CN109576308B - 一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用。其特征是通过在干细胞肝向分化过程中转染miR‑142‑3p抑制剂，所述miR‑142‑3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。经过干细胞的分化，转染miR‑142‑3p抑制剂，转染后分化和肝样细胞的分子和功能检测后发现在干细胞肝向分化的第8天转染10nM的miR‑142‑3p抑制剂，所述的CYP2E1和CYP3A4的酶活力最高。所述方法克服了人类干细胞来源肝样细胞解毒能力不高的劣势，有利于人工肝的开发及利用人类干细胞来源肝样细胞或人工肝进行医药研发的深入研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用。
背景技术
肝病是全球性疾病，其种类多、分布范围广，而且危害程度高。在我国，肝病也是患病人数最多的疾病之一。据世界卫生组织2011年的报告称，我国每年约有50万人死于各种肝病。目前治疗晚期肝病和急重型肝病的最有效疗法是整体肝移植，但是供体肝源极度匮乏限制了其广泛应用。近年来，研究人员提出了多种方案来取代整体肝移植，如人工肝支持系统、肝细胞移植、脱细胞异体肝脏框架的细胞回填后移植以及3D打印肝脏移植等。然而，无论是人工肝开发还是其它替代方案都需要首先获得全功能性的肝细胞。这同样受到肝源匮乏的限制。因此，我们迫切需要一种不受肝源限制且能生产大量全功能性肝细胞的方法。
到目前为止，多个研究小组发明了一系列方法将不同来源(鼠、猪、猴和人等)的不同细胞(多能诱导干细胞、间质干细胞和成纤维细胞等)定向诱导分化成肝样细胞。这些肝样细胞能够表达肝细胞相关标志基因，还具有肝细胞的功能如分泌白蛋白、合成尿素、储存肝糖原和具有CYP2C9、CYP3A4解毒活性等。功能性肝样细胞有望应用于人工肝和各种细胞疗法的开发。而目前，人工肝及生物人工肝等都是利用尸体的供体肝上提取的肝细胞或是动物的肝细胞(如猪等)来作为填充物。前者受到肝源匮乏和冻存肝细胞活性下降等的限制而都得不到广泛应用，后者受到代谢相容性、免役原性和人畜共患病等的限制而影响其安全应用。定向诱导分化生成肝细胞是一种可以随时随地生产人源性肝细胞的方法，将可以一劳永逸的解决肝样匮乏等问题对晚期和急重型肝病患者的影响。此外，定向分化生成的肝细胞也有望应用于肝病相关药物的研发，尤其是在药物毒性和药物代谢特征测试等领域。目前，大多数药物的毒性和代谢都是用实验动物或者肿瘤细胞系。也有研究表明，动物中负责解毒的某些关键酶类与人类中的表达调控机制和活性都有很大不同。这种异体测试研发的很多药物能通过实验室阶段的检测，但经常过不了临床I期或II期的测试。很可能是因为这些药物在人体中产生了某些毒性代谢物或者造成了不可预期的肝损伤。因而，使用人源功能性肝细胞来进行测试将有助于药物开发的成功率。定向分化的人类肝细胞在这一领域的应用将会消除肝源短缺的障碍，并有效的降低药企研发成本和时间，且能减少实验动物的使用。
前期工作
功能性肝样细胞诱导产生后，研究人员已在多个领域对其进行了应用测试。包括本发明申请人的实验室在内的多个实验室发现丙肝病毒可成功感染肝样细胞，感染后的肝样细胞上清含有病毒颗粒，可以继续感染其它细胞。这为人们研究丙肝病毒在肝脏中的入侵、扩增和分泌等分子机制提供了很好的生物模型。然而在小鼠肝脏损伤修复实验中，肝样细胞的作用却十分有限，与肝母细胞或新分离的肝细胞相比仍有较大差距。推测原因是目前所诱导生成的肝样细胞还不够成熟，仅具有部分肝细胞的功能。在药物代谢研究中也发现，肝样细胞虽然具有代谢多种药物的能力，但是其代谢效率与新鲜分离的肝细胞甚至是冻存的肝细胞之间都有较大差距。多种方案诱导产生的肝样细胞在其解毒能力上(图1)较原代肝细胞都有较大差距，而肝细胞的另一主要功能白蛋白分泌则差别不大(图1D)。这表明肝样细胞解毒能力的不足可能是当前其体内实验效果不理想和药物代谢能力弱的关键因素，这必将阻碍其在人工肝开发及临床相关领域的应用。因此，有必要对肝细胞解毒行为及其分子机制做更加深入的研究，以指导之后能在体外诱导分化出更成熟的肝样细胞。
解毒是肝细胞的标志性功能之一，与肝细胞命运及肝组织能否正常运转密切相关。细胞色素P450家族是负责催化解毒过程中一期生物转化反应的最关键酶类。在肝细胞中mRNA水平表达量最多的CYP2E1，是最为重要的一个P450家族成员，负责催化低分子量的分子如乙醇、丙酮、扑热息痛和一些麻醉剂等。本发明申请人前期研究发现，肝样细胞中其活性仅为原代肝细胞的10％左右(图1)。CYP3A4是另一个重要P450家族成员，约超过50％以上的临床药物由其催化处理。另外有很多天然毒素也是其代谢底物，如黄曲霉毒素和苯并芘等。其在肝样细胞中的活性为原代肝细胞的30％左右(图1)。肝细胞中CYP2E1和CYP3A4的表达受到信号通路(Wnt/β-catenin等)和转录因子(PXR、CAR等)等多种因素影响。有趣的是，有研究表明CYP2E1和CYP3A4的表达量在mRNA和蛋白水平显示明显的不一致性，且呈低活性水平，这表明它们很可能受到转录后水平的调控(如miRNA调控等)，但具体调控机制有待进一步研究。
