CN109517783B - 一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途 - Google Patents

一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途，所述培养基包含基础培养基和小分子的组合，所维持的小分子的组合为CBF。其中C为CHIR‑99021,B为Blebbistatin，C为Forskolin。本发明在基础培养基中添加小分子CHIR，Blebbistatin，Forskolin，从而取代添加生长因子，在体外能够长期培养肝脏胆管的类器官，并可进一步诱导分化形成肝实质细胞。本方法有利于肝脏类器官在体外的大量扩增，并为肝脏相关疾病的研究及治疗提供基础。

Description

一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，更具体地，本发明涉及培养基、CHIR-99021、blebbistatin 以及 forskolin在制备培养基中的用途、培养肝脏类器官的方法。
背景技术
肝脏是机体的重要代谢器官，肝脏受损后会快速启动修复再生，而它的修复再生主要是由肝脏胆管细胞驱动的。近几年肝脏胆管的体外培养系统的推动了对肝脏领域的研究，在体外直接对肝脏胆管进行有效的实验和观察。体外培养的肝脏类器官可移植至受损肝脏并修复受损肝脏，除此之外体外培养的肝脏类器官还用于对病人个体的个性化药物筛选，肝脏的类器官培养在药物筛选和再生医学领域有巨大的应用价值。
在进行小鼠肝脏类器官培养时，使用的培养条件为：基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin 1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-Gastrin I。进行人的肝脏类器官养时需要在小鼠肝脏类器官培养基的基础上加入10uM 的forskolin，5uM的A83-01。
目前肝脏类器官培养需要加入EGF、Noggin、R-spondin、FGF10、HGF和[Leu15]-Gastrin I等生长因子，这些生长因子价格昂贵，不利于肝脏类器官培养系统的应用，极大的限制的肝脏类器官在体外的大量扩增，用于肝脏医学领域的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基及其用途。
本发明提出的一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基，包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR-99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM。
本发明中，所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01。
本发明中，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，所述Nicotinamide的浓度为10mM。
本发明中，所述SUN11602的浓度为10μM，所述FH1的浓度为10μM，所述A83-01的浓度为0.5μM。
本发明提出的一种的用于肝脏类器官培养的全小分子培养基的用途，所述全小分子培养基用于下列的至少之一：
（１）培养肝脏类器官，其中：所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞；
（２）促进肝脏类器官增殖和/或分化，其中：所述小鼠肠隐窝或人肠肝脏胆管中任一种。
本发明中，将包裹在基质胶中的肠隐窝在权利要求１-４任一项所述全小分子培养基中进行培养，所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞。
本发明中，所述培养是在无菌、5％CO2和37℃的条件下进行。
本发明中，所述肝脏胆管细胞在权利要求1～４中任一项所述的全小分子培养基中进行培养或从肝脏胆管分离获得。
本发明中，所述人肠肝脏胆管为肝脏胆管细胞上皮细胞，将肝脏胆管细胞上皮细胞在权利要求１-４任一项所述全小分子培养基中进行培养，
本发明中，所述培养是在无菌、5％CO2和37℃的条件下进行。
本发明中，所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM，进行肝脏类器官的体外培养，促进肝脏类器官在体外的增殖。
本发明中，所述培养基进一步包括SUN11602，所述浓度为10μM， FH1，所述浓度为10μM，进一步的稳定肝脏类器官在体外的增殖。
本发明中，所述培养基进一步包括A83-01，浓度500μM，可以使培养的肝脏类器官更偏向于肝实质细胞。
本发明中，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12，任选地，所述血清替代物为N2和B27，任选地，所述双抗为青霉素和链霉素，任选地，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，任选地，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，任选地。
本发明提供了一种肝脏类器官进一步分化为肝脏成熟实质细胞的方法。在本发明不含生长因子的，包含CHIR-99021、blebbistatin和forskolin培养基中培养一段时间的肝脏类器官，可进一步加入小分子DATP，A83-01培养4天，进一步在原有培养基小分子基础上添加地塞米松，培养2天，使得培养的肝脏胆管类器官进一步分化成为成熟的肝实质细胞。这一过程可在体外探究肝成熟分化的分子机制，为肝脏发育，代谢的研究与治疗提供平台。
本发明中，利用本发明CHIR-99021、blebbistatin和forskolin培养基进行肝脏胆管类器官的体外培养。
本发明中，所述DATP浓度为10μM，所述A83-01浓度为50nM，所述地塞米松的浓度为3μM，进一步使肝脏胆管类器官分化为成熟的肝实质细胞。
本发明的有益效果在于：本发明方法成本低，是一种不含生长因子的肝脏类器官培养，根据本发明实施例的培养基可以用于肝脏胆管细胞的培养，并可以长时间维持肝脏类器官在体外的培养。根据本发明实施例的培养基有利于降低培养成本，推动培养肝脏类器官的应用，为肝脏疾病的研究及治疗提供基础。
附图说明
图1是根据本发明实施例的CBF系统可以在体外维持小鼠肝脏类器官培养的结果图；其中：(ａ) CBF系统，(ｂ) GF组；
图2是根据本发明实施例的CBF系统培养肝脏类器官与GF组培养肝脏类器官RT-qPCR的结果图；其中：(ａ) CBF系统，(ｂ) GF组；
图3是根据本发明实施例的CBF系统培养的肝脏类器官可进一步分化的RT-qPCR结果图；
