CN103237888A - 肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝脏的类器官、其用途以及获得它们的方法。

Description

肝脏的类器官、其用途以及获得它们的培养方法

发明领域

本发明涉及肝脏的类器官、其用途以及获得它们的方法。

发明背景

肝脏的基本结构单位是肝小叶。每个小叶由肝细胞板组成，所述肝细胞板内衬有向中央输出静脉呈放射状排列的血窦毛细血管。肝小叶大致呈六边形，六个角中的每一个由存在的肝门三联体(门静脉、胆管和肝动脉)划分。尽管肝细胞是主要的肝脏薄壁细胞类型，它们与胆管上皮细胞(cholangiocyte)(胆管上皮细胞(biliary epithelial cell))、内皮细胞、窦内皮细胞、库普弗(Kupffer)细胞、自然杀伤细胞和肝星形细胞协同起作用。该复杂的结构是肝功能的关键。

肝脏干细胞的存在仍然是有争议的。一方面，某种损伤发生时，肝脏中的组织维持和肝脏再生并非由干细胞而是由成熟细胞(肝细胞或胆管上皮细胞)的分裂驱动的。然而，抑制肝细胞增殖的肝脏受损模型同样表明该器官响应于损伤而再生的能力。这表明可以将肝脏看作是具有兼性干细胞的器官。

目前，从肝细胞或通过胚胎干细胞(ES)或诱导性多能干细胞的分化而获得的肝脏培养物不能更长时间的扩增和自我更新。

最近，在小肠中鉴定出特异性表达于循环的隐窝基底柱状(CBC)细胞中的基因Lgr5，所述隐窝基底柱状细胞是散布于Paneth细胞之间的小细胞(Barker et al.,2007.Nature449:1003-1007)。利用将GFP/他莫昔芬(tamoxifen)诱导的Cre重组酶盒整合至Lgr5基因座的小鼠，甚至是在Cre诱导14个月之后，通过世系追踪评估表明，Lgr5⁺CBC细胞构成能够产生上皮细胞的全部细胞类型的多能干细胞。

最近发现除了Lgr5，还有Lgr6而非Lgr4是成体干细胞特有的标志物。Lgr5表达于大脑、肾脏、肝脏、视网膜、胃、肠、胰腺、乳腺、毛囊、卵巢、肾上腺髓质和皮肤的干细胞中，而Lgr6表达于大脑、肺、乳腺、毛囊和皮肤的干细胞中。

在此我们开发了培养成体肝脏祖细胞和获得肝脏的类器官的方法，所述肝脏的类器官表现出更长时间的维持，能够分化成肝细胞和胆管上皮细胞谱系，并且维持分离的肝脏碎块的基本生理机能。

发明简述

本发明提供了用于获得肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括在第一“扩增”培养基(在此又被称为EM)中培养细胞，优选地，接着在第二“分化”培养基(在此又被称为DM)中培养细胞。

肝脏的类器官可以通过培养单个Lgr5+干细胞，含有至少一个Lgr5+干细胞的细胞群和/或肝脏碎块获得。在此，其中“培养基中的细胞”是指如下含义：包括单个Lgr5+干细胞，含有至少一个Lgr5+干细胞的细胞群和/或肝脏碎块。

在一个实施方案中，扩增培养基包含EGF、Wnt激动剂、FGF和烟酰胺。优选地，Wnt激动剂是R-spondin1，因而扩增培养基被称为“ERFNic”。特别优选的扩增培养基还包含HGF且被称为“ERFHNic”。

在一个实施方案中，分化培养基包含EGF、TGF-β抑制剂、FGF和Notch抑制剂。在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是A83-01和/或Notch抑制剂是DAPT。该分化培养基在此被称为“EAFD”，并且是本发明优选的分化培养基。任选地，FGF可由HGF替代，或可选择地，分化培养基中可同时含有或不含FGF和HGF。还可以添加地塞米松。

在优选实施方案中，细胞最初可以培养于还包含Wnt和Noggin的扩增培养基中，例如含有EGF、Noggin、R-spondin和Wnt，以及任选地FGF、HGF和烟酰胺的“ENRW”培养基。本发明人发现该培养基对于开始几日刺激细胞的初期扩增是最佳的。因而，该第一扩增培养基在此有时又被称为EM1。在一些实施方案中，大约1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更久，例如2周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久，14个月或更久之后，将Wnt和Noggin去除。然后可以在如以上所述不含Wnt或Noggin的本发明的扩增培养基中扩增细胞。该第二扩增培养基在此有时又被称为EM2。在一些实施方案中，在EM2中培养细胞大约1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日或更长的时间，如3、4、5、10、20或更多周。然后可以将培养基更换为如以上所述的最佳分化培养基，其包含TGF-β抑制剂和Notch抑制剂。通常，分化培养基不含Wnt激动剂、R-spondin或烟酰胺。这促进细胞向成熟肝细胞和胆管上皮细胞分化。这些细胞适合于移植到人或动物。

本发明还提供了肝脏的类器官。本申请首次描述了离体培养肝脏的类器官。

发明详述

第一方面，本发明提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括：

在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3或R-spondin4和/或Wnt-3a。优选地，还添加HGF。

例如，在一个实施方案中，本发明提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括：

在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：BMP抑制剂，Wnt激动剂，作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF(其能够结合FGFR2或FGFR4，优选FGF10)和HGF，胃泌素，烟酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸。

本发明人惊奇地发现，本发明的方法允许培养上皮干细胞和/或来自含有所述干细胞的肝脏的分离的碎块，同时保留了保持未分化表型和自我维持能力的干细胞的存在。更令人惊奇地是，观测到本发明的方法允许单个分离的上皮干细胞在缺乏干细胞壁龛时长成肝脏的类器官。

干细胞存在于人和小鼠成体的许多器官中。虽然成体干细胞在个体组织中的精确特性可能存在很大差异，成体干细胞共有至少以下特性：它们保持未分化的表型；其后代可向相关组织中存在的全部谱系分化；它们终生保持自我维持的能力；以及它们能够使相关组织受损后再生。干细胞存在于特化的部位，干细胞壁龛，其提供了维持所述干细胞群的适当的细胞间接触和信号。

上皮干细胞能够形成组成上皮细胞的不同细胞类型。一些诸如皮肤或肠的上皮细胞表现出快速的细胞更新，表明存在的干细胞必定连续地增殖。另一些诸如肝脏或胰脏的上皮细胞在正常条件下表现出非常缓慢的更新。

可以通过许多不同的实验方案来进行肝脏上皮干细胞的分离。虽然本发明人并不希望受任何特定理论的束缚，在此假设组织受损时存在于肝脏内的干细胞群负责肝脏再生。认为激活时负责该受损-应答再生的细胞群表达标志物Lgr5。

通过用肝毒性化合物CC14注射敲入Lgr5-LacZ的小鼠来模拟肝脏损伤，本发明人首次证实肝脏损伤诱导Lgr5表达于肝脏中活跃再生的位置处(参见实施例4)。本发明人还表明注射Wnt激动剂R-spondin引起肝管中的Wnt信号通路表达上调。虽然本发明人并不希望受任何特定理论的束缚，在此假设再生干细胞/祖细胞在肝脏损伤之后可以由Wnt信号通路激活。如果需要的话，如在此所述，可以接着从肝脏/肝脏碎块中分离Lgr5阳性细胞。因而本发明提供了从肝脏获得/分离Lgr5+细胞的方法，包括诱导肝脏损伤或通过例如用R-spondin刺激Wnt信号通路。这是有用的，因为在一些实施方案中，Lgr5+细胞是体外获得肝脏的类器官的起点(虽然本发明的培养基的应用允许通过添加诸如R-spondin的Wnt激动剂来产生Lgr5+细胞，因而为了实施本发明，从肝脏获得Lgr5+细胞并非是必需的)。还提供了通过该方法获得的Lgr5+细胞。在一些实施方案中，这样的细胞优选不表达星形细胞标志物，例如SMA。相反地，这样的细胞优选表达一种或多种肝脏祖细胞标志物或干细胞标志物，如Sox9。优选地，与成体肝脏相比，一种或多种肝脏祖细胞标志物或干细胞标志物(如Sox9)的表达在所述细胞中上调。

本发明还提供了用于再生肝脏的方法，包括刺激Wnt信号通路。这样的方法在治疗肝脏病症中是有用的。可以在体内、离体的分离的肝脏或者体外的肝脏碎块或肝细胞群中，通过损伤或通过刺激Wnt信号通路在肝细胞中进行Lgr5表达的诱导。在离体或体外进行Lgr5表达诱导的实施方案中，可以将Lgr5阳性细胞通过任何合适的方法给予有需要的患者，例如通过注射或通过植入。在一些实施方案中，将植入的细胞包含于生物相容的基质中。在一些实施方案中，在治疗中使用之前，将细胞离体扩增。

在本发明的优选方法中，将所述上皮干细胞从肝脏碎块或肝脏胆管分离，更优选地，从胆管组织分离。

胆管组织的分离方法是本领域技术人员来所熟知的。例如，胆管可如在此所附的实施例中所描述的从肝脏分离。简而言之，可以在冷(4-10°C)的培养基，优选改进型DMEM/F12(Invitrogen)中清洗成体肝脏组织，然后将组织破碎成大约5mm的块，然后再用冷解离缓冲液(含有胶原酶、分散酶和FBS的DMEM培养基)清洗。优选地，用解离缓冲液于大约37°C下孵育组织碎块约2h。然后，可以用10ml移液管将组织碎块充分悬浮于10ml冷(4-10°C)的分离缓冲液中。优选地，将含有死细胞的第一上清液丢弃，并且优选用解离缓冲液(如10-15ml)悬浮沉淀。进一步充分悬浮组织碎块之后，上清液中富集了胆管。可以以这种方法获得含有胆管的上清液，并且在显微镜下收集胆管并将其保存于冷培养液(DMEM+5-10%FBS)中。可以重复该方法，直到收集了至少10-20个胆管/孔。然后，可以将分离的胆管沉淀。优选地，分离的胆管以大约20个胆管/孔的比率接种于50ul基质胶(matrigel)中。

与成熟的肝细胞在死亡之前短时间内汇合生长相反，本发明分离的肝脏上皮干细胞自我更新且无限期地生长。已发现自我更新的细胞群是能够在其表面表达Lgr5的细胞群。Lgr5阴性细胞不会自我更新。术语“自我更新”应当理解为表示细胞自我繁殖同时保持本发明细胞的原始增殖和分化特性的能力。这样的细胞通过分裂增殖形成克隆，所述克隆进一步分裂成克隆并由此无需外部干预而扩增成细胞群的大小，而不会进化成分化潜能更受限的细胞。

优选的方法基于本发明的肝脏干细胞在其表面表达Lgr5和/或Lgr6的事实；这些蛋白属于大的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族(参见例如WO2009/022907，其内容全部并入本文)。Lgr亚家族在携带对配体结合重要的大的富含亮氨酸的胞外域上是独特的。因而优选的方法包括如前所述的由所述上皮组织制备细胞悬浮液，将所述细胞悬浮液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物(如抗体)相接触，将Lgr5和/或Lgr6结合化合物分离，以及从所述结合化合物中分离干细胞。

优选的是，从分离的胆管中手动产生含有上皮干细胞的单细胞悬浮液。优选地，将通过手动破坏这种方法产生的小的类器官碎块以大约1:6的比率分开。如果必要的话，可以在胰蛋白酶中以大约1:2稀释率短时间(仅2或3分钟)孵育这样的碎块。已发现在此阶段，用胰蛋白酶处理上皮干细胞得到非常低的存活率：如果将细胞分成独立的细胞，那么只有表达Lgr5的那些细胞存活。这部分非常少(大约占总细胞群的12%)。

优选的Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括抗体，如特异性识别且结合Lgr5或Lgr6的细胞外结构域的单克隆抗体，如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体(参见例如WO2010/016766，其内容整体并入本文)。利用这样的抗体，例如借助于本领域技术人员所了解的磁珠或通过荧光激活细胞分选术，可以分离表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞。利用本发明的方法，分离表达Lgr5和/或Lgr6的一个单细胞且将本发明的方法应用其上是可能的。因此，肝脏的类器官可源自一个单细胞。

干细胞壁龛

优选地，在模拟所述干细胞天然存在的至少一部分细胞壁龛的微环境中培养分离的干细胞。可以通过在生物材料的存在下培养所述干细胞而模拟这种细胞壁龛，所述生物材料如代表控制干细胞命运的关键调控信号的基质、支架和培养基底。这样的生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。支架提供了二维或三维的网状物。适合于这种支架的合成材料包括选自多孔固体、纳米纤维和水凝胶的聚合物，所述水凝胶如，例如肽，包括自组装的肽，由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇延胡索酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚纤维素醋酸酯和/或它们的共聚物组成的水凝胶(参见例如Saha et al.,2007.CurrOpin Chem Biol.11(4):381–387;Saha et al.,2008.Biophysical Journal95:4426–4438;Little et al.,2008.Chem.Rev108,1787–1796)。如技术人员所熟知的，机械性能如，例如支架的弹性，影响干细胞的增殖、分化和迁移。优选的支架包括生物可降解的(共)聚合物，其在植入受试者之后由天然存在的成分取代，例如以促进组织再生和/或创伤愈合。更优选地，所述支架在植入受试者之后基本上不引起免疫应答。所述支架补充有天然、半合成或合成的配体，其提供了干细胞增殖和/或分化和/或迁移所需的信号。在优选实施方案中，所述配体包括确定的氨基酸片段。所述合成聚合物的实例包括

F127嵌段共聚物表面活性剂(BASF)，以及

(Johnson and Johnson)。

细胞壁龛部分由干细胞和周围细胞以及由细胞在所述壁龛中产生的细胞外基质(ECM)决定。在本发明的优选方法中，将分离的肝脏碎块或分离的胆管或上皮干细胞附着于ECM。ECM由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中所述糖蛋白包括胶原蛋白、巢蛋白(entactin/nidogen)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。已知包含不同组分的不同类型的ECM，包括不同种类的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。所述ECM可通过在去除这些细胞并添加分离的肝脏碎块或分离的胆管或分离的上皮干细胞之前，通过在容器中培养产生ECM的细胞如成纤维细胞来提供。产生细胞外基质的细胞的实例是主要产生胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产生IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞，以及主要产生胶原蛋白(I、III和V型)、硫酸软骨素蛋白多糖、透明质酸、纤连蛋白和肌腱蛋白-C的结肠肌纤维母细胞。可选择地，通过商购提供所述ECM。商购可获得的细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白(Invitrogen)和来自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞的基膜制剂(如Matrigel^TM(BD Biosciences))。可以使用合成的细胞外基质材料，如ProNectin(Sigma Z378666)。如果需要的话，可以使用细胞外基质材料的混合物。利用ECM培养干细胞提高干细胞的长期存活和未分化的干细胞的持续存在。缺乏ECM时，不能更久的培养干细胞培养物且未观测到未分化的干细胞的持续存在。此外，ECM的存在允许培养三维的组织类器官，其在缺乏ECM时无法培养。一般将细胞外基质材料涂布于细胞培养皿，但是(另外地或可选择地)可以以溶液提供。可以使用约1mg/ml，或约1μg/cm²至约250μg/cm²或约1μg/cm²至约150μg/cm²的纤连蛋白溶液来涂布细胞培养皿。在一些实施方案中，用纤连蛋白以8μg/cm²至125μg/cm²涂布细胞培养皿。

本发明方法中使用的优选ECM包含至少两种不同的糖蛋白，如两种不同类型的胶原蛋白或胶原蛋白和层粘连蛋白。ECM可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。更优选的ECM由Matrigel^TM(BDBiosciences)提供，其包含层粘连蛋白、巢蛋白和胶原蛋白IV。

本发明的组合物可包含血清或可以不含血清和/或不含血清替代物，如本文其他地方所述。优选地，培养基和细胞制备物符合FDA生物产品要求标准的在线GMP工艺以确保产品的连续性。

培养基

本发明中使用的细胞培养基包括受本文所提供的限制的任何合适的细胞培养基。细胞培养基一般包含许多成分，其对于支持所培养细胞的维持是必需的。考虑到以下公开的内容，本领域技术人员容易配制合适的成分组合。本发明的培养基通常是含有标准细胞培养成分的营养液，所述细胞培养成分如氨基酸、维生素、无机盐、碳源和缓冲液，如下文中更详细的描述。

本发明的培养基一般在去离子蒸馏水中配制。一般在使用之前通过例如紫外光、加热、辐射或过滤来灭菌本发明的培养基以防止污染。可将培养基冷冻(如于-20°C或-80°C)以储存或运输。培养基可包含一种或多种抗生素以防止污染。培养基可具有内毒素，其含量低于0.1内毒素单位/ml或者0.05内毒素单位/ml。本领域众所周知确定培养基内毒素含量的方法。

优选的细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至pH7.4(优选具有pH7.2-7.6或至少pH7.2且不高于pH7.6)的限定的合成培养基，同时在含有5%至10%的CO₂，或至少5%且不超过10%的CO₂，优选5%的CO₂的空气中培养细胞。

本领域技术人员根据普通常识可以理解，可在本发明的细胞培养基中用作基本培养基的培养基种类。可能适合的细胞培养基可商购获得，并且包括但不限于：达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，最小必需培养基(MEM)，Knockout-DMEM(KO-DMEM)，Glasgow最小必需培养基(G-MEM)，伊格尔基本培养基(BME)，DMEM/Ham’s F12，改进型DMEM/Ham’s F12，伊思考夫改良杜尔贝可培养基和最小基本培养基(MEM)，Ham's F-10，Ham’s F-12，199培养基，以及RPMI1640培养基。

优选的细胞培养基选自补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12和RPMI1640。在进一步优选的实施方案中，使用改进型DMEM/F12或改进型RPMI，其对于无血清培养物是最佳的且已含有胰岛素。在这种情况下，优选地，所述改进型DMEM/F12或改进型RPMI培养基补充有谷氨酰胺和青霉素/链霉素。.

