CN108570443A - 一种用于培养尿液来源细胞的培养基 - Google Patents

一种用于培养尿液来源细胞的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于培养尿液来源细胞的培养基，属于细胞培养领域。所述培养基中含有人源血小板裂解物。申请人通过多年来大量地筛查实验，最终确认人源血小板裂解物作为无异源性尿液来源细胞培养基的核心添加物，可克服以往无异源性培养时所存在的尿液来源细胞增殖速度极慢并且逐渐发生细胞死亡等问题。添加人源血小板裂解物的无异源性培养基并能够较好地培养尿液来源细胞，获得研究或临床应用所需的细胞量。本发明血小板裂解物在尿液来源细胞的无异源性培养及培养基中的应用具有创新性，对再生医学具有重大的意义。

Description

一种用于培养尿液来源细胞的培养基
技术领域
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种用于培养尿液来源细胞的培养基。
背景技术
近年来随着诱导多能干细胞技术的成熟，多种不同类型细胞均可成功诱导成多能干细胞，包括尿液来源细胞，据文献报道，2011年尿液来源细胞被成功诱导成为多能干细胞。而尿液来源细胞相较于其他类型的细胞提取方法更简单，只需要收集供体的尿液即可，避免对供体造成疼痛或创伤，因此尿液来源细胞是诱导多能干细胞供体的理想来源。由于尿液来源细胞的培养是获得诱导多能干细胞的关键步骤，因此，发展适合临床级别尿液来源细胞的培养技术对再生医学具有极大的推进作用。
1972年Southerland和Bain通过收集新生儿尿液并离心进而弃除上清获得少量细胞沉淀，然后用含30％胎牛血清的培养基将细胞沉淀悬浮，进而进行培养，首次从尿液中收集培养得到尿液来源细胞。之后数十年关于尿液来源细胞培养技术得到了极大的发展，然而这些用于培养尿液来源细胞的培养基都含有胎牛血清或者其它动物源性等异源性成分。除了动物性异源性成分，异源性成分还包括植物源性、微生物源性及真菌源性等非人源物质的成分。培养基中所含有的这些异源性成分存在引入外源病毒的风险，此外，异源性成分也会成为异源抗原从而引起免疫应答，这严重地阻碍了尿液来源细胞在临床细胞治疗、临床再生医学方面等的应用。
尿液来源细胞培养基近年来不断改进，EGF、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、硒、三碘甲状腺氨酸、视黄酸、氢化可的松、腺嘌呤、B27等在不断被尝试加入尿液来源细胞培养基中来替代动物血清或其他异源物质，但实际情况是当完全缺乏动物血清或其它异源性成分时，在上述添加物存在下极难或不能获得我们所需应用量的尿液来源细胞。研究期间通常会发现在培养过程中尿液来源细胞增殖速度极慢并且逐渐发生细胞死亡，因此要实现完全无异源性尿液来源细胞的培养仍需要经过深入探索和研究。
有实验数据表明，从尿液中收集并成功培养到尿液来源细胞与尿液样本的体积、pH值、渗透压、尿液供体年龄、尿液中的草酸含量、尿液中淀粉酶活性及与尿液在膀胱中存留的时间有相当大的联系。从1L的尿液中仅可收集到0－6300个尿液来源细胞，其中大部分样本可收集到的尿液来源细胞量少于1000个，而可收集到尿液来源细胞并存活下来的尿液样本量仅占所有尿液样本量的37％。上述获得足够尿液来源细胞的样本用于培养时，培养条件均为含20％的胎牛血清的培养基，在不含血清的培养基中无法培养得到尿液来源细胞。即便是利用20％的胎牛血清的培养基进行尿液来源细胞培养时，收集到的大部分细胞呈现球状形态且无法进行贴壁生长，而且贴壁后的细胞大多为呈现纺锤状形态生长的单个细胞，培养一段时间后大部分只可观察到1到2个细胞增殖克隆，并且需要培养接近1个月才可增殖到可传代的细胞数量(R.Belik,W.Follmann,G.H.Degen,P.H.Roos,M.Blaszkewicz,H.J.Knopf,K.Golka,Improvements in culturing exfoliated urothelial cells invitro from human urine,Journal of toxicology and environmental health.Part A,71(2008)923-929.)。
