CN115975926B - 一种造血干细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents
一种造血干细胞无血清培养基及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种造血干细胞无血清培养基及其应用,该培养基由基础培养基和添加组分混合配制而成,所述添加组分由干细胞因子(SCF),重组人促血小板生成素(TPO),重组人Flt3配体(Flt3‑L),rhIL‑6,rhIL‑3,CITED2,HSF1A,OAC1,重组人胰岛素,重组人脱铁转铁蛋白,重组人血清白蛋白,乙醇胺,亚硒酸钠组成。所述基础培养基是IMDM。本发明的培养基不仅化学成分明确,无血清、无人源和动物源成分,配方简单,性能优异,可以显著提高造血干细胞的扩增能力,造血干细胞培养至13天可扩增500倍以上,收获时细胞活率可达95%以上,显著提高了CD34+细胞的阳性比例。
Description
技术领域
本发明涉及培养基技术领域,具体为一种造血干细胞无血清培养基及其应用领域。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)是血液系统中的成体干细胞,是造血与免疫系统的起始细胞。造血干细胞的显著特点之一是表达CD34抗原,它在正常骨髓中含量甚少,约占有核细胞的1%~2%,而在外周血中含量更少,约为单个核细胞的0.1%。造血干细胞具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能,具有自我更新、多向分化和归巢等特点。目前造血干细胞已被广泛应用于临床血液病的治疗,并且是基因治疗最有前景的靶细胞。
然而,目前尚未有成熟的造血干细胞扩增体系,其原因在于体外扩增的造血干细胞数目有限,同时扩增的造血干细胞的功能下降。临床上为了安全地在短期内重建一个遍布全身并具有一定功能的血液和免疫系统,则需要获得相当数量的造血干细胞才能进行成功的移植。因此,体外能够扩增足够数量的造血干细胞是治疗临床血液相关疾病的重要手段。随着科技的快速发展,造血干细胞现已被广泛用于造血重建、基因治疗、肿瘤净化及免疫治疗等方面的研究,也被用于疾病的临床治疗中,如白血病、地中海贫血症、血友病等。目前临床获得造血干细胞的途径有4种,分别是骨髓来源、外周血来源、脐带血来源、胎盘来源。脐带血中具有重建能力的造血干细胞数量极低,单份脐带血来源的造血干细胞数量不足以支持成年人和体重较大儿童的治疗;人外周血中的造血干细胞数量同样极低,需要采用粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激骨髓释放造血干细胞到外周血中,可使外周血造血干细胞增加20~30倍,但临床中常出现刺激效果不佳的情况,释放的造血干细胞数量无法达到治疗要求;直接从骨髓中采集造血干细胞,同样会出现采集数量有限的困难,同时也会有手术难度大、创伤面大等问题;胎盘组织中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的8~10倍,能提供给1~2个成人患者的治疗,但是目前胎盘干细胞不能用于临床,仅处于科研试验阶段,干细胞提纯技术尚存在争议。因此,有必要研发一种有效扩增造血干细胞的方法,以造福更多的患者。
发明内容
本发明的目的在于提供一种造血干细胞无血清培养基及其应用,以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供如下技术方案:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述添加组分各成分的浓度如下:SCF 20~100ng/mL、TPO 10~50ng/mL、Flt3-L 20~100ng/mL、rhIL-6 0.5~5ng/mL、rhIL-3 0.5~5ng/mL,CITED2 1~20ng/mL,HSF1A 0.5~3µM,OAC10.1~1µM,重组人胰岛素1~15µg/mL,重组脱铁转铁蛋白1~10µg/mL,重组人血清白蛋白1~5mg/mL,亚硒酸钠1~20ng/mL,乙醇胺1~5µg/mL;
所述基础培养基为IMDM培养基;
所述基础培养基与添加组分的体积比为100:1~5。
较优化的方案,所述添加组分各成分的浓度如下:SCF 50ng/mL、TPO 25ng/mL、Flt3-L 50ng/mL、rhIL-6 2.5ng/mL、rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC10.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
