture
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
- C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/74—Undefined extracts from fungi, e.g. yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Description
本発明は、細胞培養のためおよび組換えタンパク質産生のための培地および方法に関す
る。本発明は、具体的には、タンパク質生物治療薬を産生するための組換え真核細胞の培
養のためのタウリン補足培地およびその培養方法に関する。
しばしばβ-アミノ酸と呼ばれる有機酸タウリンは、ほとんどの組織内に高濃度で見出
され、アミノ酸システインの誘導体である(Huxtable,RJ.,1992,Ph
ysiol Rev,72:101-163)。
筋および平滑筋、血小板、および好中球)中に存在する。タウリンは、浸透圧調節、膜安
定化、および抗炎症を補助することが認められており、また、電子輸送鎖活性の増強によ
ってミトコンドリアタンパク質合成を制御してスーパーオキシド生成に対して保護する(
Jongら,2010,Journal of Biomedical Science
17(Suppl 1):S25;Jongら,2012,Amino Acids
42:2223-2232sw)。初代神経細胞培養では、タウリンは、そのグルタミン
酸塩誘導性毒性の抑制効果に起因して、細胞保護剤として特徴付けられている。胚培養用
の種々のタウリン含有培地が開発されている。
て長く利用されている。アミノ酸は、生合成前駆体、エネルギー源、およびオスモライト
などであり、産生培養においてアミノ酸を使用することは継続的な細胞成長および生産性
と強く相関する。
代謝活動および輸送機構が競合するので供給ストラテジーのデザインが困難である。アミ
ノ酸補足のタイプおよび添加のタイミングも培養によって産生されるタンパク質の品質に
影響を及ぼし得る(Altamirano,ら,2006,Electron.J.Bi
otechnol.9:61-67)。副生成物の蓄積は、しばしば、産生細胞培養にお
いて問題となり、この蓄積は細胞培養において栄養素が不均衡になることの結果と考えら
れ、最終的には細胞成長を阻害する(Fan,Y.ら、Biotechnol Bioe
ng.2015 Mar;112(3):521-35)。ヒポタウリンまたはそのアナ
ログもしくは前駆体は、細胞培養において組換え産生されたポリペプチドを含む組成物の
色の強さを低下させるという望ましい結果を達成することが示唆されている(WO201
4145098A1号、2014年9月18日公開)。未成熟網膜色素上皮細胞の成熟網
膜色素上皮細胞への成熟を促進するタウリンを含む細胞培養培地も記載されている(WO
2013184809A1号、2013年12月12日公開)。しかし、タウリン補足培
地において組換えタンパク質の生産性が至適化されることは当該分野で認識されていない
。アンモニアなどの潜在的に有毒な細胞代謝副生成物の産生を最小にしながら組換え産生
タンパク質の生産性を増大させる細胞培養プロセスが非常に望ましい。生産性が一貫して
増大すると、商業規模で生物治療製剤を有意により多く供給することができる。
したがって、哺乳動物細胞を培養するための培地および培養方法が当該分野で必要であ
り、ここで、培地は、健康且つ頑強な細胞の成長および維持、ならびに高力価の生物医薬
品薬物物質の生産が可能である。
本発明者らは、細胞培養培地中にタウリンを含めると細胞特異的生産性が増大し、且つ
それらの細胞によるアンモニア副生成物の産生が低下するという驚くべき発見をした。タ
ウリンを含む種々の供給ストラテジーにより、産生されるタンパク質の力価が増大する。
さらに、タウリンを添加しても培養成績や得られる抗体の品質に悪影響を及ぼさない。
本発明は、高収量で治療タンパク質を産生する方法であって、タウリンを含む培地中で
組換え細胞株を培養する工程を含み、前述の細胞株が治療タンパク質をコードする安定に
組み込まれた核酸を含む、方法を提供する。
関する。本発明は、無血清であり、約0.1mM~約1mMのタウリン、約0.2~約1
mMのタウリン、約0.3~約1mMのタウリン、約0.4~約1mMタウリン、または
約0.5~約1mMのタウリンを含む細胞培養培地に関する。本発明は、無血清であり、
約1mM~約10mMのタウリンを含む細胞培養培地に関する。本発明は、無血清であり
、約1mM~約5mMのタウリン、約1mM~約6mMのタウリン、約1mM~約7mM
のタウリン、約1mM~約8mMのタウリン、または約1mM~約9mMのタウリンを含
む細胞培養培地に関する。
ルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、
プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン
、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される追加のアミノ酸をさらに含
む。
形態では、培地はいかなる加水分解物も含まない。
は市販の基本培地など)を含む。1つの実施形態では、完全培地は、化学的に規定され、
血清や加水分解物を含まない。
なくとも115mMのアミノ酸またはアミノ酸塩の混合物を含む。一実施形態では、アミ
ノ酸の混合物は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セ
リン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラ
ニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、お
よびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸を表1から選択される量で含む。
形態では、培地は、脂肪酸(または脂肪酸誘導体)とαトコフェロールとの混合物を含む
。脂肪酸または脂肪酸誘導体は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パ
ルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカ
ン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸から
なる群から選択される。
、培地は、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサン
チンを含む。
シウムおよびマグネシウムなど)が含まれる。1つの実施形態では、培地は、塩化カルシ
ウムおよび硫酸マグネシウムを含む。他の塩には、リン酸塩が含まれ得る。
3±0.05mM、5±0.10mM、7±0.15mM、または10±0.2mMのタ
ウリンを含み、(2)16g/L以下の加水分解物を含み、(3)無血清であり、(4)
任意選択的にアミノ酸の混合物をさらに含み、(5)脂肪酸の混合物を含み、(6)ヌク
レオシド(アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサン
チンが含まれる)の混合物を含み、(7)カルシウム塩、マグネシウム塩、およびリン酸
塩を含む。
M~約10mMのタウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、
細胞株がタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法を提供する。他の
実施形態では、培地は、前述の本発明の態様のいずれかを具体化している。
養する方法であって、(a)細胞を増殖期の間に特定細胞培養培地中で増殖または維持す
る工程、(b)基本細胞培養培地に約0.1mM~約10mMのL-タウリンを補足する
工程であって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および(c)タ
ウリンの添加によって目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法を提供する
。いくつかの実施形態では、タウリンの補足を、産生期の間に少なくとも1回、産生期の
間に2回、3回、4回、もしくは5回、または産生期の持続時間に毎日行う。他の実施形
態では、本方法は、増殖期の間に、培養培地に約0.1mM~約10mMのL-タウリン
を補足する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法により、タウリン補足を
欠くか、0.1mM未満のタウリンを補足し、そうでなければ同一の条件下の真核細胞と
比較して、組換えタンパク質産生が改善される。
ど)中での細胞の培養方法を提供する。1つの実施形態では、本方法は、(1)少なくと
も0.1mM±0.015mMの濃度のタウリンを含み、(2)16g/L以下の加水分
解物を含むか、加水分解物を含まず、(3)無血清であり、(4)任意選択的に、表1か
ら選択されるアミノ酸の混合物からなる群から選択されるアミノ酸を含む培地中で細胞を
増殖または維持する工程を使用する。
たは細菌細胞である。1つの実施形態では、細胞は、組換えタンパク質産生で有用な哺乳
動物細胞(CHO細胞または誘導CHO-K1など)である。いくつかの実施形態では、
細胞は、目的のタンパク質(生物治療タンパク質など)を発現する。生物治療タンパク質
は、抗原結合タンパク質であってよく、この抗原結合タンパク質はFcドメインを含み得
る。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、Fc-融合タンパク質(ScFv分
子など)またはtrap分子である。trap分子には、VEGFtrapおよびIL-
1Trapタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、
目的のタンパク質は、抗体(ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、二重
特異性抗体、または抗体フラグメントなど)である。
及ぼされることを考慮すると、本方法に従って培養した細胞は、平均タンパク質力価が増
大する。1つの実施形態では、タウリンを補足しなかった培地のタンパク質力価と比較し
た場合、本方法のタウリン補足培地で成長させた細胞は、比較対照培養(すなわち、タウ
リンを補足していない培養)のタンパク質力価より少なくとも8%高いタンパク質力価を
有するタンパク質を産生する。一実施形態では、タウリン補足培養で成長させた細胞は、
タウリンを補足しなかった培地のタンパク質力価と比較した場合、比較対照培養の力価よ
り、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なく
とも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17
%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少な
くとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも2
6%、少なくとも27%、少なくとも28%、または少なくとも29%高いタンパク質力
価をもたらす。
含めない培養細胞よりもアンモニア副生成物を減少させることが可能である。1つのタウ
リン補足培地の無血清且つ加水分解物のない実施形態では、細胞培養により、補足をしな
い(すなわち、0.1mM未満のタウリン補足またはタウリン補足なし)類似の細胞培養
培地における類似の細胞培養よりも少なくとも4%低く、32%まで低くアンモニア副生
成物レベル(mM NH3)を低下させることが可能である。
use)添加物を細胞培養培地に添加する工程を含む。いくつかの実施形態では、ユース
ポイント添加物は、NaHCO3、グルタミン、インスリン、グルコース、CuSO4、
ZnSO4、FeCl3、NiSO4、Na4EDTA、およびクエン酸ナトリウムのう
ちの任意の1つまたは複数である。1つの実施形態では、本方法は、以下の各ユースポイ
ント化学物質を細胞培養培地に添加する工程を使用する:NaHCO3、グルタミン、イ
ンスリン、グルコース、CuSO4、ZnSO4、FeCl3、NiSO4、Na4ED
TA、およびクエン酸ナトリウム。いくつかの実施形態では、ユースポイント添加物を、
培養開始時に培地に含めることができる。
ら本質的になり;(2)16g/L以下の加水分解物を含み、(3)無血清であり、(4
)任意選択的に、総量が少なくとも約20mM、または少なくとも約25mM、または少
なくとも約30mM、または少なくとも約40mM、または少なくとも約50mM、また
は少なくとも約60mM、または少なくとも約70mMのアラニン、アルギニン、アスパ
ラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジ
ン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリ
ン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるア
ミノ酸の混合物をさらに含む、無血清培地中で細胞を培養する方法を提供する。
する工程;(2)目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程;(3)任意の前述の
態様に記載の無血清細胞培養培地の1つの実施形態において、または本明細書中に記載の
方法の任意の実施形態に従って、選択された細胞を培養する工程;および(4)細胞中で
目的のタンパク質を発現させる工程であって、目的のタンパク質が培地中に分泌される工
程を使用することによって目的のタンパク質を産生する方法を提供する。いくつかの実施
形態では、タンパク質の産生で使用される細胞は、生物治療薬を産生することが可能な哺
乳動物細胞(CHO細胞、293細胞、およびBHK細胞など)またはその任意の誘導体
である。1つの実施形態では、細胞は、CHO細胞(CHO-K1細胞など)である。
実施形態では、目的のタンパク質は、Fcドメインを有するタンパク質である。いくつか
の場合、2種の目的のタンパク質が重複していてもよい(例えば、受容体-Fc-融合タ
ンパク質、抗体、およびScFvタンパク質の場合など)。したがって、いくつかの実施
形態では、目的のタンパク質は、抗体(ヒト抗体またはヒト化抗体、抗体フラグメント(
FabまたはF(ab’)2など)、二重特異性抗体、trap分子(VEGF-Tra
pまたはIL-1-Trapなど)、ScFv分子、または可溶性TCR-Fc融合タン
パク質など)である。
リンを補足していない無血清細胞培養培地中で類似する細胞によって産生される平均14
、15、16、または17日目の力価より少なくとも8%高い平均14、15、16、ま
たは17日目の力価で産生することが可能である。1つの実施形態では、目的のタンパク
質を、0.1mM未満のタウリンを含むか、タウリンを補足していない無血清細胞培養培
地中で類似する細胞によって産生される平均6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、または17日目の力価より少なくとも9%、少なくとも10%、少な
くとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも1
5%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少
なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも
24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、
または少なくとも29%高い平均6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、または17日目の力価で産生することが可能である。
原結合タンパク質など)をコードする核酸配列をCHO細胞に導入すること;(2)目的
のタンパク質を安定に発現する細胞を選択すること;(3)約0.1mM~約10mMの
タウリンを含む無血清細胞培養培地中で選択した細胞を培養することによって産生する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
改良された組換えタンパク質を産生するための組換え真核細胞を培養する方法であって
、(a)細胞を増殖期の間に規定された細胞培養培地中で増殖または維持する工程、(b
)前記基本の細胞培養培地に約0.1mM~約10mMのL-タウリンを補足する工程で
あって、産生期の間に目的の組換えタンパク質を発現させる工程、および(c)タウリン
の添加によって前記目的のタンパク質の力価を増加させる工程を含む、方法。
(項目2)
前記(b)のタウリン補足を産生期の間に少なくとも1回行う、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記(b)のタウリン補足を産生期の間に少なくとも2回行う、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記(b)のタウリン補足を産生期の間に少なくとも3回行う、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記(b)のタウリン補足を産生期の間に少なくとも4回行う、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記(b)のタウリン補足を産生期の間に少なくとも5回行う、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記(b)のタウリン補足を産生期の持続時間の間に毎日行う、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記規定された細胞培養培地中の培養物に、増殖期の間に約0.1mM~約10mMの
L-タウリンを補足する工程をさらに含む、項目1~7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から
選択される、項目1~8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記細胞が、CHO(例えば、CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-C
HO)、COS(例えば、COS-7)、網膜細胞、Vero、CV1、腎臓(例えば、
HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK21)、He
La、HepG2、WI38、MRC5、Colo25、HB8065、HL-60、リ
ンパ球(例えば、Jurkat、Daudi)、A431(表皮性)、CV-1、U93
7、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、PER.C6
(登録商標)細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群から
選択される、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記細胞がCHO細胞である、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目1~11のいずれか1項に記
載の方法。
(項目13)
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、項目1~12のいずれか1項に記載の方
法。
(項目14)
前記目的のタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(T
RAP)、抗体、抗体フラグメント、およびScFv-Fc融合タンパク質からなる群か
ら選択される、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
前記目的のタンパク質が、抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗AN
G2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体
、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体
、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、
抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗
体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗
CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20二重特異性抗体、抗CD3/抗M
UC16二重特異性抗体、および抗CD3/抗PSMA二重特異性抗体からなる群から選
択される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、
デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択さ
れる、項目14に記載の方法。
(項目17)
目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
(a)目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程
;(b)前記目的のタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程;(c)約0.1mM
~約10mMのL-タウリンを含む細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程;
および(d)前記細胞中で前記目的のタンパク質を産生させる工程であって、前記目的の
タンパク質が前記培地中に分泌される工程を含む、方法。
(項目18)
前記目的のタンパク質の力価が、前記培地へのタウリンの添加によって増大した、項目
17に記載の方法。
(項目19)
前記工程(c)の細胞が、前記目的のタンパク質を高収量で産生することが可能である
