CN103966166B

CN103966166B - 尿液细胞培养基及尿液细胞的培养方法

Info

Publication number: CN103966166B
Application number: CN201410226074.7A
Authority: CN
Inventors: 兰峰; 李扬; 王彩云
Original assignee: BEIJING CELLAPY BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING CELLAPY BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-05-26
Filing date: 2014-05-26
Publication date: 2017-01-18
Anticipated expiration: 2034-05-26
Also published as: CN103966166A

Abstract

本发明公开了一种尿液细胞培养基及尿液细胞的培养方法。其中，该尿液细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM高糖培养基；添加剂包括胎牛血清1～10V％、B₂₇1～5V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～5mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、三碘甲状腺原氨酸5～15nM以及人表皮生长因子10～30ng/ml。该培养方法是采用上述尿液细胞培养基培养尿液细胞。应用本发明的技术方案，本发明的尿液细胞培养基成分明确，品质稳定且成本较低使用方便。

Description

尿液细胞培养基及尿液细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种尿液细胞培养基及尿液细胞的培养方法。

背景技术

制作iPS(induced pluripotent stem cells，诱导多能干细胞)细胞的第一步是获取人类样本，并分离适合的体细胞。虽然iPS细胞可以从多个人体组织的细胞通过重编程获得，但是大部分获取样本的方法，如皮肤活检，是损伤性的，导致搜集样本困难。最近，一些研究人员证明iPS细胞可以从血液样本中提取的CD34+细胞获得，因而使得样本收集容易一些。然而，从血液里分离/培养CD34+细胞的整个过程非常长和昂贵。

尿液与人体代谢密切相关，其中含有少量的组织脱落细胞。裴端卿博士等研究发现，人类尿液中的肾上皮细胞是诱导多能干细胞(iPSCs)的理想来源，而且利用尿液中的肾上皮细胞诱导多能干细胞符合成本效益，通用，适合于应用各个年龄、性别和种族。这项技术使得获取大量病人样本相较于其它现有方式容易和经济得多。

此外，利用尿液中的肾上皮细胞诱导多能干细胞整个程序相当快速，重现性好，所产生的诱导多能干细胞表现出很好的分化能力。研究人员能够较为容易地在医院获得用于重编程的原代细胞，仅需基本的实验室设备即可。因此尿液细胞也是生成来自正常个体或遗传病患者多能细胞的一个极好的选择。目前，市面上的尿液细胞分离培养试剂盒，价格昂贵，操作繁琐，影响大批量实验研究。

发明内容

本发明旨在提供一种尿液细胞培养基及尿液细胞的培养方法，以解决现有技术中尿液细胞培养成本较高，操作繁琐的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种尿液细胞培养基。该尿液细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM高糖培养基；添加剂包括胎牛血清1～10V％、B₂₇1～5V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～5mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、三碘甲状腺原氨酸5～15nM以及人表皮生长因子10～30ng/ml。

进一步地，添加剂包括胎牛血清3～6V％、B₂₇1～3V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～3mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子18～25ng/ml、三碘甲状腺原氨酸8～12nM以及人表皮生长因子15～25ng/ml。

进一步地，添加剂包括胎牛血清5V％、B₂₇2V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺2mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、三碘甲状腺原氨酸10nM以及人表皮生长因子20ng/ml。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃；添加剂单独保存在-20～-80℃。

进一步地，尿液细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以10:200的体积配比混合后形成尿液细胞培养基。

进一步地，尿液细胞培养基在使用前0～3天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明的另一个方面，提供一种尿液细胞的培养方法。该培养方法是采用上述尿液细胞培养基培养尿液细胞。

进一步地，包括以下步骤：S1，将收集的尿液细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入尿液细胞培养基，每隔一天半量换液，换液时需将换掉的尿液细胞培养基中的尿液细胞离心收回并重新添加到培养皿中；S3，3～5天后，全量换液，扩增细胞。

应用本发明的技术方案，本发明的尿液细胞培养基成分明确，品质稳定且成本较低使用方便。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A至图1D示出了实验一中实施例3的尿液细胞培养基培养人尿液细胞增殖过程中不同阶段的图像；

图2示出了实验一中尿液细胞在实施例3中的增殖曲线图；以及

图3示出了实验二中实施例3与对比例1中的两种尿液细胞培养基中细胞的增殖曲线图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

现有技术中，尿液细胞的培养基成分比较复杂，配制起来不够方便；试剂盒操作简单，但价格昂贵，不适合大批量实验。

针对上述技术问题，根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种尿液细胞培养基。该培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM高糖培养基；添加剂包括胎牛血清1～10V％、B₂₇1～5V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～5nM(纳摩尔)、重组人碱性成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、三碘甲状腺原氨酸5～15nM以及人表皮生长因子10～30ng/ml。应用本发明的技术方案，本发明的尿液细胞培养基成分明确，品质稳定且成本较低使用方便。

优选的，添加剂包括胎牛血清3～6V％、B₂₇1～3V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～3mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子18～25ng/ml、三碘甲状腺原氨酸8～12nM以及人表皮生长因子15～25ng/ml。

进一步优选的，添加剂包括胎牛血清5V％、B₂₇2V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺2mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、三碘甲状腺原氨酸10nM以及人表皮生长因子20ng/ml。

根据本发明一种典型的实施方式，基础培养基保存在4～8℃；添加剂单独保存在-20～-80℃，以便延长保存时间。

优选的，尿液细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以10:200的体积配比混合后形成尿液细胞培养基。尿液细胞培养基在使用前0～3天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重编程细胞的培养方法。该方法是采用上述任一种尿液细胞培养基培养尿液细胞。

