CN110468103B - 一种在体外维持造血干细胞自我更新能力的细胞因子组合 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可以体外扩增小鼠造血干细胞(HSCs)的关键细胞因子组合，包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素‑12(IL‑12)，优化了无血清培养体系并分型纯化了HSCs细胞，成功实现了HSCs体外扩增后移植的高水平的重建，连续移植后更加突显出该因子组合对HSCs自我更新能力的维持和扩增后的重建优势。

Description

一种在体外维持造血干细胞自我更新能力的细胞因子组合

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及HSCs的体外扩增方法，尤其是在优化的无血清培养基上添加特定细胞因子后，体外培养小鼠HSCs一段时间后与一定比例的竞争细胞共同移植，结果显示明显的重建优势，从而证实了该因子组合对HSCs体外功能性扩增的作用。

背景技术

随着医疗技术的不断发展与进步，干细胞成为再生医学的“主力军”。造血干细胞(HSCs)作为目前研究最为透彻的成体干细胞类群之一，在临床上广泛应用于多种造血系统恶性疾病、自身免疫性疾病的治疗。随着HSCs移植策略和移植方案的不断更新和改进，特别是半倍体移植的实施解决了供体来源短缺的瓶颈问题后，临床移植效果取得了长足的进步。但是HSCs的体外特性的维持甚至数量扩增对于进一步改善预处理方案和减少预处理损伤、脐带血HSCs移植和HSCs基因治疗方面仍然具有重要的临床意义。因此如何在体外建立HSCs的培养和扩增体系也成为困扰基础研究和临床应用的世界性难题。

HSCs以其两个特性而被熟知，即自我更新和多向分化的能力，这两者之间的平衡维持着机体血液系统的稳态。研究发现体内稳态环境中，HSCs大部分是处于静息状态的，一旦HSCs被放置于体外环境中则即刻进入细胞周期而丢失干性，干性丢失将严重影响临床的治疗效果。现有的HSCs体外培养和扩增体系主要是以无血清培养基为基础、添加多种细胞因子和小分子化合物的“鸡尾酒”样培养体系，HSCs在大多数现有的培养体系中趋于快速分裂，而细胞的快速分裂往往伴随细胞干性的丢失。同时，随着单细胞技术的不断发展与应用，HSCs的异质性也随之凸显，这为实验结果的重复也带来了困难。

众所周知，HSCs静息状态的维持与其功能特性息息相关。而细胞因子在调节HSCs进入细胞周期进而分裂增殖过程中发挥着重要作用。研究发现IL-3，IL-6，IL-11，血小板生成素(TPO)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与干细胞因字(SCF)结合使用时可以使HSCs进入细胞周期。但是可以体外在维持HSCs干性的基础上实现扩增的最佳细胞因子组合并不清楚。

发明内容

本发明针对HSCs体外培养干性丢失的问题，筛选出了可以体外维持HSCs干性的细胞因子，进一步优化建立了一整套无血清培养体系，并对HSCs进行了进一步的纯化。这种方法明显提高了HSCs在连续移植的受体小鼠体内的重建比例，由于培养基中各种成分明确，操作简便，重复性高，细胞因子组合简单，为临床HSCs的体外自我更新能力的维持和数量扩增提供了新的思路。

本发明首先提供了一种在体外维持HSCs自我更新能力的细胞因子组合，包括干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、白介素-12(IL-12)，所述各细胞因子的浓度各自独立选自25-100ng/ml，优选为50ng/ml。

本发明还提供了一种在体外维持HSCs自我更新能力的培养体系，包括基础无血清培养体系以及上述细胞因子组合，所述基础无血清培养体系包括基础培养基F-12，胰岛素-转铁蛋白-硒-X(ITS-X)，β-巯基乙醇(β-Me)，L-谷氨酰胺(L-Glu)，非必需氨基酸(Non-essential amino acid，Non-eaa)，HEPES液，青霉素和/或链霉素(P和/或S)，重组人血清白蛋白(r-HSA)。

基础无血清培养体系中的各组成成分均为市售通用产品。其中，F-12由20种氨基酸、10种维生素、8种无机盐和8种其他成分按照一定比例组成；ITS-X是一种由胰岛素(I)、转铁蛋白(T)、亚硝酸钠(S)、乙醇胺组成的混合物；Non-eaa是一种由甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸7种非必需氨基酸组成的混合物质。优选地，所述ITS-X的浓度为100x，β-Me的浓度为0.0275-0.11mM，L-Glu的浓度为1-4mM，Non-eaa的浓度为0.05-0.2mM，HEPES的浓度为5-20mM，P和/或S的浓度为0.25-1.0mg/ml，r-HSA的浓度为0.25-1.0mg/ml。