较优化的方案,所述基础培养基与添加组分的体积比为50:1。
较优化的方案,根据以上所述的一种造血干细胞无血清培养基的应用,该培养基用于培养造血干细胞。
与现有技术相比,本发明所达到的有益效果是:
本发明的一个目的在于弥补现有造血干细胞培养基的缺陷,提供一种安全可靠的含有CITED2、HSF1A、OAC1的造血干细胞化学成分限定无血清培养基,以达到实现造血干细胞增殖数量多,CD34+细胞阳性比例稳定及应用安全的培养目的,使所培养的造血干细胞能够达到临床应用的质量安全标准。
本发明通过在基础培养基中添加多种营养因子替代血清功能,培养基化学成分明确,所添加的人胰岛素、人脱铁转铁蛋白、人血清白蛋白均为重组表达产品,保持了批次间的稳定性,不需要额外添加血清。通过本发明培养基获得的造血干细胞适合于进一步的科学研究及临床应用研究。
本发明的培养基通过在基础培养基中添加成分明确的添加组分,去除传统配方中互相冲突的成分,简化了配方,添加成分种类更少,培养细胞更方便,无需额外再添加其他细胞因子,同时通过在培养液中添加CITED2和OAC1,保证造血干细胞高活率的同时,又能够使造血干细胞快速大量扩增,有利于造血干细胞的维持,同时添加了HSF1A,以促进体外造血干细胞的维持和蛋白稳态,增强了造血干细胞的维持和培养的适应性,促进蛋白平衡和健康。
本发明的含有CITED2、HSF1A、OAC1的造血干细胞培养基不含人来源的蛋白成分,排除了人源提取物可能存在的诸如艾滋病、乙肝等传染性疾病的致病风险,使用药用级别成分,对人体安全,通过本发明培养基获得的造血干细胞适合于进一步的科学研究及临床应用研究。
本发明的含有CITED2、HSF1A、OAC1的造血干细胞培养基性能优异,造血干细胞培养13天总细胞可扩增500倍以上,终末细胞活率可达95%以上,CD34+细胞阳性比例50%以上,扩增效果更加优异,可广泛应用于实际生产及临床应用研究。
本发明的组合物的作用机理是:(1)CITED2是一种新型转录共激活因子,对体外HSC的培养和维持至关重要,这是由于CITED2可以通过调控周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKN1A的表达来调节造血干细胞的静止,使其长期处于细胞周期的G0期,通过减少凋亡和增强静止来维持原始CD34+造血干细胞池。(2)维持蛋白质平衡是抵抗压力和促进健康衰老的关键。而蛋白质平衡是保持干细胞功能所必需的,有研究表明,在稳态条件下,非活性Hsf1定位于年轻成人HSC的细胞质中,并与Hsp90和TRiC等伴侣结合,在应激条件下,如离体培养或老化,蛋白质稳定被破坏,Hsf1易位到细胞核,导致HSC适应性降低。HSF1A是一种Hsp90和TRiC的小分子抑制剂,通过在培养物中添加HSF1A可增强Hsf1活化,部分抑制蛋白质合成,重新平衡蛋白质平衡,并支持HSC适应性,从而增强体外培养的HSC的长期多系重组活性。(3)有研究表明,OCT4参与了增强人HSC的细胞因子诱导的扩增能力。OAC1是一种OCT4-激活化合物,通过在培养物中添加可增强内源性OCT4的表达,再通过调节HOXB4的表达来增强人造血干和祖细胞的体外扩增。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是人脐带血单核细胞(CBMC)中CD34+细胞在实施例2培养基培养条件下的活率曲线示意图;
图2是人脐带血单核细胞(CBMC)中CD34+细胞在实施例2培养基培养条件下的增殖曲线示意图;
图3为人脐带血单核细胞(CBMC)中CD34+细胞在实施例2培养基培养条件下的细胞标志物检测结果示意图;
图4为人脐带血单核细胞(CBMC)中CD34+细胞在实施例2、实施例4~7的培养基培养条件下的活率曲线示意图;
图5为人脐带血单核细胞(CBMC)中CD34+细胞在实施例2、实施例4~7的培养基培养条件下的增殖曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
一:实验材料:
IMDM培养基的组分及其各组分含量如下。
组分中文名称 | 组分英文名称 | 含量g/L |
氯化钙 | CalciµM Chloride | 0.1653 |
硫酸镁 | MagnesiµM Sulfate (anhydrous) | 0.09767 |
氯化钾 | PotassiµM Chloride | 0.33 |
硝酸钾 | PotassiµM Nitrate | 0.000076 |