图4是根据本发明实施例的CBF系统可以长时间培养的小鼠肝脏类器官的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，参考附图描述的实施例是示例性的，用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在以下实施例中，包含基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine、10mM的Nicotinamide、 3μM 的CHIR-99021、10μM的blebbistatin以及3μM forskolin的培养基称为CBF培养基。
现有的肝脏胆管类器官培养为基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin 1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-Gastrin I，简称为GF培养基。
实施例１：基于CBF培养基的肝脏类器官的培养
按照本发明提供的CBF培养基在培养肝脏类器官的用途，对本实施例中制备的离体小鼠肝脏胆管进行培养。利用肝脏胆管体外培养为肝脏类器官技术，探讨小分子CBF在培养过程中的作用。按照文献（Laura Broutier.et al.(2016) .“Culture andestablishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3Dorganoids and their genetic manipulation.” Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1724-43.）报道的方法，从小鼠中分离并培养肝脏胆管，观察CBF体外培养状态，具体方法如下所述：
（１）从小鼠中分离肝脏，在预冷的ph7.4的PBS缓冲液中将其剪碎为5mm3的小块。并用PBS冲洗三篇，以去除血细胞，纤维和脂肪组织。将冲洗后的肝脏小块放入到含有0.125mg/ml蛋白胶原酶，0.125mg/ml中性蛋白酶，0.1mg/ml DNaseI消化液中，至于37℃培养箱中进行消化，消化2小时。吸取上清经过300g离心5分钟，再用含有1% 双抗和1% FBS的DMEM溶液进行冲洗，在由300g离心5分钟。此过程重复3遍，离心沉淀为肝脏的胆管。可在显微镜下挑取胆管。
（２）将每50个胆管与50微升预冷的基质胶（购于BD公司，货号354230）混合均匀后平铺于24孔细胞培养板的一个孔中，将细胞培养板至于37℃培养箱重5分钟，让包裹胆管的基质胶充分凝固。对照组使用含有基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine和10mM的Nicotinamide,以及培养所需的生长因子：50ng/mL的EGF、25ng/mL的Noggin、500ng/mL的R-spondin 1、100ng/mL的FGF10、50ng/mL的HGF以及10nM的[Leu15]-Gastrin I的GF培养基进行培养。CBF实验组用基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine、10mM的Nicotinamide、 3μM 的CHIR-99021、10μM的blebbistatin以及3μM forskolin的培养基称为CBF培养基进行培养。在二氧化碳细胞培养箱培养10天后，用显微镜进行观察，实验结果如图1所示。有CBF培养基培养的肝脏类器官与GF培养基培养的进行对比，在类器官的形态及生长状态上没有明显差异。
（３）随后我们用RT-qPCR对增殖细胞的胆管标志性蛋白，肝未成熟实质细胞标志性蛋白以及肝成熟的肝实质细胞标志蛋白的mRNA进行鉴定评估，具体操作如下。首先对GF培养基和CBF培养基培养的类器官用QIAGEN RNA 提取试剂盒进行RNA的提取（步骤按照提取试剂盒提供步骤进行）。将提取的RNA反转录为cDNA，已反转录后的cDNA为模板进行相对定量PCR。用于检测的引物如下，胆管标志性蛋白Krt7，Krt19和Sox9；成熟肝实质细胞标志性蛋白Alb， Cyp3a11和Sult1a1。对实验数据进行统计分析，实验结果如图2所示。在CBF培养基中的肝脏类器官和GF培养基中具有相同胆管特性，但是又比GF培养基中培养的胆管类器官更偏向于肝实质细胞。
实施例2：基于CBF培养基的肝脏类器的成熟分化培养
按照奔放提供的CBF培养基培养肝脏类器官的用途，对本实施例中的肝脏类器官进行进一步的诱导分化成为成熟的肝实质细胞。按照文献（Laura Broutier.et al.(2016).“Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver andpancreas 3D organoids and their genetic manipulation.” Nat Protoc. 2016 Sep;11(9):1724-43.）报道的方法，从小鼠中分离并培养肝脏胆管，用CBF培养基培养一段时间后，进而加入OSM和地塞米松对肝脏例器官进行进一步分化，具体方法如下：
（１）从小鼠中分离肝脏，在预冷的ph7.4的PBS缓冲液中将其剪碎为5mm3的小块。并用PBS冲洗三篇，以去除血细胞，纤维和脂肪组织。将冲洗后的肝脏小块放入到含有0.125mg/ml蛋白胶原酶，0.125mg/ml中性蛋白酶，0.1mg/ml DNaseI消化液中，至于37℃培养箱中进行消化，消化2小时。吸取上清经过300g离心5分钟，再用含有1% 双抗和1% FBS的DMEM溶液进行冲洗，在由300g离心5分钟。此过程重复3遍，离心沉淀为肝脏的胆管。可在显微镜下挑取胆管。
（２）将每50个胆管与50微升预冷的基质胶（购于BD公司，货号354230）混合均匀后平铺于24孔细胞培养板的一个孔中，将细胞培养板至于37℃培养箱重5分钟，让包裹胆管的基质胶充分凝固，用基础培养基Advanced DMEM/F12、血清替代物N2和B27、双抗、2mM的GlutaMAX、1mM的N-acetylcysteine、10mM的Nicotinamide、 3μM 的CHIR-99021、10μM的blebbistatin以及3μM forskolin的培养基称为CBF培养基进行培养。
（３）CBF培养基培养10天后，在CBF的基础上进一步添加10ng/ml的OSM和3μM的地塞米松，称为D-CBF组。在37℃二氧化碳培养箱中继续培养5天。用QIAGEN RNA 提取试剂盒对未加OSM和地塞米松的对照组CBF组和DCBF组进行RNA的提取（步骤按照提取试剂盒提供步骤进行）。反转录的cDNA作为模板进行定量PCR。检测肝成熟实质细胞标志蛋白Alb，Ttr，Mup3和Cyp3a11的mRNA水平。实验结果如图3所示，CBF培养基培养的肝脏类器官可以进一步分化为成熟的肝实质细胞。