所述HSCs可以为骨髓来源的全系HSCs细胞，也可以优选为骨髓来源的表型分选HSCs细胞，最优为骨髓来源的HSCs根据细胞的免疫表型分选获得的CD41-CD150+CD34-KSL。

本发明还提供了一种维持HSCs自我更新能力的培养方法，采用含有所述细胞因子组合的基础无血清培养体系(即采用上述在体外维持HSCs自我更新能力的培养体系)，对HSCs细胞进行培养，培养时间为七天，培养条件为37℃，二氧化碳浓度为5％。

本发明还提供了一种HSCs的移植重建方法，首先采用含有所述细胞因子组合的基础无血清培养体系对HSCs细胞进行培养，然后将培养后的HSCs细胞经至少一次移植到致死剂量照射的动物体内，一次移植时采用培养后的HSCs细胞与全骨髓细胞共同移植，一次移植之后的移植采用全骨髓细胞移植。

本发明的有益效果是：

本发明针对HSCs体外培养时因快速分化而难以实现干细胞扩增的问题，发现IL-12联合使用SCF和TPO可以使HSCs得以在快速分裂的基础上维持干性。方法简单，效果明显。

本发明优化了无血清培养体系并分型纯化了HSCs细胞，通过本发明中的细胞因子组合体外处理后的HSCs即可在连续移植中展现更好自我更新的优势。该方法简单易操作，效果显著，为今后临床中长距离运输、长期保存以及扩增HSCs提供了新的思路。

附图说明

图1是单细胞PCR的结果，分别是新鲜分选和与SCF共培养24小时后48个HSC中表达细胞因子受体的阳性细胞比例(A)和所有HSC细胞因子受体表达水平的对比(B)。

图2是单个CD41-CD150+CD34-KSLHSC体外培养七天，基础无血清培养体系中添加细胞因子的实施例SCF+TPO+IL-12与对比例SCF+TPO、SCF+IL-12连续记录分裂情况的对比图。

图3是40个CD41-CD150+CD34-KSLHSCs的新鲜分选组和培养组连续移植的外周血重建情况对比。培养组中的实施例为SCF+TPO+IL-12组与对比例的新鲜分选组、SCF+TPO、SCF+IL-12组连续移植的外周血供体细胞的总体重建比例(A)和各谱系的重建情况(B)对比图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但不限定本发明的保护范围。

实施例1分选HSC细胞与IL-12的共培养

分选10个CD41-CD150+CD34-KSLHSC细胞在不同的IL-12浓度(0，1，10，25，50，75，100ng/ml)条件下进行体外培养，并在第3，7，10和14天时观察细胞数量的变化，以及细胞的状态。结果显示在IL-12浓度为25-100ng/ml下能够正常生长，且50ng/ml时细胞的生长状态最好。

实施例2分选HSC细胞与SCF的共培养

分选96个CD41-CD150+CD34-KSLHSC单细胞，其中48个单细胞分选后直接用单细胞PCR技术检测其细胞因子受体表达情况，作为对照组；另外48个单细胞则与SCF共培养24小时后再进行检测，作为实验组。然后比较新鲜分选组与培养组细胞因子IL-12受体(IL-12rb1，IL-12rb2)的表达差异。结果如图1所示，从图1(A)可以看到培养24小时后表达细胞因子受体IL-12rb1和IL-12rb2的细胞比例明显升高，而图1(B)则显示培养后细胞表达细胞因子受体的水平也有所提高。

实施例3分选HSC细胞与细胞因子组合的共培养

采用细胞因子组合对HSCs进行体外扩增，包括如下步骤：

1)配制基础无血清培养基：F-12+ITS-X+β-Me+L-Glu+Non-eaa+HEPES+P/S+HAS，然后加入细胞因子SCF+TPO+IL-12，最终浓度均为50ng/ml。将上述培养基充分混匀后加到96孔板中，200μL每孔。

2)取8-12周大的雌性C57BL/6小鼠，脱颈处死，取双下肢，剥离出髂骨、股骨和胫骨，将骨髓冲出，CD117磁珠富集后标记抗体，上机分选CD41-CD150+CD34-KSLHSC单颗细胞。

3)将步骤2)的目的细胞直接分选到步骤1)的孔板中，将孔板置于孵箱中培养七天，每天计数每个孔中的细胞数。

对比例3

实施例3的对照组：在配制好的基础无血清培养基中添加细胞因子SCF+TPO，SCF+IL-12，最终浓度均为50ng/ml。其他条件同实施例3的条件。

实施例3、对比例3连续计数七天的统计方法和对比结果如下：

将每个孔每天记录的细胞数进行统计：>＝2，<3被认为是经历了一次细胞分裂；>＝3，<5被认为是经历了两次细胞分裂；>＝5被认为是经历了三次细胞分裂。然后对比不同细胞因子组合作用下细胞发生第一、二、三次细胞分裂的趋势。结果如图2所示，从图2中可以看出，实施例3实验组细胞与对比例3的SCF+IL-12组相比第一、二、三次细胞分裂速度显著增加，而与SCF+TPO组相比无明显差异。