正常细胞是有寿命的，分裂次数有限，当细胞分裂到一定次数后会出现衰老。常规的尿液以外来源的细胞用于培养时，通常样本来源于组织块或器官，其基数较大，经过较少的分裂次数即可获得实验所需细胞量。而尿液来源细胞因本身收集到的量极少，需进行很多次分裂后才可能获得研究或临床应用所需的细胞量，当细胞经过多次分裂，加上现有的培养条件不成熟，尿液来源细胞极易提前衰老。此外，细胞生长一般会经历生长缓慢的潜伏期、对数生长期、平顶期及退化衰老期。当初始细胞量大时，因微环境的影响，细胞经过短暂的潜伏适应期后即可进入对数生长期，增殖速度快。但是当细胞量极少时，细胞潜伏生长期延长，增殖进度慢，较难进入对数生长期，细胞极难存活，极易发生凋亡和死亡等现象。因此尿液来源细胞在培养相较于其他细胞培养难度更大，要在无血清或无任何相关的异源性成分或提取物条件下培养尿液来源细胞并获得研究或临床可应用的数量的技术在近几十年几乎无任何进展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于培养尿液来源细胞的培养基(包括无异源性培养基和异源性培养基)。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于培养尿液来源细胞的培养基，所述培养基中含有血小板裂解物。
优选的，所述血小板裂解物包括人源血小板裂解物和或/其它物种来源的血小板裂解物。
优选的，所述人源血小板裂解物包括人的血液来源的血小板裂解得到的血小板裂解物，多种类型干细胞分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，其他类型细胞重编程转分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，或利用细胞融合等生物学手段所获取的血小板裂解而来的血小板裂解物中的至少一种。
优选的，所述培养基可以分为无异源性培养基或异源性培养基。无异源性培养基是指的培养基中无动物源性、植物源性、微生物源性及真菌源性等非人源物质的组分。由于培养基中不含有异源性成分，所以不存在引入外源病毒的风险，也不存在引入异源抗原从而引起免疫应答的风险，有利于尿液来源细胞在临床细胞治疗、临床再生医学方面等的应用。
所以如果需要获得无异源性培养基，则选用人源血小板裂解物即可。
血小板裂解物是本发明所述尿液来源细胞培养基所必须添加组分。如同胎牛血清，人血小板裂解物因包括各种能够促进细胞生长的必需因子，如转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β2(TGF-β2)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)、血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)、血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)、表皮细胞生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板因子-4(PF-4)、白蛋白、脂蛋白、附着因子、蛋白酶抑制剂、有丝分裂原和凝血因子等，能够极大地促进细胞增殖。因此血小板裂解物可作为胎牛血清替代物对尿液来源的原代细胞进行培养，从而解决因使用胎牛血清所带来的抗原引起免疫应答的缺陷，以及引入自带的异源性病毒微生物等问题。
申请人通过多年来大量地筛查实验并最终确认血小板裂解物作为无异源性尿液来源细胞培养基的核心添加物。本发明培养基在含有其他组分而没有添加血小板裂解物的条件下，细胞生存到一定时间后是不能存活下去。培养基含有血小板裂解物而不含其他组分中的任意一种的条件下，尿液来源细胞仍能够增殖但增殖速度会受到一定的影响。
如果不需要获得无异源性培养基，则选用血小板裂解物时，可以不限于人源血小板裂解物；此外还可以加入目前市面上常规的尿液来源细胞培养基的组分，包括异源性组分，如牛血清蛋白。利用牛血清蛋白和血小板裂解物复配共同培养尿液来源细胞。
优选的，所述培养基中血小板裂解物的含量优选为0.5％～20％，更优选为8％～20％，按体积百分比计。
优选的，所述培养基还含有维生素C、Wnt激活剂、ROCK抑制剂中的至少一种。发明人研究发现，血小板裂解物与维生素C、Wnt激活剂或者ROCK抑制剂进行复配，效果佳。
下面具体分析一下，血小板裂解物与维生素C、Wnt激活剂或者ROCK抑制剂的原理和复配配比。
1、血小板裂解物与维生素C复配