、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
前記細胞が、0.1mM未満のL-タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパ
ク質を発現する細胞と比較して少なくとも3%より高いタンパク質収量が可能である、項
目17~19のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前記細胞が、0.1mM未満のL-タウリンを含む細胞培養培地中で前記目的のタンパ
ク質を発現する細胞と比較して少なくとも8%より高いタンパク質収量が可能である、項
目17~20のいずれか1項に記載の方法。
(項目22)
前記細胞が、CHO細胞、HEK293細胞、またはBHK細胞である、項目17~2
1のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目17~22のいずれか1項に
記載の方法。
(項目24)
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、項目17~22のいずれか1項に記載の
方法。
(項目25)
前記目的のタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(T
RAP)、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目17~24の
いずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記目的のタンパク質が、抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗AN
G2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体
、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体
、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、
抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗
体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗
CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20二重特異性抗体、抗CD3/抗M
UC16二重特異性抗体、および抗CD3/抗PSMA二重特異性抗体からなる群から選
択される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、
デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択さ
れる、項目25に記載の方法。
(項目28)
タウリン補足培養培地中で目的のタンパク質を産生する方法であって、
(a)目的のタンパク質をコードする配列を含む核酸を細胞に導入する工程;
(b)前記目的のタンパク質を発現する細胞を選択する工程;
(c)細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程;
(d)前記細胞培養培地に約0.1mM~約10mMの量でタウリンを補足する工程;
(e)前記細胞培養物を工程(d)のタウリン補足条件下で少なくとも6日間維持する工
程であって、非タウリン補足培養で培養した細胞と比較して前記細胞中で目的のタンパク
質をより高い力価で発現させ、前記目的のタンパク質が前記培地中に分泌される工程;お
よび
(f)前記目的のタンパク質を回収する工程
を含む、方法。
(項目29)
前記目的のタンパク質の力価が、タウリン補足によって増大した、項目28に記載の方
法。
(項目30)
前記回収したタンパク質のタンパク質力価が、比較対照培養の前記力価より少なくとも
8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、または少なくとも20
%より高く、前記比較対照培養培地が、工程(d)のタウリン補足条件に供されなかった
、項目29に記載の方法。
(項目31)
目的の組換えタンパク質を高収量で産生する方法であって、少なくとも約0.1mMの
L-タウリンを含む細胞培養培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み、前記細胞株が
、組換えタンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法。
(項目32)
前記目的の組換えタンパク質の収量が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で培養
した細胞株と比較して、前記細胞培養培地中にタウリンを含めることによって増大した、
項目31に記載の方法。
(項目33)
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目31または32に記載の方法
。
(項目34)
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、項目31~33のいずれかに記載の方法
。
(項目35)
前記目的のタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(T
RAP)、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目31~34の
いずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記目的のタンパク質が、抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗AN
G2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体
、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体
、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、
抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗
体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗
CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20二重特異性抗体、抗CD3/抗M
UC16二重特異性抗体、および抗CD3/抗PSMA二重特異性抗体からなる群から選
択される、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、
デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択さ
れる、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記産生方法により、0.1mM未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産
生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも0.1g/L、少なくとも0.5g/L
、少なくとも1g/L、少なくとも1.2g/L、少なくとも1.4g/L、少なくとも
1.6g/L、少なくとも1.8g/L、少なくとも2g/L、少なくとも2.2g/L
、少なくとも2.4g/L、または少なくとも2.5g/L増加させることができる、項
目31~37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記産生方法により、0.1mM未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産
生方法と比較して、タンパク質収量を少なくとも3%増加させることができる、項目31
~38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記産生方法により、0.1mM未満のタウリンを含む細胞培養培地における類似の産
生方法と比較して、アンモニア蓄積を少なくとも8%減少させることができる、項目31
~39のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
1つまたは複数のユースポイント添加物を前記細胞培養培地に添加する工程をさらに含
む、項目31~40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
約0.1mM~約10mMのL-タウリンを含む抗体の高収量組換え産生のためのCH
O細胞培養培地。
(項目43)
オルニチンをさらに含む、項目42に記載のCHO細胞培養培地。
(項目44)
プトレシンをさらに含む、項目43に記載のCHO細胞培養培地。
(項目45)
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、
イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトフ
ァンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、項目42~44のいずれ
か1項に記載のCHO細胞培養培地。
(項目46)
前記培地が無血清である、項目42~45のいずれか1項に記載のCHO細胞培養培地
。
(項目47)
前記培地が加水分解物を含まない、項目42~46のいずれか1項に記載のCHO細胞
培養培地。
(項目48)
前記培地が化学的に規定されている、項目42~47のいずれか1項に記載のCHO細
胞培養培地。
(項目49)
前記培地を0日目の産生バッチ培養物に提供する、項目42~48のいずれか1項に記
載のCHO細胞培養培地。
(項目50)
フィードを、0日目、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日目、8
日目、9日目、および/または10日目の産生バッチ培養物に提供する、項目42~49
のいずれか1項に記載のCHO細胞培養培地。
(項目51)
前記産生バッチ培養物に提供した培地およびフィードが、産生期の間に約5mM~約1
0mMの総L-タウリンを含む、項目50に記載のCHO細胞培養フィード。
(項目52)
1つまたは複数の脂肪酸をさらに含む、項目42~51のいずれか1項に記載のCHO
細胞培養培地。
(項目53)
前記1つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、
パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デ
カン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸か
らなる群から選択される、項目52に記載のCHO細胞培養培地。
(項目54)
ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、I-イノシトール、ニコ
チンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンB12か
らなる群から選択されるビタミンおよび補因子をさらに含む、項目42~53のいずれか
1項に記載のCHO細胞培養培地。
(項目55)
ヌクレオシドの混合物をさらに含む、項目42~54のいずれか1項に記載のCHO細
胞培養培地。
(項目56)
前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジ
ン、およびヒポキサンチンの1つまたは複数を含む、項目55に記載のCHO細胞培養培
地。
(項目57)
アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンをさ
らに含む、項目42~56のいずれか1項に記載のCHO細胞培養培地。
(項目58)
1つまたは複数の二価カチオンをさらに含む、項目42~57のいずれか1項に記載の
CHO細胞培養培地。
(項目59)
前記二価カチオンが、マグネシウム、カルシウム、またはその両方である、項目58に
記載のCHO細胞培養培地。
(項目60)
Ca2+およびMg2+を含む、項目59に記載のCHO細胞培養培地。
(項目61)
約0.1mM~約10mMの量でタウリンを含む、CHO細胞培養におけるタンパク質
産生のための流加培養培地および/またはフィード。
(項目62)
オルニチンをさらに含む、項目61に記載の流加培養培地および/またはフィード。
(項目63)
プトレシンを含む、項目62に記載の流加培養培地および/またはフィード。
(項目64)
アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニ
ン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、
イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトフ
ァンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物をさらに含む、項目61~63のいずれ
か1項に記載の流加培養培地および/またはフィード。
(項目65)
目的の組換えタンパク質の産生のために真核細胞を培養する方法であって、(a)項目
42~64のいずれか1項に記載の細胞培養培地を提供する工程、および(b)前記細胞
培養培地中で細胞を増殖または維持する工程であって、細胞培養物を形成し、、前記細胞
が目的のタンパク質を発現する工程を含む、方法。
(項目66)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から
選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記細胞がCHO細胞である、項目65または66に記載の方法。
(項目68)
前記目的のタンパク質が、前記細胞によって前記培地に分泌される、項目65~67の
いずれか1項に記載の方法。
(項目69)
前記目的のタンパク質が抗原結合タンパク質である、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記目的のタンパク質がFcドメインを含む、項目68または69に記載の方法。
(項目71)
前記目的のタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(T
RAP)、抗体、および抗体フラグメントからなる群から選択される、項目68~70の
いずれか1項に記載の方法。
(項目72)
前記目的のタンパク質が、抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗AN
G2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体
、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体
、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、
抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗
体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗
CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20二重特異性抗体、抗CD3/抗M
UC16二重特異性抗体、および抗CD3/抗PSMA二重特異性抗体からなる群から選
択される、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記目的のタンパク質が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、
デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群から選択さ
れる、項目71に記載の方法。
(項目74)
前記細胞培養が、0.1mM未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較
して少なくとも3%アンモニア蓄積を減少させることが可能である、項目65~73のい
ずれか1項に記載の方法。
(項目75)
前記細胞培養が、0.1mM未満のタウリンを含む培地における類似の細胞培養と比較
して少なくとも8%アンモニア蓄積を減少させることが可能である、項目65~74のい
ずれか1項に記載の方法。
本発明が記載される特定の方法および実験条件に限定されないことは理解されるべきで
ある。なぜならこのような方法および条件は変動し得るからである。同様に、本明細書で
使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定することを意図して
いないこともまた理解されるべきである。なぜなら本発明の範囲は、特許請求の範囲によ
って定義されるからである。
」、「an(1つの、ある)」および「the(上記、この、その)」は、文脈が格別そ
うでないことを規定しなければ、複数形への言及を含む。従って、例えば、「方法(a
method)」への言及は、本明細書で記載される、および/もしくは本開示を読んで当業者
に明らかになるタイプの、1またはそれより多くの方法および/または工程を含む。
明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で
記載されるものに類似もしくは均等な任意の方法および材料が本発明の実施において使用
され得るものの、特定の方法および材料がここでは記載される。本明細書で言及される全
ての刊行物は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
かタウリンを含まない細胞培養培地と比較して細胞培養における組換え細胞によるタンパ
ク質産生が改善されるという驚くべき発見をした。
制限されず、したがって、方法および条件は変動し得ると理解すべきである。本明細書中
で使用した用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を制限すること
を意図しないことも理解すべきである。
すると解釈すべきではない。別段の指示がない限り、本明細書中に記載の方法および技術
を、一般に、当該分野で公知の従来の方法に従い、且つ種々の一般的な文献および本明細
書を通して引用および考察しているより具体的な文献に記載のように行う。例えば、Sa
mbrook et al.、Molecular Cloning:A Labora
tory Manual、3rd ed.、Cold Spring Harbor L
aboratory Press、Cold Spring Harbor、N. Y.
(2001)およびAusubel et al.、Current Protoco
ls in Molecular Biology、Greene Publishin
g Associates (1992)、Harlow and Lane Anti
bodies: A Laboratory Manual、Cold Spring
Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harb
or、N.Y. (1990)、およびJulio E. Celis、Cell B
iology: A Laboratory Handbook、2nd ed.、Ac
ademic Press、New York、N.Y. (1998)、and Di
effenbach and Dveksler、PCR Primer:A Labo
ratory Manual、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1995)を
参照のこと。本開示を通して言及された全ての刊行物は、その全体が本明細書中で参考と
して組み込まれる。
「タウリン」は、2-アミノエタンスルホン酸(IUPAC命名法;CASレジストリ
番号107-35-7)としても公知である。「タウリン」および「L-タウリン」を、
同一の有機化合物を言及するために互換的に使用する。タウリンはアミノ基を含む有機酸
であるが、アミノ酸というのはアミノ基およびカルボキシル基の両方を含むので、当業者
に伝統的に公知なように、タウリンは「アミノ酸」と見なされない。システインの誘導体
であるヒポタウリンが酸化によってタウリンに変換されるときにタウリンが生合成される
。
ting)」、および「~を補足した」などは、細胞の成長および/または分化を維持お
よび/または促進するか、培養物または細胞の特質を総じて拡大または強化するか、欠損
を補うために細胞培養培地中で使用することができる成分、構成成分、分子などを添加す
ることをいう。この目的を達成するために、タウリン補足には、特定濃度のタウリン溶液
の培養培地への添加が含まれる。
換的に使用し、これらの用語は、ペプチド結合によって相互連結した2つまたはそれを超
えるアミノ酸残基を含む分子をいう。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質はまた
、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のγ-カルボキシル化、アルキル
化、ヒドロキシル化、およびADP-リボシル化などの修飾を含んでもよい。ペプチド、
ポリペプチド、およびタンパク質は、科学的または商業的に有益であり得る(タンパク質
系薬物が含まれる)。ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質には、特に、抗体およ
びキメラタンパク質もしくは融合タンパク質が含まれる。ペプチド、ポリペプチド、およ
びタンパク質は、細胞培養方法を使用して組換え動物細胞株によって産生される。
質として産生されるキメラタンパク質(trap分子など)、抗体、または抗体の一部(
例えば、VH、VL、CDR3)などの目的のタンパク質をコードする核酸ポリマーをい
う。異種ポリヌクレオチド配列を、遺伝子工学技術によって製造し(例えば、キメラタン