miRNA是一类20-30个核苷酸的非编码RNA，主要在转录后水平通过降解mRNA或抑制翻译来调控基因的表达。它们几乎参与了所有生物学进程，对肝脏发育和肝细胞功能等也有着精密的调控。为了研究肝样细胞与成熟肝细胞解毒能力具有较大差异的可能原因，以及miRNA在其中发挥的潜在的作用，本发明申请人对体外诱导的人干细胞源性肝样细胞和成熟的原代肝细胞中miRNA表达谱系做了微阵列分析，比较发现miRNA的表达模式在二者间存在显著差异。其中miR-241/142-3p/99a/199b等在成熟肝细胞中的表达量远低于肝样细胞，而miR-122/194/192等则反之。通过功能获得和缺失实验进行筛选，研究发现抑制miR-142-3p能明显提高肝样细胞P450家族中CYP3A4和CYP2E1的解毒能力(图2)。
因此综上所述，可通过抑制miR-142-3p来调节CYP2E1和CYP3A4，提高人类干细胞来源样细胞的解读功能，从而得到质量更高的全功能性肝细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供了一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法。此方法可以能明显提高肝样细胞P450家族中CYP3A4和CYP2E1的解毒能力。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法为在干细胞肝向分化过程中转染miR-142-3p抑制剂，所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，具体包括以下步骤：
1)干细胞的分化：在Matrigel-分化培养板中加入已培养好的人类干细胞悬液，加入不同的分化培养基培养分化干细胞；
2)转染miR-142-3p抑制剂：于干细胞分化的第8天，配置含有miR-142-3p抑制剂的转染液体并弃去分化培养基，并滴入转染液体，于培养箱中转染；
3)转染后干细胞的分化：转染后弃去所有液体，加入含有不同的分化培养基培养分化干细胞；
4)步骤3)培养第18天时，收取细胞，做肝样细胞的分子和功能检测。
进一步的，步骤1)中Matrigel的终使用浓度为1.6％。
进一步的，步骤1)中所述干细胞为人多功能干细胞，所述干细胞需达到80％覆盖率后方可用于制备人类干细胞悬液。
进一步的，步骤1)中所述分化培养基由低糖DMEM、MCDB-201培养基、0.25x的LA-BSA、0.25x的ITS、P/S双抗、抗坏血酸溶液、地塞米松溶液和β-巯基乙醇组成，体积比为285:200:1.25:1.25:5:5:2:0.5。
进一步的，步骤1)中所述培养的方式为：
第0天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有100ng/ml Activin-A的Activin-A分化培养基，培养2天；
第2天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a分化培养基，培养2天；
第4天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天；
第6天，弃去2/3的培养基，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天。
进一步的，步骤2)在干细胞肝向分化的第8天转染10nM的miR-142-3p抑制剂。
准备miR-142-3p抑制剂转染液体。第8天，取25μl Opti-MEM(ThermoFisher，31985062)，加入1μl Lipo3000(ThermoFisher，L3000001)，室温静置5min；取25μl Opti-MEM，加入不同浓度的miR-142-3p抑制剂，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示(广州锐博生物技术有限公司，miR20000434-1-5)，具体使用浓度如表1所示，室温静止5min；混匀(不可震荡，不能离心)，室温静置20min，待用。
进一步的，步骤3)中所述培养的方式为：
第8天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天；
第10天，弃去2/3的培养基，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天。
第12天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；
第14天，弃去2/3的培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；
第16天与第14天的培养方式相同。
本发明的目的之二在于提供了一种miR-142-3p抑制剂的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
miR-142-3p抑制剂在生产人源性肝细胞及利用所述人源功能性肝细胞进行药物研发方面的应用，所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明的目的之三在于提供了本发明方法的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法在生产人源性肝细胞及利用所述人源功能性肝细胞进行药物研发方面的应用。
本发明的有益效果在于：1)本发明的一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法通过对miR-142-3p的抑制调节CYP2E1和CYP3A4的在mRNA和蛋白水平的表达量，提高了CYP2E1和CYP3A4的活性，解决了人工肝的解毒功能问题；2)因一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用。