维生素C作用是：一方面，维生素C是多种组蛋白去甲基化酶辅因子，可以激活去甲基化酶Kdm4b、Kdm2a等。Kdm2a还可提高细胞存活、增殖、周期及抑制细胞衰老，与Oct4共同作用可激活多能性microRNA miR-302/367cluster。维生素C还可诱导核心多能性基因的表达及提高胚胎干细胞的DNA去甲基化水平。因此，维生素C在维持细胞的自我更新能力方面发挥着重要作用。
本发明采用维生素C和血小板裂解物进行复配，维生素C可以抵抗由于细胞分裂次数的增加而导致细胞的衰老，在包含血小板裂解物的培养基中添加维生素C可以防止少量的尿液来源细胞经过大量细胞分裂得到较多数量细胞后发生不可逆的衰老，维生素C与血小板裂解物协同促进尿液来源细胞进行有效持续地细胞培养。
优选的，维生素C优选为L-抗坏血酸、维生素C磷酸酯镁、或其类似衍生物中的至少一种。
其中，L-抗坏血酸可促进iPSCs的产生和提高重编程效率，IC50为6.5μM，L-抗坏血酸的CAS No:50-81-7，结构如下：
维生素C磷酸酯镁的CAS No:113170-55-1，结构如下：
优选的，维生素C优选为L-抗坏血酸，L-抗坏血酸在所述培养基中的含量优选为1～700μg/ml，更优选为10～200μg/ml。
2、血小板裂解物与Wnt激活剂复配
Wnt信号通路在维持干细胞的自我更新方面发挥重要作用，β-catenin可以作为转录因子的共激活剂，激活c-myc、Oct4、Sox2、Nanog等多能性相关基因。当Wnt激活剂激活Wnt信号通路时，可导致β-catenin在细胞核内聚集从而维持干细胞自我更新能力。此外，Wnt信号通路还对促进干细胞的增殖起重要作用。
Wnt激活剂可以维持细胞的干性及促进细胞的增殖，在包含血小板裂解物的培养基中添加Wnt激活剂可以维持尿液来源细胞进行原代培养时大量增殖时的干性，从而促进细胞较好的增殖。
优选的，Wnt激活剂包括CHIR 99021、BIO、WNT-3a、R-spondin-2中的至少一种。
其中，CHIR 99021是Wnt激活剂，IC50为10nM/6.7nM，CHIR 99021的CAS No:252917-06-9，结构如下：
BIO是Wnt激活剂，IC50为5nM，BIO的CAS No:667463-62-9，结构如下：
优选的，Wnt激活剂优选为CHIR 99021，CHIR 99021在所述培养基中的含量优选为0.0005～5μM，更优选为0.001～0.5μM。
3、血小板裂解物与ROCK抑制剂复配
Rho相关激酶(ROCK)作为Rho下游靶点，通过胞外信号可在细胞功能上发挥重要作用，包括收缩，运动，增殖，分化和细胞凋亡。其中，ROCK介导膜泡，增强肌动蛋白的收缩，并激活胱天蛋白酶信号级联和细胞凋亡。ROCK抑制剂是可以抑制Rho相关激酶作用的小分子抑制剂。ROCK抑制剂作为Rho相关激酶的抑制剂，可抑制细胞的分化及凋亡，提高干细胞的存活及维持其自我更新能力。当在包含血小板裂解物的培养基中添加ROCK抑制剂可以提高细胞贴壁能力，抑制尿液来源细胞在潜伏生长期细胞所发生的凋亡，从而有利于进一步提高细胞的增殖效率。
优选的，ROCK抑制剂包括Y-27632、Thiazovivin、Fasudil、GSK429286A、Rk1-1447中的至少一种。
其中，Thiazovivin是新型的ROCK抑制剂，IC50为0.5μM，可促进干细胞的存活。Thiazovivin的CAS No:1226056-71-8，结构如下：
Y-27632是一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，作用于ROCK-I和ROCK-II，Ki分别为220nM和300nM。Y-27632的CAS No:129830-38-2，结构如下：
Fasudil(HA-1077；AT-877)盐酸盐是ROCK-II，PKA，PKG，PKC和MLCK抑制剂，Ki分别为0.33μM，1.6μM，1.6μM，3.3μM和36μM。Fasudil的CAS No:105628-07-7，结构如下：
GSK429286A是选择性的ROCK1和ROCK2抑制剂，IC50值为14nM和63nM。GSK429286A的CAS No:864082-47-3，结构如下：
Rk1-1447是一种有效的ROCK1和ROCK2抑制剂，IC50值为14.5nM和6.2nM。Rk1-1447的CAS No:1342278-01-6，结构如下：
