CN115029313B

CN115029313B - 一种用于t细胞培养基的氨基酸组合物

Info

Publication number: CN115029313B
Application number: CN202210970030.XA
Authority: CN
Inventors: 马士棋; 林家会; 程成; 陈旭; 陈刚
Original assignee: Excell Biology Taicang Co ltd
Current assignee: Suzhou Ecosai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-12
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2022-11-01
Anticipated expiration: 2042-08-12
Also published as: CN115029313A

Abstract

本发明公开了一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物，所述氨基酸组合物包括：L‑半胱氨酸、L‑组氨酸、L‑异亮氨酸、L‑丙氨酸、L‑丝氨酸和L‑精氨酸。本发明的优点在于：1）在不影响细胞生长、扩增的情况下，提高年轻化T细胞（Tn+Tcm）比例30%以上；2）氨基酸为细胞培养常用营养物质，该组合化学成分明确，安全无害，简单方便，符合临床应用要求。

Description

一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物。

背景技术

T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助其它淋巴细胞发挥功能、对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在过继性T细胞疗法中，T细胞经过体外富集、活化、扩增，回输体内可用于治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等。

T细胞来源于骨髓中的淋巴样祖细胞，在胸腺中分化、发育、成熟，成熟T细胞进入血液，转移至外周淋巴组织（如脾脏、淋巴结等），在接受刺激后，再分化为效应性或记忆性T细胞，参与适应性免疫。初始T细胞（naiveT细胞，Tn）是效应细胞和记忆T细胞亚群的前体。初始T细胞胞体小，细胞质少，表达CD45RA、CCR7等，初始T细胞不能介导效应免疫反应，在受抗原刺激后，初始T细胞增殖并开始分化，逐级分化为中央记忆T细胞（或称中枢记忆T细胞，Tcm）、效应记忆T细胞（Tem）、效应T细胞（Tef），在分化过程中，T细胞逐渐获得对细胞因子、组织归巢受体、抗凋亡分子的响应能力，逐渐获得效应功能，同时也逐渐丢失了淋巴结归巢受体、增殖能力、IL-2产生、自我更新和存活的能力。

在过继性T细胞疗法中，回输给人体的Tn+Tcm细胞比例越多，则细胞越年轻化，所回输的细胞在人体中存活时间越长，治疗效果也越好。因此目前的临床研究中，Tn+Tcm比例是细胞质量的重要指标，已有证据表明Tn+Tcm比例与对肿瘤细胞的杀伤性有正相关性，所回输的年轻化细胞比例越高，对肿瘤细胞的杀伤比例越高。现有的商业化T细胞无血清培养基大多不考虑培养终点的T细胞群体中的年轻化细胞（Tn+Tcm）比例，培养基在促进T细胞快速扩增的同时，反而可能导致T细胞分化加剧，年轻化细胞比例减少，影响T细胞治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物，所述氨基酸组合物包括：L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-精氨酸；

所述氨基酸组合物中L-半胱氨酸的终浓度为1~3g/L，L-组氨酸的终浓度为1~3g/L，L-异亮氨酸的终浓度为2~6g/L，L-丙氨酸的终浓度为1~3g/L，L-丝氨酸的终浓度为2~6g/L，L-精氨酸的终浓度为2~6g/L；

所述氨基酸组合物以1：20~100的比例加入T细胞培养基中。

优选的，所述氨基酸组合物中L-半胱氨酸的终浓度为2g/L，L-组氨酸的终浓度为2g/L，L-异亮氨酸的终浓度为4g/L，L-丙氨酸的终浓度为2g/L，L-丝氨酸的终浓度为4g/L，L-精氨酸的终浓度为4g/L。