在一些实施方案中，基本培养基包含改进型DMEM F12、羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素、谷氨酰胺、N乙酰半胱氨酸、B27、N2和胃泌素。在一些实施方案中，培养由包含N2和胃泌素以及青霉素/链霉素的基本培养基开始，但是之后取出这些成分。例如，在一些实施方案中，N2和胃泌素以及青霉素/链霉素存在于本发明的EM1培养基中，但是不存在于EM2或DM中。例如，在一些实施方案中，N2和胃泌素以及青霉素/链霉素存在于本发明的EM1和EM2培养基中，但不存在于DM中。在特别优选的实施方案中，基本培养基是改进型DMEM/F12或DMEM变型，所述DMEM变型中补充有青霉素/链霉素、N2、B27、谷氨酰胺和胃泌素。

在优选实施方案中，基本培养基包含胃泌素。在一些实施方案中，基本培养基还包含NAc和/或B27。

进一步优选的是，所述细胞培养基补充有纯化的天然、半合成和/或合成的生长因子，并且不含不明确的成分，如胎牛血清或小牛血清。各种不同血清替代物的制剂可以通过商购得到且是本领域技术人员所熟知的。使用血清替代物时，根据常规技术可以使用按培养基体积计约1%至约30%的血清替代物。

扩增培养基(EM2):

本发明一方面提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1。该培养基被称为EM2。

优选地，Wnt激动剂是R-spondin1。包含EGF、R-spondin1、FGF和烟酰胺的培养基在此被称为ERFNic。

在一些实施方案中，EM2培养基不含Noggin，更优选地，不含BMP-抑制剂。在一些实施方案中，EM2培养基不含Wnt，例如Wnt-3a。

在一些实施方案中，除FGF之外还存在HGF。包含除FGF之外的HGF的优选培养基是ERFHNic(EGF+R-spondin(优选R-spondin1)+FGF(优选FGF10)+HGF+烟酰胺)。本发明人发现，ERFHNic培养基是长期扩增细胞的最佳培养基。缺乏HGF时，细胞在培养基中保持存活不超过三个月。进一步地，与存在HGF所培养的细胞相比，缺乏HGF时，10代之后，细胞显示生长不利，如由更低的增殖率所证实的。具体地，15代之后，缺乏HGF的细胞不会以与存在HGF的细胞相同的速率长成类器官。因而，发现HGF对于在长期培养中维持良好的增殖率是必需的。因而本发明提供了利用本发明的ERFHNic培养基培养细胞至少2周，至少1个月，至少2个月，更优选地，至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少15个月、至少20个月、至少24个月、至少25个月、至少30个月或更久，例如3年或更久。在实践中，本发明的一些实施方案包括利用E2持续细胞的大约20-30代。例如，细胞可以分裂20-30次，一般一周一次。优选地，细胞会以每周约4倍或一周2次群体倍增的速率扩增。本发明进一步提供了利用本发明的ERFHNic培养基培养细胞至少10代，例如，至少11、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60代，或者15至35代，例如大约20-30代。在一些实施方案中，TGF-β抑制剂如A83-01也存在于EM2培养基中。这在培养人细胞或类器官时特别有用。在一些实施方案中，A83-01以400至600nM的浓度存在，例如450-550nM、470-530nM或大约500nM。在EM2中存在TGF-β抑制剂的实施方案中，优选不存在Notch抑制剂。

扩增培养基(EM1):

一方面，本发明提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：EGF，BMP抑制剂，R-spondin和Wnt。优选地，BMP抑制剂是Noggin，并且EM1培养基被称为“ENRW”(EGF，Noggin，R-spondin和Wnt)。该培养基被称为EM1。本发明人发现包含Wnt和Noggin的培养基对于刺激细胞初期扩增是理想的。因而，在一些实施方案中，EM1培养基只使用1代或1周，但是同样设想EM1培养基可使用大约一年，因为其对细胞无害。因而，在一些实施方案中，从第0日至第10日使用EM1培养基培养细胞，例如第0-7日，第0-6日，第0-5日，第0-4日，第0-3日，第0-2日，第0-1日，其中第0日是细胞从其来源组织分离的那一日，第1日是随后的那一日，或者使用EM1培养基培养细胞1周或更久，例如2、3、4周或更久，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久。在一些实施方案中，EM1培养基仅在培养的第一日或者前两日使用。在一些实施方案中，使用EM1培养基持续1代或多代，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多代，例如，20-30代。在一些实施方案中，在冷冻步骤或任何其他运输步骤之后使用EM1培养基，所述运输步骤涉及不与最佳生长结合的培养基或温度变化。

EM1培养基补充有一种或多种选自以下的化合物：FGF、HGF、烟酰胺、胃泌素、B27、N-乙酰半胱氨酸和N2。在从冷冻库存或单细胞开始培养的情况下，EM1培养基优选补充有ROCK抑制剂。Y27632是用于本发明中的优选的ROCK抑制剂。

因而，在一个实施方案中提供了细胞培养基，其包含添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：表皮生长因子，能够结合FGFR2或FGFR4的FGF，优选FGF10以及HGF，这些作为促细胞分裂生长因子，

胃泌素，烟酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸，并且优选地，

BMP抑制剂，优选Noggin；以及

Wnt激动剂，优选R-spondin1和/或Wnt-3a。

还可以将B27(Invitrogen)，N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2(Invitrogen)，胃泌素(Sigma)以及烟酰胺(Sigma)添加至以上所限定的培养基中，并且认为其可刺激细胞增殖。在本发明的背景下，烟酰胺在此又被称为“Nic”。

“N2补充剂”可购自Invitrogen,Carlsbad,CA；www.invitrogen.com;目录号17502-048；以及PAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria;www.paa.com;目录号F005-004；Bottenstein&Sato,PNAS,76(1):514-517,1979。N2补充剂由PAA Laboratories GmbH以100倍的液体浓缩液提供，其包含500μg/ml人转铁蛋白，500μg/ml牛胰岛素，0.63μg/ml黄体酮，1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亚硒酸钠。可将N2补充剂以浓缩液添加至培养基中，或在添加至培养基之前稀释。其可以1倍终浓度或其他终浓度来使用。N2补充剂的使用是将转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和亚硒酸钠并入本发明的培养基中的方便方式。

“B27补充剂”(购自Invitrogen,Carlsbad,CA;www.invitrogen.com;当前目录号17504-044；以及PAA Laboratories GmbH,Pasching,Austria;www.paa.com;目录号F01-002；Brewer et al.,J Neurosci Res.,35(5):567-76,1993)可用于配制培养基，所述培养基包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。B27补充剂由PAA Laboratories GmbH以50倍的液体浓缩液提供，除其它成分外其包含生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素以及转铁蛋白。这些成分中至少亚麻酸、视黄醇、视黄醇乙酸酯和三碘甲状腺原氨酸(T3)是核激素受体激动剂。可将B27补充剂以浓缩液添加至培养基中，或在添加至培养基之前稀释。其可以1倍终浓度或其他终浓度来使用。B27补充剂的使用是将生物素、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、腐胺、视黄醇、视黄醇乙酸酯、亚硒酸钠、三碘甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、白蛋白、胰岛素和转铁蛋白并入本发明的培养基中的方便方式。

BMP抑制剂

优选添加至基本培养基的成分是BMP抑制剂。BMP作为二聚配体结合至由两种不同受体丝氨酸/苏氨酸激酶，I型和II型受体组成的受体复合物。II型受体使I型受体磷酸化，导致该受体激酶的活化。随后I型受体使特异受体底物(SMAD)磷酸化，致使信号转导通路引起转录活性。

BMP抑制剂定义为结合BMP分子以形成复合物的因子，其中所述BMP活性例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合而被中和。可选择地，所述抑制剂是担当拮抗剂或逆转激动剂的因子。这种类型的抑制剂与BMP受体结合并阻止BMP与所述受体的结合。后面这种因子的实例是抗体，其结合BMP受体并阻止BMP与抗体结合受体的相结合。

可将BMP抑制剂以这样的量添加至培养基中，如在相同细胞类型中所评估的，相对于缺乏所述抑制剂时的BMP活性水平，该量有效抑制细胞中BMP依赖性活性()最多90%，优选最多80%，更优选最多70%，更优选最多50%，更优选最多30%，更优选最多10%，更优选0%。如本领域技术人员所熟知，BMP活性可通过测定BMP的转录活性来确定，例如如Zilberberg et al.,2007.BMC Cell Biol.8:41中所示例的。

已知几类天然的BMP结合蛋白，包括Noggin(Peprotech)，腱蛋白和包含腱蛋白结构域的腱蛋白样蛋白(R&D systems)，卵泡抑素和包含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(R&D systems)，DAN和包含DAN半胱氨酸-结(knot)结构域的DAN样蛋白(R&D systems)，硬化蛋白/SOST(R&D systems)，核心蛋白聚糖(decorin,R&D systems)，以及α-2巨球蛋白(R&D systems)。

在本发明的方法中优选使用的BMP抑制剂选自Noggin、DAN和DAN-样蛋白(包括Cerberus和Gremlin(R&D systems))。这些可扩散的蛋白能够以不同程度的亲和力结合BMP配体并抑制它们接近信号受体。在基本培养基中添加这些BMP抑制剂中的任何一种阻止了干细胞损失。

优选的BMP抑制剂是Noggin。在本发明培养基的背景下，Noggin在此又被称为“N”。优选地，将Noggin以至少10ng/ml，更优选至少20ng/ml，更优选至少50ng/ml，更优选至少100ng/ml的浓度添加至基本培养基中。更加优选的浓度是大约100ng/ml或正好100ng/ml。在培养干细胞期间，可以将所述BMP抑制剂在需要时(例如每日或隔日)添加至培养基中。优选地，将BMP抑制剂每隔一日添加至培养基中。虽然需要时(例如每日或隔日)可更换培养基，但是优选每隔三日更换。

Wnt激动剂

可添加至基本培养基的另一成分是Wnt激动剂。在本发明培养基的背景下，Wnt激动剂在此又被称为“W”。Wnt信号通路由Wnt蛋白结合至卷曲蛋白(Frizzled)受体家族成员的细胞表面受体时发生的一系列事件来限定。这导致Dishevelled家族蛋白的活化，所述Dishevelled家族蛋白抑制蛋白复合物包括轴蛋白(axin)、GSK-3和蛋白APC降解细胞内β-连环蛋白(β-catenin)。所得到的富集的核β-连环蛋白增强了通过TCF/LEF家族转录因子的转录。

将Wnt激动剂定义为细胞中激活TCF/LEF-介导的转录的因子。因而Wnt激动剂选自结合并激活卷曲蛋白受体家族成员的真正的Wnt激动剂，包括任何及全部的Wnt家族蛋白，细胞内β-连环蛋白降解的抑制剂以及TCF/LEF的激活剂。将所述Wnt激动剂以这样的量添加至培养基中，如在相同细胞类型中所评估的，相对于缺乏所述分子时的所述Wnt活性水平，该量有效刺激细胞中Wnt活性至少10%、更优选至少20%、更优选至少30%、更优选至少50%、更优选至少70%、更优选至少90%、更优选至少100%。如本领域技术人员所熟知，可以通过测定Wnt的转录活性来确定Wnt活性，例如通过pTOPFLASH和pFOPFLASH Tcf荧光素酶报告构建体(Korinek et al.,1997.Science275:1784–1787)。

Wnt激动剂可包括分泌型糖蛋白，其包括Wnt-1/Int-1；Wnt-2/Irp(Int-1相关蛋白)；Wnt-2b/13；Wnt-3/Int-4；Wnt-3a(R&D systems)；Wnt-4；Wnt-5a；Wnt-5b；Wnt-6(Kirikoshi H et al.2001.Biochem Biophys Res Com283:798-805)；Wnt-7a(R&D systems)；Wnt-7b；Wnt-8a/8d；Wnt-8b；Wnt-9a/14；Wnt-9b/14b/15；Wnt-10a；Wnt-10b/12；Wnt-11；以及Wnt-16。人Wnt蛋白的概况由“THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS”,R&D Systems Catalog,2004提供。

另外的Wnt激动剂包括分泌型蛋白的R-spondin家族，其与Wnt信号通路的激活和调控相关，且由4个成员(R-spondin1(NU206,Nuvelo,San Carlos,CA)、R-spondin2((R&D systems)、R-spondin3和R-spondin-4)组成；以及Norrin(又被称为Norrie病蛋白或NDP)(R&D systems)，其是分泌型调控蛋白，由于以高亲和力结合卷曲蛋白-4受体而类似Wnt蛋白起作用并诱导Wnt信号通路的激活(Kestutis Planutis et al.(2007)BMCCell Biol.8:12)。

可以将模拟R-spondin活性的化合物用作本发明的Wnt激动剂。最近发现R-spondin与Lgr5相互作用。因而，Lgr5激动剂如激动型抗-Lgr5抗体是可用于本发明中的Wnt激动剂的例子。

在本发明培养基的背景下，R-spondin在此又被称为“R”。

最近被鉴定的Wnt信号通路的小分子激动剂氨基嘧啶衍生物同样作为Wnt激动剂被明显包括(Liu et al.(2005)Angew Chem Int Ed Engl.44,1987-90)。

已知的GSK抑制剂包括小干扰RNA(siRNA;Cell Signaling)、锂(Sigma)、kenpaullone(Biomol International;Leost,M.et al.(2000)Eur.J.Biochem.267,5983–5994)、6-溴靛玉红-30-丙酮肟(Meijer,L.et al.(2003)Chem.Biol.10,1255–1266)、SB216763和SB415286(Sigma-Aldrich)，以及防止GSK-3与轴蛋白相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生的肽。综述由Meijer et al.,(2004),Trends in Pharmacological Sciences25,471-480提供，在此通过引用并入。测定GSK-3抑制水平的方法和测定是本领域人员所熟知的，包括例如Liao et al2004,Endocrinology,145(6):2941-9)中所描述的方法和测定。

在优选实施方案中，所述Wnt激动剂选自Wnt家族成员、R-spondin1-4(例如，R-spondin1或R-spondin4)、Norrin以及GSK抑制剂中的抑制或多种。本发明人发现将至少一种Wnt激动剂添加至基本培养基对于肝脏上皮干细胞或分离的胆管或分离的肝脏碎块的增殖是重要的。

在进一步优选的实施方案中，所述Wnt激动剂包括R-spondin1或由R-spondin1组成。优选地，将R-spondin1以至少200ng/ml、更优选至少300ng/ml、更优选至少500ng/ml的浓度添加至基本培养基中。还更优选的R-spondin1浓度是大约500ng/ml或正好500ng/ml。在培养干细胞期间，可将所述Wnt家族成员在需要时(例如每日或隔日)添加至培养基中。优选地，将Wnt家族成员每隔一日添加至培养基中。虽然需要时(例如每日或隔日)可更换培养基，但是优选每隔三日更换。

在优选实施方案中，Wnt激动剂选自R-spondin、Wnt-3a和Wnt-6。更优选地，R-spondin和Wnt-3a都用作Wnt激动剂。该组合是特别优选的，因为令人惊奇地，该组合对类器官形成具有协同效应。优选的浓度对于R-spondin是1-500ng/ml，例如1-10ng/ml、10-100ng/ml、1-50ng/ml、10-200ng/ml、200至500ng/ml、30ng/ml，对于Wnt3a是100ng/ml至1000ng/ml，例如100ng/ml或1000ng/ml。

优选地，Wnt激动剂是Wnt配体，例如，如Wnt3a，并且可以新鲜添加至培养基中。可选择地，Wnt配体通过用表达所述Wnt配体的合适的表达构建体感染细胞系转染或者感染细胞系而表达于细胞系中。培养所述细胞系并在适当的时间间隔收获包含分泌型Wnt配体的培养基。例如，细胞在其一达到汇合且停止生长时就产生Wnt3a。将来自未用所述表达构建体转染或感染的细胞的培养基用作对照。收获并检测条件培养基，例如在荧光素酶表达受TCF反应元件控制的试验中来检测诸如Wnt3a的Wnt激动剂的存在(Korinek et al.、1997.Science275:1784–1787)。在再生组织的培养物中使用时，将培养基稀释。如本领域人员所熟知的，有时添加过量的Wnt配体与添加过少的Wnt配体一样，对于培养是有害的。因此，条件培养基的实际稀释度将取决于试验中确定的Wnt配体的量。

促细胞分裂生长因子

添加至基本培养基的又一成分是促细胞分裂生长因子的组合，其选自表皮生长因子(EGF，(优选来自Peprotech)，能够结合FGFR2或FGFR4的成纤维细胞生长因子(FGF)，以及肝细胞生长因子(HGF)(同样优选来自Peprotech)。能够结合FGFR2(FGF受体)或FGFR4的FGF优选FGF4、FGF7或FGF10(优选来自Peprotech)，最优选FGF10。优选使用全部3种EGF、FGF和HGF。在本发明培养基的背景下，EGF在此又被称为“E”，FGF在此又被称为“F”，以及HGF在此又被称为“H”。EGF对于各种培养的外胚层和中胚层细胞是有效的促细胞分裂因子，并且对体内和体外特定细胞和细胞培养中一些成纤维细胞的分化具有深刻的影响。EGF前体作为膜结合分子存在，其被蛋白水解切割以形成刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。EGF通过结合至定位EGF受体的质膜发挥其对靶细胞的作用。EGF受体是跨膜蛋白酪氨酸激酶。EGF结合至受体导致激酶的活化以及随后的受体自磷酸化。自磷酸化对于受体与其底物的相互作用是必需的。由EGF激活的信号转导通路包括磷脂酰肌醇通路，导致蛋白激酶C的活化并增加细胞内Ca2+浓度，以及致使MAP激酶活化的ras通路。这些通路参与调控细胞增殖，分化和存活(Herbst,2004,Int Journal of radiationoncology,59,2,S21-S26)。

优选地，将EGF以5至500ng/ml或至少5且不高于500ng/ml的浓度添加至基本培养基中。优选的浓度是至少10、20、25、30、40、45或50ng/ml且不高于500、450、400、350、300、250、200、150或100ng/ml。更优选的浓度是至少50且不高于100ng/ml。甚至更优选的浓度是约50ng/ml或50ng/ml。

FGF10是属于成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白家族的蛋白。FGF家族成员具有广泛的促细胞分裂和细胞存活活性，并且参与多种生物学过程，包括胚胎发育、细胞生长、形态发生、组织修复、肿瘤生长和入侵。FGF通过与细胞表面酪氨酸激酶受体(FGFR)相互作用来刺激细胞。已鉴定出四种密切相关的受体(FGFR1–FGFR4)。已显示FGFR1–FGFR3基因编码多种亚型，并且这些亚型可能是确定配体特异性的关键。大部分FGF结合多于一种受体(Ornitz J Biol Chem.1998Feb27;273(9):5349-57)。然而，FGF10和FGF7在FGF中是独特的，因为它们仅与特异的FGFR2亚型(被称为FGFR2b，其仅由上皮细胞专门表达)相互作用(Igarashi,J Biol Chem.1998273(21):13230-5)。FGF10是优选的能够结合FGFR2或FGFR4的FGF。

肝细胞生长因子/离散因子(HGF/SF)是通过结合至原癌性c-Met受体之后激活酪氨酸激酶信号级联来调控细胞生长、细胞运动和形态发生的形态发生因子。

对于FGF10和HGF可以使用相同的浓度。对于FGF10，优选的浓度是20、50、100、500ng/ml，不高于500ng/ml。对于HGF，优选的浓度是1、10、20、50ng/ml，不高于50ng/ml。培养干细胞期间，需要时(例如，每日或每隔一日)优选将所述促细胞分裂生长因子(即EGF、FGF10和HGF)的组合添加至培养基中。优选的是每隔一日添加。虽然需要时(例如每日或每隔一日)可以更换培养基，但是优选每隔三日更换。

在一些实施方案中，诸如A83-01的TGF-β抑制剂也存在于EM1培养基中。这在培养人细胞或类器官时是特别有用的。在一些实施方案中，A83-01以400-600nM，例如450-550nM、470-530nM或大约500nM.的浓度存在。在EM1中存在TGF-β抑制剂的实施方案中，优选不存在Notch抑制剂。

本发明优选的扩增培养基

实施例中描述了优选的培养基和利用这些培养基的方法。

例如，细胞培养基可包含添加了以下成分的基本培养基或由添加了以下成分的基本培养基组成：EGF和R-spondin1，并补充有FGF10，HGF和烟酰胺；例如，EGF(50ng/ml)和R-spondin1(1ug/ml)，并补充有FGF10(100ng/ml)，HGF(25-50ng/ml)和烟酰胺(1-10mM)。本发明人发现，该培养基对于长期扩增细胞是优选的。因此，该细胞培养基优选用作本发明的EM2。优选地，基本培养基补充有B27，N2和200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中，基本培养基是改进型DMEM/F12。然而，可以使用任何其他合适的基本培养基。

实施例中描述了另一优选的细胞培养基和使用该培养基的方法，优选地，所述培养基包含补充有以下成分的改进型DMEM/F12或由补充有以下成分的改进型DMEM/F12组成：B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGF、1μg/ml R-spondin1、10nM胃泌素、100ng/ml FGF10、10mM烟酰胺和50ng/ml HGF以及50%Wnt条件培养基，以及优选10-100ng/ml Noggin。Wnt条件培养基包含改进型DMEM、P/S、B27、N2以及还有FCS。用Wnt3A表达质粒转染的293T细胞产生Wnt。几日之后获得整个培养基(即具有分泌的Wnt)并用作Wnt来源。