パク質をコードする配列、またはコドン最適化配列、無イントロン配列(intronl
ess sequence)など)、細胞に導入することができ、細胞内でこの配列はエ
ピソームとして存在することができるか、細胞ゲノムに組み込むことができる。異種ポリ
ヌクレオチド配列は、産生細胞ゲノム内の異所に導入される天然に存在する配列であり得
る。異種ポリペプチド配列は、別の生物由来の天然に存在する配列(ヒトオルソログをコ
ードする配列など)であり得る。
軽(L)鎖である4本のポリペプチド鎖からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、
重鎖可変領域(HCVRまたはVH)および重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、3
個のドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖
定常領域を有する。軽鎖定常領域は、1個のドメイン(CL)を有する。VHおよびVL
領域は、フレームワーク領域(FR)と命名されたより保存された領域が散在する、相補
性決定領域(CDR)と命名された超可変性の領域にさらに細分することができる。各V
HおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序:FR1、CDR1、F
R2、CDR2、FR3、CDR3、FR4に配置された、3個のCDRおよび4個のF
Rで構成されている。用語「抗体」は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシ
ル化免疫グロブリンおよび非グリコシル化免疫グロブリンの両方をいう。用語「抗体」に
は、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体分子(抗体を発現する
ようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離した抗体など)が含まれる。抗体という
用語には、二重特異性抗体も含まれ、二重特異性抗体には、1つを超える異なるエピトー
プに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンが含まれる。二重特異性抗体は、
一般に、米国特許出願公開第2010/0331527号(本出願に参考として組み込ま
れる)に記載されている。
に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数のフラグメントをいう。抗体の「抗原結
合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、(i)Fabフラグメント(
VL、VH、CL、およびCH1各ドメインからなる一価フラグメント);(ii)F(
ab’)2フラグメント(ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した2つのFab
フラグメントからなる二価フラグメント);(iii)VHドメインおよびCH1ドメイ
ンからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHド
メインからなるFvフラグメント、(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(W
ardら(1989)Nature 241:544-546)、(vi)単離CDR、
および(vii)Fvフラグメントの2つのドメイン(VLおよびVH)からなり、これ
らのフラグメントが合成リンカーによって連結されて単一のタンパク質鎖を形成し、この
単一のタンパク質鎖においてVL領域およびVH領域が対になって一価の分子を形成して
いるscFvが含まれる。単鎖抗体の他の形態(ダイアボディなど)も用語「抗体」に含
まれる(例えば、Holligerら(1993)PNAS USA 90:6444-
6448;Poljakら(1994)Structure 2:1121-1123を
参照のこと)。
他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性の会合によって形成さ
れたより大きな免疫接着分子の一部であり得る。かかる免疫接着分子の例には、四量体s
cFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov
ら(1995)Human antibodies and Hybridomas 6
:93-101)および二価のビオチン化scFv分子を作製するためのシステイン残基
、マーカーペプチド、およびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanovら
(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058)が含まれる。抗体の
一部(FabフラグメントおよびF(ab’)2フラグメントなど)を、従来技術(全抗
体のパパイン消化またはペプシン消化など)を使用して全抗体から調製することができる
。さらに、抗体、抗体の一部、および免疫接着分子を、当該分野で一般的に知られている
標準的な組換えDNA技術を使用して得ることができる(Sambrookら,1989
を参照のこと)。
を有する抗体を含むように企図されている。本発明のヒト抗体は、例えば、CDR、特に
CDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含
むことができる(例えば、in vitroにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘
発またはin vivoにおける体細胞変異によって導入された変異)。しかし、用語「
ヒト抗体」は、本明細書において、マウス等、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCD
R配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むようには企図されていない。
換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラ
リーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物(
例えば、マウス)から単離された抗体(例えば、Taylorら(1992年)Nucl
. Acids Res.20巻:6287~6295頁を参照)、または他のDNA配
列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段に
よって調製、発現、作出もしくは単離された抗体等、組換え手段によって調製、発現、作
出または単離されたあらゆるヒト抗体を含むよう企図されている。係る組換えヒト抗体は
、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、あ
る特定の実施形態では、係る組換えヒト抗体は、in vitro変異誘発(または、ヒ
トIg配列のトランスジェニックである動物が使用される場合は、in vivo体細胞
変異誘発)に付され、これにより、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、
ヒト生殖系列VHおよびVL配列に由来し、これに関係するが、in vivoにおける
ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しなくてよい配列となる。
み、これらのタンパク質のうちの1つが免疫グロブリン分子のFc部分であり、これらの
タンパク質は自然界では一緒には見出されない。抗体誘導ポリペプチドの種々の部分(F
cドメインを含む)に融合した一定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、
例えば、Ashkenaziら,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88
:10535,1991;Byrnら,Nature 344:677,1990;およ
びHollenbaughら,”Construction of Immunoglo
bulin Fusion Proteins”,in Current Protoc
ols in Immunology,Suppl.4,pages 10.19.1
- 10.19.11,1992に記載されている。「受容体Fc融合タンパク質」は、
いくつかの実施形態において免疫グロブリンのヒンジ領域ならびにその後に続くCH2ド
メインおよびCH3ドメインを含むFc部分にカップリングした1つまたは複数の受容体
の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Fc-融合タンパク質は、1つまた
は複数のリガンドに結合する2つまたはそれを超える個別の受容体鎖を含む。例えば、F
c-融合タンパク質は、例えば、IL-1 trap(例えば、hIgG1のFcに融合
したIL-1R1細胞外領域に融合したIL-1RAcPリガンド結合領域を含むリロナ
セプト;米国特許第6,927,004を参照のこと)またはVEGF trap(例え
ば、hIgG1のFcに融合したVEGF受容体Flk1のIgドメイン3に融合したV
EGF受容体Flt1のIgドメイン2を含むアフリベルセプト;米国特許第7,087
,411号および同第7,279,159号を参照のこと)などのtrapである。
用語「細胞培養培地」および「培養培地」は、典型的には、細胞の成長を増強するため
に必要な栄養素(炭水化物エネルギー源、必須アミノ酸(例えば、フェニルアラニン、バ
リン、トレオニン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、リジン、お
よびヒスチジン)、および非必須アミノ酸(例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、および
チロシン)、微量元素、エネルギー源、脂質、ビタミンなど)を提供する哺乳動物細胞の
成長のために使用される栄養液をいう。細胞培養培地は、抽出物(例えば、血清もしくは
ペプトン(水解物))を含み得、これらは、細胞増殖を支える原材料を供給する。培地は
、動物由来抽出物の代わりに、酵母由来抽出物もしくはダイズ抽出物を含み得る。化学的
に規定される培地とは、化学成分の全てが既知である(すなわち、既知の化学構造を有す
る)細胞培養培地をいう。化学的に規定される培地は、動物由来成分(例えば、血清由来
もしくは動物由来のペプトン)を完全に含まない。一実施形態では、培地は、化学的に規
定される培地である。
モンおよび成長因子が含まれる)を含み得る。本溶液を、好ましくは、pHおよび塩濃度
が細胞の生存および増殖に最適になるように調合する。
をいう。用語「細胞」を、「細胞集団」と互換的に使用する。
、真核生物の細胞(例えば、非ヒト動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、トリ細胞、昆虫
細胞、酵母細胞もしくは細胞融合物(例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマ))
を含む。ある種の実施形態において、上記細胞は、ヒト、サル(monkey)、類人猿
(ape)、ハムスター、ラットもしくはマウスの細胞である。他の実施形態において、
上記細胞は、以下の細胞から選択される:CHO細胞(例えば、CHO K1、DXB-
11 CHO、Veggie-CHO)、COS細胞(例えば、COS-7)、網膜細胞
、Vero細胞、CV1細胞、腎臓細胞(例えば、HEK293、293 EBNA、M
SR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa細胞、HepG2細胞、WI
38細胞、MRC 5細胞、Colo25細胞、HB 8065細胞、HL-60細胞、
リンパ球、例えば、Jurkat細胞(Tリンパ球)またはDaudi細胞(Bリンパ球
)、A431細胞(表皮)、CV-1細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C12
7細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前述の
細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態において、上記細胞は、1種またはそれより
多くのウイルス遺伝子を含む(例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞(例えば、P
ER.C6(登録商標)細胞))。いくつかの実施形態において、上記細胞は、CHO細
胞である。他の実施形態において、上記細胞は、CHO K1細胞である。
拡大させる種培養に関する。タウリンを、本明細書中に記載の発明に従って、種培養配合
物中の基本培地に添加することができる。
立って、典型的には増殖期(シードトレイン(seed train)または種培養とし
ても公知)が存在し、この増殖期に、細胞培養のための全ての構成成分を培養過程の開始
時に培養容器に供給し、次いで、細胞集団を生産規模になるまで拡大させる。従って、培
養容器に、開始させる細胞株に応じて初期細胞増殖期に適切な播種密度で細胞を接種する
。いくつかの態様では、その後の産生期における細胞の生産性をさらに改善または増強す
るために、本明細書中に記載の発明に従って、種培養配合物中の基礎培養培地にタウリン
を添加することができる。
ウリンを添加することによって、組換え真核細胞による1つまたは複数の目的の組換えタ
ンパク質の産生を改善し、かつ細胞生存を維持しながら組換え真核細胞の成長を増強する
ように細胞培養条件を改変する産生培養に関する。産生培養容器またはバイオリアクター
中で、基礎培養培地および細胞を、種培養または増殖期の後に培養容器に供給する。特定
の実施形態では、細胞上清または細胞ライセートを産生培養後に回収する。他の実施形態
では、目的のポリペプチドまたはタンパク質を、当該分で周知の技術を使用して培養培地
または細胞ライセート(いずれにせよ目的のタンパク質の位置に依存し得る)から回収す
る。
フラスコ、中空繊維、エアリフトバイオリアクターなどが挙げられるが、これらに限定さ
れない。適切な細胞培養容器は、バイオリアクターである。バイオリアクターとは、環境
条件を扱うもしくは制御するように製造もしくは操作される任意の培養容器をいう。この
ような培養容器は、当該分野で周知である。
して細胞増殖および生産性を持続させ、CO2を除去するために開発されてきた。ガス交
換の効率を維持することは、細胞培養およびタンパク質生産の成功裡のスケールアップを
確実にするために重要な基準である。適切なシステムは、当業者に周知である。
および培養培地が、その培養容器に最初に供給され、さらなる培養栄養素が、連続しても
しくは不連続増分で、培養の間に培養物にゆっくりと供給される(培養終了前に定期的な
細胞および/もしくは生成物採取があってもなくてもよい)バッチ培養をいう。流加培養
は、定期的に全培養物(これは、細胞および培地を含み得る)が取り出され、新鮮な培地
で置換される「半連続流加培養」を含む。流加培養は、細胞培養のための全成分(動物細
胞および全ての培養栄養素を含む)が、バッチ培養における培養プロセスの開始時に培養
容器に供給されることから、単純な「バッチ培養」とは区別される。流加培養は、上清が
上記プロセスの間に培養容器から取り出されない限りにおいて灌流培養とはさらに区別さ
れ得るのに対して、灌流培養において、上記細胞は、例えば、濾過によって培養物中に引
きとめられ、その培養培地は、連続してもしくは断続して導入され、培養容器から除去さ
れる。しかし、流加細胞培養の間に試験目的でサンプルが取り出されることが企図される
。上記流加プロセスは、最大作業体積および/もしくはタンパク質生産が達成されること
が決定されるまで継続する。
定の増殖期の中で増殖させるために使用される技術に関する。例えば、細胞の一定の供給
が必要とされるか、または特定の目的のポリペプチドもしくはタンパク質の生産が必要と
される場合、上記細胞培養は、特定の増殖期での維持を必要とし得る。従って、その条件
は、継続してモニターされなければならず、その特定の期に上記細胞を維持するためにそ
れに応じて調節されなければならない。
(培地)
本発明は、無血清で約0.1mM~10mMのタウリンを含む細胞培養培地を提供する。
「無血清」は、動物血清(ウシ胎児血清など)を含まない細胞培養培地に適用する。無血
清培地は、16g/L以下の加水分解物(ダイズ加水分解物など)を含み得る。本発明は
また、血清を含まないだけではなく加水分解物も含まない化学的に規定された培地を提供
する。「加水分解物を含まない」は、動物または植物のタンパク質加水分解物(例えば、
ペプトンおよびトリプトンなど)などの外因性のタンパク質加水分解物を含まない細胞培
養培地に適用する。「基本培地」は、(シードトレイン中および/または細胞培養物産生
の0日目に存在する)初期培地であり、細胞を増殖させ、必要な全ての栄養素(アミノ酸
の基本混合物が含まれる)を含む。基本培地用の種々のレシピ(すなわち、配合物)を、
商業的に利用可能なロットで製造または購入することができる。同様に、「基本フィード
培地」は、産生培養の間に一般的に消費され、且つ供給ストラテジー(いわゆる「流加」
培養用)で利用される補足栄養素の混合物を含む。多様な基本フィード培地が市販されて
いる。「フィード」には、プロトコール(ケモスタットなどの連続フィード培養系(C.
Altamiranoら,Biotechnol Prog.2001 Nov-Dec
;17(6):1032-41を参照のこと)が含まれる)または流加プロセス(Y.M
.Huangら,Biotechnol Prog.2010 Sep-Oct;26(
5):1400-10)などに従った計画的添加または一定間隔での培地への添加が含ま
れる。例えば、培養物に、1日1回、1日おきに1回、3日毎に1回供給することができ
るか、モニタリングしている特定の培地構成成分の濃度が所望の範囲から外れた場合に供
給することができる。
、加水分解物を減少させるか排除すると、不運なことに、細胞の成長、生存率、およびタ
ンパク質発現が減少する。したがって、化学的に規定された無血清且つ加水分解物がない
か、または加水分解物を含まない培地は、細胞成長およびタンパク質産生を改善するため
のさらなる成分が必要である。
地を含む。本明細書中に記載の発明に従って、タウリンを、種培養配合物中の基本培地に
添加することができる。さらに、タウリンを、産生培養配合物中の基本培地に添加し、次
いで、これに、培養されるべき細胞の要件または所望の細胞培養パラメータに応じて、ポ
リアミンなどのさらなる成分または増加した濃度のアミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモ
ン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、および微量元素などの構成成分を周期的に(い
わゆる「流加」培養など)供給してもしなくてもよい。
が枯渇し得るか(さらなるアミノ酸補足を行わない場合)、タウリン補足細胞培養培地は
、「非枯渇」であり得る(枯渇アミノ酸(下記)を補足する場合)。本発明者らは、産生
期にタウリンを補足した培養物によって前述の種々の培養条件下での組換えタンパク質産
生が改善されることを観察した。
0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10mMの濃度(ミリモ
ル/リットルで示す)のタウリンを含むタウリン補足培地を提供する。
μM±45μMのオルニチン、または600μM±90μMオルニチン、またはさらには
900μM±135μMのオルニチンを含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも約
5mg/L±1mg/Lのオルニチン・HCl、または少なくとも約,10mg/L±2
mg/Lのオルニチン・HCl、15mg/L±2.25mg/Lのオルニチン・HCl
、または少なくとも約50mg/L±7.5mg/Lのオルニチン・HCl、または少な
くとも約100mg/L±15mg/Lのオルニチン・HCl、または少なくとも約15
0mg/L±22.5mg/Lのオルニチン・HClを含む。
つかの細胞培養培地配合物中の構成成分として、非常に低い濃度で含まれている;例えば
、WO2005/028626号(0.02~0.08mg/Lプトレシンと記載);米
国特許第5,426,699号(0.08mg/L);米国特許第RE30,985号(
0.16mg/L);米国特許第5,811,299号(0.27mg/L);米国特許
第5,122,469号(0.5635mg/L);米国特許第5,063,157号(
1mg/L);WO2008/154014号(約100μM~約1000μM);米国
特許出願公開第2007/0212770号(0.5~30mg/Lポリアミン;2mg
/Lプトレシン;2mg/Lプトレシン+2mg/Lオルニチン;2mg/Lプトレシン
+10mg/Lオルニチン)を参照のこと。
足し、ここで、プトレシン濃度は少なくとも約150~720μMであり得る。いくつか
の実施形態では、培地に約170~230μMのプトレシンをさらに補足する。1つの実
施形態では、培地は、90μM±15μM以上のオルニチンに加えて、200μM±30
μMのプトレシンを含む。1つの実施形態では、培地は、15mg/L±2.25mg/
L以下のオルニチンに加えて、30mg/L±4.5mg/L以下のプトレシン・2HC
lを含む。別の実施形態では、培地は、15mg/L±2.25mg/L以上のオルニチ
ン・HClに加えて、30mg/L±4.5mg/L以上のプトレシン・2HClを含む
(2014年9月18日公開の国際公開番号WO2014/144198A1号(その全
体が本明細書中で参考として組み込まれる)を参照のこと)。
4mMの範囲の濃度(0.09±0.014mM、0.3±0.05mM、0.6±0.
09mM、または0.9±0.14mMオルニチンなど)で培地中に存在する。いくつか
の実施形態では、培地はまた、少なくとも0.20±0.03mMのプトレシンを含む。
いくつかの実施形態では、さらなるプトレシン濃度は、0.20±0.03mM~0.7
14±0.11mMの範囲(0.20±0.03mM、0.35±0.06、または0.