优选的，所述氨基酸组合物以1：50的比例加入T细胞培养基中。

优选的，所述T细胞培养基包括：X-Vivo-15T细胞无血清培养基或者KBM581T细胞无血清培养基。

添加了本发明的用于T细胞培养基的氨基酸组合物的培养基获得的T细胞群体中年轻化细胞（Tn+Tcm）比例与所添加的氨基酸类型及浓度相关，如果添加其他类型的氨基酸组合，则无提高年轻化细胞比例的效果。

与现有技术相比，本发明的原理及其所达到的有益效果是：

发明人发现，目前已知的26种氨基酸中，特定的6种氨基酸组合可以增加年轻化T细胞比例，而其他氨基酸组合则无此效果。因此，本发明提供了一种用于T细胞培养基的氨基酸组合物，可以显著提高年轻化细胞（Tn+Tcm）比例。

本发明的优点在于：1）在不影响细胞生长、扩增的情况下，提高年轻化T细胞（Tn+Tcm）比例30%以上；2）氨基酸为细胞培养常用营养物质，该组合化学成分明确，安全无害，简单方便，符合临床应用要求。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明实施例1各组培养基细胞活率示意图；

图2是本发明实施例1各组培养基细胞扩增倍数示意图；

图3是本发明实施例1各组培养基的各类T细胞所占比例示意图；

图4是本发明实施例2各组培养基细胞活率示意图；

图5是本发明实施例2各组培养基细胞扩增倍数示意图；

图6是本发明实施例2各组培养基的各类T细胞所占比例示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的氨基酸组合物的配置过程如下：

在PBS溶液中，按照需要的浓度加入L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-精氨酸，最后用0.22µm孔径的SFCA材质过滤器过滤。

PBS为细胞培养常用缓冲溶液，配制方法为：磷酸二氢钾(KH₂PO₄) 0.27g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄) 1.42g，氯化钠(NaCl) 8g，氯化钾(KCl) 0.2g，溶于水，调节pH=7.4，定容1L体积。

将配制好的氨基酸组合物以1：20、1：50或1：100比例加入到商业化T细胞无血清培养基中，如X-Vivo-15T细胞无血清培养基、KBM581T细胞无血清培养基或其它本领域的专业人员认可的T细胞无血清培养基，再进行T细胞培养。例如，氨基酸组合物的添加比例为1：50，即1L培养基中添加20mL氨基酸组合物。

T细胞培养至第9天，离心收集细胞，并进行对细胞表现标志物CCR7和CD45RA进行流式细胞仪检测，所得CCR7+CD45RA+代表Tn细胞，CCR7+CD45RA-代表Tcm细胞，CCR7-CD45RA-代表Tem细胞，CCR7-CD45RA+代表Tef细胞。优选的氨基酸配制浓度以及组合物添加比例可将年轻化细胞（Tn+Tcm）比例提高30%以上。

实施例中材料来源为：

L-半胱氨酸（Sigma，货号C7352），L-组氨酸（Sigma，货号H6034），L-异亮氨酸（Sigma，货号I7403），L-丙氨酸（Sigma，货号A7469），L-丝氨酸（Sigma，货号S4311），L-精氨酸（Sigma，货号A8094）。所述商业化T细胞无血清培养基为X-Vivo-15T细胞无血清培养基（龙沙，货号04-418Q）、KBM581T细胞无血清培养基（康宁，货号88-551-CM）、PBMC细胞（妙顺生物，货号PB010C）。

实施例中其他所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：

X-Vivo-15T细胞无血清培养基作为T细胞培养基。

使用以1：50比例添加了各氨基酸组合物的X-Vivo-15T细胞无血清培养基（或不添加氨基酸组合物的对照）体外培养人外周血单核细胞（PBMC）中T细胞。

各氨基酸组合物如下：

第一组为本发明低浓度氨基酸组合：L-半胱氨酸1g/L，L-组氨酸1g/L，L-异亮氨酸2g/L，L-丙氨酸1g/L，L-丝氨酸2g/L，L-精氨酸2g/L，溶于PBS，过滤后使用。