因此，本发明提供了细胞培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成：

表皮生长因子，能够结合FGFR2或FGFR4的FGF，优选FGF10以及HGF，这些作为促细胞分裂生长因子，

胃泌素、烟酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，以及优选地，

BMP抑制剂，更优选Noggin，和

Wnt激动剂，更优选R-spondin1和/或Wnt-3a。

因而本发明包括第一优选的培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成：

作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF10和HGF，

胃泌素、烟酰胺、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸，

BMP抑制剂，更优选Noggin，和

Wnt激动剂，更优选R-spondin1和Wnt-3a。

该培养基可以用作本发明的EM1细胞培养基来刺激细胞的初期扩增。

在一些实施方案中，用作EM1细胞培养基的培养基包含本发明的EM2培养基的全部成分且另外包含Wnt-3a和Noggin。

在补充有N-乙酰半胱氨酸，B27和N2的基本培养基的实施方案中，以下成分优选添加至培养基中：EGF、R-spondin1、胃泌素、FGF10、烟酰胺和HGF以及Wnt-条件培养基。优选地，基本培养基补充有依照以上所述量的N-乙酰半胱氨酸、EGF、R-spondin1、胃泌素、FGF10、烟酰胺和HGF以及Wnt条件培养基。

例如，在一些实施方案中，基本培养可补充有150ng/ml至250ng/mlN-乙酰半胱氨酸；优选地，基本培养基补充有大约或正好200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有40ng/ml至60ng/ml EGF；优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml EGF。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有0.5μg/ml至1.5μg/mlR-spondin1；优选地，基本培养基补充有大约或正好1μg/ml R-spondin1。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有5nM至15nM胃泌素；优选地，基本培养基补充有大约或正好10nM胃泌素。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有25-200ng/ml FGF10，例如70ng/ml至130ng/ml FGF10；优选地，基本培养基补充有大约或正好100ng/mlFGF10。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有5mM至15mM烟酰胺；优选地，基本培养基补充有大约或正好10mM烟酰胺。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有25ng/ml至100ng/ml HGF，例如35ng/ml至65ng/ml HGF；优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml HGF。例如，在一些实施方案中，基本培养基可补充有35%至65%Wnt条件培养基；优选地，基本培养基补充有大约或正好50%Wnt条件培养基。

在一些实施方案中，胃泌素和N2中的一种或两种并不存在于细胞培养基中。

优选地，基本培养基是改进型DMEM/F12。

优选地，该第一培养基(例如，EM1、EM2或者EM1和EM2二者)在本发明培养方法的开始两周使用。然而，其可用于更短的时间段，例如1、2、3、5、7或10日，或者更长的时间段，例如3、4、5、10、20周或更久，5个月或更久，例如，6、7、8、9、10、11、12个月或更久。

分化培养基(DM):

另一方面，提供了第二细胞培养基，其包含添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基或由添加了以下成分的人或动物细胞的基本培养基组成：EGF、TGF-β抑制剂和Notch抑制剂。本发明人发现，该培养基对于分化细胞是有用的。用于分化细胞的培养基在此可被称为DM。

优选地，第二细胞培养基还包含FGF和/或HGF。在一个实施方案中，第二培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：

作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子，FGF10和HGF；

Notch抑制剂；以及

TGF-β抑制剂。

在一个实施方案中，TGF-β抑制剂是A83-01和/或Notch抑制剂是DAPT。在另一实施方案中，DM细胞培养基还包含地塞米松。

优选的第二细胞培养基和利用该培养基的方法描述于实施例中，所述培养基包含添加了以下成分的基本培养基或由添加了以下成分的基本培养基组成：50ng/ml EGF、100ng/ml FGF10、50nM A8301和10uMDAPT。与任何其他合适的基本培养基一样，改进型DMEM/F12可用作基本培养基。

在一些实施方案中，第二细胞培养基不含R-spondin或Wnt。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含Wnt激动剂。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含烟酰胺。在一些实施方案中，第二细胞培养基不含BMP抑制剂。

本发明人发现，R-spondin1和烟酰胺都抑制成熟肝细胞标志物CYP3A11的表达却促进成肝母细胞标志物白蛋白的表达。因此，为了增强细胞分化成更成熟的肝脏命运，本发明人从细胞培养中去除R-spondin和烟酰胺。本发明人还发现特异性胆管转录因子的表达在含有R-spondin1的扩增培养基中高度上调，表明培养物基因表达不平衡地偏向更多的胆管细胞命运。Notch和TGF-β信号通路影响体内胆管细胞命运。实际上，缺失Rbpj(实现活性Notch信号通路所必需的)导致异常的小管发生(ZongY.Development2009)，而向肝脏外植体添加TGF-β利于体外胆管分化(Clotman F.Genes and Development2005)。由于Notch和TGF-β信号通路在肝脏培养物中都高度上调(图9)，本发明人推测抑制胆管细胞命运可能触发细胞向更多的肝细胞表型分化。发现向优选不含R-spondin或Wnt的分化培养基中添加TGF-β抑制剂(如A8301)和Notch抑制剂(如DAPT)增强成熟肝细胞标志物的表达，并且增加肝细胞样细胞的数量(例如，参见实施例2)。

Notch是可通过多重蛋白水解切割而激活的跨膜表面受体，其中的一种由具有蛋白酶活性的蛋白复合体(被称为γ-分泌酶)切割。γ-分泌酶是在膜内实施其切割活性的蛋白酶。γ-分泌酶是多元复合酶，并且由至少四种不同的蛋白组成，即早老蛋白(早老蛋白1或2)、nicastrin，PEN-2和APH-I。早老蛋白是γ-分泌酶的催化中心。配体结合Notch受体时经过构象变化，这允许通过金属蛋白酶ADAM蛋白酶作用而脱落胞外域。在这之后紧接着是γ-分泌酶复合体作用，其导致Notch细胞内结构域(NICD)的释放。NICD易位至细胞核与CSL(C-启动子结合因子/重组信号序列结合蛋白Jκ/无毛阻抑物(Supressor-of-Hairless)/Lagl)相互作用。NICD的结合将CSL由转录阻遏物转化为致使Notch靶基因表达的激活剂。在本发明的背景下可使用的优选的Notch抑制剂实例是：γ-分泌酶抑制剂，如DAPT或二苯并氮卓(dibenzazepine,DBZ)或苯二氮卓(benzodiazepine,BZ)或LY-411575，这些是能够减少配体介导的Notch活化的抑制剂(例如通过Notch的显性阴性配体或通过显性阴性Notch或通过能够至少部分阻断Notch配体与Notch之间的相互作用的抗体)，或者ADAM蛋白酶的抑制剂。

TGF-β信号通路参与许多细胞功能，包括细胞生长，细胞命运和细胞凋亡。信号通路一般由TGF-β超家族配体与II型受体的结合开始，这募集I型受体并使其磷酸化。然后I型受体使SMAD磷酸化，其充当细胞核内的转录因子，并调控靶基因的表达。可选择地，TGF-β信号通路可激活MAP激酶信号通路，例如通过p38MAP激酶。TGF-β超家族配体包括骨形态发生蛋白(BMP)，生长分化因子(GDF)，抗穆勒氏管激素(AMH)，激活素，nodal以及TGF-β。

TGF-β抑制剂是降低TGF-β信号通路活性的因子。本领域已知许多破坏TGF-β信号通路的方式，其可与本发明结合使用。例如，TGF-β信号通路可由以下方式破坏：通过小干扰RNA策略抑制TGF-β表达；抑制弗林蛋白酶(furin，使TGF-β激活的蛋白酶)；通过生理学抑制剂抑制通路，如由Noggin、DAN或DAN-样蛋白抑制BMP；用单克隆抗体中和TGF-β；用TGF-β受体激酶1(又被称为激活素受体样激酶，ALK5)、ALK4、ALK6、ALK7或其他TGF-β相关的受体激酶的小分子抑制剂抑制；通过过表达其生理学抑制剂Smad7或通过利用硫氧还蛋白作为Smad锚着蛋白使Smad不能活化来抑制Smad2和Smad3信号通路(Fuchs,O.Inhibition ofTGF-Signaling for the Treatment of Tumor Metastasis and Fibrotic Diseases.Current Signal Transduction Therapy,Volume6,Number1,January2011,pp.29-43(15))。

已知确定物质是否是TGF-β抑制剂的多种方法，并且这些方法可与本发明结合使用。例如，细胞检测可在用在包含驱动荧光素酶报告基因的人PAI-1启动子或Smad结合位点的报告基因构建体稳定转染的细胞中。相对于对照组的荧光素酶活性的抑制可用作化合物活性的测量标准(De Gouville et al.,Br J Pharmacol.2005May;145(2):166–177)。

根据本发明，TGF-β抑制剂可以是蛋白、肽、小分子、小干扰RNA、反义寡核苷酸、适体或抗体。抑制剂可以是天然存在的或合成的。可用于本发明中的优选小分子TGF-β抑制剂的实例包括列于表1中的小分子抑制剂：

表1靶向受体激酶的小分子TGF-β抑制剂

本发明的方法可包括利用一种或多种表1中所列的任意抑制剂。本发明的方法可包括利用所列的一种抑制剂与另一种抑制剂的任意组合。例如，本发明的方法可包括利用SB-525334或SD-208或A83-01；或者本发明的方法可包括利用SD-208和A83-01；或者本发明的方法可包括利用SD-208和A83-01。技术人员将理解，存在许多主要设计为靶向其他激酶的其他小分子抑制剂，但是其在高浓度时同样可抑制TGF-β受体激酶。例如，SB-203580是p38MAP激酶抑制剂，认为其在高浓度时(例如，大约10uM或更高)抑制ALK5。任何这类抑制TGF-β信号通路的抑制剂同样可在本发明中使用。

可将A83-01以10nM至10uM，或20nM至5uM，或50nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约500nM的A83-01添加至培养基中。在EM中使用时，可将A83-01以350-650nM的浓度添加至培养基中，例如，450-550nM，更优选大约500nM。在DM中使用时，可将A83-01以25-75nM的浓度添加至培养基中，例如，40-60nM或大约50nM。

可将SB-431542以80nM至80uM，或100nM至40uM，或500nM至10uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约1uM的SB-431542添加至培养基中。

可将SB-505124以40nM至40uM，或80nM至20uM，或200nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约500nM的SB-505124添加至培养基中。

可将SB-525334以10nM至10uM，或20nM至5uM，或50nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约100nM的SB-525334添加至培养基中。

可将LY364947以40nM至40uM，或80nM至20uM，或200nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约500nM的LY364947添加至培养基中。

可将SD-208以40nM至40uM，或80nM至20uM，或200nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约500nM的SD-208添加至培养基中。

可将SJN2511以20nM至20uM，或40nM至10uM，或100nM至1uM的浓度添加至培养基中。例如，可将大约200nM的A83-01添加至培养基中。

另一方面，本发明提供了可选择的第二培养基，其包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：

作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子，FGF10和HGF；

胃泌素，烟酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸。

该可选择的第二培养基作为分化培养基(DM)是有用的。优选地，该可选择的第二培养基在培养开始的两周之后使用。在该阶段，似乎不再需要BMP抑制剂和Wnt配体。因而，在一些实施方案中，可选择的第二培养基不含BMP抑制剂或Wnt配体。在一些实施方案中，可选择的第二培养基不含BMP抑制剂或Wnt激动剂。

正如第一培养基(EM，即EM1和EM2或EM1或EM2)，在一些实施方案中，基本培养基可补充有如上文所述量的N-乙酰半胱氨酸、EGF、胃泌素、FGF10、烟酰胺和HGF。例如，优选地，基本培养基补充有大约或正好200ng/ml N-乙酰半胱氨酸。优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml EGF。优选地，基本培养基补充有大约或正好10nM胃泌素。优选地，基本培养基补充有大约或正好100ng/ml FGF10。优选地，基本培养基补充有大约或正好10mM烟酰胺。优选地，基本培养基补充有大约或正好50ng/ml HGF。

本发明中使用的第一和第二细胞培养基允许上皮干细胞或肝脏上皮干细胞或分离的胆管或分离的肝脏碎块在细胞外基质上存活和/或增殖和/或分化。

允许存活和/或增殖的培养基是优选诱导或促进细胞存活和/或增殖至少5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200日的培养基。可以利用本领域已知的技术来评估增殖，如可以进行BrdU染色、Edu染色、Ki67染色以及利用生长曲线测定。例如，我们已证明，10个胆管培养6日之后，可以稀释至6个孔，每孔具有10个类器官(60个新的类器官)。每次6日的传代中，我们可以产生大约360个类器官。在32周内每周进行1次传代，仅7个月我们就能够产生超过11,000(11520)个新的类器官结构。这对于工业生产是重要的，因为用于移植的细胞和类器官的可用性形成重要问题。对于小鼠移植而言，例如，需要至少10⁵个细胞。为了成功移植，人移植可能需要10⁶或10x10⁶个细胞。

换言之，在适当的条件下，本发明使用的培养基能够扩增干细胞群传代至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100次形成肝脏的类器官。

以上所定义的第二培养基优选诱导或促进培养至少5日的细胞特异性分化。分化可通过检测与在此所定义的肝脏谱系相关的特异性标志物的存在来测定。取决于标志物的特性，所述标志物的表达可通过在此所定义的第一培养基或者第一培养基接着第二培养基中培养至少5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16日之后，通过RTPCR或免疫组化来评估。

分化培养基是优选诱导或促进培养至少5日的细胞特异性分化的培养基。分化可通过检测与在此所定义的肝脏谱系相关的特异性标志物的存在来测定。

在本发明的背景下，术语细胞培养基与介质、培养基、细胞介质、基本培养基或基本细胞介质或基本细胞培养基或扩增培养基或分化培养基同义。

本发明另一方面提供了包含本发明培养基的气密容器。在一些实施方案中，培养基是扩增培养基。在一些实施方案中，培养基是分化培养基。为了防止污染，气密容器对于运输或储存培养基可能是优选的。容器可以是任何合适的容器，例如烧瓶、平皿、瓶子、广口瓶、小瓶子或袋子。

获得和/或培养干细胞的方法

获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，包括在存在本发明的一种或多种细胞培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块。

在一些实施方案中，获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，包括在存在EM1培养基然后是EM2培养基然后是DM培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块。

在一些实施方案中，获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，包括在存在EM2培养基然后是DM培养基，且不使用EM1培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块。

在一些实施方案中，获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，包括在存在EM1培养基然后是DM培养基，且不使用EM2培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块。

获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，可包括：

i)在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF以及HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1-4中的任意一种；以及，接着

ii)在存在如本文所定义的第二细胞培养基(DM培养基)的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块。

在一些实施方案中，在步骤i)之前，所述方法包括在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：EGF、BMP抑制剂、R-spondin和Wnt。优选地，BMP抑制剂是Noggin，并且EM1培养基被称为“ENRW”(EGF、Noggin、R-spondin和Wnt)。

在一个实施方案中，提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括：

在如本文所述的EM2培养基中，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述EM2培养基例如，包含诸如R-spondin的Wnt激动剂，表皮生长因子，能够结合FGFR2或FGFR4的FGF，优选FGF10，以及烟酰胺。优选地，所述培养基还包含HGF。

在进一步的实施方案中，提供了获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括：

在培养基中，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含BMP抑制剂，Wnt激动剂，作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF以及HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，胃泌素，烟酰胺，B27，N2以及N-乙酰半胱氨酸。

在另一优选的方法中，在如上所定义的EM1培养基中培养至少2周之后，在不含BMP抑制剂和Wnt激动剂的培养基中继续培养。在一些实施方案中，该培养在本发明的EM2中继续进行。在可选择的实施方案中，所述培养在本发明的第二培养基(DM)中继续进行，所述第二培养基(DM)还包含诸如A83-01的TGF-β抑制剂和诸如DAPT的Notch抑制剂、在一些实施方案中，该培养在本发明的EM2中然后在DM培养基中继续进行。

因而获得和/或培养肝脏的类器官、上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的肝脏组织碎块的优选方法是在第一培养基(EM)中进行第一步培养，接着在第二培养基(DM)中进行分开的第二步培养。第一步培养可持续至少两周，也可以更久，例如，3周或更久，4周或更久或1、2、3、4、5、6、7、8个月或更久。第二步培养优选持续6周或更短，更优选1个月或更短，例如3周或更短，2周或更短，1周或更短。已发现许多细胞在DM中2周之后开始死亡，因而优选地，第二步培养2周或更短，或最多1个月。因此，仅在不太优选的实施方案中，第二步可持续8、9、10、11、12、13、14、15、16日或3周或1、2、3、4、5、6个月或更久。每一步优选利用本文所定义的细胞外基质和本文详述的培养基来进行。

在可选择的另一实施方案中，所述方法在第一培养基中进行，无需转换到第二培养基。该方法持续8、9、10、11、12、13、14、15、16日或3周或1、2、3、4、5、6、7、8个月或更久。

在一些实施方案中，本发明第一培养基的培养步骤包括在EM1培养基中培养，然后在EM2培养基中培养。因而，以上所述的时间可指细胞或碎块在EM1接着在EM2培养基中培养的总时间。在一些实施方案中，在EM1培养基中培养的步骤可持续少于10日，例如少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、少于3、少于2或少于1日。在一些实施方案中，在EM1培养基中培养的步骤可持续1至10日、例如，1-7日、2-6日、3-5日，例如4或5日。在一些实施方案中，在EM2培养基中培养的步骤可持续10日或更久，例如，11、12、13、14、15、16日或更久，或1-3周或2-4周或3-6周或1、2、3、4、5、6个月或更久。

每种培养基中存在的各化合物的优选浓度已在本文说明书或实施例中限定。

本文所述的获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法还可用于获得和/或培养表达Lgr5的细胞群，这样的方法包括于本发明中。因而还提供了通过本发明的方法获得表达Lgr5的细胞群。

本领域技术人员显而易见的是，本发明优选的培养方法是有优势的，因为并不需要饲养细胞。饲养细胞层通常用于支持干细胞的培养并抑制它们的分化。饲养细胞层一般是与关注的细胞共同培养且为其提供合适的生长表面的单层细胞。饲养细胞层提供了关注的细胞能生长的环境。饲养细胞通常是有丝分裂失活的(例如通过辐射或用丝裂霉素C处理)，以防止其增殖。不期望利用饲养细胞，因为其使细胞传代复杂化(每一次传代必需将细胞与饲养细胞分离，并且每一次传代都需要新的饲养细胞)。饲养细胞的利用可致使期望的细胞受饲养细胞污染。这对于医疗应用显然是有问题的，甚至是研究领域，使对细胞进行的任何实验结果的分析复杂化。如本文其它地方所述，本发明的培养基特别有优势，因为它们可用于培养细胞而无需接触饲养细胞，即本发明的方法并不需要饲养细胞层来支持其生长被支持的细胞。

因此，本发明的组合物可以是不含饲养细胞的组合物。如果组合物中的肝细胞在缺乏饲养细胞层时被培养至少一代，通常认为该组合物不含饲养细胞。本发明不含饲养细胞的组合物一般含有少于约5%，少于约4%，少于约3%，少于约2%，少于约1%的饲养细胞(表示为组合物中细胞总量的%)或优选完全没有饲养细胞。

在一个优选的实施方案中，例如，如果将肝脏的类器官用于再生医学，所述方法可由上皮细胞或分离的肝脏碎块开始。细胞或肝脏碎块可以是自体的或异体的。“自体的”细胞是来源于将其再次引入用于细胞疗法(例如为了允许组织再生)的同一有机体的细胞。原则上，自体细胞并不要求与患者相匹配来在移植时克服免疫排斥的问题和/或减少免疫抑制干扰的需要。“异体的”细胞是来源于与将其引入用于细胞疗法(例如为了允许组织再生)的个体不同的个体，但是是同一物种的细胞。仍然要求一定程度的患者匹配以预防排斥的问题。本领域技术人员熟知使组织排斥最小化的技术。