发明人研发中尝试加入ROCK抑制剂如Thiazovivin、Y-27632、Fasudil、GSK429286A、Rk1-1447等并通过多次实验，其中Thiazovivin与血小板裂解物复配效果最佳，其MTT结果值显示当加入Thiazovivin时，Day7增殖数据为0.89，而其他ROCK抑制剂较这个值小，只有0.85或更小。发明人最终确定将Thiazovivin与血小板裂解物复配，作为尿液来源细胞无异源性培养基的成分。
优选的，ROCK抑制剂优选为Thiazovivin，Thiazovivin在所述培养基中的含量优选为0.01～30μM，更优选为0.1～10μM。
优选的，所述培养基还含有表皮细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、肾上腺素、三碘甲腺原氨酸中的至少一种。
表皮细胞生长因子是一种重要的生长因子，在调节细胞生长，存活，迁移，凋亡，增殖等方面发挥重要作用。
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。一方面，胰岛素与IGF-IR结合介导IGF-IR自身磷酸化，可激活PI3K，进而导致PIP3表达提高，最终激活AKT，从而影响细胞增殖，分化，凋亡及细胞内葡萄糖运转。另一方面，胰岛素功能被抑制或信号不足时将影响干细胞的自我更新能力，导致细胞分化，在维持细胞的自我更新能力方面发挥着重要作用。
氢化可的松是肾上腺皮质产生的类固醇激素，具有抗炎和免疫抑制作用。
铁离子可促进细胞的快速增殖，铁离子的存在还会影响DNA合成，基因调节等，此外，铁离子的氧化还原反应会促进高活性氧的形成，而高活性氧可引起氧化应激，脂质过氧化，DNA损伤并最终导致细胞死亡。因此，细胞内铁离子的缺乏或过多均可对细胞造成重大影响，而转铁蛋白，是一种糖蛋白，在细胞培养中主要是负责铁离子的运输，其次是结合内源性铁离子，对维持铁的平衡发挥重要的作用。
肾上腺素是一种激素和神经递质，肾上腺素受体激活可刺激DNA合成及提高细胞的存活。
三碘甲状腺原氨酸是一种甲状腺激素，三碘甲状腺原氨酸与甲状腺激素受体β1结合激活MAPK(ERK1/2)信号通路，从而促进细胞增殖。
优选的，所述培养基含有下述组分：血小板裂解物、维生素C、Wnt激活剂、ROCK抑制剂、表皮细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、肾上腺素、三碘甲腺原氨酸，及基础培养基。
优选的，所述培养基中各组分含量为：表皮细胞生长因子1～100ng/ml、胰岛素1～75μg/ml、氢化可的松1～360ng/ml、转铁蛋白0.5～75μg/ml、肾上腺素0.1～5μg/ml、三碘甲腺原氨酸0.1～200pg/ml、L-抗坏血酸10～200μg/ml、Wnt激活剂CHIR 99021 0.001～0.5μM、ROCK抑制剂Thiazovivin 0.1～10μM、血小板裂解物0.5％v/v-20％v/v、基础培养基补足至1L。
优选的，基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、αMEM、RPMI 1640、CMRL-1066、Ham'sF12、IMDM、199、MCDB中的至少一种或多种上述基础培养基以任意比例混合。所述培养基没有浓度要求，均是市售产品的统一浓度。
优选的，基础培养基是由DMEM/F12或DMEM或DMEM/F12和DMEM按照任意比例混合。
一种培养基的添加物，所述添加物为血小板裂解物。
优选的，所述血小板裂解物包括人源血小板裂解物和或/其它物种来源的血小板裂解物。
优选的，所述人源血小板裂解物包括人的血液来源的血小板裂解得到的血小板裂解物，多种类型干细胞分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，其他类型细胞重编程转分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，或细胞融合等生物学手段所获取的血小板裂解而来的血小板裂解物中的至少一种。
血小板裂解物在尿液来源细胞培养中的应用。
血小板裂解物在尿液来源细胞的无异源性培养中的应用。
一种尿液来源细胞，所述细胞是利用上述任一项所述培养基培养得到。
本发明的有益效果是：
申请人通过多年来大量地筛查实验，最终确认人源血小板裂解物作为无异源性尿液来源细胞培养基的核心添加物，可克服以往无异源性培养时所存在的尿液来源细胞增殖速度极慢并且逐渐发生细胞死亡等问题。添加人源血小板裂解物的无异源性培养基并能够较好地培养尿液来源细胞，获得研究或临床应用所需的细胞量。