第二组为本发明优选氨基酸组合浓度：L-半胱氨酸2g/L，L-组氨酸2g/L，L-异亮氨酸4g/L，L-丙氨酸2g/L，L-丝氨酸4g/L，L-精氨酸4g/L，溶于PBS，过滤后使用。

第三组为本发明高浓度氨基酸组合：L-半胱氨酸3g/L，L-组氨酸3g/L，L-异亮氨酸6g/L，L-丙氨酸3g/L，L-丝氨酸6g/L，L-精氨酸6g/L，溶于PBS，过滤后使用。

第四组为其他氨基酸组合一：L-赖氨酸2g/L，L-苏氨酸2g/L，L-苯丙氨酸4g/L，L-天冬氨酸2g/L，L-脯氨酸4g/L，L-谷氨酸4g/L，溶于PBS，过滤后使用。

第五组为其他氨基酸组合二：L-色氨酸2g/L，L-甲硫氨酸2g/L，甘氨酸4g/L，L-酪氨酸2g/L，L-亮氨酸4g/L，L-天冬酰胺4g/L，溶于PBS，过滤后使用。（发明人在研究过程中，测试过多种非本发明提供的氨基酸组合，均无提高年轻化细胞比例的效果，实施例1仅以第四组、第五组两种组合为例）。

第六组为不添加氨基酸组合物的对照。

培养过程为：将PBMC细胞悬液加入准备好的6孔板培养皿中，每种培养基接种3个复孔，接种密度0.7×10⁶/mL，添加终浓度10µg/mL的CD3抗体，终浓度5µg/mL的CD28抗体，及终浓度100IU/mL的IL2，放入37℃，5%二氧化碳培养箱内培养。分别于培养的第3天（D3）、第5天（D5）、第7天（D7）、第9天（D9）观察细胞增殖情况并对细胞进行计数、补液，获得细胞增殖曲线和细胞活率的数据，在第9天使用CCR7、CD45RA抗体对细胞进行流式分析。

细胞活率如图1所示，细胞扩增倍数如图2所示，细胞比例如图3所示。各氨基酸组合物的添加对细胞活率影响不大，氨基酸组合物的添加使细胞扩增倍数略有提高。不添加氨基酸组合物的对照所得平均第9天年轻化细胞（Tn+Tcm）比例为30%，而使用本发明优选氨基酸组合浓度所得平均第9天年轻化细胞比例为83%，相比于对照组提高了年轻化细胞比例50%以上，而使用本发明低浓度氨基酸组合与高浓度氨基酸组合所得的平均年轻化细胞比例分别为64%、72%，使用其他氨基酸组合一与其他氨基酸组合二所得的平均年轻化细胞比例分别为21%、24%，说明本发明的氨基酸组合物针对年轻化细胞比例的提升特异有效。

实施例2：

KBM581T细胞无血清培养基作为T细胞培养基。

使用以添加不同比例的本发明优选氨基酸组合浓度的KBM581T细胞无血清培养基（或不添加氨基酸组合物的对照、添加了其他氨基酸组合的对照）体外培养人外周血单核细胞（PBMC）中T细胞。

各氨基酸组合物以及添加比例如下：

第一组、第二组、第三组均为本发明优选氨基酸组合浓度：L-半胱氨酸2g/L，L-组氨酸2g/L，L-异亮氨酸4g/L，L-丙氨酸2g/L，L-丝氨酸4g/L，L-精氨酸4g/L，溶于PBS，过滤后使用。

第一组添加比例为1：20，即1L培养基中添加50mL氨基酸组合物。

第二组添加比例为1：50（本发明优选添加比例），即1L培养基中添加20mL氨基酸组合物。

第三组添加比例为1：100，即1L培养基中添加10mL氨基酸组合物。

第四组为其他氨基酸组合一：L-赖氨酸2g/L，L-苏氨酸2g/L，L-苯丙氨酸4g/L，L-天冬氨酸2g/L，L-脯氨酸4g/L，L-谷氨酸4g/L，溶于PBS，过滤后使用。添加比例为1：50，即1L培养基中添加20mL氨基酸组合物。