碳酸氢钠 | SodiµM Bicarbonate | 3.024 |
氯化钠 | SodiµM Chloride | 4.505 |
磷酸氢钠 | SodiµM Phosphate Monobasic (anhydrous) | 0.109 |
亚硒酸钠 | SodiµM Selenite | 0.000017 |
L-丙氨酸 | L-Alanine | 0.025 |
L-精氨酸盐酸盐 | L-Arginine • HCl | 0.084 |
L-天门冬酰胺水合物 | L-Asparagine • H2O | 0.0284 |
L-天门冬氨酸 | L-Aspartic Acid | 0.03 |
L-胱氨酸盐酸盐 | L-Cystine • 2HCl | 0.09124 |
L-谷氨酸 | L-Glutamic Acid | 0.075 |
L-谷氨酰胺 | L-Glutamine | 0.584 |
甘氨酸 | Glycine | 0.03 |
L-组氨酸盐酸盐水合物 | L-Histidine • HCl • H2O | 0.042 |
L-异亮氨酸 | L-Isoleucine | 0.105 |
L-亮氨酸 | L-Leucine | 0.105 |
L-赖氨酸盐酸盐 | L-Lysine • HCl | 0.146 |
L-甲硫氨酸 | L-Methionine | 0.03 |
L-苯丙氨酸 | L-Phenylalanine | 0.066 |
L-脯氨酸 | L-Proline | 0.04 |
L-丝氨酸 | L-Serine | 0.042 |
L-苏氨酸 | L-Threonine | 0.095 |
L-色氨酸 | L-Tryptophan | 0.016 |
L-酪氨酸二钠盐水合物 | L-Tyrosine • 2Na • 2H2O | 0.10379 |
L-缬氨酸 | L-Valine | 0.094 |
D-生物素 | D-Biotin | 0.000013 |
氯化胆碱 | Choline Chloride | 0.004 |
叶酸 | Folic Acid | 0.004 |
肌醇 | myo-Inositol | 0.0072 |
烟酰胺 | Niacinamide | 0.004 |
D-泛酸钙 | D-Pantothenic Acid (hemicalciµM) | 0.004 |
吡哆醛盐酸盐 | Pyridoxal • HCl | 0.004 |
核黄素 | Riboflavin | 0.0004 |
硫胺素盐酸盐 | Thiamine • HCl | 0.004 |
维生素B12 | Vitamin B12 | 0.000013 |
D-葡萄糖 | D-Glucose | 4.5 |
N-2-羟乙基哌嗪-N '-2-乙磺酸 | HEPES | 5.958 |
丙酮酸钠 | Pyruvic Acid • Na | 0.11 |
以上IMDM培养基配制所用的试剂均从西格玛试剂官网购买,或者,实际制备IMDM培养基时也可从西格玛试剂公司直接购买IMDM粉剂(厂家:西格玛,货号I7633)加注射水和3.024g碳酸氢钠(厂家:西格玛,货号S5761),充分溶解后用0.22微米滤膜过滤而成。
SCF(厂家:近岸蛋白,货号GMP-CD53),TPO(厂家:近岸蛋白,货号GMP-CJ95),Flt3-L(厂家:近岸蛋白,货号GMP-CA82),rhIL-6(厂家:近岸蛋白,货号GMP-C099),rhIL-3(厂家:近岸蛋白,货号GMP-CF63),CITED2(厂家:Abcam,货号ab87363),HSF1A(厂家:上海皓元,货号HY-103000),OAC1(厂家:上海皓元,货号HY-12303),重组人胰岛素(厂家:西格玛,货号91077c),重组脱铁转铁蛋白(厂家:西格玛,货号T1147),重组人血清白蛋白(厂家:禾元生物,货号HYC002M01),亚硒酸钠(厂家:西格玛,货号S5261),乙醇胺(厂家:西格玛,货号E6133)。
商品化无血清培养基(厂家:碧爱欧生物,货号9655造血干细胞培养基)。
CD34抗体(厂家:百进生物,货号343504)。
实施例1:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:20mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 20ng/mL,TPO10ng/mL,Flt3-L 20ng/mL,rhIL-6 0.5ng/mL,rhIL-3 0.5ng/mL,CITED2 1ng/mL,HSF1A0.5μM,OAC1 0.1µM,重组人胰岛素1µg/mL,重组脱铁转铁蛋白1µg/mL,重组人血清白蛋1mg/mL,亚硒酸钠1ng/mL,乙醇胺1µg/mL。