附图说明
图1A-C：为诱导人肝样细胞与成熟原代肝细胞中细胞色素氧化酶P450家族成员CYP3A4、CYP2C9和CYP2E1在未诱导(DMSO)和诱导(利福平和乙醇)下的活性比较，以及D：白蛋白分泌水平比较。
图2A：miR-142-3p与肝细胞解毒能力，miR-142-3p抑制剂在肝样细胞中转染效率；B：转染miR-142-3p抑制剂后其表达水平显著下降；C-E：分别为在人干细胞、诱导肝样细胞、抑制miR-142-3p表达的诱导肝样细胞和原代肝细胞中检测细胞色素P450家族成员未诱导(DMSO和水)和诱导(奥美拉唑、利福平和乙醇)下的活性。
图3干细胞肝向诱导分化示意图。
图4成熟肝细胞(H)、肝样细胞(hiHLC)和miR-142-3p抑制剂处理的肝样细胞中检测成熟肝细胞标志基因表达水平。
图5优化后的肝样细胞中白蛋白(ALB)的表达水平。
图6优化后的肝样细胞中白蛋白、尿素等的合成水平。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法
在干细胞肝向分化过程中转染miR-142-3p抑制剂来调节CYP2E1和CYP3A4的酶活力。但需要确定最佳的miR-142-3p抑制剂的转染浓度，具体方法如下：
1.准备Matrigel-分化培养板。在冰上缓慢解冻Matrigel(Corning，356230)。取25ml冰冷的DMEM-F12(不含HEPES，Invitrogen 11320074)，加入400μl Matrigel(终浓度为1.6％)混合均匀，然后取0.5ml加入到12孔板的每个孔(Sigma CLS3512)。在37℃下孵化至少30分钟或在室温下2-3小时，使Matrigel凝结。
2.人类ESC/iPSC细胞的准备。用于分化的人类ESC/iPSC细胞，培养在含21％氧气，5％二氧化碳的37℃培养箱内，培养基为扩增培养基mTesR1(StemCell，85850)，隔天换液一次。至细胞达到80％覆盖率时，利用Dispase(StemCell，07923)酶消化，使ESC/iPSC成为单细胞。用扩增培养基重悬细胞为1x106/ml，并加入10μM Y-27632(Sigma，SCM075)。
3.取5x105(500μl)干细胞至步骤1准备好的Matrigel包被的12孔板的每个孔(事先弃掉其中的液体)，并补充扩增培养基至1000μl于37℃，21％O2和5％CO2培养过夜。
4.第0天，弃去所有培养基，用1000μl PBS(ThermoFisher，10010001)洗一遍，加入1000μl含有100ng/ml Activin-A(R&D Systems，338-AC)和50ng/ml Wnt3a(R&D Systems，1324-WN)的分化培养基[每500ml溶液含285ml低糖DMEM(Invitrogen 31885023)，200mlMCDB-201培养基溶液(Sigma M-6770)，1.25ml 0.25 x Linoleic acid—Bovine serumalbumin(LA-BSA)(Sigma L-9530)，1.25ml 0.25 x Insulin–transferrin–selenium(ITS)(Sigma I-3146)，5ml 50U Penicillin/Streptomycin(Invitrogen 15140122)，5ml 100nML-ascorbic acid solution(Sigma A92902),2ml 1μM dexamethasone solution(SigmaD4902),，0.5ml 50μMβ-巯基乙醇(Invitrogen 31350010)]，同样条件培养2天。
5.第2天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a(R&D Systems，314-BP)分化培养基，同样条件培养2天。
6.第4天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
7.第6天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
8.准备miR-142-3p抑制剂转染液体。第8天，取25μl Opti-MEM(ThermoFisher，31985062)，加入1μl Lipo 3000(ThermoFisher，L3000001)，室温静置5min；取25μl Opti-MEM，加入不同浓度的miR-142-3p抑制剂，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(广州锐博生物技术有限公司，miR20000434-1-5)，具体使用浓度如表1所示，室温静止5min；混匀(不可震荡，不能离心)，室温静置20min，待用。
9.弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，滴入步骤8溶液，同样条件培养6小时；
10.弃去所有溶液，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml FGF1(R&DSystems，232-FA)的分化培养基，同样条件培养2天。
11.第10天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml FGF1的分化培养基，同样条件培养2天。