714±0.11mMプトレシンなど)である。
のその添加は、当業者の技術の範囲内である。いくつかの実施形態では、非枯渇とするか
、補足栄養素を必要とする場合、培地に、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、
グリシン、リジン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギ
ニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メ
チオニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の混合物
を補足する。
する。1つの実施形態では、培地は、累積濃度が少なくとも40μM、少なくとも45μ
M、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、少なくとも65μ
M、少なくとも70μM、少なくとも75μM、少なくとも80μM、少なくとも85μ
M、少なくとも90μM、少なくとも95μM、少なくとも100μM、または少なくと
も105μMのプリン誘導体を含む。1つの実施形態では、培地は、約100μM~11
0μMのプリン誘導体を含む。プリン誘導体には、ヒポキサンチンならびにヌクレオシド
であるアデノシンおよびグアノシンが含まれる。1つの実施形態では、培地は、累積濃度
が少なくとも30μM、少なくとも35μM、少なくとも40μM、少なくとも45μM
、少なくとも50μM、少なくとも55μM、少なくとも60μM、または少なくとも6
5μMのピリミジン誘導体を含む。1つの実施形態では、培地は、約65μM~75μM
のピリミジン誘導体を含む。ピリミジン誘導体には、ヌクレオシドであるチミジン、ウリ
ジン、およびシチジンが含まれる。1つの特定の実施形態では、培地は、アデノシン、グ
アノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンを含む。
脂肪酸(または脂肪酸誘導体)およびトコフェロールをさらに補足する。一実施形態では
、脂肪酸は、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステア
リン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、
ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸のうちのいずれか1つま
たは複数を含む。1つの実施形態では、培地は、トコフェロール、リノール酸、およびチ
オクト酸を含む。
)を累積濃度が少なくとも約700μMまたは少なくとも約2mMでさらに補足すること
もできる。1つの実施形態では、ビタミンの混合物は、1つまたは複数のD-ビオチン、
塩化コリン、葉酸、ミオ-イノシトール、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、D-パ
ントテン酸(hemiCa)、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンB12など
を含む。1つの実施形態では、ビタミンの混合物は、D-ビオチン、塩化コリン、葉酸、
ミオ-イノシトール、ナイアシンアミド、塩酸ピリドキシン、D-パントテン酸(hem
iCa)、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンB12の全てを含む。
ウリン、さらに、とりわけ(a)アミノ酸;(b)任意選択的に、ヌクレオシド;(c)
二価カチオンの塩;(d)脂肪酸およびトコフェロール;および(e)ビタミンを含む化
学的に規定された加水分解物を含まない無血清培地が含まれる)が含まれる。いくつかの
実施形態では、少量の全加水分解物をタウリン補足培地に添加することができる。
み合わせにタウリンを使用することができることを想定している。基本培地は、当該分野
で一般的に知られており、とりわけ、イーグルMEME(最小必須培地)(Eagle,
Science,1955,112(3168):501-504)、ハムF12(Ha
m,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1965,53:288-29
3)、F-12 K培地、ダルベッコ培地、ダルベッコ改変イーグル培地(Proc.N
atl.Acad.Sci.USA.,1952 August;38(8):747-
752)、DMEM/ハムF12 1:1、トローウェルT8、A2培地(Holmes
and Wolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10
:389-401)、ウェイマウス培地(Davidson and Waymouth
,Biochem.J.,1945,39(2):188-199)、ウィリアムズE培
地(William’sら,Exp.Cell Res.,1971,69:105 e
t seq.)、RPMI 1640(Mooreら,J.Amer. Med.Ass
oc.,1967,199:519-524)、MCDB 104/110培地(Bet
tgerら,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1981,78(9)
:5588-5592)、Ventrex HL-1培地、アルブミン-グロブリン培地
(Orrら,Appl.Microbiol.,1973,25(1):49-54)、
RPMI-1640培地、RPMI-1641培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッ
コイ5A培地、リーボビッツL-15培地、および無血清培地(EX-CELL(商標)
300シリーズ(JRH Biosciences,Lenexa,Kansas)など
)、プロタミン-亜鉛-インスリン培地(Weissら,1974,米国特許第4,07
2,565号)、ビオチン-葉酸培地(Cartaya,1978,米国再発行特許第3
0,985号)、トランスフェリン-脂肪酸培地(Baker,1982,米国特許第4
,560,655号)、トランスフェリン-EGF培地(Hasegawa,1982,
米国特許第4,615,977号;Chessebeuf,1984,米国特許第4,7
86,599号)、および他の培地の順列(Inlow,米国特許第6,048,728
号;Drapeau,米国特許第7,294,484号;Mather,米国特許第5,
122,469号;Furukawa,米国特許第5,976,833号;Chen,米
国特許第6,180,401号;Chen,米国特許第5,856,179号;Etch
everry,米国特許第5,705,364号;Etcheverry,米国特許第7
,666,416号;Ryll,米国特許第6,528,286号;Singh,米国特
許第6,924,124号;およびLuan,米国特許第7,429,491号などを参
照のこと)が含まれる。
本明細書中に定義のアミノ酸混合物、CaCl2 2H2O;HEPES緩衝液、KCl
;MgSO4;NaCl;Na2HPO4または他のリン酸塩;ピルビン酸塩;D-ビオ
チン;塩化コリン;葉酸;ミオ-イノシトール;ナイアシンアミド;塩酸ピリドキシン;
D-パントテン酸;リボフラビン;塩酸チアミン;ビタミンB12;ρ-アミノ安息香酸
;エタノールアミンHCl;ポロクサマー188;DL-a-トコフェロールホスファー
ト;リノール酸;Na2SeO3;チオクト酸;およびグルコース;ならびに、任意選択
的に、アデノシン;グアノシン;シチジン;ウリジン;チミジン;およびヒポキサンチン
2Na。
0~400、275~350、または約300mOsmである。本発明の培地中での細胞
の成長中、特に、流加プロトコールにしたがった任意の供給後の培養物の容量オスモル濃
度は、約350、400、450、500、または約550mOsmまで増加し得る。
剰量の1つまたは複数の塩の添加によって、容量オスモル濃度は約300になる。1つの
実施形態では、容量オスモル濃度を、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マグネシウム塩、
カルシウム塩、アミノ酸塩、脂肪酸の塩、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリ
ウム、塩であるキレート剤、糖(例えば、ガラクトース、グルコース、スクロース、フル
クトース、フコースなど)、およびその組み合わせから選択される1つまたは複数のオス
モライトの添加によって所望のレベルまで増加させる。1つの実施形態では、オスモライ
トを、特定培地中に既に存在する構成成分中のオスモライト濃度を超える濃度で添加する
(例えば、特定された糖構成成分の濃度を超える濃度で糖を添加する)。
タウリンを含む任意の他の無血清培地も同様にタウリン補足培地という。逆に、タウリン
を含まない培地(すなわち、0.1mM未満のタウリンを含む培地)を、以後、非タウリ
ン補足培地または非タウリン補足という。
細胞培養の供給ストラテジーは、多細胞生物外または組織外の細胞の最適な成長および
増殖を確実にすることを目的とする。哺乳動物細胞に適切な培養条件は、当該分野で公知
である。例えば、Animal cell culture:A Practical
Approach,D.Rickwood,ed.,Oxford Universit
y Press,New York(1992)を参照のこと。哺乳動物細胞を、懸濁液
中または固体基質に付着させながら培養することができる。流動床バイオリアクター、中
空繊維バイオリアクター、回転瓶、振盪フラスコ、または撹拌槽型バイオリアクター(マ
イクロキャリアを使用するか使用しない)、およびバッチ、流加、連続、半連続、または
灌流の各モードでの操作が哺乳動物細胞培養に利用可能である。細胞培養培地または濃縮
フィード培地を、培養中に培養物に連続的にまたは間隔を置いて添加することができる。
例えば、培養物に、1日1回、1日おきに1回、3日毎に1回供給することができるか、
モニタリングしている特定の培地構成成分の濃度が所望の範囲から外れた場合に供給する
ことができる。
なくとも20mMのアミノ酸をさらに補足することができる。1つの実施形態では、開始
細胞培養培地中に含まれる初期アミノ酸濃度は、かかる累積(合計)補足アミノ酸濃度に
含まれない。細胞培養培地の1つの実施形態、すなわち、細胞を培養する方法または目的
のタンパク質を産生するための方法において、培地に、約20mM超、約25mM超、約
30mM超、約40mM超 約50mM超、または約60mM超、約70mM超、約10
0mM超、約200mM超、約300mM超、約400mM超、または約500mM超の
量で補足することができる。本明細書中の表1も参照のこと。1つの実施形態では、培地
へのアミノ酸の添加量は、約30mM±10mMまたはそれを超える。
培地」を提供するために、補足物供給レジメンを最適にすることができる。
を有すると判断されている細胞培養培地が含まれる。アミノ酸フィードは、典型的には、
細胞培養における組換えタンパク質産生のための構成要素として必要なアミノ酸を補足す
る。しかし、培養細胞によって産生される特定のタンパク質の要件に応じて、アミノ酸に
よっては他のアミノ酸より早く枯渇し得る。非枯渇培地では、必要なアミノ酸が消費され
た場合にこのアミノ酸が補充されるように供給レジメが特定されている。したがって、枯
渇およびその後の至適消費率(pg/細胞-日)を、以下の工程によって決定することが
できる:細胞培養培地中で目的のタンパク質を発現する真核細胞を培養すること;各時点
での培養培地中の各アミノ酸濃度を測定して枯渇レベルを確立すること;アミノ酸濃度が
枯渇レベルを下回る枯渇時点を識別すること;各アミノ酸の消費率を計算すること;およ
び枯渇時点の直前の時点での消費率として至適消費率を決定すること。次いで、培養培地
を枯渇させないために、細胞培養物に、適切な濃度の特定のアミノ酸を補足して決定した
かかる至適消費率を維持する。
リン補足細胞培養培地を提供すると理解される。
培養物を提供する。タンパク質生物治療薬を産生するために日常的に使用される細胞株の
例には、とりわけ、初代細胞、BSC細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、LLC-M
K細胞、CV-1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、CR
FK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-1細胞、LLCPK細胞、PK15細胞、
LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK細胞、BHK-21細胞、CHO細胞、CHO
-K1細胞、NS-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、3T3細胞、293細胞
、Per.C6細胞、およびニワトリ胚細胞が含まれる。1つの実施形態では、細胞株は
、CHO細胞株または大規模タンパク質産生のために最適化されたいくつかの特定のCH
O細胞バリアントのうちの1つまたは複数(例えば、CHO-K1)である。
加することができるか、培地配合物中に含めることができるインスリンを含む。1つの実
施形態では、細胞株は、生物治療タンパク質を産生することが可能な細胞を含む。
る。流加培養は当該分野で一般的に知られており、タンパク質産生を最適にするために使
用されている(Y.M.Huangら,Biotechnol Prog.2010 S
ep-Oct;26(5):1400-10を参照のこと)。
を行った後、ポリペプチド産生期として公知の別個の第2の培養を行う。流加プロセスを
、典型的には、産生期の間に使用する。
含む細胞培養培地を提供する。あるいは、約0.1mM~約10mMのタウリンを含む細
胞培養培地を、産生細胞培養の1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、7日
目、8日目、9日目、および/または10日目に補足することができる。複数の日に産生
培養物に添加される細胞培養培地には、総量が約0.1mM~約10mMのタウリンを含
む。約0.1mM~約10mMの総タウリンを含む細胞培養培地を、任意の順序で添加す
ることができる。
産生培養の期間中毎日または2~3日毎の頻度で間隔を置いて補足物を供給することがで
きる。2週間またはそれを超える産生培養の持続期間を通して、少なくとも2回、または
少なくとも8回補足物を供給する(栄養素を含む補足培地を添加する)ことができる。別
の実施形態では、培養の持続期間中毎日補足物を供給することができる。別の培養供給ス
ケジュールも想定される。
ミノ酸は、当該分野で公知であり、且つ本明細書中に記載の方法に従って決定される。こ
のレジメを使用する場合、さらなるアミノ酸を、決定されたアミノ酸枯渇に応じて、産生
培養持続期間中に一定の間隔、好ましくは、毎日、または2~3日毎の頻度で補足または
添加する。1つの実施形態では、非枯渇細胞培養培地を維持するためのさらなるアミノ酸
の混合物を、2週間またはそれを超える培養中の1日目前後、2日目前後、3日目前後、
4日目前後、5日目前後、6日目前後、7日目前後、8日目前後、9日目前後、10日目
前後、11日目前後、12日目前後、13日目前後、および14日目前後に培養物に添加
する。別の培養供給スケジュールも想定される。
容器、約50~100mLの培地を有する250mLの容器、約100~200mLの培
地を有する500mLの容器など)で培養することができる。あるいは、培養は、大規模
(例えば、約300~1000mLの培地を有する1000mLの容器、約500mL~
3000mLの培地を有する3000mLの容器、約2000mL~8000mLの培地
を有する8000mLの容器、および約4000mL~15000mLの培地を有する1
5000mLの容器など)であり得る。生産用培養物は、10,000Lまたはそれを超
える培地を含むことができる。タンパク質治療薬の臨床製造用などの大規模細胞培養物は
、典型的には、数日間、または数週間維持され、その間に細胞が所望のタンパク質を産生
する。この間に、培養物に、培養中に消費された構成成分(栄養素およびアミノ酸など)
を含む濃縮フィード培地を補足することができる。濃縮フィード培地は、任意の細胞培養
培地配合物に基づき得る。かかる濃縮フィード培地は、細胞培養培地のほとんどの構成成
分を、その通常の有用量の、例えば、約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍
、14倍、16倍、20倍、30倍、50倍、100倍、200倍、400倍、600倍
、800倍、またはさらに約1000倍含むことができる。濃縮フィード培地を、しばし
ば、流加培養プロセスで使用する。
生中に「ユースポイント添加物」(添加物、ユースポイント成分、またはユースポイント
化学物質としても公知)をさらに補足する。ユースポイント添加物には、成長因子または
他のタンパク質、緩衝液、エネルギー源、塩、アミノ酸、金属、およびキレート剤のうち
の任意の1つまたは複数が含まれる。他のタンパク質には、トランスフェリンおよびアル
ブミンが含まれる。成長因子(サイトカインおよびケモカインが含まれる)は当該分野で
一般的に知られており、細胞成長、または、いくつかの場合、細胞分化を刺激することが
公知である。成長因子は、通常、タンパク質(例えば、インスリン)、小ペプチド、また
はステロイドホルモン(エストロゲン、DHEA、およびテストステロンなど)である。
いくつかの場合、成長因子は、細胞増殖またはタンパク質産生を促進する非天然化学物質
(例えば、テトラヒドロ葉酸(THF)およびメトトレキサートなど)であり得る。タン
パク質およびペプチドの成長因子の非限定的な例には、アンギオポエチン、骨形成タンパ
ク質(BMP)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮成長因子(EGF)、エリスロ
ポエチン(EPO)、線維芽細胞成長因子(FGF)、膠細胞株由来神経栄養因子(GD
NF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子(GM-CSF)、増殖分化因子-9(GDF9)、肝細胞成長因子(HGF)、ヘパ
トーム由来成長因子(HDGF)、インスリン、インスリン様成長因子(IGF)、遊走
刺激因子(migration-stimulating factor)、ミオスタチ
ン(GDF-8)、神経成長因子(NGF)および他のニューロトロフィン、血小板由来
成長因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トランスフォーミング成長因子α
(TGF-α)、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)、腫瘍壊死因子-α(
TNF-α)、血管内皮成長因子(VEGF)、wntシグナル伝達経路アゴニスト、胎