实施例2:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:20mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 50ng/mL,TPO25ng/mL,Flt3-L 50ng/mL,rhIL-6 2.5ng/mL,rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
实施例3:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:20mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 100ng/mL,TPO50ng/mL,Flt3-L 100ng/mL,rhIL-6 5ng/mL,rhIL-3 5ng/mL,CITED2 20ng/mL,HSF1A 3µM,OAC1 1µM,重组人胰岛素15µg/mL,重组脱铁转铁蛋白10µg/mL,重组人血清白蛋白5mg/mL,亚硒酸钠20ng/mL,乙醇胺5µg/mL。
实施例4:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:10mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 50ng/mL,TPO25ng/mL,Flt3-L 50ng/mL,rhIL-6 2.5ng/mL,rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
实施例5:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:30mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 50ng/mL,TPO25ng/mL,Flt3-L 50ng/mL,rhIL-6 2.5ng/mL,rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
实施例6:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:40mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 50ng/mL,TPO25ng/mL,Flt3-L 50ng/mL,rhIL-6 2.5ng/mL,rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
实施例7:
一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述基础培养基为IMDM培养基,所述基础培养基与添加组分的体积比为1000mL:50mL。
以所述添加组分的体积计,所述添加组分各成分的含量如下:SCF 50ng/mL,TPO25ng/mL,Flt3-L 50ng/mL,rhIL-6 2.5ng/mL,rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL。
以上实施例1~7中,其中实施例2公开的培养基组分配比效果更为优异,以下选取实施例2公开的培养基配方制备的培养基进行试验论证。
检测试验1:以实施例2为实验组,商品化无血清培养基为对照组;
本发明中使用不同的培养基培养脐带血单个核细胞中磁珠分离来的CD34+细胞,在6孔板中每孔接种5×105个细胞,培养体积2mL,置于37℃,5%CO2培养箱中培养。
72小时后观察细胞状态,当观察到的细胞变大变多,补加新鲜的造血干细胞无血清培养基,调整细胞密度0.3×106细胞数/mL,每隔两天进行一次补液,使细胞浓度维持在0.3×106细胞数/mL,继续培养至第13天得到待处理的细胞。
检测结果如下:
1.造血干细胞的细胞活力及增殖效率检测
在检测试验1公开的培养过程中,培养的第0,3,7,10,13天分别取样进行计数,获得细胞增殖曲线和细胞活率的数据。细胞活率曲线如图1所示,细胞增殖曲线如图2所示。
数据显示:培养第13天时,在本申请实施例2制备的无血清培养基(实验组)培养条件下,总细胞可扩增500倍,细胞活率达到95%以上;明显优于商品化无血清培养基的培养。
2.造血干细胞细胞表面标志物检测