第五组为其他氨基酸组合二：L-色氨酸2g/L，L-甲硫氨酸2g/L，甘氨酸4g/L，L-酪氨酸2g/L，L-亮氨酸4g/L，L-天冬酰胺4g/L，溶于PBS，过滤后使用。添加比例为1：50，即1L培养基中添加20mL氨基酸组合物。（发明人在研究过程中，测试过多种非本发明提供的氨基酸组合，均无提高年轻化细胞比例的效果，实施例2仅以第四组、第五组两种组合为例）。

第六组为不添加氨基酸组合物的对照。

培养过程与实施例1一致。

细胞活率如图4所示，细胞扩增倍数如图5所示，细胞比例如图6所示。各氨基酸组合物的添加对细胞活率影响不大，氨基酸组合的添加使细胞扩增倍数略有提高。不添加氨基酸组合物的对照所得平均第9天年轻化细胞（Tn+Tcm）比例为17%，而使用本发明优选氨基酸组合浓度以及优选添加比例所得平均第9天年轻化细胞比例为58%，相比于对照组提高了年轻化细胞比例40%以上，而使用本发明优选氨基酸组合浓度以及1：20、1：100添加比例所得的平均年轻化细胞比例分别为51%、44%，使用其他氨基酸组合一与其他氨基酸组合二所得的平均年轻化细胞比例均为15%，说明本发明的氨基酸组合物针对年轻化细胞比例的提升特异有效。

尽管一种适用于培养γδT细胞的无血清培养基（专利号CN201410120087.6）专利公开了苯丙氨酸、丝氨酸、络氨酸等氨基酸，其应用与本申请相似。但是此专利与其他类似专利，均是在现有基础培养基（涵盖大部分氨基酸）的基础上添加特定物质，仅将氨基酸作为能源物质用于培养基中，且所有氨基酸一起使用，没有意识到不同种氨基酸对于T细胞年轻化或者其他亚型比例调控的特定作用，也没有将氨基酸分类测试相关作用的启示。

综上所述，本发明的氨基酸组合物添加入T细胞培养基，针对年轻化细胞（Tn+Tcm）比例的提升特异有效，同现有技术相比，其技术效果产生“量”的变化，超过人们预期的想象，对所述技术领域的技术人员来说，事先无法预测或者推理出来，产生了预料不到的技术效果。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种包含氨基酸组合物的T细胞培养基，其特征在于，所述氨基酸组合物由：L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-丝氨酸和L-精氨酸组成；

所述氨基酸组合物中L-半胱氨酸的浓度为1~3g/L，L-组氨酸的浓度为1~3g/L，L-异亮氨酸的浓度为2~6g/L，L-丙氨酸的浓度为1~3g/L，L-丝氨酸的浓度为2~6g/L，L-精氨酸的浓度为2~6g/L；

所述氨基酸组合物以1：20~100的体积比例加入T细胞培养基中。

2.根据权利要求1所述的一种包含氨基酸组合物的T细胞培养基，其特征在于：所述氨基酸组合物中L-半胱氨酸的浓度为2g/L，L-组氨酸的浓度为2g/L，L-异亮氨酸的浓度为4g/L，L-丙氨酸的浓度为2g/L，L-丝氨酸的浓度为4g/L，L-精氨酸的浓度为4g/L。

3.根据权利要求2所述的一种包含氨基酸组合物的T细胞培养基，其特征在于：所述氨基酸组合物以1：50的体积比例加入T细胞培养基中。

4.根据权利要求1所述的一种包含氨基酸组合物的T细胞培养基，其特征在于，所述T细胞培养基包括：X-Vivo-15T细胞无血清培养基或者KBM581T细胞无血清培养基。