盤成長因子(PlGF)、ウシ胎児ソマトトロピン(somatotrophin)(F
BS)、インターロイキン-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5
、IL-6、およびIL-7などが含まれる。1つの実施形態では、細胞培養培地に、ユ
ースポイント添加成長因子であるインスリンを補足する。1つの実施形態では、添加後の
培地中のインスリン濃度(すなわち、細胞培養培地中のインスリン量)は、約0.1μM
~10μMである。
ず、任意の当業者は、特定のタンパク質を産生する特定の細胞株との使用に適切な緩衝液
または緩衝系を選択することができる。1つの実施形態では、ユースポイント添加緩衝液
はNaHCO3である。別の実施形態では、緩衝液はHEPESである。他の実施形態で
は、ユースポイント添加緩衝液は、NaHCO3およびHEPESの両方を含む。
周知である。制限されないが、1つの実施形態では、ユースポイント添加エネルギー源は
グルコースである。特定の細胞株および産生されるタンパク質の特定且つ具体的な要件を
考慮すると、1つの実施形態では、グルコースを、約1~20mMの濃度まで培地に添加
することができる。いくつかの場合、グルコースを、20g/Lまたはそれを超える高レ
ベルで添加することができる。
トラナトリウム二水和物(dehydrate)およびクエン酸塩は、当該分野で使用さ
れる2つの一般的なキレート剤であるが、他のキレート剤を本発明の実施において使用す
ることができる。1つの実施形態では、ユースポイント添加キレート剤はEDTAテトラ
ナトリウム二水和物である。1つの実施形態では、ユースポイント添加キレート剤は、ク
エン酸塩(Na3C6H5O7など)である。
イント添加アミノ酸(例えば、グルタミンなど)をさらに補足することができる。1つの
実施形態では、細胞培養培地に、ユースポイント添加グルタミンを約1mM~13mMの
最終濃度で補足する。
、および銅の塩など)が含まれる。1つの実施形態では、細胞培養培地に、硫酸銅、硫酸
亜鉛、塩化第二鉄、および硫酸ニッケルのうちの任意の1つまたは複数を補足する。
非タウリン補足で培養した細胞由来のタンパク質力価(収量)より少なくとも4%、少な
くとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少な
くとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも1
4%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少
なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%高い、少なく
とも23%高い、少なくとも24%高い、少なくとも25%高い、少なくとも26%高い
、少なくとも27%高い、少なくとも28%高いまたは少なくとも29%高い。いくつか
の実施形態では、タウリン補足培地中の細胞から得られるタンパク質力価は、非タウリン
補足培地で培養した類似の細胞または同一の細胞由来のタンパク質力価(収量)より少な
くとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、または少なくとも5%高い。
る細胞培養と比較して、タウリン補足培地において4%より大きく、5%より大きく、6
%より大きく、7%より大きく、8%より大きく、9%より大きく、10%より大きく、
15%、または20%より大きく低下する。
タウリン補足培地およびタウリン補足培地での細胞の培養方法に加えて、本発明は、タ
ウリン補足培地で培養した細胞におけるタンパク質(治療に有効な抗体または他の生物医
薬品薬物物質など)の改良された産生方法を提供する。本発明は、治療タンパク質を高収
量で産生する方法であって、タウリンを含む培地中で組換え細胞株を培養する工程を含み
、細胞株が、治療タンパク質をコードする安定に組み込まれた核酸を含む、方法を提供す
る。
物細胞によるタンパク質の力価(収量)は、非タウリン補足培地で培養した同一の哺乳動
物細胞によるタンパク質の力価より少なくとも100mg/L、少なくとも0.5g/L
、少なくとも1g/L、少なくとも1.2g/L、少なくとも1.4g/L、少なくとも
1.6g/L、少なくとも1.8g/L、少なくとも2g/L、少なくとも2.5g/L
高い。
ルあたりのタンパク質産物のグラムで表すことができるタンパク質収量または力価は、少
なくとも100mg/L、少なくとも1g/L、少なくとも1.2g/L、少なくとも1
.4g/L、少なくとも1.6g/L、少なくとも1.8g/L、少なくとも2g/L、
少なくとも2.5g/L、少なくとも3g/L、少なくとも、3.5g/L、少なくとも
4g/L、少なくとも4.5g/L、少なくとも5g/L、少なくとも5.5g/L、少
なくとも6g/L、少なくとも6.5g/L、少なくとも7g/L、少なくとも7.5g
/L、少なくとも8g/L、少なくとも8.5g/L、少なくとも9g/L、少なくとも
9.5g/L、少なくとも10g/L、少なくとも15g/L、または少なくとも20g
/Lである。
非タウリン補足培地で培養した類似の細胞または同一の細胞由来のタンパク質力価(収量
)より少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも
6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくと
も11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%
、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なく
とも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%高い、少なくとも
24%高い、少なくとも25%高い、少なくとも26%高い、少なくとも27%高い、少
なくとも28%高いまたは少なくとも29%高い。
ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原
結合抗体フラグメント、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、F
abフラグメントまたはF(ab’)2フラグメント、IgD抗体、IgE抗体、IgM
抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、またはIgG4抗体で
ある。一実施形態では、抗体はIgG1抗体である。一実施形態では、抗体はIgG2抗
体.一実施形態では、抗体はIgG4抗体である。一実施形態では、抗体はキメラIgG
2/IgG4抗体である。一実施形態では、抗体はキメラIgG2/IgG1抗体である
。一実施形態では、抗体はキメラIgG2/IgG1/IgG4抗体である。
公開第2015/0203579A1号に記載の抗PD1抗体)、抗プログラム細胞死リ
ガンド-1(例えば、米国特許出願公開第2015/0203580A1号に記載の抗P
D-L1抗体)、抗Dll4抗体、抗アンジオポエチン(Angiopoetin)-2
抗体(例えば、米国特許第9,402,898号に記載の抗ANG2抗体)、抗アンジオ
ポエチン(Angiopoetin)様3抗体(例えば、米国特許第9,018,356
号に記載の抗AngPtl3抗体)、抗血小板由来成長因子受容体抗体(例えば、米国特
許第9,265,827号に記載の抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗プロラクチ
ン受容体抗体(例えば、米国特許第9,302,015号に記載の抗PRLR抗体)、抗
補体5抗体(例えば、米国特許出願公開第2015/0313194A1号に記載の抗C
5抗体)、抗TNF抗体、抗上皮成長因子受容体抗体(例えば、米国特許第9,132,
192号に記載の抗EGFR抗体または米国特許出願公開第2015/0259423A
1号に記載の抗EGFRvIII抗体)、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシ
ン-9抗体(例えば、米国特許第8,062,640号または米国特許出願公開第201
4/0044730A1号に記載の抗PCSK9抗体)、抗成長分化因子-8抗体(例え
ば、抗ミオスタチン抗体としても公知であり、米国特許第8,871,209号または同
第9,260,515号に記載の抗GDF8抗体)、抗グルカゴン受容体(例えば、米国
特許出願公開第2015/0337045A1号または同第2016/0075778A
1号に記載の抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、インターロイキン4
受容体抗体(例えば、米国特許出願公開第2014/0271681A1号または米国特
許第8,735,095号もしくは同第8,945,559号に記載の抗IL4R抗体)
、抗インターロイキン6受容体抗体(例えば、米国特許第7,582,298号、同第8
,043,617号、または同第9,173,880号に記載の抗IL6R抗体)、抗I
L1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、
抗IL7抗体、抗インターロイキン33(例えば、米国特許出願公開第2014/027
1658A1号または同第2014/0271642A1号に記載の抗IL33抗体)、
抗呼吸器合胞体ウイルス抗体(例えば、米国特許出願公開第2014/0271653A
1号に記載の抗RSV抗体)、抗分化抗原群3(例えば、米国特許出願公開第2014/
0088295A1号および同第20150266966A1号ならびに米国特許出願第
62/222,605号に記載の抗CD3抗体)、抗分化抗原群20(例えば、米国特許
出願公開第2014/0088295A1号および同第20150266966A1号な
らびに米国特許第7,879,984号に記載の抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗
CD28抗体、抗分化抗原群-48(例えば、米国特許第9,228,014号に記載の
抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例えば、米国特許第9,079,948号に記
載)、抗中東呼吸器症候群ウイルス(例えば、米国特許出願公開第2015/03370
29A1号に記載の抗MERS抗体)、抗エボラウイルス抗体(例えば、米国特許出願公
開第2016/0215040号に記載)、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝
子3抗体(例えば、抗LAG3抗体または抗CD223抗体)、抗神経成長因子抗体(例
えば、米国特許出願公開第2016/0017029号ならびに米国特許第8,309,
088号および同第9,353,176号に記載の抗NGF抗体)、および抗アクチビン
A抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗CD
3×抗CD20二重特異性抗体(米国特許出願公開第2014/0088295A1号お
よび同第20150266966A1号に記載)、抗CD3×抗ムチン16二重特異性抗
体(例えば、抗CD3×抗Muc16二重特異性抗体)、および抗CD3×抗前立腺特異
的膜抗原二重特異性抗体(例えば、抗CD3×抗PSMA二重特異性抗体)からなる群か
ら選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アリロクマブ、サリルマ
ブ、ファシヌマブ(fasinumab)、ネスバクマブ(nesvacumab)、デ
ュピルマブ、トレボグルマブ(trevogrumab)、エビナクマブ(evinac
umab)、およびリヌクマブ(rinucumab)からなる群から選択される。本開
示を通して言及した全ての刊行物は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
換えタンパク質(例えば、Fc-融合タンパク質)である。いくつかの実施形態では、F
c-融合タンパク質は、Fc部分にカップリングした受容体の細胞外ドメインを1つまた
は複数含む受容体Fc-融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Fc部分は、
IgGのヒンジ領域の後にCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。いくつかの実施
形態では、受容体Fc-融合タンパク質は、単一のリガンドまたは複数のリガンドのいず
れかに結合する2つまたはそれを超える個別の受容体鎖を含む。例えば、Fc-融合タン
パク質は、TRAPタンパク質(例えば、IL-1 trap(例えば、リロナセプト(
hIgG1のFcに融合したIl-1R1細胞外領域に融合したIL-1RAcPリガン
ド結合領域含む);米国特許第6,927,004号(その全体が本明細書中で参考とし
て組み込まれる)を参照のこと)またはVEGF trap(例えば、アフリベルセプト
またはziv-アフリベルセプト(hIgG1のFcに融合したVEGF受容体Flk1
のIgドメイン3に融合したVEGF受容体Flt1のIgドメイン2を含む);米国特
許第7,087,411号および同第7,279,159号を参照のこと)など)である
。他の実施形態では、Fc-融合タンパク質は、ScFv-Fc-融合タンパク質であり
、このタンパク質は、1つまたは複数の抗原結合ドメイン(Fc部分にカップリングした
抗体の重鎖可変フラグメントおよび軽鎖可変フラグメントなど)のうちの1つまたは複数
を含む。
生に適切な細胞型の例には、哺乳動物細胞、昆虫細胞、トリ細胞、細菌細胞、および酵母
細胞が含まれる。細胞は、幹細胞、組換え遺伝子発現用ベクターで形質転換された組換え
細胞、またはウイルス産物産生用のウイルスでトランスフェクトされた細胞であり得る。
細胞は、目的のタンパク質をコードする組換え異種ポリヌクレオチド構築物を含み得る。
この構築物は、エピソームであり得るか、細胞のゲノムに物理的に組み込まれた要素であ
り得る。細胞はまた、目的のタンパク質が異種ポリペプチド構築物にコードされることな
く目的のタンパク質を産生することができる。換言すれば、細胞は、目的のタンパク質を
天然にコードすることができる(抗体を産生するB細胞など)。細胞はまた、初代細胞(
ニワトリ胚細胞など)または初代細胞株であり得る。有用な細胞の例には、BSC細胞、
LLC-MK細胞、CV-1細胞、COS細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK
細胞、CRFK細胞、RAF細胞、RK細胞、TCMK-1細胞、LLCPK細胞、PK
15細胞、LLC-RK細胞、MDOK細胞、BHK-21細胞、ニワトリ胚細胞、NS
-1細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、BHK細胞、293細胞、RK細胞、Pe
r.C6細胞、およびCHO細胞が含まれる。種々の実施形態では、細胞株は、CHO細
胞誘導体(CHO-K1、CHO DUX B-11、CHO DG-44、Veggi
e-CHO、GS-CHO、S-CHO、またはCHOlec変異株など)である。
の実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖領域(CH1領域、CH2領域、ま
たはCH3領域など)を含む。1つの実施形態では、タンパク質は、ヒトまたはげっ歯類
の免疫グロブリンCH2領域およびCH3領域を含む。1つの実施形態では、タンパク質
は、ヒトまたはげっ歯類の免疫グロブリンCH1領域、CH2領域、およびCH3領域を
含む。1つの実施形態では、タンパク質は、ヒンジ領域ならびにCH1領域、CH2領域
、およびCH3領域を含む。1つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖可
変ドメインを含む。1つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイ
ンを含む。1つの実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む。1つの実施形態では、タンパク質は、抗体(ヒ
ト抗体、げっ歯類抗体、またはキメラヒト/げっ歯類抗体(例えば、ヒト/マウス、ヒト
/ラット、またはヒトハムスター)など)である。
バイオリアクターおよび大規模産業用バイオリアクターまでの任意の規模の培養で実施す
ることができる。同様に、シードトレイン拡大期を、振盪フラスコまたはウェイブバッグ
から1リットルまたはそれを超える規模のバイオリアクターまでの任意の規模の培養で行
うことができる。大規模プロセスを、約100リットルから20,000リットルまたは
それを超える体積で行うことができる。幾つかの手段(温度変化または化学的誘導など)
のうちの1つまたは複数を用いてタンパク質産生を制御することができる。増殖期は、産
生期より高温で生じ得る。例えば、増殖期は約35℃~38℃の第1の温度で生じること
ができ、産生期は、約29℃~37℃、任意選択的に、約30℃~36℃または約30℃
~34℃の第2の温度で生じ得る。さらに、タンパク質産生の化学誘導物質(カフェイン
、酪酸塩、タモキシフェン、エストロゲン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、およ
びヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)など)を、温度変化と同時、前、または
後に添加することができる。誘導物質を温度変化の後に添加する場合、誘導物質を温度変
化の1時間後から5日後に添加することができる(温度変化の1~2日後など)。産生細
胞培養を、ケモスタットなどの連続供給培養系(C.Altamiranoら,2001
前出を参照のこと)としてか、流加プロセス(Huang、2010前出)に従って実施
することができる。
用される細胞株を、商業的または科学的に興味深いポリペプチドを発現するように遺伝子
操作することができる。細胞株の遺伝子操作は、組換えポリヌクレオチド分子を用いた細
胞のトランスフェクション、形質転換、もしくは、導入、または宿主細胞に所望の組換え
ポリペプチドを発現させるための別の変化(例えば、相同組換えおよび遺伝子活性化また
は組換え細胞の非組換え細胞との融合による)を含む。目的のポリペプチドを発現するよ
うに細胞または細胞株を遺伝子操作するための方法およびベクターは、当業者に周知であ
る;例えば、種々の技術が、Current Protocols in Molecu
lar Biology.Ausubelら,eds.(Wiley & Sons,N
ew York,1988および年4回のアップデート);Sambrookら,Mol
ecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold
Spring Laboratory Press,1989);Kaufman,R.