本发明的优选方法包括培养含有所述上皮干细胞的分离的肝脏碎块的方法。

另一优选的方法包括从上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的肝脏碎块获得肝脏的类器官的方法。

另一优选的方法包括从上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的肝脏碎块获得和培养肝脏的类器官的方法。

如本文前面所确定的优选方法中，BMP抑制剂选自Noggin、DAN和DAN样蛋白(包括Cerberus和Gremlin)，优选地，包括Noggin或者为Noggin，和/或所述Wnt激动剂选自一种或多种Wnt，优选Wnt-3a、R-spondin1-4、Norrin以及GSK抑制剂，更优选地，包括Wnt-3a和/或R-spondin或者为Wnt-3a和/或R-spondin。

在另一优选的方法中，肝脏的类器官源自一个单细胞，优选表达Lgr5的细胞，更优选地，其中所述单细胞包含含有关注的核酸分子的核酸构建体。细胞还可以表达肝脏特异的标志物，如Hnf1α和Hnf4。

以前已描述了表达Lgr5的某些细胞类型的分离(参见例如WO2009/022907和WO2010/016766)。然而，本文公开的表达Lgr5的肝脏特异的干细胞类型以前并未描述过。因此，本发明提供了通过以显著水平天然表达至少Lgr5和一种或多种以下标志物来表征的成体干细胞群：Hnf1α、Hnf4a、Sox9、KRT7和KRT19。该细胞群还表达小肠和胃中常见的祖细胞群标志物，如Cd44和Sox9(Barker&Huch et al Cell stemcell2010)。这些在本发明的干细胞中高度表达，但是并不在成体肝脏中表达，这加强了本文所述的肝脏培养物的自我更新能力。本发明此方面的细胞还可上调Wnt靶基因，包括例如，MMP7、Sp5和Tnfrs19。这为需要活跃且稳健的经典Wnt信号通路活性以维持这些培养物的自我更新能力提供了有力证据。

“天然表达”意味着细胞并没有以任何方式进行重组操纵，即细胞并未通过引入外源基因材料而被人工诱导来表达这些标志物或调控这些标志物的表达，如引入外源(非天然)或更强的启动子或其他调控序列可操作地连接于内源基因或外源引入形式的基因。天然表达来自于细胞内的基因组DNA，包括外显子编码序列之间的内含子(如果存在这些的话)。天然表达不来自于cDNA。必要的话，天然表达可以通过任何一种不同的方法来证明，例如对基因读码框进行测序以检查不存在外来的异源序列。“成体”意指胚胎后。对于本发明的干细胞，术语“成体干细胞”意指从动物胚胎期以后的生长阶段的组织或器官分离的干细胞。

该干细胞群还可通过以任意显著水平缺乏某些标志物的天然表达来表征，其中许多标志物与细胞分化相关。具体地，分离的成体干细胞群的细胞不以显著水平天然表达Cd11b、CD13、CD14、AFP、Pdx1、任何CYP成员(如CYP3A11、CYP11A1)中的一种或多种。如本文所定义，这些标志物被称为阴性标志物。

术语“表达的”用于描述细胞内标志物的存在。为了被认为是表达的，标志物必须以可检测的水平存在。“可检测的水平”意味着可利用诸如PCR、印迹或FACS分析的标准实验室方法中的一种来检测标志物。如果表达在30个PCR循环之后可被合理地检测到(相当于每个细胞至少约100个拷贝的细胞表达水平)，就认为基因是由本发明的细胞群表达的。术语“表达(express)”和“表达(expression)具有一致的含义。表达水平低于此阈值时，认为标志物未表达。标志物在本发明细胞中的表达水平与同一标志物在另一细胞(例如如胚胎干细胞)中的表达水平之间的比较，可优选通过比较从从同一物种分离的两种细胞类型来进行。优选该物种为哺乳动物，并且更优选该物种为人。这样的比较可方便地利用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)实验来进行。

本领域内已知的许多物理分离方法中的任何一种都可用于选择本发明此方面的细胞，并且将其与其他细胞类型进行区别。这样的物理方法可包括基于由本发明的细胞特异性表达的标志物的FACS和各种免疫-亲和方法。如上所述，Lgr5、Hnf1α和Hnf4是在本发明的细胞中以高水平表达的3种细胞标志物。因此，仅以示意的方式，本发明的细胞可通过许多物理分离方法来分离，这依赖于这些标志物的存在。

在一个实施方案中，本发明的细胞可利用如抗这些标志物中的一种的抗体通过FACS分离。对于本领域技术人员显而易见的是，这可通过荧光标记的抗体，或通过荧光标记的与一抗特异性结合的二抗来实现。合适的荧光标记的实例包括但不限于FITC、Alexa488、GFP、CFSE、CFDA-SE、DyLight488、PE、PerCP、PE-Alexa700、PE-Cy5

PE-Cy5.5、PI、PE-Alexa750以及PE-Cy7。该列表仅以示例的方式提供，并不意欲限制。

对于本领域技术人员显而易见的是，利用抗-Lgr5抗体的FACS分析将提供纯化的细胞群。然而，在一些实施方案中，可优选进一步通过利用其他可识别的标志物中的一种或多种进行另一轮FACS分析来纯化细胞群，优选Hnf1α和Hnf4，但是也可使用其他的标志物。

在另一实施方案中，本发明的细胞可通过免疫-亲和纯化来分离，这是本领域所熟知的分离方法。仅以示意的方式，本发明的细胞可通过针对c-kit的免疫-亲和纯化来分离。对于本领域技术人员显而易见的是，该方法依赖于纯化柱上固定的抗体。然后将细胞样品上样到柱子上，允许适当的细胞被抗体结合，从而结合到柱子上。清洗步骤之后，利用优先结合至固定的抗-c-kit抗体上的竞争者将细胞从柱子上洗脱，以允许细胞从柱子上释放。

对于本领域技术人员显而易见的是，利用固定抗体的免疫-亲和纯化将提供纯化的细胞群。然而，在一些实施方案中，可以优选进一步通过利用其他可识别的标志物中的一种或多种如Hnf4进行另一轮免疫-亲和纯化来纯化细胞群，同时利用等份的分离的克隆来确定其它相关细胞内标志物的表达。

对于本领域技术人员显而易见的是，连续的纯化步骤并非必然需要涉及相同的分离物理方法。因此，很明显的是，例如，细胞可通过利用抗-Lgr5抗体的FACS步骤，之后由利用SSEA-1亲和柱的免疫-亲和纯化步骤来进行纯化。在某些实施方案中，分离之后可将细胞培养至少约15日、至少约20日、至少约25日或至少约30日。在某些方面，将细胞在培养中扩增更长时间以提高细胞群中细胞表型的同质性。

该方法的其他特征在本说明书专有的定义部分进行了定义。如本领域已知，一般接种单细胞悬液或小的细胞群(2-50个细胞/群)而非大的细胞群。当细胞分裂时，可将这样的细胞以促进细胞增殖的密度接种于支持物上。通常，当单细胞被分离时，使用至少1-500个细胞/孔的铺板密度，孔的表面为0.32cm²。当接种群时，铺板密度优选250-2500个细胞/cm²。对于再次铺板，可使用约2500个细胞/cm²至约5,000个细胞/cm²的密度。再次铺板时，如本领域已知，一般接种单细胞悬液或小的细胞群而非大的细胞群。

本发明的类器官

以上所述的细胞生长成在本文中称为“类器官”的实体。因此，通过本发明的方法获得的肝脏的类器官是本发明的另一方面。就我们所知，这是在这样的持续时间(即培养至少7个月，参见本文所包含的实施例)首次获得有功能的活的肝脏的类器官。功能优选由本文所定义的肝脏标志物的存在和/或由本文所定义的所述类器官的结构来表征。由于所获得的肝脏的类器官的最终量与培养的持续时间相关，本领域技术人员可理解的是，本发明是一项开创性发明并且可能为如再生医学开辟新的可能性。

例如，本发明的类器官可包含至少1x10³个细胞，至少1x10⁴个细胞，至少1x10⁵个细胞，至少1x10⁶个细胞，至少1x10⁷个细胞或更多的细胞群。在一些实施方案中，每一个类器官包含大约1x10³个细胞至5x10³个细胞；通常，10-20个类器官可在24孔板中的一个孔内一起生长。

本发明的细胞和类器官可以是非人的动物或者人。本发明人首次证明，利用本发明的培养基和方法在体外培养和维持动物和人肝脏的类器官是可能的。

在附图中给出本发明所形成的类器官的示意性实例。可以看出，本发明的类器官可具有囊状结构，在其外部是具有至少一个芽和中央腔的细胞层。基质胶外面的类器官倾向于大于基质胶中间的类器官，可能是因为它们能更接近必需的生长因子。在结构上，本发明的类器官的形状常常是细长的。它们可包括一个或多个芽结构——单细胞上皮层，其具有与胆管没有不同的结构。共聚焦显微镜下，该结构对角蛋白染色呈阳性。它们可包括具有极化核和小细胞质的细胞。类器官可具有由多层形成的部分；这样的细胞常常倾向于在细胞更中心处具有它们的核，即未极化的。多层部分中的细胞可自我组建以在细胞之间包括间隙或腔。

肝脏的类器官优选包含肝细胞和胆管上皮细胞，更优选其中可检测到以下标志物中的至少一种：至少一种肝细胞标志物如白蛋白、转甲状腺素蛋白、B-1整合素和谷氨酰胺合成酶，和/或CYP3A11、FAH、tbx3、TAT和Gck中的至少一种，和/或至少一种胆管上皮细胞标志物如角蛋白7和19。本领域技术人员知道如何检测这些标志物中的每一种(即RT-PCR和/或免疫组化)。优选地，如在实验部分中所进行的，评估这些标志物中每一种的表达。这些标志物中的每一种通常在通过本发明的方法培养至少2周、3周或1个月之后表达。对两种培养条件下的类器官的微阵列分析都显示肝脏的类器官类似成体肝脏组织。

在一些实施方案中，肝脏的类器官中大约35%的细胞表达肝细胞表面标志物，例如25-45%、30-40%、33-37%、35%或更少，或15-35%的细胞。

优选地，本发明所产生的细胞和类器官还具有肝细胞功能，如表达以下成熟肝细胞标志物或对以下成熟肝细胞标志物染色呈阳性：白蛋白、B-1整合素、CK-8、CK-18、转甲状腺素蛋白(TTR)、葡萄糖6P、Met、谷氨酰胺合成酶(Glul)、转铁蛋白、Fahd1、Fahd2a、K7、K19以及细胞色素P450亚型3A13(CYP3A13)、51(CYP51)、2D10(CYP2D10)、2j6(CYP2j6)、39A1(CYP39A1)、4A10(CYP4A10)、4F13(CYP4F13)、4F16(CYP4F16)、CYP4B1以及20A1(CYP20A1)。另外，在一些实施方案中，与在成体肝脏中一样，在两种培养条件下都未检测到胚胎肝基因AFP。在一些实施方案中，甲胎蛋白的表达刚刚在背景基因表达之上。

另外，所熟知的肝脏转录因子如HNF1a、HNF1b和HNF4在两种条件下都高度表达。

由于肝脏和胰腺是紧密相关的器官，我们研究了我们的肝脏培养物是否也表达胰腺特异性基因。将胰腺从功能上分为内分泌胰腺和外分泌胰腺。内分泌胰腺主要以表达胰岛素、胰高血糖素和生长抑素为特征。这些激素的表达由一组内分泌胰腺特异性转录转录因子严格调控，最重要的是Pdx1和NeuroD。外分泌胰腺由腺泡和管室组成，负责产生消化酶淀粉酶、胰脂酶和糜蛋白酶等。这些基因的表达也受特异性外分泌胰腺基因如Ptf1调控。

在此所述的肝脏培养物中缺乏胰腺特异性基因Ptf1a、胰腺淀粉酶(Amy2a4)、胰脂酶(Pnlip)、胰岛素(ins1和ins2)、胰高血糖素(Gcg)、糜蛋白酶(cela1)、Pdx1以及NeuroD。

在一些实施方案中，以下基因中的一种或多种或全部以与成体肝脏肝细胞中对应基因类似的水平表达于肝脏的类器官中：Aqp1、Bmp2、Apo3、Apol7a、Sord、C3、Ppara、Pparg、tbx3、lgf1、ll17rb、ll1b、Tgfbi、Apoa1、Apoa4、Apob、Cyp26b1、Cyp27a1、Cyp2b13、Cyp2b9、Cyp2c37、Cyp2f2、Cyp2g1、Cyp2j13、Cyp3a11、Cyp4a10以及Cypf14。例如参见图16A。

在一些实施方案中，以下基因中的一种或多种以与成体肝脏肝细胞中对应基因类似的关闭水平表达于肝脏的类器官中：Ccl2、Osmr、Icam1以及Cxcl2。

在一些实施方案中，以下基因中的一种或两种差异表达于肝脏的类器官和新生儿肝脏中：mKi67和dkn3。

在一些实施方案中，以下基因中的一种、两种或全部以相似的水平表达于肝脏的类器官和新生儿肝脏中：cyp2j6、olfm4和Lefty1。例如，参见图16B。

在一些实施方案中，在本发明的扩增培养基(如EM1或EM2)中培养时，本发明的肝脏的类器官具有管状表型。

在一些实施方案中，在本发明的分化培养基中培养时，本发明的肝脏的类器官表达成体肝脏标志物。

在一个实施方案中，本发明的肝脏的类器官具有如图16C所示的基因表达谱。

在特别优选的实施方案中，本发明的小鼠肝细胞群或类器官具有如图18所示的表达谱。例如，在一个优选的实施方案中，本发明的小鼠干细胞群或类器官：

a)表达以下干细胞标志物中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)，优选全部：lgr5、lgr4、epcam、Cd44、Tnfrsf19、Sox9、Sp5、Cd24a、Prom1、Cdca7以及Elf3；和/或

b)不表达以下的干细胞标志物：lgr6；和/或

c)在本发明的扩增培养基中生长时，表达以下肝细胞或胆管上皮细胞标志物中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19种)，优选全部：Hnf1a、Hnf1b、Hnf4a、Hhex、Onecut1、Onecut2、Prox1、Cdh1、Foxa2、Gata6、Foxm1、Cebpa、Cebpb、Cebpd、Cebpg、Glul、Krt7、Krt19以及Met；和/或

d)在本发明的扩增培养基中生长时，不表达以下基因中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种)：afp、Ins1、Ins2、Gcg、Ptf1a、Cela1、Cela2a、Cela3b、Neurod1、Neurod2、Neurog1、Neurog2、Neurog3、Amy2a4、Igf1r、Igf2以及Cd34；和/或

e)表达以下重编程基因中的至少一种(如1、2或3种)：Klf4、Myc以及Pou5f1；和/或

f)不表达以下重编程基因：Sox2。

优选地，其中所述的基因表达优选例如利用微阵列通过测定mRNA水平的表达来检测。

更优选地，本发明的小鼠肝细胞群或类器官具有以上a)至f)的全部特征。

在一些实施方案中，以上所述的本发明的小鼠细胞群或类器官的基因表达谱是针对在本发明的扩增培养基中培养的小鼠细胞群或类器官。

在一些实施方案中，提供了本发明的人肝细胞群或类器官，其具有图19所示的基因表达标签。例如，在本发明的EM1中培养的人肝细胞群或类器官优选表达，如在EM1细胞培养基中被表达的图19所示的基因。例如，在本发明的EM2中培养的人肝细胞群或类器官优选表达图19所示的基因，正如在EM2细胞培养基中被表达。例如，在本发明的DM中培养的人肝细胞群或类器官优选表达，如在DM细胞培养基中被表达的图19所示的基因。

例如，在一个优选的实施方案中，本发明的人肝细胞群或类器官：

a)表达以下干细胞标签基因中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9种)，优选全部：LGR4、TACSTD1/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7以及ELF3；和/或

b)表达以下重编程基因中的至少一种(如1、2、3、4种)，优选全部：KLF4、MYC、POU5F1以及SOX2；和/或

c)表达以下肝细胞/胆管上皮细胞特异性基因中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19种)，优选全部：HNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXM1、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19以及MET；和/或

d)不表达以下肝细胞/胆管上皮细胞特异性基因中的至少一种(如1、2、3、4、5、6种)，优选全部：NEUROG2、IGF1R和CD34、AFP、GCG和PTF1A，例如，其不表达NEUROG2、IGF1R以及CD34；和/或

e)表达以下肝细胞特异性基因中的至少一种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18种)，优选全部：TTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2以及SCARB1；

其中所述的基因表达优选例如利用微阵列通过测定mRNA水平的表达来检测。

更优选地，本发明的人肝细胞群或类器官具有以上a)至e)的全部特征。

在一些实施方案中，如图19所示，本发明的人肝细胞群或类器官中的基因相对于参照RNA的表达上调或下调。优选地，所述参照RNA是通用人参照RNA(Stratagene,产品号740000)。在一些实施方案中，基因相对于参照RNA上调或下调，若同样示于图19中，正如相对于参照RNA被上调或下调但是上调或下调的程度无需相同。在其他实施方案中，上调或下调的程度是+/-35%、+/-30%、+/-25%、+/-20%、+/-20%、+/-15%、+/-10%、+/-5%、+/-3或与图19所示的大致相同。在其他实施方案中，本发明的人的类器官中的基因表达的绝对水平是+/-35%、+/-30%、+/-25%、+/-20%、+/-15%、+/-10%、+/-5%、+/-3%或与图19所示的大致相同。

本发明的人肝细胞群或类器官还优选表达Lgr5和/或Tnfrsf19，优选两种都表达。在一些实施方案中，在本发明的扩增培养基中培养时，人肝细胞群或类器官表达Lgr5和/或Tnfrsf19，优选两种都表达。优选地，Lgr5和/或Tnfrsfr19的表达通过RT PCR来检测。在一些实施方案中，在分化培养基中培养时，与在扩增培养基中培养时它们在类器官或细胞中的表达水平相比，Lgr5和/或Tnfrsf19以更低的表达水平存在于类器官或细胞中(例如低至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少10倍，至少15倍)。

优选地，本发明的细胞和类器官能够分泌白蛋白，例如，以大约1μg/小时/10⁶细胞至10μg/小时/10⁶细胞，优选2μg至6μg/小时/10⁶细胞的速度。

此外，这样的细胞和类器官可分泌尿素。例如，35mm平皿中的细胞，尿素合成的活性可以是48小时1μg至50μg，优选5μg至30μg。

本发明的细胞和类器官例如染色时，可显示明显的糖原累积。本发明的细胞和类器官主动合成糖原的能力可通过将培养基由低葡萄糖分化培养基转换为补充有10%FBS和0.2μM地塞米松的高葡萄糖DMEM两日来检测。

本发明的细胞和类器官可具有诱导型细胞色素P450活性(如CYP1A)。这种活性可例如利用乙氧基异吩恶唑酮-O-脱乙基酶(EROD)测试来检测(Cancer Res,2001,61:8164-8170)。例如，可将细胞或类器官与P450底物如3-甲基胆蒽相接触，并将EROD的活性水平与对照细胞相比。

形态上，所述细胞呈现肝细胞样。

如图2所示，优选的肝脏的类器官包含囊状结构，或者由这样的囊状结构组成，在所述囊状结构外部是具有芽和中央腔的细胞层。该肝脏的类器官可具有以下特征中的一种或多种(如2、3或全部4种)：(a)具有的细胞密度>5×10⁵细胞/cm³、优选>10×10⁵细胞/cm³；(b)具有相当于2-30层细胞的厚度，优选相当于2-15层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间互相接触；(d)显示健康肝组织固有的功能；(e)具有细长的形状，具有两个限定的区，即单层上皮细胞区，其中可检测到高度极化的细胞并表达角蛋白标志物(该区类似胆管区)，以及构成类器官主体的另一个区，其由具有非极化细胞的多层上皮细胞形成，其中可检测到白蛋白表达。对本领域技术人员而言明显的是，这样的肝脏的类器官优选不是肝脏碎块，和/或不包含血管，和/或不包含肝小叶或胆管。