12.第12天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml HGF(R&D Systems，294-HGN)和10ng/ml OSM(Sigma，O9635-10UG)的分化培养基，同样条件培养2天。
13.第14天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
14.第16天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
15.第18天，收取细胞，做肝细胞相关分子和功能等检测。
实验结果如表1所示，在使用10nM的miR-142-3p抑制剂时，CYP2E1和CYP3A4的酶活力最高。
表1.
实施例2抑制人源肝样细胞的miR-142-3p后可提高肝样细胞的功能
通过实施例1的方法诱导生成的肝样细胞，在抑制了miR-142-3p后，大幅增加了其成熟细胞相关标志基因的表达水平，如ALB、ARG1、PCK1、CPT1、CYP3A4和CYP2E1(图4所示)。也增加了其白蛋白的蛋白表达水平(图5所示)，以及白蛋白和尿素的合成水平(图6所示)。
对比实施例1一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法
在干细胞肝向分化过程中转染miR-142-3p抑制剂来调节CYP2E1和CYP3A4的酶活力。在干细胞分化的第4天加入10nM的miR-142-3p抑制剂，具体方法如下：
1.准备Matrigel-分化培养板。在冰上缓慢解冻Matrigel(Corning，356230)。取25ml冰冷的DMEM-F12(不含HEPES，Invitrogen11320074)，加入400μl Matrigel(终浓度为1.6％)混合均匀，然后取0.5ml加入到12孔板的每个孔(Sigma CLS3512)。在37℃下孵化至少30分钟或在室温下2-3小时，使Matrigel凝结。
2.人类ESC/iPSC细胞的准备。用于分化的人类ESC/iPSC细胞，培养在含21％氧气，5％二氧化碳的37℃培养箱内，培养基为扩增培养基mTesR1(StemCell，85850)，隔天换液一次。至细胞达到80％覆盖率时，利用Dispase(StemCell，07923)酶消化，使ESC/iPSC成为单细胞。用扩增培养基重悬细胞为1x106/ml，并加入10μM Y-27632(Sigma，SCM075)。
3.取5x105(500μl)干细胞至步骤1准备好的Matrigel包被的12孔板的每个孔(事先弃掉其中的液体)，并补充扩增培养基至1000μl于37℃，21％O2和5％CO2培养过夜。
4.第0天，弃去所有培养基，用1000μl PBS(ThermoFisher，10010001)洗一遍，加入1000μl含有100ng/ml Activin-A(R&D Systems，338-AC)和50ng/ml Wnt3a(R&D Systems，1324-WN)的分化培养基[每500ml溶液含285ml低糖DMEM(Invitrogen 31885023)，200mlMCDB-201培养基溶液(Sigma M-6770)，1.25ml 0.25 x Linoleic acid—Bovine serumalbumin(LA-BSA)(Sigma L-9530)，1.25ml 0.25 x Insulin–transferrin–selenium(ITS)(Sigma I-3146)，5ml 50U Penicillin/Streptomycin(Invitrogen 15140122)，5ml 100nML-ascorbic acid solution(Sigma A92902),2ml 1μM dexamethasone solution(SigmaD4902),，0.5ml 50μMβ-巯基乙醇(Invitrogen 31350010)]，同样条件培养2天。
5.第2天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a(R&D Systems，314-BP)分化培养基，同样条件培养2天。
6.准备miR-142-3p抑制剂转染液体。第4天，取25μl Opti-MEM(ThermoFisher，31985062)，加入1μl Lipo 3000(ThermoFisher，L3000001)，室温静置5min；取25μl Opti-MEM，加入浓度为10nM的miR-142-3p抑制剂，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(广州锐博生物技术有限公司，miR20000434-1-5)，室温静止5min；混匀(不可震荡，不能离心)，室温静置20min，待用。
7.弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，滴入步骤8溶液，同样条件培养6小时；
8.第4天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
9.第6天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
10.弃去所有溶液，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml FGF1(R&DSystems，232-FA)的分化培养基，同样条件培养2天。