本发明将血小板裂解物用于尿液来源细胞的培养，可极大地促进尿液来源细胞诱导得到多能干细胞并促进多能干细胞的临床应用。本发明血小板裂解物在尿液来源细胞的无异源性培养及培养基中的应用具有创新性，对再生医学具有重大的意义。
本发明在尿液来源细胞的无异源性培养基中加入血小板裂解物，它属于人来源成分，避免异种物质存在，所选用的人血小板裂解物可以从健康献血者获得并通过免疫及病原体检测。如同胎牛血清，人血小板裂解物包括各种能够促进细胞生长的必需因子，它含有TGF-β1、TGF-β2、FGF、IGF-1、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、EGF、VEGF、血小板因子-4(PF-4)、附着因子、蛋白酶抑制剂、有丝分裂原和凝血因子，能够极大地促进细胞增殖。
本发明在培养基中加入血小板裂解物后并经过多次实验验证可直接分离获得尿液所包含的细胞并进行扩大培养，实验结果也显示了本发明培养基极大的提高了尿液来源细胞的增殖速度及延长了生命周期。
利用本发明添加了血小板裂解物的培养基培养收集得到原代尿液来源细胞，所述细胞呈米粒状梭长形，在尿液来源细胞初始培养的第3至5天可观察到细胞贴壁，最终可观察到3至5处细胞克隆，在第15天可对细胞进行传代处理，其效果优于20％胎牛血清的培养基对尿液来源细胞的培养效果(R.Belik,W.Follmann,G.H.Degen,P.H.Roos,M.Blaszkewicz,H.J.Knopf,K.Golka,Improvements in culturing exfoliatedurothelial cells in vitro from human urine,Journal of toxicology andenvironmental health.Part A,71(2008)923-929.)。
本发明采用维生素C和血小板裂解物进行复配用于尿液来源细胞的无异源性培养。维生素C可以抵抗由于细胞分裂次数的增加而导致细胞的衰老，因此，在包含血小板裂解物的培养基中添加维生素C可以防止少量的尿液来源细胞经过大量细胞分裂得到较多数量细胞后发生不可逆的衰老，维生素C与血小板裂解物协同促进尿液来源细胞进行有效持续地细胞培养。
Wnt激活剂可以维持细胞的干性及促进细胞的增殖，在包含血小板裂解物的培养基中添加Wnt激活剂可以维持尿液来源细胞进行原代培养时大量增殖时的干性，从而促进细胞较好的增殖。
当在包含血小板裂解物的培养基中添加ROCK抑制剂可以提高细胞贴壁能力，抑制尿液来源细胞在潜伏生长期细胞所发生的凋亡，从而有利于进一步提高细胞的增殖效率。
附图说明
图1 MTT结果；
图2 MTT结果；
图3 MTT结果；
图4 MTT结果；
图5 MTT结果；
图6 MTT结果；
图7 MTT结果；
图8 MTT结果；
图9 MTT结果；
图10尿液来源细胞收集培养形态图；
图11尿液来源细胞培养衰老检测图。
具体实施方式
本发明实施例中的血小板裂解物，它属于人来源成分，避免异种物质存在，所选用的人血小板裂解物从健康献血者获得并通过免疫及病原体检测。
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例1
按照表1进行不同组别培养基的配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、αMEM、RPMI 1640、CMRL-1066、Ham's F12、IMDM、199、MCDB。
表1无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl，于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-25组的MTT结果如图1所示。
图1是MTT的结果图，MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的甲臢，用酶标仪测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量。
从图1可知，添加了血小板裂解物且不含异源性成分的各组培养基均能对尿液来源细胞进行增殖培养，在Day7时，组别1的MTT值最高，即基础培养基为DMEM：DMEM/F12＝1:1较其它基础培养基培养效果好。
实施例2
本实施例是在实施例1组别1的基础上，按照表2进行培养基配液，其中，血小板裂解物占培养基的体积比例按照表3进行添加，得到不同组别的培养基。配置时，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表2含不同体积比例血小板裂解物培养基组分