在本发明的背景下，肝脏碎块是成体肝脏，优选人的成体肝脏的一部分。优选地，如本文所鉴定的肝脏的类器官因而并非肝脏碎块。肝脏的类器官优选利用来自成体肝脏的细胞，优选来自成体肝脏的上皮干细胞，更优选来自成体肝脏表达Lgr5的上皮干细胞获得。

在一些实施方案中，肝脏的类器官包含表达Lgr5的细胞。例如，在一些实施方案中，肝脏的类器官中至少2%，更优选至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%的细胞表达Lgr5。类似地，本发明提供了表达Lgr5的细胞或细胞群，其中所述细胞获自本发明的肝脏的类器官。这种细胞的后代同样包括在本发明中。

在实施方案中，肝脏的类器官是利用本发明的方法仍在培养的肝脏的类器官，因而与细胞外基质相接触。优选地，将肝脏的类器官嵌入非间充质细胞外基质。在本发明的背景下，“相接触”意指物理或机械或化学接触，其意味着为了从所述细胞外基质分离所述肝脏的类器官需要使用力。

在优选实施方案中，可将肝脏的类器官培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、10周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个月或更久。

在另一优选实施方案中，肝脏的类器官源自单细胞，优选表达Lgr5的单细胞，更优选其中所述的单细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体含有关注的核酸分子。

本发明进一步提供了本发明的培养基在细胞外基质上培养上皮干细胞或含有这些干细胞的分离的类器官结构的用途，由此所述干细胞优选不包含人胚胎干细胞。优选的是人成体干细胞。此外，从肝脏单个分选的上皮干细胞同样能够在本发明的培养基中起始这些3维类器官。本发明还提供了本发明的培养基培养包含干细胞的肝脏碎块的用途。

优选的是，所述干细胞是肝脏干细胞或上皮干细胞。本发明的培养基允许确立长期的培养条件，在此条件下形成肝脏的类器官，其中存在所有分化的细胞类型。利用本发明的培养方法允许至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月的培养期。

本发明进一步提供了肝脏的类器官，优选包含至少50%的活细胞，更优选至少60%的活细胞，更优选至少70%的活细胞，更优选至少80%的活细胞，更优选至少90%的活细胞。细胞活力可利用FACS中的Hoechst染色或碘化丙啶染色来评估。

活细胞优选具有如上所述的肝功能或肝细胞特征。

本发明的细胞和类器官的用途

在另一方面，本发明提供了如上所述的本发明的肝细胞或类器官在药物发现筛选、毒性测定或再生医学中的用途。此外，本发明提供了本发明的肝脏的类器官后代在毒性测定中的用途。这样的毒性测定可利用来源于肝脏的类器官或肝脏的类器官或其部分的细胞来进行体外测定。这样的后代和肝脏的类器官易于培养，并且与例如目前在毒性测定中使用的上皮细胞系如Caco-2(ATCC HTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和XBF(ATCC CRL8808)相比，更加接近于原始上皮细胞。可预期的是，用肝脏的类器官获得的毒性结果更加接近于由患者获得的结果。将基于细胞的毒性测试用于确定器官特异的细胞毒性。在所述测试中测试的化合物包括癌症化学预防剂，环境化学品，食品补充剂以及潜在的毒剂。将细胞暴露于不同浓度的测试剂持续一定的时间。测定中测试剂的浓度范围在初步测定中通过暴露5日和从最高溶解浓度的对数稀释来确定。暴露期结束时，对培养物进行生长抑制评估。对数据进行分析以确定50%抑制点的浓度(TC50)。

例如，在肝脏肝细胞中诱导细胞色素P450酶是确定药物效力和毒性的关键因素。具体地，P450的诱导是繁琐的药物与药物之间相互作用的重要机制，并且其同样是限制药物效力和控制药物毒性的重要因素。细胞色素P450诱导测定难以发展，因为它们需要完整的正常的人肝细胞。已证明这些细胞对数量上产生足以维持高通量测定的大量生产是棘手的。

例如，根据本发明的此方面，可将备选化合物与本文所述的细胞或类器官相接触，并且可监测细胞或细胞活性的任何改变。本发明的细胞或类器官的其他非治疗用途的实例包括：研究肝脏胚胎学，肝细胞谱系以及分化途径；基因表达研究，包括重组基因表达；参与肝损伤和修复的机制；研究肝脏的炎症性和感染性疾病；研究致病机制；以及研究肝细胞转化机制和肝癌病因学。

为了高通量的目的，在多孔平板中培养所述肝脏的类器官，如，例如96孔板或384孔板。使用分子文库来鉴定影响所述类器官的分子。优选的文库包括抗体片段文库，肽噬菌体展示文库，肽文库(如LOPAP^TM,Sigma Aldrich)，脂质文库(BioMol)，合成化合物文库(如LOP AC^TM,SigmaAldrich)或天然化合物文库(Specs,TimTec)。此外，可以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一种或多种基因表达的基因文库。这些基因文库包括cDNA文库，反义文库以及siRNA或其他非编码RNA文库。优选将细胞暴露于不同浓度的测试剂持续一定的时间。在暴露期结束时，评估培养物。术语“影响”用于涵盖细胞中的任何变化，包括但不限于增殖的减少或失败，形态变化及细胞死亡。所述肝脏的类器官还可用于鉴定特异性靶向上皮癌细胞而非所述肝脏的类器官的药物。

本发明的肝脏的类器官可进一步代替在潜在的新药物或者已知或新的食品补充剂的毒性测定中使用的细胞系，如Caco-2细胞。

此外，可将这样的肝脏的类器官用于培养病原体。

包含肝脏的类器官的培养物在再生医学中是有用的，例如在肝上皮细胞的辐射后和/或手术后修复中，在患有慢性或急性肝衰竭或疾病的患者的上皮细胞修复中。肝脏疾病包括但不限于肝细胞癌、艾欧吉勒综合征(Alagille Syndrome)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、胆管闭锁、慢性肝炎、肝癌、肝硬化、肝囊肿、脂肪肝、半乳糖血症、吉尔伯特氏综合征(Gilbert's Syndrome)、原发性胆汁性肝硬化、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、原发性硬化性胆管炎、雷尔氏综合征(Reye'sSyndrome)、肉样瘤病、酪氨酸血症、I型糖原累积病、威尔逊氏病(Wilson'sDisease)、新生儿肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、卟啉症以及血色沉着病。

导致肝衰竭的遗传病症可受益于利用本发明的培养基和/或方法培养的细胞以部分或全部细胞替换形式的基于细胞的疗法。导致肝衰竭的非限制性的遗传病症的列表包括：进行性家族性肝内胆汁淤积、III型糖原类疾病、酪氨酸血症、脱氧鸟苷激酶缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、先天性红细胞生成异常性贫血、多囊肝病、多囊肾病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、尿素循环障碍、有机酸血症、溶酶体累积病以及脂肪酸氧化障碍。同样受益于基于细胞的疗法的其他病症包括威尔森氏病(Wilson’s Disease)和遗传性淀粉样变性(FAP)。

其他非肝细胞相关致因的肝衰竭仍可受益于通过利用本发明的培养基和/或方法培养的细胞的基于细胞的疗法的一些暂时修复的功能，所述肝衰竭需要整个肝脏移植以实现完全疗效。这样的病症的非限制性实例的列表包括：原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、Aglagille综合征、纯合子家族性高胆固醇血症、伴有肝硬化的乙型肝炎、伴有肝硬化的丙型肝炎、布加综合征(Budd-Chiari syndrome)、原发性高草酸尿症、自身免疫性肝炎以及酒精性肝病。

本发明的肝脏的类器官可用于治疗涉及肝细胞失调的遗传性疾病的方法中。这样的疾病可以是早发型或晚发型。早发型疾病包括代谢相关的器官衰竭(如α1-抗胰蛋白酶缺乏症)、糖原累积病(如GSD II、庞佩氏病(Pompe’s disease))、酪氨酸血症、轻度DGUOK、I型CDA、尿素循环障碍(如OTC缺乏症)、有机酸血症以及脂肪酸氧化障碍。晚发型疾病包括原发性甘草酸尿症、家族型高胆固醇血症、威尔森氏病、遗传性淀粉样变性以及多囊肝病。用由本发明的肝脏的类器官产生的健康肝细胞部分或全部替换可用于修复肝功能或延缓肝衰竭。

本发明的肝脏的类器官可用于治疗慢性肝衰竭的方法中，所述慢性肝衰竭是由遗传性代谢疾病引起或作为肝细胞感染的结果。遗传性代谢疾病的治疗可包括给予本发明的基因改造的自体肝脏的类器官。肝细胞感染的治疗可包括给予基于本发明的异体肝脏的类器官。在一些实施方案中，在2-3个月的时间内给予肝脏的类器官。

可将本发明的肝脏的类器官用于治疗急性肝衰竭，所述急性肝衰竭例如是由于可由乙酰氨基酚、药物或酒精的使用而导致的肝中毒。在一些实施方案中，恢复肝功能的疗法包括注射肝细胞悬液，所述肝细胞悬液来自由本发明的类器官获得的冷冻的即用型异体肝细胞。冷冻合适的类器官的能力意味着可获得用于直接递送的类器官，因而无需等待输血。

对于更换或矫正肝功能缺损的情况，由本发明产生的一个或多个肝脏的类器官构建细胞-基质结构是可能的。认为仅有约10%的肝细胞团是充足的功能所必需的。由于可得到的供体相对有限和青少年的器官较小，这使类器官单元组分能够植入儿童，尤其优选整个器官移植。例如，8个月大的小孩的正常肝脏重约250g。因而该小孩需要约25g组织。成人的肝脏重约1500g，因而仅需要移植成人肝脏的约1.5%。当植入本发明的类器官单元时，任选附着于聚合物支架，在新宿主中将会发生增殖，所得到的肝细胞团替代了缺损的宿主功能。本发明人首次证明，由适合于植入非人动物或人的成体肝脏干细胞或含有干细胞的肝脏组织碎块中产生成熟的肝细胞是可能的。利用本发明的第一培养基，本发明人已证实维持和扩增肝脏干细胞群是可能的。利用本发明的第二培养基，本发明人已证实肝母细胞能在体内分化成适合于移植目的的成熟的肝细胞。因此，本发明人提供了用于肝脏再生、更换或矫正肝功能缺损的新的肝细胞来源。

本发明人还证明，将由本发明的方法培养的类器官成功植入免疫缺陷的小鼠中(参见实施例7)，并且源自移植的类器官的细胞在体内形成胆管上皮细胞和肝细胞。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于植入人或动物的本发明的类器官或源自类器官的细胞。

用于移植目的的人肝脏的类器官的应用由于多种原因而优于胎儿或成体肝细胞的应用。首先，本发明的培养方法提供了细胞的无限扩增，因而无限量的供应。具体地，本发明人已证实在恰当的培养条件下(如利用本发明的扩增培养基)，Lgr5+细胞在体外可经过多于1000次分裂。因此，可从肝脏的类器官中提取Lgr5+细胞，并且再传代，这提供可移植的产生肝细胞和胆管上皮细胞的细胞的连续的自我更新来源。相比之下，胎儿或成体肝细胞源自供体肝脏，其仅提供单轮移植。此外，供体细胞仅可存活几天但是失去了它们的肝细胞特性。这意味着移植必须在可得到供体时就进行。另一方面，源自类器官的细胞在多次分裂和持续很久的时间内保持了它们的表型，这意味着它们对任何阶段的移植都是现成的和可获得的。这可能还允许将源自类器官的细胞用作临时性肝脏治疗以延长肝移植等候名单上的患者的寿命。本发明的肝脏的类器官的另一优势在于，它们可被冷冻，随后解冻而不会丧失功能。这使细胞库易于储存且在紧急使用时快速可用。例如，这在制备可用于治疗急性肝中毒的“常备”产品中可能是有用的。类器官还可以由从肝供体采集的作为小活检的细胞或组织碎块长出，这将对治疗的任何伦理异议降至最低。供体甚至可以来自待治疗的患者，这可减少与外来细胞和器官移植相关的任何不利的副作用，并减少对免疫抑制药物的需要。

因此，包括于本发明范围内的是通过细胞疗法治疗人或动物患者的方法。术语“动物”在此表示所有的哺乳动物，优选人类患者。还包括所有发育阶段包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。例如，患者可以是成体，或者疗法可以是儿科应用(如新生儿、儿童或青少年)。这样的细胞疗法包括通过任何合适的方法给予患者本发明产生的细胞或类器官。具体地，这样的治疗方法包括受损组织的再生。本文使用的术语“给予”涉及公认形式的给予，例如静脉内或注射，以及通过移植给予，例如通过源自本发明的细胞或类器官的组织工程肝脏手术、植入或移植来移植。就细胞而言，全身性给予个体是可能的，例如通过胸导管输注入肠系膜上动脉、腹腔动脉、锁骨下静脉，通过上腔静脉输注入心脏，或者通过膈下淋巴输注入腹腔随后迁移细胞，或者通过输注入肝动脉血供应或门静脉直接进入心脏部位。

每次输注可给予10⁴至10¹³细胞/100kg人。优选地，可通过静脉内输注约1-5x10⁴至1-5x10⁷细胞/100kg人。更优选地，可通过静脉内输注约1x10⁴至10x10⁶细胞/100kg人。在一些实施方案中，提供了细胞或类器官的单次给予。在其他实施方案中，使用多次给予。可在初期的治疗方案内提供多次给予，例如，连续3-7日，然后以其他次数重复。

在一些实施方案中，可取的是用由本发明的肝脏的类器官产生的健康肝细胞重新填充或替换患者肝脏的10-20%。

由本文所定义的表达Lgr5的一个单细胞重建肝脏的类器官也是可能的。该单细胞可以通过引入如本文所定义的核酸构建体来进行改造，例如，以矫正基因缺陷或突变。按需要特异性缺失表达同样是可能的，例如，利用siRNA。待表达的潜在多肽可以是在代谢性肝脏疾病包括如AAT(α抗胰蛋白酶)中缺乏的那些多肽中的任何一种。为了阐明肝脏生理机能，我们还可表达或失活参与Wnt、EGF、FGF、BMP或notch通路中的基因。同样地，为了筛查药物毒性，负责肝脏药物代谢的基因(例如，CYP家族中的基因)的表达或失活受到高度关注。

在一个实施方案中，可将扩增的上皮干细胞重编程成相关的组织命运如，例如肝细胞，包括肝细胞和胆管上皮细胞。到目前为止，不可能由成体干细胞再生肝细胞。本发明的培养方法能够分析将紧密相关的上皮干细胞转分化为肝细胞的因子，所述肝细胞包括肝细胞和胆管上皮细胞。

对本领域技术人员而言明显的是，基因治疗还可用于针对修复受损或患病组织的方法中。可通过例如腺病毒或逆转录病毒基因递送载体递送遗传信息如DNA和/或RNA至干细胞来进行使用。本领域技术人员可替换或修复在基因治疗中靶定的特定基因。例如，可将正常基因插入基因组内的非特异性位置来替换非功能性基因。在另一实例中，异常的基因序列可通过同源重组由正常的基因序列替换。可选择地，选择性回复突变能将基因还原为其正常的功能。另一实例是改变特定基因的调控(到将基因开启或关闭的程度)。优选地，通过基因治疗的方法离体处理干细胞，然后将其转移至哺乳动物，优选需要治疗的人。例如，可在植入患者之前在培养时对类器官来源的细胞进行基因改造。

本发明人虽然发现在健康肝脏中无法检测到Lgr5，但是可检测到残余的Lgr5。因而，本发明还提供了诊断肝脏损伤的方法，包括检测是否表达Lgr5，其中表达Lgr5蛋白指示肝脏损伤。本发明还提供了通过监测肝脏中Lgr5的表达来监测肝脏修复或再生的方法。可通过任何合适的方法来检测Lgr5表达，例如，流式细胞术、免疫组化或利用PCR方法。

本发明还提供了组合物或细胞培养物容器，其包含以上所述的本发明任一方面的细胞和/或类器官，和以上所述的本发明任一方面的培养基。例如，这样的组合物或细胞培养物容器可包含处于如上所述的培养基中的按照本发明方法培养的任意数量的细胞或类器官。例如，优选的培养基包含补充有以下成分的改进型DMEM/F12或由补充有以下成分的改进型DMEM/F12组成：B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸，50ng/ml EGF、1μg/ml R-spondin1、10nM胃泌素、100ng/ml FGF10、10mM烟酰胺和50ng/ml HGF以及50%Wnt条件培养基。

定义

核酸构建体包含关注的核酸分子，并且确保给定的核酸分子在其被引入的细胞中表达。特别优选的核酸构建体是编码多肽的核酸分子可操作地连接至启动子的表达载体，所述启动子能够指导所述核酸分子(即编码序列)在所述细胞中的表达。短语“表达载体”通常是指能够在细胞中引起其包含的基因/核酸分子表达的核酸分子，所述细胞与这样的序列相容。这些表达载体一般至少包括合适的启动子序列，以及任选地，转录终止信号。编码多肽的核酸或DNA或核苷酸序列被并入DNA/核酸构建体，所述DNA/核酸构建体能够被引入并在本发明的方法所鉴定的体外细胞培养物中表达。制备用于引入特定细胞的DNA构建体一般包括由所述细胞识别的复制系统，编码需要的多肽的预期DNA区段，以及可操作地连接至多肽编码区段的转录和翻译起始和终止调控序列。当DNA区段被放置于与另一DNA区段的功能关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子促进编码序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至所述序列。如果信号序列DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则所述信号序列DNA可操作地连接至编码多肽的DNA。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在有信号序列的情况下，既要连续又要在阅读相位(reading phase)中。然而，增强子无需与转录受其控制的编码序列连续。连接通过在方便的限制性位点或在插入以替代限制性位点的适体或接头处连接来实现。

适当的启动子序列的选择通常取决于所选择的用于表达DNA区段的宿主细胞。合适的启动子序列的实例包括本领域所熟知的真核启动子(参见，如Sambrook and Russell,2001,同上)。转录调控序列一般包括由细胞识别的异源增强子或启动子。合适的启动子包括CMV启动子。表达载体包括复制系统以及转录和翻译调控序列，连同可使用的用于多肽编码区段的插入位点。细胞系和表达载体可行的组合实例描述于Sambrookand Russell(2001,同上)以及Metzger et al.(1988)Nature334:31-36中。

本发明并不限于待表达于本文所鉴定的表达Lgr5的细胞中的特定多肽或关注的核酸分子。根据方法的目的，可设想在肝细胞中表达多肽和/或使多肽在肝细胞中的表达失活。待表达的潜在多肽可以是在代谢性肝脏疾病中缺乏的全部多肽，如AAT(α抗胰蛋白酶)。为了阐明肝脏生理机能，我们还可表达或失活Wnt、EGF、FGF、BMP或notch途径中涉及的基因。同样地，为了筛查药物毒性，负责肝脏药物代谢的基因(如CYP家族的基因)的表达或失活受到高度关注。

本发明的一些方面涉及包含以上所定义的核苷酸序列的核酸构建体或表达载体，其中所述载体是适合于基因治疗的载体。适合于基因治疗的载体描述于Anderson1998,Nature392:25-30;Walther and Stein,2000,Drugs60:249-71;Kay et al.,2001,Nat.Med.7:33-40;Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-604;Amado and Chen,1999,Science285:674-6;Federico,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:448-53;Vigna and Naldini,2000,J.GeneMed.2:308-16;Marin et al.,1997,Mol.Med.Today3:396-403;Peng andRussell,1999,Curr.Opin.Biotechnol.10:454-7;Sommerfelt,1999,J.Gen.Virol.80:3049-64;Reiser,2000,Gene Ther.7:910-3；以及其中所引用的文献中。实例包括整合和非整合的载体，如基于逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺病毒相关病毒(AAV)、慢病毒、pox病毒、甲病毒以及疱疹病毒的载体。