优选的，包括以下步骤：S1，将收集的尿液细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入尿液细胞培养基，每隔一天半量换液，换液时需将换掉的尿液细胞培养基中的尿液细胞离心收回并重新添加到培养皿中；S3，3～5天后，全量换液，扩增细胞。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

在下列实施例中，添加剂通过以下步骤配置：

尿液细胞添加剂：

第一步：配制各种成分的储备液：①谷氨酰胺200mM、②重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)200ng/ul、③人表皮生长因子(bEGF)200ng/ul、④三碘甲状腺原氨酸1000nM。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为胎牛血清1～10V％、B₂₇1～5V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～5mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、三碘甲状腺原氨酸5～15nM以及人表皮生长因子10～30ng/ml。

实施例1-5中的尿液细胞培养基的组分如表1所示。

表1

对比例1中的培养基为RE/MC培养液(lonza公司，CC-412)。

将上述实施例1-3中的重编程培养基按照如下步骤配制：

在2～8℃化冻尿液细胞添加剂，随后将尿液细胞添加剂加入基础培养基形成尿液细胞培养基，可在2～8℃稳定储存达两周。

尿液细胞培养基：将10ml尿液细胞添加剂与200ml基础培养基混合后形成尿液细胞培养基。

尿液细胞培实验

实验一：

1.实验材料：人新鲜尿液

2.培养基：实施例1-5中的尿液细胞培养基

3.实验步骤：

S1，用500ml无菌瓶收集新鲜尿液约300ml，密封瓶口，转入无菌间操作(建议先适量饮水排出陈尿，等待一段时间后采集尿液)；将收集的尿液转移至50mL的离心管中，300g离心10min；待离心结束后，小心弃去上清，每管保留约3mL，将细胞重悬后，合并到一管中，300g离心10min；弃上清，用5-8ml尿液细胞洗涤液(PBS+双抗)重悬细胞，转移至15ml离心管中，300g离心10min；弃上清，3ml尿液细胞完全培养液重悬细胞沉淀，接种于Matrigel铺底的3.5cm培养皿中；

S2，每2天半量换液：吸出2mL的培养基，以300g离心5min，沉淀用2mL的新鲜完全培养基重悬，并小心加回到原皿；

S3，直至细胞贴壁后，每两天一次全换液，待细胞增殖密集后，PBS清洗，0.25％胰酶消化传代即可；通过绘制增殖曲线，验证培养基的培养效果进行比较。结果证实，实施例3，细胞状态好，增殖旺盛，特附图说明。

图1A至1D示出了实验一中实施例3的培养基培养人尿液细胞在分离培养过程中不同生长阶段的图像，其中，图1A图示出了刚分离到的尿液细胞图；图1B图示出了培养3～5天，少量尿液细胞贴壁图；图1C图示出了培养7天后，尿液细胞增殖图；图1D图示出了培养10～15天，尿液细胞传代扩增图。

图2示出了实验一中实施例3培养尿液细胞的细胞增殖曲线图。

实验二：

1.实验材料：人新鲜尿液

2.培养基：实施例3中的尿液细胞培养基和对比例1的RE/MC培养液

3.实验步骤：

S3，直至细胞贴壁后，每两天一次全换液，待细胞增殖密集后，PBS清洗，0.25％胰酶消化传代即可；通过绘制增殖曲线，对不同培养基的培养效果进行比较。

实验结果如图3所示。

另外，实施例1-2和4-5在上述尿液细胞培养试验中的实验结果与实施例3相似，只是略差于实施例3，但还是其效果还是优于对比例的，在此实施例1-2和4-5的实验结果不再一一罗列。

综上，从实验一和二的结果(图1-3)可以看出，本发明的尿液细胞培养基细胞增殖能力好，使用方便，简单易行。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种尿液细胞培养基，其特征在于，由基础培养基和添加剂组成；

其中，所述基础培养基为DMEM高糖培养基；

所述添加剂由胎牛血清1～10V％、B₂₇ 1～5V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～5mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、三碘甲状腺原氨酸5～15nM以及人表皮生长因子10～30ng/ml组成。

2.根据权利要求1所述的尿液细胞培养基，其特征在于，

所述添加剂由胎牛血清3～6V％、B₂₇ 1～3V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺1～3mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子18～25ng/ml、三碘甲状腺原氨酸8～12nM以及人表皮生长因子15～25ng/ml组成。

3.根据权利要求2所述的尿液细胞培养基，其特征在于，

所述添加剂由胎牛血清5V％、B₂₇ 2V％、青链霉素1V％、谷氨酰胺2mM、重组人碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml、三碘甲状腺原氨酸10nM以及人表皮生长因子20ng/ml组成。

4.根据权利要求1所述的尿液细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基保存在4～8℃；所述添加剂单独保存在-20～-80℃。

5.根据权利要求4所述的尿液细胞培养基，其特征在于，所述尿液细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：

在2～8℃化冻所述添加剂；

将所述添加剂与所述基础培养基以10:200的体积配比混合后形成所述尿液细胞培养基。

6.根据权利要求5所述的尿液细胞培养基，其特征在于，所述尿液细胞培养基在使用前0～3天配制，并在2～8℃保存。

7.一种尿液细胞的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至6中任一项所述的尿液细胞培养基培养。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将收集的尿液细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；

S2，向所述培养皿中加入所述尿液细胞培养基，每隔一天半量换液，换液时需将换掉的所述尿液细胞培养基中的所述尿液细胞离心收回并重新添加到所述培养皿中；

S3，3～5天后，全量换液，扩增细胞。