表3血小板裂解物体积比例
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基为150μl，于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-18组的MTT值如图2所示。
从图2可知，不同体积比例血小板裂解物均能对原代尿液来源细胞进行增殖培养，在Day7时，组别12，即含血小板裂解物体积比例为10％的培养基MTT值最高。其次，是组别10-18，即含血小板裂解物体积比例为8％～20％的培养基MTT值次之。
实施例3
按照表4进行不同组别培养基的配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表4的培养基配方中添加了血小板裂解物和多种维生素C，维生素C包括L-抗坏血酸、维生素C磷酸酯镁。
表4无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl；于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-7组的MTT结果如图3所示。从图3可知，在Day7时，加入不同种类及不同浓度的维生素C能在不同程度促进细胞增殖，其中组别3的MTT值最高。
实施例4
按照表5进行不同组别培养基的配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表5无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl，于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-9组的MTT结果如图4所示，不同浓度L-抗坏血酸均能对原代尿液来源细胞进行增殖培养，在Day7时，组别4，即含L-抗坏血酸浓度为35μg/ml的培养基MTT值最高。其次，是组别3-7，即含L-抗坏血酸浓度为10～200μg/ml的培养基MTT值相对较高。说明L-抗坏血酸的优选添加含量为10～200μg/ml。
实施例5
按照表6进行不同组别培养基的配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表6的培养基配方中添加了血小板裂解物和多种Wnt激活剂，Wnt激活剂包括CHIR99021、BIO、WNT-3a、R-spondin-2。
表6无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl；于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-14组的MTT结果如图5所示。从图5可知，在Day7时，加入不同种类及不同浓度的Wnt激活剂能在不同程度促进细胞增殖，其中组别3的MTT值最高。
实施例6
按照表7进行不同组别培养基的配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表7无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl，于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-9组的MTT结果如图6所示。从图6可知，不同浓度的CHIR 99021均可以促进尿液来源细胞的增殖，其中最佳的组别为第5组，即CHIR 99021浓度为0.025μM时效果最好，其次，是组别3-8，即含CHIR 99021浓度为0.001～0.5μM的培养基MTT值相对较高。说明CHIR 99021的优选添加含量为0.001～0.5μM。
实施例7
按照表8进行不同组别培养基配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表8的培养基配方中添加了血小板裂解物和多种ROCK抑制剂。ROCK抑制剂包括Y-27632、Thiazovivin、Fasudil、GSK429286A、Rk1-1447。
表8无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl；于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-17组的MTT结果如图7所示。从图7可知，在Day7时，加入不同种类及不同浓度的ROCK抑制剂能在不同程度促进细胞增殖，其中组别6的MTT值最高。