特别适合于基因治疗的载体包括腺病毒(Ad)和腺病毒相关病毒(AAV)载体。这些载体感染大量分裂和非分裂的细胞类型，包括肝细胞。另外腺病毒载体能够进行高水平的转基因表达。然而，由于腺病毒和AAV载体进入细胞之后的附加体性质，这些病毒载体最适合于如上所述的仅需要瞬时表达转基因的治疗应用(Russell,2000,J.Gen.Virol.81:2573-2604;Goncalves,2005,Virol J.2(1):43)。将优选的腺病毒载体改造为降低宿主应答，如Russell(2000、同上)所综述的。已在人体内深入研究了AAV基因转移的安全性和效力，其在肝脏、肌肉、CNS和视网膜中得到了积极的结果(Manno et al Nat medicine2006,Stroes et al ATVB2008,Kaplitt,Feigin,Lancet2009;Maguire,Simonelli et al NEJM2008;Bainbridge et al NEJM2008)。AAV2是在人和实验模型的基因转移研究中最佳表征的血清型。AAV2显示对骨骼肌、神经元、血管平滑肌细胞和肝细胞的天然趋化性。因此AAV2是靶向肝脏组织的载体的良好选择。基于腺相关病毒的非整合载体的其他实例包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11以及假型AAV。利用非人血清型，如AAV8和AAV9，对克服个体中的这些免疫应答可能是有用的，并且刚刚开始临床试验(ClinicalTrials.gov Identifier:NCT00979238)。为了基因转移至肝细胞，已证明腺病毒血清型5或AAV血清型2、7或8是有效的载体，因而优选Ad或AAV血清型(Gao,Molecular Therapy(2006)13、77–87)。

在本发明中应用的优选的逆转录病毒载体是基于慢病毒的表达构建体。慢病毒载体具有感染非分裂细胞的独特能力(Amado and Chen,1999Science285:674-6)。构建的方法和基于慢病毒的表达构建体的应用描述于美国专利号6,165,782、6,207,455、6,218,181、6,277,633和6,323,031，以及Federico(1999,Curr Opin Biotechnol10:448-53)和Vigna et al.(2000,J Gene Med2000;2:308-16)中。

通常，基因治疗载体将作为以上所述的表达载体，在某种意义上它们包含待表达的编码本发明的多肽的核苷酸序列，由此将核苷酸序列可操作地连接至如上所述的适当的调控序列。这样的调控序列至少包括启动子序列。来自基因治疗载体的适合于表达编码多肽的核苷酸的启动子包括，如巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子，病毒长末端重复序列启动子(LTRs)，如来自莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)、劳氏肉瘤病毒或HTLV-1的启动子，猿病毒40(SV40)早期启动子，以及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。合适的启动子于以下描述。

已描述了可通过给予小有机化合物或无机化合物诱导的几种诱导型启动子系统。这样的诱导型启动子包括受重金属控制的那些启动子，如金属硫蛋白启动子(Brinster et al.1982Nature296:39-42;Mayo et al.1982Cell29:99-108)、RU-486(黄体酮拮抗剂)(Wang et al.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:8180-8184)、类固醇(Mader and White,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5603-5607)、四环素(Gossen and Bujard1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551;美国专利号5,464,758;Furth et al.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9302-9306;Howe et al.1995J.Biol.Chem.270:14168-14174;Resnitzky et al.1994Mol.Cell.Biol.14:1669-1679;Shockett et al.1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6522-6526)以及tTAER系统，其基于由tetR多肽组成的多嵌合反式激活因子，作为VP16的激活结构域，以及雌激素受体的配体结合结构域(Yee et al.,2002,US6,432,705)。

除了以上提及的以外，适合于编码用于通过RNA干扰(参见下文)敲低特异性基因的小RNA的核苷酸序列的启动子还包括，聚合酶II启动子，聚合酶III启动子。RNA聚合酶III(pol III)负责合成多种小细胞核和细胞质非编码RNA，包括5S、U6、腺病毒VA1、Vault、端粒酶RNA以及tRNAs。已确定了编码这些RNA的大量基因的启动子结构，并且发现RNA pol III启动子落入结构的三种类型中(综述参见Geiduschek andTocchini-Valentini,1988Annu.Rev.Biochem.57:873-914;Willis,1993Eur.J.Biochem.212:1-11;Hernandez,2001,J.Biol.Chem.276:26733-36)。特别适合于表达siRNA的是3型RNA pol III启动子，由此转录通过仅在5'-侧翼区(即转录起始位点的上游)存在的顺式作用元件驱动。上游序列元件包括常规TATA盒(Mattaj et al.,1988Cell55,435-442)、近端序列元件以及远端序列元件(DSE;Gupta and Reddy,1991Nucleic Acids Res.19,2073-2075)。受3型pol III启动子控制的基因实例是U6小核RNA(U6snRNA)、7SK、Y、MRP、H1以及端粒酶RNA基因(参见，如Myslinskiet al.,2001,Nucl.Acids Res.21:2502-09)。

基因治疗载体可任选地包含编码第二或另外的多肽的第二或一个或更多个另外的核苷酸序列。第二或另外的多肽可以是(可选择的)标志物多肽，其允许鉴定、选择和/或筛选包含表达构建体的细胞。适合于此目的的标志物蛋白如荧光蛋白GFP，以及可选择的标志物基因HSV胸苷激酶(用于在HAT培养基上选择)、细菌性潮霉素B磷酸转移酶(用于在潮霉素B上选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于在G418上选择)，以及二氢叶酸还原酶(DHFR)(用于在甲氨喋呤上选择)、CD20、低亲和力神经生长因子。获得这些标志物基因的来源以及它们应用的方法提供于Sambrookand Russel(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版),ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。

可选择地，第二或另一核苷酸序列可编码提供故障安全(fail-safe)机制的多肽，如果认为需要的话，其允许来自转基因细胞的个体被治愈。这样的核苷酸序列，通常被称为自杀基因，编码能够将前药转化成毒性物质的多肽，所述毒性物质能够杀死表达多肽的转基因细胞。这种自杀基因的适合的实例包括，如大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶基因或来自单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因中的一种，其中可将更昔洛韦(ganciclovir)用作前药来杀死个体中的IL-10转基因细胞(参见如Clair et al.,1987,Antimicrob.Agents Chemother.31:844-849)。

为了敲低特定多肽的表达，将基因治疗载体或其他表达构建体用于表达需要的核苷酸序列，所述核苷酸序列优选编码RNAi因子，即具有RNA干扰能力的RNA分子或具有RNA干扰能力的RNA分子的一部分。这样的RNA分子被称为siRNA(短干扰RNA，包括如短发卡RNA)。可选择地，siRNA分子可以直接处于例如药物组合物中，所述药物组合物被给予表达Lgr5的细胞或肝细胞(即肝细胞或胆管上皮细胞)或肝脏的类器官之内或附近。

期望的核苷酸序列包括编码针对靶基因mRNA区的反义RNA的反义编码DNA和/或编码针对靶基因mRNA同一区的正义RNA的正义编码DNA。在本发明的DNA构建体中，将反义和正义编码DNA可操作地连接至如上所述的能够分别表达反义和正义RNA的一个或多个启动子。“siRNA”优选指小干扰RNA，其是在哺乳动物细胞中无毒性的长度短的双链RNA(Elbashir et al.,2001,Nature411:494-98;Caplen et al.,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:9742-47)。长度未必限于21至23个核苷酸。只要其不显示毒性，对于siRNA的长度没有特别限制。“siRNA”可以是如至少15、18或21个核苷酸，且长度可长达25、30、35或49个核苷酸。可选择地，待表达的siRNA最终转录产物的双链RNA部分可以是，如至少15、18或21个核苷酸，并且长度可长达25、30、35或49个核苷酸。

“反义RNA”优选具有与靶基因mRNA互补的序列的RNA链，并且被认为通过结合至靶基因mRNA而诱导RNAi。“正义RNA”具有与反义RNA互补的序列，并且与其互补的反义RNA退火以形成siRNA。在该情况下术语“靶基因”优选是指由于通过当前的系统表达siRNA而沉默其表达的基因，并且可任意选择。就该靶基因而言，优先选择例如，其序列是已知的但是功能仍未被阐明的基因，以及其表达被认为是疾病致因的基因。确定为靶基因的基因可以是其基因组序列尚未完全阐明的基因，只要基因的mRNA的部分序列具有至少15个核苷酸或更多，这是能够结合siRNA链(反义RNA)中的一条的长度。因此，可选择其中一些序列(优选至少15个核苷酸)已阐明的基因、表达序列标签(EST)和mRNA的一部分作为“靶基因”，即使尚未确定它们的全长序列。

siRNA中两条RNA链配对的双链RNA部分不限于完全配对的链，并且可包含由于错配(相应的核苷酸不互补)、突起(在一条链的相应的互补核苷酸中缺乏)等的非配对的部分。可包含的非配对部分达到它们不干扰siRNA形成的程度。本文使用的“突起”优选包含1至2个非配对核苷酸，以及siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区包含优选1至7个突起，更优选1至5个突起。此外，本文使用的“错配”优选包含于siRNA中两条RNA配对的双链RNA区，在数量上优选是1至7个，更优选1至5个。在优选的错配中，核苷酸中的一个是鸟嘌呤，另一个是尿嘧啶。这样的错配是由于编码正义RNA的DNA中由C至T，G至A或其混合的突变，但是不特别限于它们。此外，在本发明中，siRNA中两条RNA链配对的双链RNA区可包含突起和错配，优选其在数量上共为1至7个，更优选1至5个。这样的非配对部分(错配或突起等)可抑制下文所述的反义与正义编码DNA之间的重组，并使得下文所述的siRNA表达系统稳定。此外，虽然很难对茎环DNA(其在siRNA的两条RNA链配对的双链RNA区中包含非配对部分)测序，但通过引入如上所述的错配或突起使之能够测序。而且，在配对的双链RNA区中含有错配或突起的siRNA具有在大肠杆菌或动物细胞中稳定的优势。

siRNA的末端结构可以是平末端或粘性末端(悬突)，只要siRNA由于其RNAi效应能够沉默靶基因的表达即可。粘性(悬突)末端结构不仅限于3'悬突，也可包括5'悬突结构，只要其能够诱导RNAi效应。此外，悬突核苷酸的数量不限于已报道的2或3个，只要悬突能够诱导RNAi效应，其可以是任意数量。例如，悬突由1至8个，优选2至4个核苷酸组成。在此，具有粘性末端结构的siRNA的全长表示为配对双链部分的长度和在两端包含悬突单链的一对的长度的总和。例如，对于在其两端具有4个核苷酸悬突的19bp双链RNA部分的情况，全长表示为23bp。此外，由于该悬突序列对靶基因具有低特异性，其没有必要与靶基因序列互补(反义)或相同(正义)。此外，只要siRNA能够保持其对靶基因的基因沉默效应，siRNA例如可在其一端的悬突部分包含低分子量RNA(其可以是天然RNA分子，如tRNA、rRNA或病毒RNA，或人工RNA分子)。

此外，如上所述，“siRNA”的末端结构在两端必然是中断的结构，并且可具有其中双链RNA一头的末端通过接头RNA(“shRNA”)连接的茎-环结构。双链RNA区(茎-环部分)的长度可以是如至少15、18或21个核苷酸，且长度可长达25、30、35或49个核苷酸。可选择地，双链RNA区(其是待表达的siRNA的最终转录产物)的长度为，如至少15、18或21个核苷酸，且长度可长达25、30、35或49个核苷酸。此外，对于接头的长度没有特别限制，只要其长度不阻碍茎部分的配对即可。例如，为了茎部分稳定配对并抑制编码该部分的DNA之间的重组，接头部分可具有三叶草tRNA结构。即使接头的长度阻碍茎部分的配对，例如也可能构建接头部分以包含内含子，使得在将前体RNA加工为成熟RNA的过程中切除该内含子，由此允许茎部分配对。对于茎-环siRNA的情况，不具有环结构的RNA的任意端(头或尾)可具有低分子量RNA。如以上所述，该低分子量RNA可以是天然RNA分子如tRNA、rRNA、snRNA或病毒RNA，或人工RNA分子。

为由反义和正义编码DNA分别表达反义和正义RNA，本发明的DNA构建体包含如上所定义的启动子。启动子在构建体中的数量和位置原则上是任意选择的，只要其能够表达反义和正义编码DNA。作为本发明DNA构建体的简单实例，可形成串联表达系统，其中启动子位于反义和正义编码DNA的上游。该串联表达系统能够产生在两端具有前述中断结构的siRNA。在茎-环siRNA表达系统(茎表达系统)中，以相反方向安排反义和正义编码DNA，并且这些DNA由接头DNA连接以构建单元。将启动子连接至该单元的一侧以构建茎-环siRNA表达系统。在此，对接头DNA的长度和序列没有特别限制，其可以是任意长度和序列，只要其序列不是终止序列且其长度和序列在如上所述成熟RNA产生过程中不阻碍茎部分配对即可。作为实例，编码以上所述tRNA的DNA可用作接头DNA。

对于串联和茎-环表达系统的情况，5'端可以具有能够促进由启动子转录的序列。更具体地，对于串联siRNA的情况，siRNA产生的效率可通过在反义和正义编码DNA的5'端添加能够促进由启动子转录的序列来提高。对于茎-环siRNA的情况，可以在上述单元的5'端添加这样的序列。来自这类序列的转录本可处于与siRNA连接的状态中，只要不阻碍由siRNA沉默靶基因即可。如果该状态阻碍了基因沉默，优选利用修剪方式(例如，本领域所熟知的核酶)对转录本进行修剪。对于本领域技术人员明显的是，可在同一载体或不同载体中表达反义和正义RNA。为避免正义和反义RNA的下游添加过量序列，优选在各自链(编码反义和正义RNA的链)的3'端放置转录终止子。终止子可以是四个或更多连续的腺嘌呤(A)核苷酸的序列。

在本文及其权利要求书中，动词“包含(to comprise)”及其变化形式以其非限制性意义使用，指的是包括该词之后的项目，但是并不排除未具体提及的项目。此外，动词“由……组成”可由“基本上由……组成”替换，指的是本文所定义的产品可包括除特别指明的成分之外的其他成分，所述其他成分不改变本发明特有的特征。此外，本文所定义的方法可包括除特别指明的步骤之外的其他步骤，所述其他步骤步骤不改变本发明特有的特征。此外，由不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及的元件不排除存在多于一个元件的可能性，除非文中明确要求有一个且只有一个元件。因而，不定冠词“一(a)”或“一个(an)”通常指“至少一个”。词“约”或“大约”与数值连用(约10)时，优选指的是该值可以是多于或少于该值10的1%的给定值。

本申请引用的全部专利和文献在此通过引用整体并入。

以下实施例的提供仅是为了示例的目的，并非意图以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1肝脏的类器官生长因子需求。(A)用EGF(E)、R-spondin1(R)、Noggin(N)、Wnt3A条件培养基(W)或它们的组合，并补充有FGF10、HGF和烟酰胺所维持的肝脏的类器官的DIC图像。(B)每周计数类器官的数量并在需要时传代。结果表示为3次独立实验的平均值±SEM。(C)通过RTPCR分析Lgr5、角蛋白7(K7)和白蛋白(Alb)基因的基因表达。(D)分离的胆管长成类器官。接种之后相应天数的微分干涉差图像。放大10倍(第0、1、3和5日)。第15日放大4倍。培养物每4-7日通过手工解离传代。培养物已生长了至少8个月。

图2肝脏的类器官的形态。(A)上图：显示不同区域(PT=门管三联，CV=中央静脉)的小鼠肝脏的石蜡切片。下图：显示不同区域b(单层上皮细胞)和h(复层上皮细胞)的肝脏的类器官的石蜡切片。(B)右图：肝脏的类器官的Ecadherin染色。可鉴别出两个不同的区域。区域b，由类似肝脏中的胆管结构的单层上皮细胞形成。该胆管区域由广谱细胞角蛋白(PCK)阳性染色的高度极化的细胞形成(下图)。左图显示在肝脏的类器官中存在第二区域。该h区域由具有非极化细胞的复层上皮细胞形成。细胞围绕中央腔组织化并表达肝细胞标志物Alb。放大10倍。

图3肝脏培养物中的Wnt信号。在源自Lgr5-LacZ或Axin2LacZ小鼠的培养物中检测Lac Z表达。在源自Bl6小鼠的肝脏培养物中未检测到阳性染色。放大4倍，插图20倍。

图4肝脏分化标志物的表达。(A)胆管上皮细胞标志物角蛋白7(K7)以及肝细胞标志物角蛋白8(K8)和白蛋白(Alb)的表达的免疫组化和免疫荧光分析。(B)肝细胞标志物白蛋白(Alb)、转甲状腺素蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、葡萄糖6磷酸酶(G6P)和细胞色素p450亚型3A11(CYP3A11)；以及胆管上皮细胞标志物角蛋白7(K7)和角蛋白19(K19)的基因表达分析。

图5肝脏单细胞培养物。(A)表明所分选细胞范围的流式细胞图。(B)在所指明的时间点生长成类器官的单细胞。放大40倍(第1-3日)，10倍(第16日)，4倍(第21日开始)。(C和D)Lgr5GFP单个分选的细胞的集落形成效率的代表图。将100个细胞以一式三份接种并于10日之后对集落进行计数。

图6肝脏培养物的微阵列分析。保持于补充有Noggin(ENR)或者Noggin和Wnt(ENRW)的ER或ER培养基中1个月的成体肝脏组织和肝脏的类器官培养物的基因表达谱分析。比较不同样品的基因图谱与褐色脂肪组织(BAT)、白色脂肪组织(WAT)、肌肉和新生儿肝脏的基因图谱。(A)显示培养物存在与成体肝脏类似的谱型但是与非肝脏相关组织如肌肉和BAT和WAT不同的谱型的热图分析，以及(B)不同条件下的肝细胞标志物和胆管上皮细胞列表。

图7:长期培养之后小鼠肝脏的类器官培养物显示稳定的核型

A–维持于EGF(E)和R-spondin1(R)，并补充有FGF10、HGF和烟酰胺(左图，ER)或维持于相同组合，并补充有Noggin(N)和Wnt3A条件培养基(W)(右图，ENRW)中24个月时间的肝脏的类器官的DIC图像。

B–培养8个月之后的小鼠肝脏的类器官的核型分析。发现正常染色体计数(n=40，左图)和多倍体(典型的肝细胞特征)(n=80，右图)。

图8:补充因子FGF10、HGF和烟酰胺对生长和分化的作用。

A–描述肝脏由肝母细胞至成熟肝细胞发育的3个阶段期间分化表达的基因的图。

B–显示所用方案的图。在实验前2日，将培养物接种于扩增培养基EM2(ERFHNic：EGF(E)和R-spondin1(R)，并补充有FGF10、HGF和烟酰胺；ERFHNic在图8B中示为‘ER’)中。2日之后，将培养基更换为单独的EGF(E)或EGF补充有R-spondin1(ER)，其含有或不含文中所述浓度的选自FGF10(F)或HGF(H)或烟酰胺(Nic)或其组合的另外的补充物。5日之后，将培养物分离并以1:4的比率再次铺板用于各条件。在这些条件下，每7日分离和再次铺板培养物，持续总共10周的时间。

C–第一次分离之后第一日所测试的每种培养条件。结果显示，EGF和R-spondin1结合FGF10或HGF或烟酰胺或其组合对于实现至少1次传代是必需的。

D–长期培养之后，补充有FNic的ER或补充有FHNic的ER都导致多的传代数。第10代之后，包括3种补充因子的培养条件即ERFHNic的生长速率更快(图15A，B)。