11.第10天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml FGF1的分化培养基，同样条件培养2天。
12.第12天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml HGF(R&D Systems，294-HGN)和10ng/ml OSM(Sigma，O9635-10UG)的分化培养基，同样条件培养2天。
13.第14天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
14.第16天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
15.第18天，收取细胞，做肝细胞相关分子和功能等检测。
实验结果：CYP3A4的酶活力为569.6±21.67，CYP2E1的酶活力为36.42±9.41，酶活力与在第8天转染10nM的miR-142-3p抑制剂的酶活力相比，酶活力水平均不高。
对比实施例2一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法
在干细胞肝向分化过程中转染miR-142-3p抑制剂来调节CYP2E1和CYP3A4的酶活力。在干细胞分化的第12天加入10nM的miR-142-3p抑制剂，具体方法如下：
1.准备Matrigel-分化培养板。在冰上缓慢解冻Matrigel(Corning，356230)。取25ml冰冷的DMEM-F12(不含HEPES，Invitrogen 11320074)，加入400μl Matrigel(终浓度为1.6％)混合均匀，然后取0.5ml加入到12孔板的每个孔(Sigma CLS3512)。在37℃下孵化至少30分钟或在室温下2-3小时，使Matrigel凝结。
2.人类ESC/iPSC细胞的准备。用于分化的人类ESC/iPSC细胞，培养在含21％氧气，5％二氧化碳的37℃培养箱内，培养基为扩增培养基mTesR1(StemCell，85850)，隔天换液一次。至细胞达到80％覆盖率时，利用Dispase(StemCell，07923)酶消化，使ESC/iPSC成为单细胞。用扩增培养基重悬细胞为1x106/ml，并加入10μM Y-27632(Sigma，SCM075)。
3.取5x105(500μl)干细胞至步骤1准备好的Matrigel包被的12孔板的每个孔(事先弃掉其中的液体)，并补充扩增培养基至1000μl于37℃，21％O2和5％CO2培养过夜。
4.第0天，弃去所有培养基，用1000μl PBS(ThermoFisher，10010001)洗一遍，加入1000μl含有100ng/ml Activin-A(R&D Systems，338-AC)和50ng/ml Wnt3a(R&D Systems，1324-WN)的分化培养基[每500ml溶液含285ml低糖DMEM(Invitrogen 31885023)，200mlMCDB-201培养基溶液(Sigma M-6770)，1.25ml 0.25 x Linoleic acid—Bovine serumalbumin(LA-BSA)(Sigma L-9530)，1.25ml 0.25 x Insulin–transferrin–selenium(ITS)(Sigma I-3146)，5ml 50U Penicillin/Streptomycin(Invitrogen 15140122)，5ml 100nML-ascorbic acid solution(Sigma A92902),2ml 1μM dexamethasone solution(SigmaD4902),，0.5ml 50μMβ-巯基乙醇(Invitrogen 31350010)]，同样条件培养2天。
5.第2天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a(R&D Systems，314-BP)分化培养基，同样条件培养2天。
6.第4天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
7.第6天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有50ng/ml BMP4的分化培养基，同样条件培养2天。
8.第8天，弃去所有溶液，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml FGF1(R&D Systems，232-FA)的分化培养基，同样条件培养2天。
9.第10天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml FGF1的分化培养基，同样条件培养2天。
10.准备miR-142-3p抑制剂转染液体。第12天，取25μl Opti-MEM(ThermoFisher，31985062)，加入1μl Lipo 3000(ThermoFisher，L3000001)，室温静置5min；取25μl Opti-MEM，加入浓度为10nM的miR-142-3p抑制剂，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示(广州锐博生物技术有限公司，miR20000434-1-5)，室温静止5min；混匀(不可震荡，不能离心)，室温静置20min，待用。