实施例8
按照表9及表10进行不同组别培养基配液，先加入基础培养基以外各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表9无异源性尿液来源细胞培养基部分成分
表10thiazovivin不同浓度
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl；于Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-15组的MTT结果如图8所示。从图8可知，各组培养基均能对尿液来源细胞进行增殖培养，在Day7时，加入不同浓度的thiazovivin能在不同程度促进细胞的增殖，其中组别7的MTT值最高。
实施例9
按照表11进行不同组别培养基配液，先加入基础培养基以外的各组分，然后再加入基础培养基进行补齐，其中，基础培养基为DMEM/F12:DMEM＝1:1。
表11无异源性尿液来源细胞培养基配方
消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(96孔板)铺板1500个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基REGM培养基进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔培养基150μl；Day1，Day4，Day7进行MTT检测。
经MTT检验，第1-8组的MTT结果如图9所示。从图9可知，各组培养基均能对尿液来源细胞进行增殖培养，在Day7时，共同加入维生素C、CHIR 99021、Thiazovivin的组别的MTT值最高。采用血小板裂解物和维生素C进行复配，血小板裂解物和Wnt激活剂进行复配，及血小板裂解物和ROCK抑制剂进行复配时，这三种复配效果相当，当血小板裂解物与维生素C、Wnt激活剂、ROCK抑制剂这三者同时进行复配时，其效果大于其两两复配的效果。
实施例10
本实施例是利用实施例9中组别8进行原代尿液来源细胞培养基配液。收集10ml-2L的尿液，1010g离心5min，弃上清，用含双抗的PBS对沉淀进行重悬并再次进行离心弃上清，然后使用尿液原代细胞培养基重悬沉淀至细胞培养板(24孔板)，并加入抗生素primoycin(1:500)，然后放置于37℃，5％CO2细胞培养箱内进行培养，期间不对其进行其他操作，五天后进行换液，待细胞克隆长至一定大小进行消化传代。
培养收集到的原代尿液来源细胞如图10所示。从图中可知，细胞呈米粒状梭长形，在尿液来源细胞培养的第3至5天可观察到细胞贴壁，最终可观察到3至5处细胞克隆，在第15天可对细胞进行传代处理，其效果优于20％胎牛血清的培养基对尿液来源细胞的培养效果(R.Belik,W.Follmann,G.H.Degen,P.H.Roos,M.Blaszkewicz,H.J.Knopf,K.Golka,Improvements in culturing exfoliated urothelial cells in vitro from humanurine,Journal of toxicology and environmental health.Part A,71(2008)923-929.)。因此，按照实施例9中组别8配液所得到的无异源性尿液来源细胞培养基可以收集并培养得到原代尿液来源细胞。
实施例11
本实施例是按照实施例9中各组别进行原代尿液来源细胞培养基配液。消化原代尿液来源细胞并进行计数，每孔(24孔板)铺板2000个细胞，Day0使用尿液原代细胞培养基(REGM培养基)进行培养，Day1，Day3，Day5更换为对应组别培养基进行培养，每孔添加培养基500μl，Day7进行衰老检测。
进行衰老检测时，先加入PBS进行洗涤，固定完毕后再次用PBS进行洗涤，然后加入新鲜配制的β-半乳糖甘酶染色液进行37℃孵育过夜，第二天显微镜下观察染色状态。