E–去除某些因子之后5日(起点是ERFHNic)，显示不同的肝细胞标志物(CYP3A11、Alb、FAH)和胆管上皮细胞标志物(K19)及干细胞标志物IGR5的表达的RT-PCR分析。注意仅有条件EF显示所测试的肝细胞标志物的全部表达。将HPRT用作管家基因来标准化基因表达。

图9:显示来自三种不同肝脏培养条件的细胞和成体肝脏组织中的不同肝细胞和胆管上皮细胞特异性转录因子定量的表。还显示了Notch和TGF-β信号通路的关键组分的表达。E=EFHNic，ER=ERFHNic，ENRW=ENRWFHNic。

图10:分化方案。

A–显示所用方案的图。在实验之前2日，将培养物接种于扩增培养基(ERFHNic：EGF(E)和R-spondin1(R)，并补充有FGF10、HGF和烟酰胺；ERFHNic在图10A中示为‘ER’)中。2日之后，将培养基更换为EGF(E)，并补充有所示浓度的A8301(A)，或DAPT(D)，或FGF10(F)或HGF(H)或烟酰胺(Nic)或R-spondin1(R)或Wnt3A或Noggin(N)或这些的组合。将RNA在几个时间点分离。采集小鼠肝脏组织当作阳性对照(+)，而将水当作阴性对照(-)。

B–显示分化条件之后7日的肝细胞标志物CYP3A11、Alb、FAH、tbx3、TAT和Gck表达的RT-PCR分析。注意仅有条件EADF显示所测试的肝细胞标志物全部表达。将HPRT用作管家基因来标准化基因表达。

C–分化条件之后的时间进程表达分析。分化之后第2、5和8日，通过RTPCR分析肝细胞标志物CYP3A11、Alb、FAH和胆管上皮细胞标志物K19的表达。注意肝脏标志物CYP3A11和FAH的表达在第5日开始，第8日之后达到峰值。将HPRT用作管家基因来标准化基因表达。A；A8301；D：DAPT；F：FGF10；H：HGF；De；地塞米松。

D–显示添加不同浓度的分化化合物A和D7日之后肝细胞标志物CYP3A11、Alb、FAH、tbx3、TAT、G6P和Gck表达的滴定实验。将HPRT用作管家基因来标准化基因表达。

E–肝脏标志物K19、白蛋白和肝细胞表面标志物的免疫荧光染色。用Hoeschst来染色细胞核。

F–对源自Albcreert2LacZ小鼠肝脏的类器官的Xgal染色。在他莫昔芬(tamoxifen)诱导的源自Albcreert2LacZ的培养物EADF分化之后检测到白蛋白阳性细胞(箭头)。

图11:ERFHNic培养条件下源自人的肝脏培养物。

图12:生理条件下或受损后再生过程中肝脏应答Wnt信号刺激。

A：在Axin2LacZ小鼠中注射Lgr5配体R-spondin1显示肝细胞应答Wnt刺激(箭头指示X-gal阳性细胞)。未表达Lgr5，因而发明人假设用Lgr4来启动应答。

B：在Axin2LacZ小鼠中注射CCL4显示再生过程中应答Wnt信号被激活。

图13:肝脏受损-再生之后Lgr5上调模型。

用0.8ml/kg肝毒性化合物CCL4注射成年Lgr5-LacZ KI小鼠。图显示在未注射的(未受损的)肝脏中，Wnt通路仅在导管内层的细胞中是活跃的。由CCl4损伤细胞之后，非导管内层的细胞同样具有活化的Wnt通路。

A–显示Lgr5在CCL4损伤肝脏中上调的时间进程实验(箭头显示x-gal阳性细胞)。对照：注射CCL4的WT小鼠和注射安慰剂的Lgr5LacZKi小鼠没有显示任何染色(右图)。

B–Lgr5与肝脏标志物共染色。

图14:分离的胆管对K19染色

Lgr5LacZ胆管分离。K19染色证实所分离和接种的结构确实是肝内胆管。

图15:生长因子需求

3种补充因子(FGF10、HGF和烟酰胺)对肝脏培养物的长期自我维持是必需的。长期培养之后，包括FNic($)或ERFHNic($$)的ER组合都导致多的传代数。第10代之后，包括3种补充因子的培养条件即ERFHNic的生长速率更快(参见图16B)。

图16:分化条件下小鼠肝脏的类器官的基因表达谱类似成体和新生儿肝脏的谱型。

A–显示分化条件EADF和成体或新生儿肝脏之间类似表达(a)或类似关闭(b)的基因的基因簇。

B–显示肝脏的类器官和成体或新生儿肝脏(a)之间差异表达的基因以及EADF和新生儿肝脏(b)之间类似表达的基因的基因簇。

C–来自微阵列分析的原始信号数据，比较所选择导管标志物、Ngn3表达必需的转录因子以及扩增培养基中的成体肝脏、成体胰腺、胰腺的类器官和肝脏的类器官中的内分泌标志物的表达水平。

图17:将细胞植入小鼠的肝脏疾病模型。

将类器官植入小鼠模型：FGR成体小鼠(FAH-/-RAG-/-IL2R-/-)。将肝细胞植入小鼠作为对照。

A–将源自肝脏的类器官的K19阳性细胞(顶部左图)和Fah阳性细胞(中图)植入FAH敲除小鼠。肝细胞植入的对照(顶部右图)。下面的流式细胞图显示肝细胞阳性细胞的百分比在导致阳性FAH植入的肝细胞的组中更高。

C和D–移植细胞的流式细胞术分析。(C)获自Lgr5-GFP小鼠的克隆1，和(D)获自Lgr5-lacZ小鼠的克隆2。肝细胞表面标志物显示包含大细胞和高粒度细胞的阳性亚群，即代表成熟肝细胞表型的细胞。

E–移植时间表。

图18:小鼠肝脏标签基因。

显示以下的表：a)在小鼠肝脏干细胞中表达的标志物；b)在小鼠肝脏干细胞中不表达的标志物；c)是扩增培养基中小鼠肝脏的类器官标签的小鼠肝脏干细胞中表达的肝细胞和胆管上皮细胞标志物；d)是扩增培养基中小鼠肝脏的类器官标签的小鼠肝脏干细胞中不表达的肝细胞和胆管上皮细胞标志物；e)在小鼠肝脏的类器官中表达的重编程基因；f)在小鼠肝脏的类器官中不表达的重编程基因。利用通用小鼠参照RNA(Strategene,目录号740100)作为参照RNA，通过肝脏微阵列获得结果。如果检测的绝对数值小于100，被认为未检测到基因。

图19:人肝脏标签基因

显示人的类器官的肝脏微阵列结果的表。从左至右给出的结果是a)扩增培养基EM1，b)扩增培养基EM2，c)分化培养基，d)成体肝脏。

左侧四栏中的数值(log2)是样品与参照(商购)RNA样品(用于全部阵列)之间比较的结果。给出了与参照样品中存在的RNA相比。每种样品中mRNA的相对表达。所使用的参照RNA是通用人参照RNA(Stratagene,目录号740000)。因而，这些栏中的负数不涉及真正的表达水平，仅仅意味着该RNA比参照样品中的更少。右侧4栏是绝对数值。如果它们低于100，被认为未检测到。

实施例

实施例1–用于肝脏的类器官生长和扩增的扩增培养基

分离之后，将胆管(参见图1)悬浮于基质胶中并在不同生长因子条件下培养。EGF(50ng/ml)和R-spondin1(1ug/ml)的组合，并补充有FGF10(100ng/ml)、HGF(25-50ng/ml)和烟酰胺(1-10mM)，即ERFHNic对于培养物的长期维持是必不可少的，表明体外维持成体肝脏祖细胞增殖严格需要Wnt信号通路和EGF信号通路。添加Noggin(100ng/ml)和Wnt条件培养基(50%)同样显示培养物的长期维持(参见图1A和1B)。在这些支持长期维持的培养条件下，通过RT-PCR来检测Lgr5表达以及肝细胞标志物(白蛋白)和胆管上皮细胞标志物(K7)(参见图1C)。在这些培养条件下，肝脏的类器官通过手工或酶裂解以1:8的稀释度每周传代并培养好几个月(图1D)。

我们分析了培养物中Wnt靶基因Axin2和Lgr5的表达。Axin2LacZ和Lgr5-LacZ肝脏的培养物都显示出接种之后1个月的肝脏的类器官中存在Axin2-和Lgr5-阳性细胞，由此证明Wnt信号通路是活跃的且对于培养物生长是必需的(图3)。肝脏培养物还表达肝细胞标志物(如白蛋白、转甲状腺素蛋白、谷氨酰胺合成酶)以及胆管上皮细胞标志物(角蛋白7和19)(参见图4)。

从Lgr5LacZ或Lgr5GFP小鼠分选单个Lgr5细胞时，单克隆生长成类器官。这些培养物还表达胆管上皮细胞和肝细胞谱系的标志物，并且超过4个月维持和定期以1:6-1:8分离(参见图5A和B)。有趣的是，仅有源自Lgr5阳性细胞的培养物长成类器官(图5C和D)。这些数据表明Lgr5细胞是这些培养物的祖细胞，并且能够繁殖2种不同肝脏谱系的后代。

确定了肝脏的类器官源自Lgr5+ve细胞，我们开始确定它们相对于成体肝脏标签的个体基因标签。从成体肝脏和生长于补充有FGF10、烟酰胺和肝细胞生长因子的ER或ENRW培养基中的肝脏的类器官中分离RNA。随后通过比较相对于通用RNA参照品表达的基因表达谱推断成体肝脏和2种肝脏培养条件的基因标签。所有样品的杂交利用相同的参照RNA，这允许我们比较其中的3个独立样品(成体肝脏、ER和ENRW)。热图(heat map)分析显示，两种培养条件的表达谱与成体肝脏组织的表达谱高度相似，然而与肌肉和脂肪组织谱相比时，它们没有分享相同的谱(参见图6)。成体肝脏与肝脏培养物之间的相似基因表达谱之中，检测到肝脏特异性基因如HNF1a、HNF1b、HNF4、Alb、Glul、Met、G6P、Fahd1、Fahd2a、CYP4B1、K7以及K19。热图分析显示，彼此之间以及与成体肝脏样品相比时，两种培养条件都存在相似的表达模式。然而，详细分析数据时，我们可观测到没有Wnt和Noggin的条件比包括两种生长因子的条件显示出更加分化的模式。这与图1C中显示的数据相一致，其中Wnt存在时肝细胞几乎没有分化(通过白蛋白表达的方法)。该结果表明，Wnt在损害分化中有利于培养物的自我更新。

同样地，在两种培养条件以及成体肝脏中，都可检测到非特异性成体肝脏基因如AFP以及非肝脏转录因子如Pdx1或NeuroD。

值得注意的是，在两种培养条件而不是成体肝脏中，干细胞标志物Lgr5是肝脏培养物标签中最高度富集的基因中的一种。另外，小肠和胃中的祖细胞群的细胞标志物如Cd44和Sox9(Barker&Huch et al Cell stemcell2010)在两种培养条件而不是成体肝脏中高度表达，再次表明肝脏培养物的自我更新能力以及正常成体肝脏的静止状态。

此外，除了Lgr5之外，与成体肝脏细胞相比，多种Wnt靶基因在肝脏培养物中同样高度上调，包括MMP7、Sp5和Tnfrs19等，这为需要活跃且稳健的经典Wnt信号通路活性来维持培养物的自我更新能力提供了有力证据。

实施例2–改进的分化培养基

肝脏培养物在ER或ENRW条件下自我更新，并且可以每周为基础来维持和扩增，持续长达1年(图7A)。1年之后的核型分析未显示染色体畸变的证据。所分析的细胞中多于66%呈现了正常的染色体计数，并且它们中的13%还显示出多倍性，这是肝细胞的典型性状(图7B)。

EGF(50ng/ml)和R-spondin1(1ug/ml)的组合，并补充有FGF10(100ng/ml)、HGF(25-50ng/ml)和烟酰胺(1-10mM)，对于长期维持培养物是优选的。在这些条件下，我们获得了表达胆管和一些肝母细胞或未成熟肝细胞标志物(Glul、白蛋白)的长寿命的细胞培养物。然而，这些肝细胞标志物阳性细胞的数量非常低。在这些培养条件下，未检测到成熟肝细胞标志物(如p450细胞色素)。这些结果表明，在此所述的培养物条件有利于能够产生肝细胞-样细胞的肝脏祖细胞的扩增，虽然数量较低，但不是完全成熟的肝细胞(图8A)。

为在体外增强培养物的肝细胞性质并获得成熟的肝细胞，我们首先确定了添加至EGF和R-spondin1中的三种补充因子(FGF10、HGF和烟酰胺)是否对肝细胞表达以及培养物的自我更新产生正面或负面的影响。我们产生了肝脏的类器官培养物并用加上FGF10或HGF或烟酰胺或其组合的EGF或EGF和R-spondin1来培养它们，并且我们每周一次分离培养物，总共10周。每个时间点，我们还分析几种成熟肝细胞标志物(FAH、CYP3A11)和肝母细胞标志物(白蛋白)的表达(图8B)。

与图1(参见实施例1)中的数据相一致，我们观测到R-spondin1和烟酰胺结合FGF10对于肝脏培养物的生长和自我更新是必不可少的(图8C和D)。R-spondin1和烟酰胺都抑制成熟标志物CYP3A11的表达，然而促进肝母细胞标志物白蛋白的表达。将FGF10或HGF添加至只含有EGF(没有R-spondin1和烟酰胺)的培养基中，有利于成熟标志物CYP3A11的表达，尽管以非常低的水平(图8E)。为鉴定可能利于肝细胞分化的其它化合物，我们使用两种不同的方法，这两种方法都基于EGF+HGF和/或FGF10的基础条件。

第一种方法包括测试除了EGF+FGF10或HGF条件之外的一系列化合物。表2中给出所分析化合物的完整列表。

表2

第二种方法考虑了已公开的关于实现体外胆管和肝细胞分化所需的转录因子表达的发育研究的知识。在补充有FGF10、HGF和烟酰胺的E或ER或ENRW条件下的类器官的转录因子表达的比较分析示于图8中。除了tbx3和prox1之外，存在肝细胞分类所需的全部转录因子。然而，我们还注意到，特异性胆管转录因子的表达在含有R-spondin1(R)的培养物中高度上调，表明培养物基因表达不平衡地偏向更多的胆管细胞命运。

Notch和TGF-β信号通路参与体内胆管细胞命运。实际上，缺失Rbpj(对于实现活跃的Notch信号通路是必需的)导致异常的管腔化(Zong Y.Development2009)，并且向肝脏外植体添加TGF-β有利于体外胆管分化(Clotman F.Genes and Development2005)。由于Notch和TGF-β信号通路在肝脏培养物中高度上调(图9)，我们推断胆管细胞命运的抑制可能触发细胞向更多的肝细胞表型分化。选择A8301作为TGF-β受体ALK5、4和7的抑制剂，以及DAPT作为γ-分泌酶的抑制剂，所述γ-分泌酶是活化Notch通路所需的活性蛋白酶。我们先在扩增条件(ER培养基)下培养细胞2日，并在第2日(图10A)时开始通过添加不同化合物的组合来开始分化条件。每隔一日更换培养基，8-9日之后分析分化标志物的表达。使用ER和ENRW条件作为阴性对照。

具有DAPT和A8301的EGF+FGF10的组合出人意料地导致所分析的肝细胞标志物(CYP3A11、TAT、白蛋白)表达的大幅提高(图10B)。第5日就可检测到这种影响，第8-9日时达到峰值(图10C)。最高浓度效力分别在10uM(DAPT)和50nM(A8301)时实现(图10D)。地塞米松(已知的肝细胞分化分子)的添加不导致基因表达的任何提高。如通过针对肝细胞标志物白蛋白和2F8的免疫荧光检测以及对AlbCreLacZ衍生的类器官的Xgal染色所评估的，EGF、FGF10、A8301和DAPT的组合不仅增强了表达，还提高了肝细胞-样细胞的数量(图10E和F)。因此，我们可得出前述的分化方案利于在体外由肝脏干细胞培养产生肝细胞样细胞的结论。

实施例3–人肝脏的类器官

通过这些扩增条件(ERFHNic和ENRWFHNic)，我们能够用添加500uM TGFβ抑制剂(A83-01)的扩增培养基来扩增源自人胆管的培养物(图11)。

材料和方法(实施例1-3)

肝脏培养物-胆管分离

在冷的改进型DMEM/F12(Invitrogen)中清洗分离的成体肝脏组织，然后将组织切成约5mm的碎块，并进一步用冷解离缓冲液(含有胶原酶、分散酶和FBS的DMEM培养基)清洗。用解离缓冲液于37°C孵育组织碎块2h。然后，将组织碎块用10ml移液管充分悬浮于10ml冷分离缓冲液中。将含有死细胞的第一上清液丢弃，并用10-15ml解离缓冲液悬浮沉淀。进一步充分悬浮组织碎块之后，上清液富含胆管。重复该过程，到获得足够的胆管为止。

将分离的胆管沉淀并与50μl基质胶(BD Bioscience)混合，接种于24-孔细胞培养板并在基质胶完全聚合之前于37°C孵育5-10min。聚合之后，过量装载500μl组织培养基。

培养基组成：补充有B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/mlEGF、1μg/ml R-spondin1、胃泌素:10nM、FGF10100ng/ml、烟酰胺10mM和HGF:50ng/ml及50%Wnt条件培养基的改进型DMEM/F12。

每隔2日更换整个培养基。1周之后，去除Wnt条件培养基，利用1000μl移液管将形成的类器官与基质胶分离，并将其手动解离成小碎块并转移到新鲜的基质胶。每周一次或两次以1:4的分离比进行传代。在这些条件下，维持培养物至少6个月。

试剂

人肝细胞生长因子(HGF)购自Peprotech，EGF购自invitrogen，R-Spondin购自Nuvelo，Noggin购自peprotech，FGF10购自Peprotech，胃泌素购自Sigma Aldrich，烟酰胺购自Sigma。

微阵列

对于源自Lgr5的肝脏培养物的表达分析，利用Qiagen RNAase试剂盒从成体肝脏或培养于培养基中的肝脏培养物分离RNA，所述培养基不含Wntcm和Noggin(ER)，或者含有Wntcm和Noggin(ENRW)。用低RNAInput Linear Amp试剂盒(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)标记150ng总RNA。将通用小鼠参照RNA(Agilent)差异标记并与成体肝脏组织或者ER或ENRW处理的培养物杂交。使用4X44K Agilent小鼠全基因组双色微阵列(G4122F)。根据Agilent指南进行标记、杂交和冲洗。

实施例4–肝脏受损之后Lgr5表达上调

在肝脏中，Wnt信号通路在中央静脉区是活跃的。我们最近观测到Wnt信号通路在肝脏代谢中起关键作用(Boj et al.私人交流)。在肝管细胞中，Wnt信号通路在肝脏受损之后活化(Hu et al2007,Gastroenterology,133(5):1579-91)。类似地，利用代表Wnt信号通路的可靠的常规的报告基因Axin2-LacZ等位基因，在注射Wnt激动剂Rspo1之后(参见图12A)或在肝脏被肝毒性化合物四氯化碳(CCl4)损伤之后(参见图12B)，我们还在整个肝脏薄壁组织中观测到Wnt信号通路的上调。