11.弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，滴入步骤8溶液，同样条件培养6小时；
12.第12天，弃去所有培养基，用1000μl PBS洗一遍，加入1000μl含有20ng/ml HGF(R&D Systems，294-HGN)和10ng/ml OSM(Sigma，O9635-10UG)的分化培养基，同样条件培养2天。
13.第14天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
14.第16天，吸取750μl培养基弃掉，加入1000μl含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的分化培养基，同样条件培养2天。
15.第18天，收取细胞，做肝细胞相关分子和功能等检测。
实验结果：CYP3A4的酶活力为1659.9±58.67，CYP2E1的酶活力为69.89±25.41，酶活力与在第8天转染10nM的miR-142-3p抑制剂的酶活力相比，酶活力水平均不高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
<120> 一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
Claims (9)
1.一种提高人类干细胞来源肝样细胞解毒功能的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)干细胞的分化：在Matrigel-分化培养板中加入已培养好的人类干细胞悬液，加入不同的分化培养基培养分化干细胞；
2)转染miR-142-3p抑制剂：于干细胞分化的第8天，配置含有miR-142-3p抑制剂的转染液体并弃去分化培养基，并滴入转染液体，于培养箱中转染；
3)转染后干细胞的分化：转染后弃去所有液体，加入含有不同的分化培养基培养分化干细胞；
4)步骤3)培养第18天时，收取细胞，做肝样细胞的分子和功能检测；
所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中Matrigel的终使用浓度为1.6％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述干细胞为人多功能干细胞，所述干细胞需达到80％覆盖率后方可用于制备人类干细胞悬液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分化培养基由低糖DMEM、MCDB-201培养基、0.25x的LA-BSA、0.25x的ITS、P/S双抗、抗坏血酸溶液、地塞米松溶液和β-巯基乙醇组成，体积比为285:200:1.25:1.25:5:5:2:0.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的方式为：
第0天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有100ng/ml Activin-A的Activin-A分化培养基，培养2天；
第2天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml Wnt3a的Wnt3a分化培养基，培养2天；
第4天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天；
第6天，弃去2/3的培养基，加入含有50ng/ml BMP4的BMP4分化培养基，培养2天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)在干细胞肝向分化的第8天转染10nM的miR-142-3p抑制剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述培养的方式为：
第8天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天；
第10天，弃去2/3的培养基，加入含有20ng/ml FGF1的FGF1分化培养基，培养2天；
第12天，弃去所有培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；
第14天，弃去2/3的培养基，PBS清洗，加入含有20ng/ml HGF和10ng/ml OSM的HGF-OSM分化培养基，培养2天；
第16天与第14天的培养方式相同。
8.miR-142-3p抑制剂在生产人源性肝细胞及利用所述人源性肝细胞进行药物制备的应用，其特征在于，所述miR-142-3p抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
9.权利要求1-7任意一项所述的方法在生产人源性肝细胞及利用所述人源性肝细胞进行药物制备的应用。
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| MicroRNAs as key mediators of hepatic detoxification;Yemiao Chen 等;《Toxicology》;20161231;第368-369卷;第80-90页 * |
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