在检测试验1公开的培养过程中,分别在第0天、3天、7天、13天检测CD34蛋白的表达情况。分别取约0.5×106个细胞,2000rpm离心5分钟,去上清后用PBS重悬,使用荧光标记的CD34抗体与PBS重悬的细胞进行孵育,孵育条件为:4℃,15分钟,然后使用PBS进行清洗2次,弃上清,0.5mL PBS重悬。将处理好的细胞用流式细胞仪进行检测分析。CD34蛋白的表达情况如图3所示。
数据显示:在本申请实施例2制备的无血清培养基(实验组)培养条件下,扩增7天后,CD34+细胞阳性比例大于70%;扩增13天后,CD34+细胞阳性比例大于50%,明显优于商品化无血清培养基的培养。
检测试验2:
取实施例4~7所公开的方案配置培养基,其中实施例2中培养基编号M1、实施例4中培养基编号M2、实施例5中培养基编号M3、实施例6中培养基编号M4、实施例7中培养基编号M5、商品化无血清培养基。
按照检测试验1所公开的方案进行实验,以对比实施例2、实施例4~7中培养基所实现的效果差异。
检测结果如下:
1.造血干细胞的细胞活力及增殖效率检测
在检测试验1公开的培养过程中,培养的第0,3,7,10,13天分别取样进行计数,获得细胞增殖曲线和细胞活率的数据;细胞活率曲线如图4所示,细胞活率数据如下表1所示。
表1
细胞活率 | D0 | D3 | D7 | D10 | D13 |
M1 | 0.911 | 0.943 | 0.981 | 0.936 | 0.976 |
M2 | 0.911 | 0.896 | 0.965 | 0.921 | 0.932 |
M3 | 0.911 | 0.903 | 0.943 | 0.906 | 0.911 |
M4 | 0.911 | 0.932 | 0.933 | 0.915 | 0.906 |
M5 | 0.911 | 0.909 | 0.961 | 0.896 | 0.912 |
商品化无血清培养基 | 0.911 | 0.941 | 0.975 | 0.929 | 0.941 |
细胞增殖曲线如图5所示,数据如下表2所示。
表2
细胞增殖 | D0 | D3 | D7 | D10 | D13 |
M1 | 1 | 26.98 | 76.36 | 230.16 | 532.66 |
M2 | 1 | 18.31 | 45.66 | 114.83 | 302.63 |
M3 | 1 | 22.21 | 53.65 | 163.22 | 369.55 |
M4 | 1 | 22.05 | 49.03 | 139.35 | 323.33 |
M5 | 1 | 21.31 | 48.32 | 142.32 | 352.66 |
商品化无血清培养基 | 1 | 25.26 | 61.21 | 190.65 | 435.23 |
2.造血干细胞表面标志物检测
在检测试验1公开的培养过程中,分别在第0天、3天、7天、13天检测CD34蛋白的表达情况。分别取约0.5×106个细胞,2000rpm离心5分钟,去上清后用PBS重悬,使用荧光标记的CD34抗体与PBS重悬的细胞进行孵育,孵育条件为:4℃,15分钟,然后使用PBS进行清洗2次,弃上清,0.5mLPBS重悬。将处理好的细胞用流式细胞仪进行检测分析。CD34蛋白的表达情况如下表3所示。
数据显示M1配制方案CD34流式表型第13天时可达51.2%,优于其他配制方案。
表3
编号 | CD34+阳性表达率 |
M1 | 51.2% |
M2 | 25.3% |
M3 | 32.6% |
M4 | 28.7% |
M5 | 23.1% |
商品化无血清培养基 | 39.5% |
需要说明的是,在本文中,诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种造血干细胞无血清培养基,所述培养基包括基础培养基和添加组分,所述添加组分各成分的浓度如下:SCF 50ng/mL、TPO 25ng/mL、Flt3-L 50ng/mL、rhIL-6 2.5ng/mL、rhIL-3 2.5ng/mL,CITED2 10ng/mL,HSF1A 2µM,OAC1 0.5µM,重组人胰岛素10µg/mL,重组脱铁转铁蛋白5.5µg/mL,重组人血清白蛋白2mg/mL,亚硒酸钠7ng/mL,乙醇胺2µg/mL;
所述基础培养基为IMDM培养基;
所述基础培养基与添加组分的体积比为50:1。
2.一种造血干细胞无血清培养基的应用,其特征在于:根据权利要求1所述的造血干细胞无血清培养基应用于造血干细胞的培养。
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