Wnt靶基因Lgr5在几种自我更新活跃的组织中标记干细胞，但是以前并未报道过受损时会被表达。我们以前描述了，Lgr5-LacZ敲入小鼠(Barker et al,2007,Nature449(7165):1003-7)显示在健康肝脏中基本上不可测出Lgr5，但通过qPCR可检测残余的mRNA表达。在对Lgr5-LacZ敲入小鼠注射CCl4之后(参见Barker et al,2007,LacZ小鼠，同上，以及FuruyamaK et al.,Nat Genetics,43,34-41,2001对CCl4方法的描述)，我们观测到在肝脏新形成的芽结构中明显表达报告基因(参见图13A)，在受损之后6.5日达到峰值并持续到第9日，受损之后第13日肝脏一完全再生就显示明显衰减(参见图13A，顶部右图)。在经历相似损伤方案的野生型同窝出生小鼠中未检到报告基因的表达(参见图13A，底部右图)。

活跃再生位置处出现Lgr5表达，表明Lgr5可预示受损时由Wnt重新激活再生干细胞/祖细胞。的确，我们发现重新出现的Lgr5细胞不表达成熟肝细胞的标志物(K19或FAH)或星形细胞的标志物(SMA)，但是相反地，它们是最近描述的肝脏祖细胞标志物Sox9阳性的(图13B)。这意味着Lgr5+细胞(其作为体外获得类器官的出发点)，可通过诱导肝脏受损或通过用R-spondin刺激Wnt信号通路从肝脏碎块获得。通过受损或R-spondin诱导肝细胞的Lgr5表达可在获得细胞之前在体内进行，在分离的肝脏中离体进行，或者在肝脏碎块或肝细胞群中体外进行。

实施例5–肝脏的类器官培养物的长期扩增

在实施例1中，发现EGF(50ng/ml)和R-spondin1(1ug/ml)的组合，并补充有FGF10(100ng/ml)、HGF(25-50ng/ml)和烟酰胺(1-10mM)，优选用于长期维持培养物。我们现在还证明添加至EGF和R-spondin1的这三种补充因子(FGF10、HGF和烟酰胺)对于超过3个月的培养物的扩增全部都是必需的。为了评价，我们从肝脏薄壁组织分离胆管，如图14所示(使用K19染色来证实分离结构的身份)，并通过用以下培养它们来产生肝脏的类器官培养物：i)EGF；或ii)EGF和R-spondin1，加上FGF10或HGF或烟酰胺；或iii)EGF和R-spondin1，加上FGF10和HGF以及烟酰胺(ERFHNic)。我们每周一次分离培养物，持续总共14周时间。结果证实，如实施例1和2所报道，EGF、R-spondin1和烟酰胺与FGF10组合对于肝脏组织的生长和自我更新是必需的。10代之后，与补充有HGF的培养物相比，缺乏HGF的培养物显示生长不利。虽然仍然存活，相比补充有全部组合(FGF10、HGF和烟酰胺)的培养物1:6-1:8的增殖率，其增殖率下降至1:2-1:4。15代之后，用未补充HGF的ERFNic的培养物不再存活。因此，这些结果表明HGF是长期维持之后保持良好的增殖率所必需的(图15)。

实施例6–在分化条件下肝脏的类器官中表达的标志物

通过实施例2所述的分化方案，我们能够在肝脏的类器官中检测到肝母细胞标志物(白蛋白)和肝细胞表面标志物。为定量这些肝细胞-样细胞的数量，我们利用肝细胞表面标志物进行了培养物的流式细胞术分析。我们观测到，与在扩增培养条件下几乎未检测到肝细胞表面标志物阳性细胞相反，分化之后，多达35%的细胞是该肝细胞表面标志物阳性的(参见图17B和C)。

接着，我们分析了在这些分化条件下小鼠肝脏的类器官的基因表达谱(图16和图1，我们观测到如Alb、FAH和TAT以及Cyp3基因的明显上调)。我们发现，分化之后小鼠肝脏的类器官的基因表达类似于成熟小鼠肝细胞和/或小鼠肝脏中的基因表达。

实施例7–将肝脏的类器官植入小鼠

从利用ERFHNic扩增条件和EAFD分化条件培养的类器官获取细胞并植入缺乏酪氨酸分解酶延胡索酰乙酰乙酸酶(FAH)的免疫缺陷小鼠品系(用于I型酪氨酸血症人类疾病的小鼠模型)中(Azuma et al.2007,NatureBiotech,25(8),903-910)。移植时间表在图17D中给出。初步结果显示，在FAH缺陷小鼠的肝脏薄壁组织中存在分散的FAH阳性细胞，表明源自类器官培养物的肝脏细胞已被植入受体肝脏(参见图17A，右侧)。此外，还在受体小鼠的肝脏中观测到K19阳性细胞数量显著增加。这表明源自类器官的移植细胞能够在体内产生两种谱系：肝细胞(由FAH标志物显示)和胆管上皮细胞(由K19标志物显示)(参见图17A，顶部左图)。这通过流式细胞术分析来自两个独立的培养物的两个独立克隆的移植细胞来进一步支持(分别参见图17B和17C)。用含有GFP的病毒转导Lgr5+细胞，并在分化之后进行流式细胞术分析。肝细胞表面标志物阳性的细胞显示指示更大细胞的更大散布，这代表粒度和成熟度，即成熟肝细胞。肝细胞表面标志物阴性的细胞导致指示更小细胞的更小散布，即不太成熟的祖细胞。因此，在分化培养物中存在全部细胞类型(成熟和未成熟的细胞)。其余分化的细胞，因而将不用于FACS分析的细胞用于移植实验。

实施例8

通过微阵列分析分析根据本发明的方法培养的来自小鼠肝脏的类器官来确定哪些基因表达以及哪些基因不表达。

实施例9

利用本发明的EM1、EM2和DM培养基培养来自人肝脏的类器官，并通过寡核苷酸微阵列分析来分析人肝脏以确定哪些基因表达以及哪些基因不表达。扩增培养基中表达的基因，分化培养基中表达的基因以及成体肝脏中表达的基因之间显著不同的基因表达谱是显而易见的。肝细胞基因表达的趋势大致与小鼠中的相同，但是类器官的分化比小鼠肝脏的类器官中的更少。这可能是由于使用了人细胞。

如在利用寡核苷酸阵列分析中常常发生的，未检测到Lgr5和Tnfrsf19。然而，在扩增培养基培养的类器官中发现它们的存在。

材料与方法(实施例4至7)

动物处理

2-8月龄的Lgr5LacZ或Axin2-LacZ或WT同窝出生的BL6/Balbc F1小鼠接受腹膜内注射溶解于玉米油中的0.8ml/kg CCL4(n=)或单独的玉米油(n=)。2或5或9或13日之后将小鼠处死，分离肝脏并进一步进行针对RNA的处理或β半乳糖苷酶染色。

β-半乳糖苷酶(lacZ)染色

分离肝脏组织并立即在旋转试验台上，于4°C下在20倍体积的冰冷固定剂(含有1%甲醛；0.2%戊二醛；0.02%NP40的PBS0)中孵育2小时。去除固定剂，并在旋转试验台上，于室温下在洗涤缓冲液(PBS0；2mMMgCl₂；0.02%NP40；0.1%脱氧胆酸钠)中两次冲洗组织20分钟。然后添加β-半乳糖苷酶底物(含有5mM K₃FE(CN)₆；5mM K₄Fe(CN)₆.3H₂0；2mM MgCl₂；0.02%NP40；0.1%脱氧胆酸钠；1mg/ml X-gal的PBS0)，于37°C下黑暗中孵育组织2小时，并于室温下过夜。将底物去除，并在旋转试验台上，用PBS0于室温下两次冲洗组织20分钟。然后在旋转试验台上，于4°C下黑暗中，将组织在20倍体积的含4%多聚甲醛(PFA)的PBS0中过夜固定。将PFA去除，并在旋转试验台上，用PBS0于室温下两次冲洗组织20分钟。

将染色的组织转移到组织盒，并通过标准方法制备石蜡块。制备组织切片(4μM)并用中性红复染。

R-spondin1处理

6-8周大的Axin2-lacZ小鼠用100μg纯化的人R-spondin1经腹腔注射并于48小时之后处死，用于肝脏中的LacZ表达分析。

RT-PCR

利用RNeasy微型RNA提取试剂盒(Qiagen)从胃细胞培养物或新鲜分离的组织提取RNA，并利用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Promega)逆转录。如以前所述(Huch et al.,2009)，在热循环仪(GeneAmp PCR System9700;Applied Biosystems,London,UK)中扩增cDNA。以下表3中给出所使用的引物。

表3:RT-PCR引物

免疫组化

在此使用的免疫染色步骤以前描述于Huch et al.2009中。简而言之，将5微米切片脱蜡，复水，并利用PBS-T(PBS;Tween200.1%)渗透组织切片。需要时，用10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)处理切片以修复抗原，利用通用封闭缓冲液(BioGenex))封闭，并用一抗孵育。然后，切片用PBS冲洗两次并用过氧化物酶偶联的二抗孵育。DAB+(DAKO)用作显色底物。切片用迈耳氏苏木精复染并在Leica DMR显微镜上显示。所使用的一抗是兔抗-Sox9(1:600；室温下1h，Millipore)，小鼠抗-SMA(1:1000；4°C下过夜，Sigma)、兔抗-FAH(1:5000；37°C下过夜，由M.Grompe馈赠)，兔抗-K19(1:500；4°C下过夜，由M.Grompe馈赠)。所使用的过氧化物酶偶联的二抗是小鼠或兔Brightvision(Immunologic)。

免疫荧光

为了整个封片染色，类器官或分离的胆管用丙酮(类器官)或PFA4%(胆管)固定30min，用PBS冲洗一次，用PBS0.3%Triton-X100渗透5分钟，利用通用封闭液(Power block HK085-5KE BioGenex)封闭并用稀释于PBS1%FBS的一抗过夜孵育。在PBS中冲洗几次之后，用二抗孵育样品。用Hoescht33342染色细胞核。利用共聚焦显微镜(Leica,SP5)获取图像。利用Volocity软件(Improvision)进行三维重构。所使用的一抗是兔抗-K19(1:500;由M.Grompe馈赠)，兔抗-肝细胞表面标志物(1:50，由M.Grompe馈赠)，山羊抗-白蛋白(1:50，santa Cruz)。所使用的二抗全部在驴中诱导并偶联至不同的Alexa荧光团(驴抗-山羊568，驴抗-大鼠488，驴抗-兔647，Molecular probes)。

流式细胞术

在添加以1:20稀释的MIC1-1C3杂交瘤上清液或以1:50稀释的OC2-2F8杂交瘤上清液之前，将解离的细胞以每毫升1x104细胞重悬于1ml DMEM+2%FBS中，于4°C下孵育30min。用冷杜比可磷酸缓冲盐(DPBS)冲洗之后，将细胞重悬于含有1:200稀释的APC-偶联的山羊抗鼠二抗(吸附了小鼠血清蛋白)(Jackson Immunoresearch)的DMEM+2%FBS中。将碘化丙啶染色用于标记死细胞以排除。分析并用CytopeiainFluxV-GS(Becton-Dickenson)分选细胞。

移植测定

将分选的细胞群注射到脾脏，并如以前所述进行NTBC去除以诱导肝细胞选择(Overturf et al.1996)。停药3周时间，之后在受体动物恢复正常体重之前重新给予。

Claims (53)

1.获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官的方法，其中所述方法包括：

在存在培养基的条件下，与细胞外基质相接触培养上皮干细胞和/或含有所述上皮干细胞的分离的组织碎块，所述培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：作为促细胞分裂因子的表皮生长因子(EGF)和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3或R-spondin4。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述肝脏碎块源自胆管。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述肝脏碎块受到损伤，如机械损伤。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基本培养基是改进型DMEM/F12。

5.如权利要求1所述的方法，其中将以下成分的一种或多种，优选2种、3种、4种或全部添加到所述基本培养基中：BMP抑制剂、胃泌素、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。

6.如权利要求5所述的方法，其中将以下成分全部添加到所述基本培养基中：EGF、BMP抑制剂、R-spondin和Wnt激动剂。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自Noggin、DAN和DAN样蛋白，所述DAN样蛋白包括Cerberus和Gremlin；和/或

所述Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a、Norrin和GSK-抑制剂中的一种或多种；和/或

所述R-spondin选自R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3和R-spondin4。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中还将HGF添加到所述基本培养基中。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在培养至少一日之后，将培养基更换为不含BMP抑制剂或Wnt激动剂的培养基。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述不含BMP抑制剂或Wnt激动剂的培养基包含添加了以下成分的基本培养基：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子(EGF)、FGF以及HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及R-spondin1、R-spondin2、R-spondin3、R-spondin4中的任意一种。

11.如权利要求10所述的方法，其中将EGF、R-spondin1、FGF10、HGF和烟酰胺全部添加到所述基本培养基中，或者任选地，添加R-spondin4替代R-spondin1。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在培养至少两周之后，将培养基更换为不含BMP抑制剂或Wnt激动剂的培养基。

13.如权利要求12所述的方法，其中第二培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：EGF，FGF和/或HGF，TGF-β抑制剂以及Notch抑制剂。

14.如权利要求13所述的方法，其中将以下成分全部添加到所述基本培养基中：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF和HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4；Notch抑制剂以及TGF-β抑制剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述FGF是FGF10。

16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述Notch抑制剂是γ-分泌酶抑制剂，任选DAPT或二苯并氮卓(DBZ)或苯二氮卓(BZ)或LY-411575。

17.如权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是蛋白、肽或小分子。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述TGF-β抑制剂是选自以下的小分子抑制剂：A83-01SB-431542、SB-505124、SB-525334、LY364947、SD-208、SJN2511。

19.如权利要求13至18中任一项所述的方法，其中将以下成分的一种或多种，优选2种、3种或全部添加到所述基本培养基中：胃泌素、B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括

在以下细胞培养基中培养所述上皮干细胞和/或所述分离的组织碎块，所述细胞培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：EGF，BMP抑制剂，R-spondin以及Wnt；以及

随后在以下细胞培养基中培养所述上皮干细胞和/或所述分离的组织碎块，所述细胞培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF和HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1或R-spondin4；以及

随后在以下细胞培养基中培养所述上皮干细胞和/或所述分离的组织碎块，所述细胞培养基包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：EGF，FGF和/或HGF，TGF-β抑制剂以及Notch抑制剂。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肝脏的类器官源自一个表达Lgr5的单细胞。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其不含饲养细胞。

23.成体肝脏干细胞群，其通过以显著水平天然表达标志物Lgr5、Hnf1α和Hnf4中的一种或多种来表征。

24.如权利要求23所述的成体肝脏干细胞群，其中所述成体肝脏干细胞是人成体肝脏干细胞。

25.如权利要求23或24所述的成体肝脏干细胞群，其中所述细胞群通过权利要求1至21中任一项所述的方法获得。

26.肝脏的类器官，其包含权利要求23、24或25所述的至少一种细胞类型。

27.如权利要求26所述的肝脏的类器官，其还包含至少一种肝细胞和至少一种胆管上皮细胞。

28.如权利要求26或27所述的肝脏的类器官，其表达以下标志物中的至少一种：肝细胞标志物，如白蛋白、B-1整合素、转甲状腺素蛋白和谷氨酰胺合成酶；和/或至少一种胆管上皮细胞标志物，如角蛋白7和19。

29.如权利要求26至28中任一项所述的肝脏的类器官，其包含至少1x10³细胞至5x10⁴细胞的群，例如至少1x10³细胞至5x10³细胞的群。

30.如权利要求26至29中任一项所述的肝脏的类器官，其包含囊状结构，以及在其外部的具有至少一个芽和中央腔的细胞层。

31.如权利要求26至30中任一项所述的肝脏的类器官，其具有以下特征中的一种或多种(例如2种、3种、4种或全部5种)：(a)具有的细胞密度>5×10⁵细胞/cm³，优选>10×10⁵细胞/cm³；(b)具有相当于2-30层细胞的厚度，优选相当于2-15层细胞的厚度；(c)细胞在三维空间相互接触；(d)显示健康肝脏组织固有的功能，(e)具有细长的形状，具有两个限定的区。

32.如权利要求23至31中任一项所述的细胞群或类器官，其能够分泌白蛋白。

33.如权利要求23至32中任一项所述的细胞群或类器官，其分泌尿素。

34.如权利要求23至33中任一项所述的细胞群或类器官，其显示明显的糖原累积。

35.如权利要求23至34中任一项所述的细胞群或类器官，其具有可诱导的细胞色素P450活性。

36.如权利要求23至35中任一项所述的细胞群或类器官，其中所述细胞在形态上呈现肝细胞样。

37.如权利要求23至36中任一项所述的肝脏的类器官，其中所述肝脏的类器官与细胞外基质相接触。

38.如权利要求23至37中任一项所述的肝脏的类器官，其可以被培养至少1个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少5个月，至少6个月，至少7个月，至少8个月，至少10个月，至少15个月，至少20个月，至少24个月或更久。

39.如权利要求23至38中任一项所述的人肝细胞群或人肝脏的类器官，其表达以下干细胞标签基因中的至少一种，优选全部：LGR4、TACSTD1/Epcam、CD44、SOX9、SP5、CD24、PROM1、CDCA7和ELF3。

40.如权利要求23至39中任一项所述的人肝细胞群或人肝脏的类器官，其表达以下重编程基因中的至少一种，优选全部：KLF4、MYC、POU5F1和SOX2。

41.如权利要求23至40中任一项所述的人肝细胞群或人肝脏的类器官，其表达以下肝细胞/胆管上皮细胞特异性基因中的至少一种，优选全部：HNF1A、HNF1B、HNF4A、HHEX、ONECUT1、ONECUT2、PROX1、CDH1、FOXA2、GATA6、FOXM1、CEBPA、CEBPB、CEBPD、CEBPG、GLUL、KRT7、KRT19和MET。

42.如权利要求23至41中任一项所述的人肝细胞群或人肝脏的类器官，其不表达以下肝细胞/胆管上皮细胞特异性基因中的至少一种，优选全部：NEUROG2、IGF1R和CD34、AFP、GCG和PTF1A，例如其不表达NEUROG2、IGF1R和CD34。

43.如权利要求23至42中任一项所述的人肝细胞群或人肝脏的类器官，其表达以下肝细胞特异性基因中的至少一种，优选全部：TTR、ALB、FAH、TAT、CYP3A7、APOA1、HMGCS1、PPARG、CYP2B6、CYP2C18、CYP2C9、CYP2J2、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F8、CYP4V2和SCARB1。

44.权利要求23至43中任一项所述的肝脏的类器官在药物发现筛选、毒性测定或再生医学中的用途。

45.细胞培养基，其包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：

作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子、FGF和HGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，

胃泌素，烟酰胺，B27，N2和N-乙酰半胱氨酸；以及优选地，

BMP抑制剂；和

Wnt激动剂。

46.细胞培养基，其包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基：作为促细胞分裂生长因子的表皮生长因子和FGF，所述FGF能够结合FGFR2或FGFR4且优选FGF10，烟酰胺，以及优选地，Wnt激动剂，优选R-spondin1和/或Wnt-3a。

47.如权利要求46所述的细胞培养基，其还包含HGF。

48.细胞培养基，其包含添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基或由添加了以下成分的动物或人细胞的基本培养基组成：EGF、FGF和/或HGF、TGF-β抑制剂以及Notch抑制剂。

49.权利要求45至48中任一项所述的培养基用于在细胞外基质上培养上皮干细胞或分离的组织碎块的用途。

50.如权利要求49所述的用途，其用于获得和/或培养肝脏碎块或肝脏的类器官。

51.用于再生肝脏或用于获得表达Lgr5的细胞的方法，其包括刺激肝脏中的Wnt信号通路。

52.权利要求23至43中任一项所述的肝脏的类器官或细胞群用于治疗肝脏失调、病症或疾病的用途。

53.治疗肝脏失调、病症或疾病的方法，其包括将权利要求23至43中任一项所述的细胞群或肝脏的类器官给予有需要的患者。

Images