J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,19
90,pp.15-69に例示されている。培養における成長に適切な広範な種々の細胞
株が、American Type Culture Collection(Mana
ssas,Va.)および販売者から利用可能である。産業で一般的に使用される細胞株
の例には、VERO、BHK、HeLa、CVl(Cosが含まれる)、MDCK、29
3、3T3、骨髄腫細胞株(例えば、NSO、NSl)、PC12、WI38細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が含まれる。CHO細胞は、複雑な組換え
タンパク質(サイトカイン、凝固因子、および抗体など)の産生のために広く使用されて
いる(Braselら(1996),Blood 88:2004-2012;Kauf
manら(1988),J.Biol Chem 263:6352-6362;McK
innonら(1991),J MoI Endocrinol 6:231-239;
Woodら(1990),J Immunol.145:3011-3016)。ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ(DHFR)欠損変異細胞株(Urlaubら(1980),Pro
c Natl Acad Sci USA 77:4216-4220)、DXBl1、
およびDG-44は、有効なDHFR選択性を示し、且つ増幅可能な遺伝子発現系によっ
てこれらの細胞中で高レベルの組換えタンパク質発現が可能であるので、望ましいCHO
宿主細胞株である(Kaufman RJ.(1990),Meth Enzymol
185:537-566)。さらに、これらの細胞は接着培養物または懸濁培養物として
操作が容易であり、比較的良好な遺伝子安定性を示す。CHO細胞およびCHO細胞によ
って組換え発現されたタンパク質は広く特徴付けられており、規制当局によって臨床的製
造および商業的製造での使用が承認されている。いくつかの実施形態では、CHO細胞株
は、米国特許出願公開第2010/0304436A1号、同第2009/016290
1A1号、および同第2009/0137416A1号、ならびに米国特許第7,455
,988B2号、同第7,435,553B2号、および同第7,105,348B2号
に記載の細胞株である。
は、本発明の各々の態様または実施形態の例示であることを意図する。機能的に等価な方
法および構成成分は、本発明の範囲内である。本明細書中に記載の発明に加えて、前述の
説明および添付の図面から本発明の種々の修正形態が当業者に自明である。かかる修正形
態は、本発明の範囲内である。
実施例1A-ハイスループット振盪フラスコ培養:250mL振盪フラスコに、CHO
-K1由来のモノクローナル抗体(Ab1)産生細胞株の種培養物を接種した。接種した
細胞を35.5℃で17日間成長させ、必要に応じてグルコースおよび他の補足栄養素を
供給した。細胞を、化学的に規定された(加水分解物を含まず、かつ無血清)基本培地中
で成長させた。
した(フラスコ1b)。
*力価増加(%)についてのベースラインコントロール;フラスコ1bを補足ない培地に
おける力価(フラスコ1a)と比較した。
^補足なし培養物と補足培養物との間の最終力価の相違が統計学的に有意である(p<0
.05)。
して統計学的に有意である(p<0.05)。タウリン補足培養物は、補足なし培養物に
対し最終タンパク質力価が全体で8%増加する。
において、2Lバイオリアクターに、CHO-K1由来のモノクローナル抗体(Ab2、
Ab3、またはAb4)産生細胞株の種培養物を接種した。接種した培養物を、温度35
.5℃、DO設定点40.4%、および空気注入22ccmで14日間成長させた。Ab
2およびAb3プロセスのpH設定値は7.0±0.15であり、Ab4プロセスのpH
設定値は7.13±0.27であった。必要に応じて、グルコース、消泡剤、および基礎
フィードをバイオリアクターに供給した。培養物を、補足なし培地(バイオリアクター2
a、3a、4a)で成長させるか、約1mMタウリン補足培地(Ab2およびAb3)ま
たは約3mMタウリン補足培地(Ab4)(産生0日目に添加(それぞれ、バイオリアク
ター2b、3b、および4b))中で成長させた。
用いて成長させた細胞は8g/Lタンパク質を産生した。タウリン補足せずに成長させた
細胞と比較した24%の力価の増加は統計学的に有意である(p<0.05)。得られた
Ab3産生培養物およびAb4産生培養物の最終力価も、タウリン非補足培養物と比較し
て、14日後に有意に高い(p<0.05)(それぞれ、11%および20%)。表3を
参照のこと。
*補足なし培地は、力価増加%についてのベースラインコントロールであり、ここで、バ
イオリアクター2b、3b、または4bの力価増加%を補足なし培地(それぞれ、バイオ
リアクター2a、3a、または4a)における力価と比較する。
^補足培養物と補足なし培養物との間の最終力価の相違は統計学的に有意である(p<0
.05)。
リン補足によるタンパク質力価の有意な改善が、6日目より各培養日で認められた。
*同日に回収した補足なし培地と比較した近似増加(%)
^タウリン補足を用いた力価の増加は、補足なし培地と比較して統計学的に有意である(
p<0.05)。
補足しない同一の培養物と比較して12%増加)。図1も参照のこと。この経時変化にお
ける最大の相違は9日目に認められ(3aと比較してバイオリアクター3bにおいて29
%の有意な(p<0.05)増加)、培養最終日(14日目)に11%の有意な(p<0
.05)力価の増加が認められた。
および異なる細胞株(実施例1B)にわたって観察される。
の一貫性)
産生0日目の培養物へのタウリンの添加量を変化させることによって、タンパク質力価
の一貫性を試験した。250mL振盪フラスコに、CHO-K1由来のモノクローナル抗
体(Ab1)産生細胞株の種培養物を接種した。接種した細胞を35.5℃で14日間成
長させ、必要に応じてグルコースおよび他の補足栄養素を供給した。細胞を、化学的に規
定された(加水分解物なし、かつ無血清)基本培地中で成長させた。
M、0.7mM、1mM、3mM、5mM、7.5mM、または10mMの濃度でタウリ
ンを含んでいた。
*補足なし培地は力価増加%についてのベースラインコントロールである。
#補足なしコントロールと比較した最終力価の相違は統計学的に有意である(p<0.1
)。
^補足なしコントロールと比較した最終力価の相違は統計学的に有意である(p<0.0
5).
を変動させても一貫して高力価であることを示す。タウリン補足条件についての最終力価
は、補足なし条件と統計学的に異なっていた。0.1mMタウリンではp<0.1であり
、0.3mM~10mMタウリンではp<0.05であった。
ルの試験)
実施例3A:シードトレイン拡大期の間のタウリン添加:
スコモデルで評価した。フラスコ6a(表6)では、Ab1産生CHO細胞を、1mMタ
ウリンを補足した化学的に規定された(加水分解物なし、かつ無血清)基本培地中で解凍
した。基礎培地のタウリン濃度を、拡大期を通して1mMに維持した。産生の間、培養基
礎培地に、0日目に1mM タウリンを補足した。グルコースおよび栄養基礎フィードを
、17日間の産生の間に必要に応じて供給した。
)の化学的に規定された(加水分解物なし、かつ無血清)基礎培地中で成長した。産生0
日目に、培養基礎培地に、1mMタウリンを補足した。17日の産生の間に、グルコース
および栄養基礎フィードを必要に応じて供給した。
最終力価(17日目)の相違は、統計学的に有意ではない(p>0.1)。
補足)についての最終(17日目)力価値は類似している。得られた力価は統計学的に有
意ではない(p>0.1)。シードトレイン拡大期におけるタウリン添加の利点は、産生
期におけるタウリン補足に類似している。
動スケジュールがタウリン補足培養物のタンパク質力価に任意の影響を及ぼしたかどうか
を決定するために、Ab1産生CHO細胞を成長させる類似の振盪フラスコ培養において
さらなる実験を行った。細胞を、供給スケジュールが前述と同一であり、グルコース/栄
養基礎フィードを必要に応じて添加する実施例2に類似の変動培養条件に供した。
ルにおいて類似の生産性(7.1g/L、6.8g/L、および7.0g/L)が観察さ
れる。本実験で比較した力価値は統計学的に異なっていない(p>0.1)(表7を参照
のこと)。
14日の力価値間の相違は統計学的に有意でない(p>0.1)。
に有利であるという結果も変化させない。したがって、タウリン補足を、0日目に1回加
えるか、その後の産生期に加えるか、産生期に複数の間隔を置いて加えることができる。
測定)
アンモニア副生成物を、Ab1産生CHO細胞のタウリン補足培養物について実施例2
に類似の様式で行った14日後の培養物で測定した。細胞を、グルコース/栄養基本フィ
ードを必要に応じて添加する上記に類似の変動培養条件に供した。
*アンモニア減少%についてのベースラインコントロール;タウリン補足条件を補足なし
培地中のアンモニアと比較した。
^アンモニア濃度の減少は統計学的に有意である(p<0.1)。
モニア副生成物が32%減少していた。タウリン補足由来のアンモニア濃度の減少は統計
学的に有意である(p<0.1)。
Claims (58)
- 目的の組換えタンパク質の改良された産生のために真核細胞を培養する方法であって、
(a)増殖期の間に、真核細胞を、無血清かつ加水分解物を含まない細胞培養培地中で増殖または維持する工程、および
(b)産生期の間に、前記細胞培養培地に、0.1mM~10mMのL-タウリンを補足し、前記目的の組換えタンパク質を発現させる工程
を含み、
前記L-タウリンの添加により、前記目的の組換えタンパク質の力価が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で少なくとも6日間の後に前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも6日間の後に、少なくとも3%増加する、方法。 - 前記細胞培養培地が、オルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、アミノ酸の混合物、1つまたは複数の脂肪酸、ビタミンおよび補因子、ヌクレオシドの混合物、または、1つまたは複数の二価カチオンを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項3に記載の方法であって、
前記アミノ酸の混合物が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸を含み、
前記1つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群より選択され、
前記ビタミンおよび補因子が、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ミオ-イノシトール、ニコチンアミド、ピリドキシンHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB12からなる群より選択され、
前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジンおよびヒポキサンチンのうち1つまたは複数を含み、かつ
前記1つまたは複数の二価カチオンが、Ca2+、Mg2+または両方を含む、
方法。 - 産生期の間に、前記細胞培養培地に0.5~10mMのL-タウリンが補足される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(b)のL-タウリン補足を、産生期の間に1~5回行う、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(b)のL-タウリン補足を、前記産生期の持続時間の間に毎日行う、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記(b)のL-タウリン補足を、前記産生期の開始時(0日目)に行う、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 増殖期の間に、前記細胞培養培地に0.1mM~10mMのL-タウリンを補足することをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 増殖期の間に、前記細胞培養培地に0.5mM~10mMのL-タウリンを補足することをさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核細胞が、哺乳動物細胞、トリ細胞、昆虫細胞、および酵母細胞からなる群から選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、CHO細胞、COS細胞、網膜細胞、Vero細胞、CV1細胞、腎臓細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、WI38細胞、MRC5細胞、Colo25細胞、HB8065細胞、HL-60細胞、リンパ球、表皮性細胞、CV-1細胞、U937細胞、3T3細胞、L細胞、C127細胞、SP2/0細胞、NS-0細胞、MMT細胞、PER.C6(登録商標)細胞、幹細胞、腫瘍細胞、および前記細胞に由来する細胞株からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 請求項12に記載の方法であって、
(a)前記CHO細胞が、CHO K1細胞、DXB-11 CHO細胞、もしくはVeggie-CHO細胞であるか、
(a)前記COS細胞が、COS-7細胞であるか、
(b)前記腎臓細胞が、HEK293細胞、293EBNA細胞、MSR293細胞、MDCK細胞、HaK細胞、もしくはBHK21細胞であるか、
(c)前記リンパ球が、Jurkat細胞、もしくはDaudi細胞であるか、または
(d)前記表皮細胞が、A431細胞である、
方法。 - 前記目的の組換えタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の組換えタンパク質がFcドメインを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の組換えタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(TRAP)、抗体、抗体フラグメント、およびScFv-Fc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項14または15に記載の方法。
- 前記抗体が、抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗Dll4抗体、抗ANG2抗体、抗AngPtl3抗体、抗PDGFR抗体、抗Erb3抗体、抗PRLR抗体、抗TNF抗体、抗EGFR抗体、抗PCSK9抗体、抗GDF8抗体、抗GCGR抗体、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、抗IL4R抗体、抗IL6R抗体、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗RSV抗体、抗NGF抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗CD48抗体、抗CD3/抗CD20二重特異性抗体、抗CD3/抗MUC16二重特異性抗体、および抗CD3/抗PSMA二重特異性抗体からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記抗体が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記TRAPタンパク質が、IL-1 TRAPタンパク質またはVEGF TRAPタンパク質を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記VEGF TRAPタンパク質がアフリベルセプトである、請求項19に記載の方法。
- 前記L-タウリン補足を含む前記細胞培養培地中で培養された前記細胞によって産生された前記目的の組換えタンパク質の力価が、少なくとも1.8g/Lである、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記L-タウリンの添加により、アンモニア副生成物レベルが、L-タウリンを含まない細胞培養培地中の前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも4%低下する、請求項1~21のいずれか一項に記載の方法。
- 目的の組換えタンパク質を産生する方法であって、
(a)目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程;
(b)前記目的の組換えタンパク質を発現する前記細胞を選択する工程;
(c)0.1mM~10mMのL-タウリンを含む無血清かつ加水分解物を含まない細胞培養培地中で選択した前記細胞を培養する工程;および
(d)前記細胞中で前記目的の組換えタンパク質を産生させる工程であって、前記目的の組換えタンパク質が前記細胞培養培地中に分泌される工程
を含み、
前記L-タウリンの添加により、前記目的の組換えタンパク質の力価が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で少なくとも6日間の後に前記目的の組換えタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも6日間の後に、少なくとも3%増加する、方法。 - 目的の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程が、前記目的の組換えタンパク質をコードする前記核酸を前記細胞に安定的に組み込むことを含む、請求項23に記載の方法。
- 前記細胞培養培地がオルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせを含む、請求項23または24に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が0.5mM~10mMのL-タウリンを含む、請求項23~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、CHO細胞、HEK293細胞、またはBHK細胞である、請求項23~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の組換えタンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項23~27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の組換えタンパク質がFcドメインを含む、請求項23~28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記目的の組換えタンパク質が、Fc-融合タンパク質、受容体-Fc-融合タンパク質(TRAP)、抗体、抗体フラグメント、およびScFv-Fc融合タンパク質からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体が、アリロクマブ、サリルマブ、ファシヌマブ、ネスバクマブ、デュピルマブ、トレボグルマブ、エビナクマブ、およびリヌクマブからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記TRAPタンパク質が、IL-1 TRAPタンパク質またはVEGF TRAPタンパク質を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記VEGF TRAPタンパク質がアフリベルセプトである、請求項32に記載の方法。
- 前記L-タウリンの添加により、アンモニア副生成物レベルが、L-タウリンを含まない細胞培養培地中の前記目的のタンパク質を発現する細胞と比較して、少なくとも4%低下する、請求項23~33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記L-タウリン補足を含む前記細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された前記目的の組換えタンパク質の力価が、少なくとも1.8g/Lである、請求項23~34のいずれか一項に記載の方法。
- デュピルマブを発現する真核細胞を培養する方法であって、
(a)0.1mM~10mMのL-タウリンを補足した無血清かつ加水分解物を含まない細胞培養培地を提供する工程、
(b)前記真核細胞を、前記細胞培養培地中で増殖または維持して、細胞培養物を形成する工程、および
(c)前記細胞培養物からデュピルマブを産生させる工程
を含み、
前記細胞培養培地へのL-タウリンの補足により、デュピルマブの力価が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で増殖または維持した細胞からのデュピルマブの力価と比較して少なくとも3%増加する、方法。 - (b)において、前記基礎細胞培養培地に、オルニチン、プトレシンまたはこれらの組み合わせが補足される、請求項36に記載の方法。
- 前記基礎細胞培養培地に、0.09mM~0.9mMのオルニチンが補足される、請求項37に記載の方法。
- 工程(b)の前にさらに増殖期を含み、前記増殖期が、L-タウリンを補足していない基礎細胞培養培地中で前記真核細胞を増殖または維持することを含む、請求項36~38のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(b)の前にさらに増殖期を含み、前記増殖期が、0.1mM~10mMのL-タウリンを補足した基礎細胞培養培地中で前記真核細胞を増殖または維持することを含む、請求項36~38のいずれか一項に記載の方法。
- (b)の前記タウリンが、工程(b)の間に少なくとも1回提供される、請求項36~40のいずれか一項に記載の方法。
- (b)の前記タウリンが、毎日提供される、請求項36~41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基礎細胞培養培地が、
(a)アミノ酸の混合物、
(b)1つまたは複数の脂肪酸、
(c)ビタミンおよび補因子、
(d)ヌクレオシドの混合物、または
(e)1つまたは複数の二価カチオン
を含む、請求項36~42のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項43に記載の方法であって、
(a)アミノ酸の混合物が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸を含む、
(b)前記1つまたは複数の脂肪酸が、リノール酸、リノレン酸、チオクト酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ラウリン酸、ベヘン酸、デカン酸、ドデカン酸、ヘキサン酸、リグノセリン酸、ミリスチン酸、およびオクタン酸からなる群から選択される、
(c)前記ビタミンおよび補因子が、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ミオ-イノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、およびビタミンB12からなる群から選択される、
(d)前記ヌクレオシドの混合物が、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、チミジン、およびヒポキサンチンの1つまたは複数を含む、あるいは
(e)前記1つまたは複数の二価カチオンが、Ca2+、Mg2+または両方を含む、
方法。 - 前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項36~44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項45に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、CHO-K1細胞、CHO DUX B-11細胞、CHO DG-44細胞、Veggie-CHO細胞、GS-CHO細胞、S-CHO細胞、CHO lec変異株細胞またはこれらの誘導体である、請求項46に記載の方法。
- 前記CHO細胞がCHO-K1細胞である、請求項46に記載の方法。
- デュピルマブを産生する方法であって、
(a)デュピルマブをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を細胞に導入する工程、
(b)前記デュピルマブを発現する前記細胞を単離する工程、
(c)0.1mM~10mMのL-タウリンを含む無血清かつ加水分解物を含まない細胞培養培地において前記単離した細胞を培養することにより、細胞の集団を生成する工程、
(d)前記細胞の集団からデュピルマブを発現させる工程であって、前記デュピルマブが前記培地に分泌される、工程、および
(e)前記デュピルマブを回収する工程
を含み、
前記細胞培養培地への0.1mM~10mMのL-タウリンの添加により、デュピルマブの力価が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で培養した細胞からのデュピルマブの力価と比較して少なくとも3%増加する、方法。 - 前記デュピルマブの前記力価が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中で培養した細胞と比較して、少なくとも8%増加する、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞の集団が、L-タウリンを含まない細胞培養培地中でデュピルマブを発現する細胞と比較して、少なくとも8%高いデュピルマブのタンパク質収量が可能である、請求項49または50に記載の方法。
- L-タウリンを含む細胞培養培地中で前記細胞の集団を培養することによるデュピルマブの産生が、タウリンを含まない類似の細胞培養培地中で前記細胞の集団を培養した場合と比較して、デュピルマブの収量を、少なくとも0.1g/L増加させることができる、請求項49~51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項49~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がCHO細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記CHO細胞が、CHO-K1細胞、CHO DUX B-11細胞、CHO DG-44細胞、Veggie-CHO細胞、GS-CHO細胞、S-CHO細胞、CHO lec変異株細胞またはこれらの誘導体である、請求項54に記載の方法。
- (c)において、0.1mM~10mMのL-タウリンを含む細胞培養培地中で、前記細胞の集団を少なくとも6日間培養することを含む、請求項49~55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記デュピルマブをコードする核酸が、前記細胞において安定に組み込まれる、請求項49~56のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養培地に1つまたは複数のユースポイント添加物を添加する工程を含む、請求項49~57のいずれか一項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022135752A JP2022162157A (ja) | 2015-08-04 | 2022-08-29 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562200689P | 2015-08-04 | 2015-08-04 | |
US62/200,689 | 2015-08-04 | ||
JP2018503655A JP2018521664A (ja) | 2015-08-04 | 2016-08-03 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018503655A Division JP2018521664A (ja) | 2015-08-04 | 2016-08-03 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022135752A Division JP2022162157A (ja) | 2015-08-04 | 2022-08-29 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021112215A JP2021112215A (ja) | 2021-08-05 |
JP2021112215A5 JP2021112215A5 (ja) | 2022-05-20 |
JP7198868B2 true JP7198868B2 (ja) | 2023-01-04 |
Family
ID=56738219
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018503655A Withdrawn JP2018521664A (ja) | 2015-08-04 | 2016-08-03 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
JP2021080955A Active JP7198868B2 (ja) | 2015-08-04 | 2021-05-12 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
JP2022135752A Pending JP2022162157A (ja) | 2015-08-04 | 2022-08-29 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018503655A Withdrawn JP2018521664A (ja) | 2015-08-04 | 2016-08-03 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022135752A Pending JP2022162157A (ja) | 2015-08-04 | 2022-08-29 | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US11312936B2 (ja) |
EP (1) | EP3331987A1 (ja) |
JP (3) | JP2018521664A (ja) |
KR (1) | KR20180032581A (ja) |