经β-半乳糖苷酶衰老检验，第1-8组的day7的染色结果如图11所示。从图11可知，各组培养基均能对尿液来源细胞进行增殖培养，且细胞均较为年轻，其中，染色结果显示第8组的细胞最年轻。以上实验数据表明：本发明的培养基在表皮细胞生长因子1～100ng/ml、胰岛素1～75μ/ml、氢化可的松1～360ng/ml、转铁蛋白0.5～75μ/ml、肾上腺素0.1～5μg/ml、三碘甲腺原氨酸0.1～200pg/ml、维生素C 10～200μg/ml、Wnt激活剂CHIR 99021 0.001～0.5μM、ROCK抑制剂Thiazovivin 0.1～10μM，血小板裂解物0.5％v/v～20％v/v的浓度范围内，均可以促进尿液来源细胞的增殖速度及单细胞存活率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种用于培养尿液来源细胞的培养基，其特征在于：所述培养基中含有血小板裂解物。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述血小板裂解物包括人源血小板裂解物和或/其它物种来源的血小板裂解物。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述人源血小板裂解物包括人的血液来源的血小板裂解得到的血小板裂解物，多种类型干细胞分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，其他类型细胞重编程转分化而来的血小板裂解而来的血小板裂解物，或利用生物学手段所获取的血小板裂解而来的血小板裂解物中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述培养基中血小板裂解物的含量优选为0.5％～20％，按体积百分比计。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：所述培养基还含有维生素C、Wnt激活剂、ROCK抑制剂中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于：维生素C包括L-抗坏血酸、维生素C磷酸酯镁、或其类似衍生物中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于：维生素C优选为L-抗坏血酸，L-抗坏血酸在所述培养基中的含量优选为1～700μg/ml。
8.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于：Wnt激活剂包括CHIR 99021、BIO、WNT-3a、R-spondin-2中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的培养基，其特征在于：Wnt激活剂优选为CHIR 99021，CHIR99021在所述培养基中的含量优选为0.0005～5μM。
10.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于：ROCK抑制剂包括Y-27632、Thiazovivin、Fasudil、GSK429286A、Rk1-1447中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的培养基，其特征在于：ROCK抑制剂优选为Thiazovivin，Thiazovivin在所述培养基中的含量优选为0.01～30μM。
12.根据权利要求1-11任一项所述的培养基，其特征在于：所述培养基还含有表皮细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、肾上腺素、三碘甲腺原氨酸中的至少一种。
13.根据权利要求12任一项所述的培养基，其特征在于：所述培养基含有下述组分：血小板裂解物、维生素C、Wnt激活剂、ROCK抑制剂、表皮细胞生长因子、胰岛素、氢化可的松、转铁蛋白、肾上腺素、三碘甲腺原氨酸，及基础培养基。
14.根据权利要求13任一项所述的培养基，其特征在于：所述培养基中各组分含量为：表皮细胞生长因子1～100ng/ml、胰岛素1～75μg/ml、氢化可的松1～360ng/ml、转铁蛋白0.5～75μg/ml、肾上腺素0.1～5μg/ml、三碘甲腺原氨酸0.1～200pg/ml、L-抗坏血酸10～200μg/ml、Wnt激活剂CHIR 99021 0.001～0.5μM、ROCK抑制剂Thiazovivin 0.1～10μM，血小板裂解物0.5％v/v～20％v/v，基础培养基补足至1L。
15.一种尿液来源细胞，其特征在于：所述细胞是利用权利要求1-14任一项所述培养基培养得到。
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