Claims (6)

1.一种用于肝脏类器官培养的全小分子培养基的用途，其特征在于：所述全小分子培养基包括：基础培养基、血清替代物、双抗、谷氨酸盐/酯、N-乙酰半胱氨酸、Nicotinamide、CHIR-99021、blebbistatin和forskolin，其中：所述CHIR-99021的浓度为3μM，所述Blebbistatin的浓度为10μM，所述forskolin的浓度为10μM；所述全小分子培养基还包括SUN11602、FH1和A83-01， 其特征在于：
（1）培养肝脏类器官，其中：所述肝脏类器官为肝脏胆管细胞；
（２）促进肝脏类器官增殖和/或分化，其中：所述肝脏类器官为人肠肝脏胆管。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述基础培养基为Advanced DMEM/F12，所述血清替代物为N2或B27中一种或两种，所述双抗为青霉素或链霉素中任一种或两种，所述谷氨酸盐/酯的浓度为2mM，所述N-乙酰半胱氨酸的浓度为1mM，所述Nicotinamide的浓度为10mM。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述SUN11602的浓度为10μM，所述FH1的浓度为10μM，所述A83-01的浓度为0.5μM。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述肝脏胆管细胞在权利要求1～3中任一项所述的全小分子培养基中进行培养或从肝脏胆管分离获得。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述人肠肝脏胆管为肝脏胆管细胞上皮细胞，将肝脏胆管细胞上皮细胞在权利要求1-４任一项所述全小分子培养基中进行培养。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述培养是在无菌、5％CO2和37℃的条件下进行。
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