CN (2) | CN107922920B (ja) |
AR (1) | AR105602A1 (ja) |
AU (2) | AU2016301305B2 (ja) |
BR (1) | BR112018002214A2 (ja) |
CA (3) | CA2989178A1 (ja) |
EA (1) | EA201890137A1 (ja) |
HK (2) | HK1248279A1 (ja) |
IL (2) | IL298775A (ja) |
MX (2) | MX2018001531A (ja) |
MY (1) | MY192561A (ja) |
TW (3) | TW202330904A (ja) |
WO (1) | WO2017024062A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
JP2020527332A (ja) | 2017-06-12 | 2020-09-10 | ブルーフィン バイオメディシン, インコーポレイテッド | 抗−il1rap抗体および抗体薬物コンジュゲート |
CN108918892B (zh) * | 2018-08-01 | 2021-04-27 | 百奥泰生物制药股份有限公司 | 一种测定抗vegf抗体活性的方法及其应用 |
KR102597919B1 (ko) * | 2018-11-02 | 2023-11-06 | 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 | 지속적으로 수확하고 세포 출혈없는 강화된 관류에 의한 세포 배양 과정 |
HUP1800376A2 (hu) * | 2018-11-07 | 2020-05-28 | Richter Gedeon Nyrt | Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer |
CN109777793B (zh) * | 2019-03-15 | 2020-12-08 | 常熟理工学院 | 一种gdsl脂肪酶、基因工程菌及其应用 |
US10961500B1 (en) | 2019-04-23 | 2021-03-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cell culture medium for eukaryotic cells |
WO2021092047A1 (en) * | 2019-11-04 | 2021-05-14 | Rubius Therapeutics, Inc. | Methods of generating enucleated erythroid cells using taurine or hypotaurine |
CN110862972B (zh) * | 2019-11-07 | 2020-10-30 | 衡阳师范学院 | 一种犬腺病毒ⅰ型无血清培养方法 |
MX2021014863A (es) | 2019-12-06 | 2022-09-28 | Regeneron Pharma | Composiciones de proteina anti-vegf y metodos para producir la misma. |
CN113005082B (zh) * | 2019-12-20 | 2023-08-18 | 苏州依科赛生物科技股份有限公司 | 一种t细胞无血清培养基及其应用 |
CN113025590B (zh) * | 2019-12-24 | 2022-08-09 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种提高环糊精葡萄糖基转移酶分泌表达的优化方法及其应用 |
EP4281542A1 (en) * | 2021-01-20 | 2023-11-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of improving protein titer in cell culture |
KR102296986B1 (ko) * | 2021-01-21 | 2021-08-31 | 정덕수 | 우태아혈청 성분의 유해함을 극복하기 위한 화학적으로 정의된 줄기세포배양액 개발 |
CN113480652B (zh) * | 2021-07-30 | 2023-04-07 | 成都景泽生物制药有限公司 | 一种重组cho细胞发酵培养生产重组egfr抗体活性分子的方法 |
WO2023167857A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cell culture methods for antibody production |
CN115029313B (zh) * | 2022-08-12 | 2022-11-01 | 依科赛生物科技(太仓)有限公司 | 一种用于t细胞培养基的氨基酸组合物 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002517235A (ja) | 1998-06-08 | 2002-06-18 | ジェネスパン コーポレイション | 安定化一過性遺伝子発現 |
CN101603026A (zh) | 2009-06-19 | 2009-12-16 | 华东理工大学 | 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基 |
US20140273095A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Serum-Free Cell Culture Medium |
JP2015006209A (ja) | 2006-01-04 | 2015-01-15 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | 無オリゴペプチド細胞培地 |
JP2015027265A (ja) | 2013-07-30 | 2015-02-12 | ダイソー株式会社 | 細胞培養用培地 |
WO2015063180A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Antibody composition |
Family Cites Families (202)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4072565A (en) | 1974-11-04 | 1978-02-07 | The Dow Chemical Company | Production of viruses in tissue culture without use of serum |
US3883511A (en) | 1974-03-07 | 1975-05-13 | Rit Rech Ind Therapeut | New 6-aminopenicillanic acid derivative |
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4419446A (en) | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
NZ201705A (en) | 1981-08-31 | 1986-03-14 | Genentech Inc | Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast |
EP0082974B1 (en) | 1981-12-24 | 1986-05-14 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Method for the cultivation of normal diploid cells and cultivation medium used therefor |
US4601978A (en) | 1982-11-24 | 1986-07-22 | The Regents Of The University Of California | Mammalian metallothionein promoter system |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
FR2543158B1 (fr) | 1983-03-24 | 1985-11-15 | Inst Nat Sante Rech Med | Milieu de culture de cellules animales sans serum, sans hormones et sans facteurs de croissance et procedes de culture primaire et d'obtention de lignees cellulaires utilisant ce milieu |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
US4965199A (en) | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
EP0308936B1 (en) | 1987-09-23 | 1994-07-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells |
DE3801236A1 (de) | 1988-01-18 | 1989-07-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pentosansulfat-medium |
ATE135397T1 (de) | 1988-09-23 | 1996-03-15 | Cetus Oncology Corp | Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte |
US6048728A (en) | 1988-09-23 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
EP0368684B2 (en) | 1988-11-11 | 2004-09-29 | Medical Research Council | Cloning immunoglobulin variable domain sequences. |
US5529920A (en) | 1988-12-14 | 1996-06-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Human liver epithelial cell line and culture media therefor |
JPH03504330A (ja) | 1988-12-14 | 1991-09-26 | アメリカ合衆国 | ヒト肝上皮細胞系のための細胞培地 |
FR2646437B1 (fr) | 1989-04-28 | 1991-08-30 | Transgene Sa | Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant |
EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
EP0739904A1 (en) | 1989-06-29 | 1996-10-30 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
EP1132471A3 (de) | 1989-09-12 | 2001-11-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | TNF-bindende Proteine |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
JP2897043B2 (ja) * | 1989-12-21 | 1999-05-31 | 東ソー株式会社 | 完全合成培地 |
ATE356869T1 (de) | 1990-01-12 | 2007-04-15 | Amgen Fremont Inc | Bildung von xenogenen antikörpern |
JP3230091B2 (ja) | 1990-06-25 | 2001-11-19 | ウェルファイド株式会社 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
EP0571390B1 (en) | 1990-11-23 | 2000-03-08 | Peptech Limited | The delay, prevention and/or reversal of cell senescence |
ES2113940T3 (es) | 1990-12-03 | 1998-05-16 | Genentech Inc | Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas. |
US5571894A (en) | 1991-02-05 | 1996-11-05 | Ciba-Geigy Corporation | Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor |
EP0586505A1 (en) | 1991-05-14 | 1994-03-16 | Repligen Corporation | Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection |
US7018809B1 (en) | 1991-09-19 | 2006-03-28 | Genentech, Inc. | Expression of functional antibody fragments |
WO1993006213A1 (en) | 1991-09-23 | 1993-04-01 | Medical Research Council | Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach |
US5587458A (en) | 1991-10-07 | 1996-12-24 | Aronex Pharmaceuticals, Inc. | Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof |
WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
US5667988A (en) | 1992-01-27 | 1997-09-16 | The Scripps Research Institute | Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains |
DE69334255D1 (de) | 1992-02-06 | 2009-02-12 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür |
EP0631623A4 (en) | 1992-03-04 | 1996-09-25 | Synaptic Pharma Corp | DNA CODING FOR TAURINE AND GABA TRANSPORTERS AND THEIR USE. |
JPH07102147B2 (ja) | 1992-03-16 | 1995-11-08 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
WO1994004690A1 (en) | 1992-08-17 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Bispecific immunoadhesins |
EP1005870B1 (en) | 1992-11-13 | 2009-01-21 | Biogen Idec Inc. | Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
US5426699A (en) | 1993-10-25 | 1995-06-20 | Antec Corporation | Method and apparatus for digitizing a scrambled analog video signal |
EP0666312A1 (en) | 1994-02-08 | 1995-08-09 | Wolfgang A. Renner | Process for the improvement of mammalian cell growth |
US5856179A (en) | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
US5641870A (en) | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
AU5632296A (en) | 1995-04-27 | 1996-11-18 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
WO1996034096A1 (en) | 1995-04-28 | 1996-10-31 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5705364A (en) | 1995-06-06 | 1998-01-06 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process |
US6656466B1 (en) | 1995-06-06 | 2003-12-02 | Genetech, Inc. | Human tumor necrosis factor—immunoglobulin(TNFR1-IgG1) chimera composition |
DE19628895A1 (de) | 1995-07-17 | 1997-01-23 | Fraunhofer Ges Forschung | Metallhaltige Ribonukleotidpolypeptide |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
JP4306813B2 (ja) | 1995-09-19 | 2009-08-05 | アスビオファーマ株式会社 | 動物細胞の新規培養方法 |
US6043092A (en) | 1996-03-18 | 2000-03-28 | University Of Pittsburgh | Cell culture media for mammalian cells |
WO1998024893A2 (en) | 1996-12-03 | 1998-06-11 | Abgenix, Inc. | TRANSGENIC MAMMALS HAVING HUMAN IG LOCI INCLUDING PLURAL VH AND Vλ REGIONS AND ANTIBODIES PRODUCED THEREFROM |
US20080318254A9 (en) | 1997-03-10 | 2008-12-25 | The Regents Of The University Of California | PSCA antibodies and hybridomas producing them |
US20020012991A1 (en) | 1997-04-07 | 2002-01-31 | Florence Chua Nee Ho Kit Fong | Cell culture media for enhanced protein production |
US20020173629A1 (en) | 1997-05-05 | 2002-11-21 | Aya Jakobovits | Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor |
US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
AU7984498A (en) | 1997-06-25 | 1999-01-04 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Serum-free cell growth medium |
US6610833B1 (en) | 1997-11-24 | 2003-08-26 | The Institute For Human Genetics And Biochemistry | Monoclonal human natural antibodies |
AU2455199A (en) * | 1998-01-12 | 1999-07-26 | Betagene, Inc. | Compositions and methods for regulated secretion from neuroendocrine cell lines |
US6528286B1 (en) | 1998-05-29 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Mammalian cell culture process for producing glycoproteins |
WO2000057891A1 (en) | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Trustees Of Boston University | Compositions and methods for producing platelets and/or proplatelets from megakaryocytes |
AU754808B2 (en) | 1999-03-30 | 2002-11-28 | Amgen Fremont Inc. | Method for preparing Monoclonal Antibody |
AT409379B (de) | 1999-06-02 | 2002-07-25 | Baxter Ag | Medium zur protein- und serumfreien kultivierung von zellen |
ES2237429T3 (es) | 1999-06-08 | 2005-08-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Polipeptidos quimericos modificados con propiedades farmacocineticas mejoradas. |
US7087411B2 (en) | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
CN1114619C (zh) | 1999-06-25 | 2003-07-16 | 中国科学院上海细胞生物学研究所 | 小鼠杂交瘤株Hepama-1分泌的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法 |
WO2001025454A2 (en) | 1999-10-04 | 2001-04-12 | Medicago Inc. | Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen |
US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
US7105348B2 (en) | 2000-10-31 | 2006-09-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
RU2192884C2 (ru) | 2000-11-09 | 2002-11-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН | Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета |
US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
ATE325865T1 (de) | 2001-01-16 | 2006-06-15 | Regeneron Pharma | Isolierung von sezernierte proteine exprimierenden zellen |
US20090137416A1 (en) | 2001-01-16 | 2009-05-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Isolating Cells Expressing Secreted Proteins |
JP2005519580A (ja) | 2001-05-16 | 2005-07-07 | アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イエシバ ユニバーシティ | 非ヒト動物由来のヒト抗肺炎球菌抗体 |
CA2447791A1 (en) | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Neslihan Delacruz | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
SI1425389T1 (sl) | 2001-08-23 | 2012-02-29 | Genmab As | Humana protitelesa, specifična za interlevkin 15 (IL-15) |
EP1321515A1 (en) | 2001-12-21 | 2003-06-25 | Ingenium Pharmaceuticals AG | Method of culturing cells |
CN1180080C (zh) | 2002-01-18 | 2004-12-15 | 中国科学院上海细胞生物学研究所 | 一种改进的肝癌鼠源单克隆抗体的制备方法 |
US6927004B2 (en) | 2002-03-08 | 2005-08-09 | Asml Netherlands B.V. | Mask for use in lithography, method of making a mask, lithographic apparatus, and device manufacturing method |
US20030190710A1 (en) * | 2002-03-28 | 2003-10-09 | Devries Ruth L. | Control of glycoforms in IgG |
US8673589B2 (en) | 2002-05-29 | 2014-03-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Inducible eukaryotic expression system |
AU2003237259B2 (en) | 2002-05-29 | 2008-01-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Inducible eukaryotic expression system |
US7371922B2 (en) | 2002-07-31 | 2008-05-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Nuclear transfer with porcine embryonic stem cells |
US6924124B1 (en) | 2002-08-23 | 2005-08-02 | Immunex Corporation | Feeding strategies for cell culture |
JP2007525410A (ja) | 2003-01-17 | 2007-09-06 | ザ リサーチ ファンデーション オブ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク | 膵臓癌に関連する抗原、それらに対する抗体、及び診断方法及び処置方法 |
WO2004069172A2 (en) | 2003-01-30 | 2004-08-19 | The Government of the United States of America as represented by the Department of Veterans Affairs | Multilineage-inducible cells and uses thereof |
ATE472597T2 (de) | 2003-05-15 | 2010-07-15 | Wyeth Llc | Kontrollierte glukosezufuhr für tierzellkultur |
JP4999158B2 (ja) | 2003-05-21 | 2012-08-15 | メダレツクス・インコーポレーテツド | 炭疽菌(bachillusanthracis)の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体 |
US7303694B2 (en) | 2003-07-17 | 2007-12-04 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Liquid crystals with reduced toxicity and applications thereof |
EP1664283A4 (en) | 2003-09-18 | 2007-12-26 | Raven Biotechnologies Inc | CELL CULTURE MEDIA |
PL1767546T3 (pl) | 2004-06-08 | 2012-07-31 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd | Hamujące angiogenezę białka chimeryczne i ich zastosowanie |
US7294484B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-11-13 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
US20060094104A1 (en) | 2004-10-29 | 2006-05-04 | Leopold Grillberger | Animal protein-free media for cultivation of cells |