实施例4与细胞因子组合共培养的HSC细胞的移植重建

采用体外扩增的HSCs在小鼠体内进行移植重建，包括如下步骤：

1)配制基础无血清培养基：F-12+ITS-X+β-Me+L-Glu+Non-eaa+HEPES+P/S+HAS，然后加入细胞因子SCF+TPO+IL-12，最终浓度均为50ng/ml。将上述培养基充分混匀后加到96孔板中，200微升每孔。

2)取8-12周大的雌性B6-Ly5.1小鼠，脱颈处死，取双下肢，剥离出髂骨、股骨和胫骨，将骨髓冲出，CD117磁珠富集后标记抗体，上机分选CD41-CD150+CD34-KSLHSCs细胞，每孔40颗细胞。

3)将步骤2)的目的细胞直接分选到步骤1)的孔板中，将孔板置于孵箱中培养七天，然后在每个孔中加入C57BL/6小鼠来源的2×10^6个全骨髓细胞，轻轻吹的混匀后，从尾静脉移植到致死剂量照射后的C57BL/6受体小鼠体内。

4)上述为一次移植的操作步骤，在一次移植8个月后进行二次移植。将一次移植的受体小鼠脱颈处死，取双下肢，剥离出髂骨、股骨和胫骨，将骨髓冲出，并将同一组小鼠的骨髓液混在一起，然后取2×10^7个全骨髓细胞通过尾静脉移植到致死剂量照射后的受体小鼠体内，即完成了二次移植。

移植后定期用流式细胞术检测小鼠外周血B6-Ly5.1小鼠来源细胞的比例及向各谱系的分化情况。

对比例4

实施例4的对照组：设置新鲜分选组，即将B6-Ly5.1小鼠来源的40个HSCs分选到未添加任何细胞因子的基础无血清培养基中，不经过培养直接连同C57BL/6小鼠来源的2×10^6个全骨髓细胞从尾静脉移植到致死剂量照射后的C57BL/6受体小鼠体内。对比例的培养组则为将细胞分选到添加了细胞因子SCF+TPO，SCF+IL-12的基础无血清培养基中，细胞因子最终浓度均为50ng/ml，其他条件同实施例4的条件。

实施例4、对比例4连续移植后的检测方法及结果如下：

一次移植1，4，8个月时和二次移植1，4，6个月时分别收集小鼠外周血20μL/只，首先每管外周血加入1mlAck，常温孵育7分钟，去掉红细胞，然后加入抗体：CD45.1-FITC，CD45.2-PE，CD4-PE-cy7，CD8-APC，B220-percp-cy5.5，Mac1/Gr1-APC-eFluor780，4℃避光孵育30分钟，用3ml缓冲液洗第1遍，200μL缓冲液重悬，用流式细胞术检测并比较实施例与对比例CD45.1+、CD4+T、CD8+T、Mac1/Gr1+髓系细胞的比例。结果如图3所示，从图3中可以看出，对比例中的新鲜分选组在一次移植后重建比例较高，二次移植后重建水平降低，而实施例与另外两个对比例相比，一次和二次移植都表现出明显的重建优势，且髓系重建始终处于稳定的高水平。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种培养体系在制备体外维持HSCs自我更新能力制剂中的应用，其特征在于，所述培养体系包括基础无血清培养体系以及细胞因子组合，所述基础无血清培养体系包括基础培养基F-12，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS-X)，β-巯基乙醇(β-Me)，L-谷氨酰胺(L-Glu)，非必需氨基酸(Non-essential amino acid，Non-eaa)，HEPES液，青霉素和/或链霉素，重组人血清白蛋白(r-HSA)；所述细胞因子包括25-100ng/ml干细胞因子(SCF)、25-100ng/ml血小板生成素(TPO)和25-100ng/ml白介素-12(IL-12)；所述HSCs为骨髓来源的免疫表型为CD41-CD150+CD34-KSL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ITS-X的浓度为100x，β-Me的浓度为0.0275-0.11mM，L-Glu的浓度为1-4mM，非必需氨基酸的浓度为0.05-0.2mM，HEPES的浓度为5-20mM，青霉素和/或链霉素的浓度为0.25-1.0mg/ml，r-HSA的浓度为0.25-1.0mg/ml。

3.根据权利要求1-2任一所述的应用，其特征在于，所述体外维持HSCs自我更新能力的方法，为采用所述的培养体系对所述HSCs细胞进行培养，培养时间为七天，培养条件为：37℃，二氧化碳浓度5％。

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