CA2585547A1 (en) * | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Centocor, Inc. | Chemically defined media compositions |
US8273553B2 (en) | 2004-11-02 | 2012-09-25 | Ares Trading S.A. | Production of growth hormone in serum-free cell culture medium for mammalian cells |
SG170006A1 (en) | 2005-02-18 | 2011-04-29 | Medarex Inc | Monoclonal antibodies against cd30 lacking fucosyl residues |
KR20080005563A (ko) | 2005-04-21 | 2008-01-14 | 글렌 에이. 골드스타인 | 불임과 연관된 산화성 스트레스의 치료를 위한n-아세틸시스테인 아미드(nac 아미드) |
JP2008538767A (ja) | 2005-04-22 | 2008-11-06 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | Cd20抗体による認知症又はアルツハイマー病の治療方法 |
PE20070796A1 (es) | 2005-10-24 | 2007-08-15 | Wyeth Corp | Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia |
DE602007008627D1 (de) | 2006-02-14 | 2010-10-07 | Genetix Ltd | Zellkulturmedium |
US8216575B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-10 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains |
ATE537190T1 (de) | 2006-06-02 | 2011-12-15 | Regeneron Pharma | Hochaffine antikörper gegen den humanen il-6- rezeptor |
MX2008015645A (es) | 2006-06-09 | 2009-02-06 | Anthrogenesis Corp | Nicho placentario y uso de este para cultivar celulas primordiales. |
US7534595B2 (en) * | 2006-06-12 | 2009-05-19 | Biomarin Pharmaceutical Inc. | Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof |
US7608693B2 (en) | 2006-10-02 | 2009-10-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High affinity human antibodies to human IL-4 receptor |
TW200827445A (en) | 2006-11-08 | 2008-07-01 | Wyeth Corp | Rationally designed media for cell culture |
TW200902708A (en) | 2007-04-23 | 2009-01-16 | Wyeth Corp | Methods of protein production using anti-senescence compounds |
ES2522615T3 (es) | 2007-06-04 | 2014-11-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Regiones de expresión y estabilidad potenciadas |
US20100221823A1 (en) | 2007-06-11 | 2010-09-02 | Amgen Inc. | Method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production |
AU2008282152B2 (en) | 2007-07-31 | 2013-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Human antibodies to human CD20 and method of using thereof |
AU2008284753B2 (en) | 2007-08-07 | 2014-01-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of producing heterogeneous protein |
US8309088B2 (en) | 2007-08-10 | 2012-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF |
CN100482786C (zh) | 2007-12-28 | 2009-04-29 | 天津百若克医药生物技术有限责任公司 | 一种人胚肾293细胞扩增无蛋白培养基 |
CN102317440B (zh) | 2008-01-09 | 2014-12-03 | 塞尔卡有限公司 | 改进的培养基添加剂及其应用方法 |
JP2012503487A (ja) | 2008-09-26 | 2012-02-09 | シェーリング コーポレイション | 高力価抗体の製造 |
JO3672B1 (ar) | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
TWI513818B (zh) | 2009-06-02 | 2015-12-21 | Regeneron Pharma | 岩藻糖基化(fucosylation)-缺乏之細胞 |
KR102010827B1 (ko) | 2009-06-26 | 2019-08-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
JP2012533548A (ja) | 2009-07-14 | 2012-12-27 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 組成物における黄色形成および過酸化物形成を阻害する方法 |
EA023193B1 (ru) | 2009-07-31 | 2016-05-31 | Бакстер Интернэшнл Инк. | Среда для культивирования клеток для экспрессии белков adamts |
CN104059955A (zh) | 2009-08-11 | 2014-09-24 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 在无谷氨酰胺的细胞培养基中的蛋白质生产 |
ES2776980T3 (es) | 2009-12-23 | 2020-08-03 | Merck Sharp & Dohme | Línea celular 3M |
JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
JO3340B1 (ar) | 2010-05-26 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري |
PT2591094T (pt) | 2010-07-08 | 2018-11-20 | Baxalta Inc | Método de produção de adamts13 recombinante em cultura celular |
JOP20190250A1 (ar) | 2010-07-14 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | صيغ مستقرة تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد عامل نمو الأعصاب |
KR20130101034A (ko) | 2010-08-31 | 2013-09-12 | 프리슬랜드 브랜즈 비브이 | 진핵 세포를 위한 배양 배지 |
AR083044A1 (es) | 2010-09-27 | 2013-01-30 | Regeneron Pharma | Anticuerpos anti-cd48 y usos de los mismos |
EA034617B1 (ru) | 2010-10-06 | 2020-02-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Дозированная форма жидкой фармацевтической композиции, содержащей антитела к рецептору интерлейкина-4 (il-4r) |
KR20130118899A (ko) | 2010-11-05 | 2013-10-30 | 애브비 인코포레이티드 | 세포배양에서의 화학적으로 규명된 배지의 개발을 위한 효율적이고 효과적인 보충물 스크리닝 |
JO3756B1 (ar) | 2010-11-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون |
CN102093978A (zh) | 2010-12-17 | 2011-06-15 | 上海市农业科学院 | 猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液 |
KR101903208B1 (ko) | 2010-12-28 | 2018-10-01 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 동물 세포의 배양 방법 |
US20120171161A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Sascha Abramson | Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof |
JO3412B1 (ar) | 2011-06-17 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة ل angptl3 واستخداماتها |
AU2012328524B2 (en) * | 2011-10-28 | 2017-05-18 | Excelse Bio, Inc. | Protein formulations containing amino acids |
PT2780368T (pt) | 2011-11-14 | 2018-03-22 | Regeneron Pharma | Composições e métodos para aumentar a massa muscular e a força muscular antagonizando especificamente gdf8 e/ou activina a |
BR112014017882A2 (pt) | 2012-01-23 | 2017-06-27 | Regeneron Pharma | formulações estabilizadas contendo anticorpos anti-ang-2 |
WO2013120497A1 (en) | 2012-02-15 | 2013-08-22 | Curevac Gmbh | Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein |
JP6090735B2 (ja) | 2012-03-02 | 2017-03-08 | 国立大学法人山口大学 | 消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地、及びそれを用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法 |
US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
WO2013158279A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Protein purification methods to reduce acidic species |
JP5940147B2 (ja) | 2012-04-25 | 2016-06-29 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 心筋指向性細胞を含む細胞製剤 |
JO3820B1 (ar) | 2012-05-03 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية لـ fel d1وطرق لاستخدامها |
WO2013184809A1 (en) | 2012-06-05 | 2013-12-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for the rapid production of retinal pigmented epithelial cells from pluripotent cells |
EP3103861B1 (en) | 2012-06-21 | 2020-09-30 | Baxalta GmbH | Virus filtration of cell culture media |
TW201843172A (zh) | 2012-06-25 | 2018-12-16 | 美商再生元醫藥公司 | 抗-egfr抗體及其用途 |
AU2013298521A1 (en) | 2012-08-02 | 2015-02-26 | Sanofi | Article of manufacture comprising aflibercept or ziv-aflibercept |
EP2882778B1 (en) | 2012-08-13 | 2018-04-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-pcsk9 antibodies with ph-dependent binding characteristics |
AU2013305063A1 (en) | 2012-08-20 | 2015-03-19 | Schreder | Method of and system for isolating LED luminaires from electrical surges |
JOP20200236A1 (ar) | 2012-09-21 | 2017-06-16 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها |
JP6463634B2 (ja) * | 2012-10-10 | 2019-02-06 | 中外製薬株式会社 | 改変宿主細胞の樹立方法 |
JO3405B1 (ar) | 2013-01-09 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد مستقبل عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية - بيتا واستخداماتها |
US9173380B2 (en) | 2013-02-18 | 2015-11-03 | Garmin Switzerland Gmbh | Animal indicator apparatus |
JO3532B1 (ar) | 2013-03-13 | 2020-07-05 | Regeneron Pharma | الأجسام المضادة لمضاد انترلوكين-33 واستعمالاتها |
US9217168B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-12-22 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods of cell culture |
TWI659968B (zh) | 2013-03-14 | 2019-05-21 | 再生元醫藥公司 | 針對呼吸道融合病毒f蛋白質的人類抗體及其使用方法 |
JP6404314B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-10-10 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | Il−33拮抗薬とその使用法 |
US20160237400A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-08-18 | The Jackson Laboratory | Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof |
BR112015021993A8 (pt) * | 2013-03-15 | 2019-12-03 | Genentech Inc | polipeptídeo, métodos para sua produção, métodos para cultivo de uma célula, composição farmacêutica, kit, e meio de cultura celular |
CN105324487B (zh) | 2013-05-29 | 2020-01-17 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 唾液酸化的定量控制 |
TWI641620B (zh) | 2013-08-21 | 2018-11-21 | 再生元醫藥公司 | 抗-prlr抗體及其用途 |
CN105722500B (zh) * | 2013-09-11 | 2019-08-30 | 伊戈尔生物药品股份有限公司 | 包含离子性液体的液体蛋白质制剂 |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
EA202191909A1 (ru) | 2014-01-13 | 2022-01-31 | Эмджен Инк. | Регулирование метаболизма орнитина для управления содержанием высокоманнозных гликоформ рекомбинантных белков |
TWI681969B (zh) | 2014-01-23 | 2020-01-11 | 美商再生元醫藥公司 | 針對pd-1的人類抗體 |
TWI680138B (zh) | 2014-01-23 | 2019-12-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗pd-l1之人類抗體 |
RS59077B1 (sr) | 2014-03-11 | 2019-09-30 | Regeneron Pharma | Anti-egfrviii antitela i njihova primena |
TWI701042B (zh) | 2014-03-19 | 2020-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物 |
US9795121B2 (en) | 2014-05-05 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized C3 animals |
JO3701B1 (ar) | 2014-05-23 | 2021-01-31 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي |
US20170107553A1 (en) | 2014-06-03 | 2017-04-20 | Lupin Limited | Cell culture process for producing a protein |
JP2017533695A (ja) | 2014-09-16 | 2017-11-16 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | 抗グルカゴン抗体およびその使用 |
TWI710573B (zh) | 2015-01-26 | 2020-11-21 | 美商再生元醫藥公司 | 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體 |
CA3208857A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Cell culture medium |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
HRP20220133T8 (hr) | 2015-09-23 | 2022-05-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Optimizirana anti-cd3 bispecifična antitijela i njihove upotrebe |
KR101936049B1 (ko) | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
TW202140776A (zh) | 2016-04-26 | 2021-11-01 | 美商美國泰福生技股份有限公司 | 細胞培養基 |
KR20210084695A (ko) | 2017-07-06 | 2021-07-07 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 당단백질을 만들기 위한 세포 배양 과정 |
-
2016
- 2016-08-02 TW TW112107035A patent/TW202330904A/zh unknown
- 2016-08-02 TW TW111142922A patent/TW202340452A/zh unknown
- 2016-08-02 TW TW105124386A patent/TWI797060B/zh active
- 2016-08-03 AU AU2016301305A patent/AU2016301305B2/en active Active
- 2016-08-03 MY MYPI2017704726A patent/MY192561A/en unknown
- 2016-08-03 BR BR112018002214-4A patent/BR112018002214A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2016-08-03 CN CN201680041992.XA patent/CN107922920B/zh active Active
- 2016-08-03 KR KR1020187002832A patent/KR20180032581A/ko not_active Application Discontinuation
- 2016-08-03 US US15/749,037 patent/US11312936B2/en active Active
- 2016-08-03 IL IL298775A patent/IL298775A/en unknown
- 2016-08-03 EA EA201890137A patent/EA201890137A1/ru unknown
- 2016-08-03 CA CA2989178A patent/CA2989178A1/en active Pending
- 2016-08-03 CA CA3236085A patent/CA3236085A1/en active Pending
- 2016-08-03 CA CA3236082A patent/CA3236082A1/en active Pending
- 2016-08-03 MX MX2018001531A patent/MX2018001531A/es unknown
- 2016-08-03 CN CN202210303904.6A patent/CN114854668A/zh active Pending
- 2016-08-03 WO PCT/US2016/045403 patent/WO2017024062A1/en active Application Filing
- 2016-08-03 JP JP2018503655A patent/JP2018521664A/ja not_active Withdrawn
- 2016-08-03 EP EP16753768.7A patent/EP3331987A1/en active Pending
- 2016-08-04 AR ARP160102388A patent/AR105602A1/es unknown
-
2017
- 2017-12-24 IL IL256525A patent/IL256525B2/en unknown
-
2018
- 2018-02-02 MX MX2022003477A patent/MX2022003477A/es unknown
- 2018-06-15 HK HK18107802.3A patent/HK1248279A1/zh unknown
- 2018-08-02 HK HK18109999.2A patent/HK1250740A1/zh unknown
-
2020
- 2020-01-14 US US16/742,670 patent/US10927342B2/en active Active
-
2021
- 2021-05-12 JP JP2021080955A patent/JP7198868B2/ja active Active
-
2022
- 2022-03-29 US US17/707,017 patent/US20220235318A1/en active Pending
- 2022-08-29 JP JP2022135752A patent/JP2022162157A/ja active Pending
- 2022-12-19 AU AU2022291430A patent/AU2022291430A1/en active Pending
-
2023
- 2023-09-22 US US18/371,959 patent/US20240018467A1/en active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002517235A (ja) | 1998-06-08 | 2002-06-18 | ジェネスパン コーポレイション | 安定化一過性遺伝子発現 |
JP2015006209A (ja) | 2006-01-04 | 2015-01-15 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | 無オリゴペプチド細胞培地 |
CN101603026A (zh) | 2009-06-19 | 2009-12-16 | 华东理工大学 | 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基 |
US20140273095A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Serum-Free Cell Culture Medium |
JP2015027265A (ja) | 2013-07-30 | 2015-02-12 | ダイソー株式会社 | 細胞培養用培地 |
WO2015063180A1 (en) | 2013-10-29 | 2015-05-07 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Antibody composition |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Cytotechnology, 2005, Vol.47, pp.37-49 |
Enzyme Microb. Technol., 2006, Vol.39, pp.426-433 |
Methods Mol. Biol., 2014, Vol.1104, pp.105-116 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7198868B2 (ja) | タウリン補足細胞培養培地およびその使用 | |
US11970724B2 (en) | Serum-free cell culture medium | |
JP2024503408A (ja) | 細胞培養におけるタンパク質力価の改善方法 | |
EA041694B1 (ru) | Среда для культивирования клеток с добавлением таурина и способы применения | |
EA045169B1 (ru) | Не содержащая сыворотки среда для культивирования клеток |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210512 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210608 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220512 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220527 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220829 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221206 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7198868 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |