CN112458037A - 一种尿液细胞培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域，公开了一种尿液细胞培养方法，包括材料准备、获取尿液细胞、接种尿液细胞和细胞换液。本发明的尿液细胞的培养成功率高，培养成功率高达84％，不受人体的年龄、性别和尿液量影响，可为细胞治疗、疾病诊断和临床转化提供大量尿液细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种尿液细胞培养方法。
背景技术
尿液并非废物，尿液中除了含有水、无机盐、糖分以外还含有一些脱落的尿道上皮细胞、肾小管上皮细胞甚至一些极少量的干细胞等。尿液细胞可用于组织工程，其目标是组织和器官的再生，可以用于治疗创伤、癌症和畸形等多种疾病。尿液来源的细胞因其收集和分离成本低、增殖效率高、分化程度高而被认为是组织工程种子细胞的候选细胞，从新生儿尿液中可获大量肾脏祖细胞。尿液细胞可作为干细胞的来源，如通过重编程诱导为多能干细胞、尿液干细胞、神经祖细胞。尿液中的肾上皮细胞特别是尿液中足细胞的检测，可作为一种有价值的非侵入性方法来获取疾病活动或疾病类型的信息，并可用于门诊活检后的随访。因此尿液具有极大的应用前景。
尿液细胞有圆形、梭形、菱形、多边形以及一些不规则的形状，为贴壁生长且具有密度依赖性生长的细胞，其传代能力较弱，最多传3～5代后细胞活力明显下降，并且出现较多不规则的细胞，导致目前的尿液细胞的培养成功率较低。因此，发明人发明一种尿液细胞培养方法。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种尿液细胞培养方法，本发明的尿液细胞的培养成功率高，且不受人体的年龄、性别和尿液量影响，可为细胞治疗、疾病诊断和临床转化提供大量尿液细胞。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种尿液细胞培养方法，包括如下步骤：
S1：将所有待使用实验用具在超净台紫外灯下灭菌30min，备用；向四孔板的每个孔中均加入配制好的0.1％明胶0.5ml，放入37℃培养箱中孵育30-60min；
S2：配制HUC1培养基，所需试剂及其体积如下：DMEM:F1244.15ml，FBS5ml，P/S0.5ml，REGMBulletKit50ul；配制HUC2培养基50ml，所需试剂及其体积如下：REBM22.15ml，DMEM:F1222ml，FBS5ml，P/S0.5ml，REGMBullet Kit50ul；备用；
S3：尿液取样
取捐赠者尿液样本100ml，要求捐赠者饮用足够的水，并连续一周采集单个样本，避免第一次排尿；样品在容器中收集并保存在水浴中，尿液的前1/3舍弃，取后2/3的尿液于无菌培养瓶中，取完尿液后立即用50ml离心管分装；细胞分离与清洗：将分装多管后的尿液在离心机中以1500rpm离心10min，离心后取出，在超净台中轻缓倒出上清，每管剩余0.5ml尿液，向剩余的0.5ml尿液中加入之前配置好的细胞洗涤液1-2ml，细胞洗涤液含1％双抗的PBS，吹打混匀后将多管尿液合并于15ml离心管中，再次以1500rpm离心10min，倒去上清后获得细胞沉淀，将洗过的细胞重新聚集起来；
S4：尿液细胞接种
取步骤S1中的四孔板，吸出四孔板中的明胶，取500ulHUC1浸润四孔板；将第二次离心好的尿液倒出，留管底200-400l含细胞的溶液，随后每管加入HUC1培养基1-2ml，每一个孔可接种500ul含细胞的培养基，加入HUC1后反复吹打混匀后接种至四孔板，接种细胞之后，在四孔板上做好标记，并放入5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
S5：细胞培养和换液
原代细胞接种培养24h后即第二天时在显微镜下观察细胞，可见漂浮的尿液中残留的细胞，轻柔地更换培养基以去除漂浮细胞，此时使用HUC1进行全量换液，第三天时将原代培养基更换为扩大培养基，使用HUC2培养基进行全量换液，第四天不换液，第五天HUC2全量换液，第六天不换液，第七天HUC2半量换液，之后每隔一天后HUC2半量换液，直到细胞密度达70％以后传代。
进一步的，步骤S2中的HUC1培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含有hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000；步骤S2中的HUC2培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的尿液细胞的培养成功率高，培养成功率高达84％，不受人体的年龄、性别和尿液量影响，可为细胞治疗、疾病诊断和临床转化提供大量尿液细胞。
附图说明
图1为本发明的实施例中尿液细胞原代培养明场图片；
图2为本发明的实施例中尿液细胞原代培养明场图片；
图3为本发明的实施例中尿液细胞P0-P5明场图片；
图4为本发明的实施例中尿液细胞多次传代并进行细胞计数的结果图；
图5为本发明的实施例中记录的1-19天细胞生长情况结构图；
图6为本发明的实施例中总计19天内不同形状细胞数目的饼图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
本实施例在无菌环境中收集女性捐献者的尿液和男性捐献者的尿液，收集时尿液的前1/3舍弃，取后2/3的尿液于无菌培养瓶中，总共的新鲜尿液样本数量为43例，取完尿液后立即用15ml离心管分装，并记录尿液捐献者的年龄、性别以及捐献的尿液量。随后采用如下步骤对尿液进行培养：
S1：将所有待使用实验用具在超净台紫外灯下灭菌30min，备用；向四孔板的每个孔中均加入配制好的0.1％明胶0.5ml，放入37℃培养箱中孵育30-60min；
S2：配制HUC1培养基，所需试剂及其体积如下：
其中，REGMBulletKit具体包含以下小分子：hEGF,Hydrocortisone，Epinephrine,Insulin,triiodothyronine,Transferrin,GA-1000；
配制HUC2培养基50ml，所需试剂及其体积如下：
其中，REGMBulletKit具体包含以下小分子：hEGF,Hydrocortisone,Epinephrine,Insulin,triiodothyronine,Transferrin,GA-1000；备用；
S3：尿液取样
取捐赠者尿液样本100ml，要求捐赠者饮用足够的水，并连续一周采集单个样本，避免第一次排尿；样品在容器中收集并保存在水浴中，尿液的前1/3舍弃，取后2/3的尿液于无菌培养瓶中，取完尿液后立即用50ml离心管分装；细胞分离与清洗：将分装多管后的尿液在离心机中以1500rpm离心10min，离心后取出，在超净台中轻缓倒出上清，每管剩余0.5ml尿液，向剩余的0.5ml尿液中加入之前配置好的细胞洗涤液1-2ml，细胞洗涤液含1％双抗的PBS，吹打混匀后将多管尿液合并于15ml离心管中，再次以1500rpm离心10min，倒去上清后获得细胞沉淀，将洗过的细胞重新聚集起来；
S4：尿液细胞接种
取步骤S1中的四孔板，吸出四孔板中的明胶，取500ulHUC1浸润四孔板；将第二次离心好的尿液倒出，留管底200-400l含细胞的溶液，随后每管加入HUC1培养基1-2ml，每一个孔可接种500ul含细胞的培养基，加入HUC1后反复吹打混匀后接种至四孔板，接种细胞之后，在四孔板上做好标记，并放入5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
S5：细胞培养和换液
原代细胞接种培养24h后即第二天时在显微镜下观察细胞，可见漂浮的尿液中残留的细胞，轻柔地更换培养基以去除漂浮细胞，此时使用HUC1进行全量换液，第三天时将原代培养基更换为扩大培养基，使用HUC2培养基进行全量换液，第四天不换液，第五天HUC2全量换液，第六天不换液，第七天HUC2半量换液，之后每隔一天后HUC2半量换液，直到细胞密度达70％以后传代；换液信息如下表所示：
本实施例的步骤S2中的HUC1培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含有hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000；步骤S2中的HUC2培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000。
见附图1，本实施例在尿液细胞的原代培养过程中，将新鲜尿液经过处理后培养，从第5天开始会出现个别细胞群落如图1A，群落比较分散，容易在六孔板边缘最先发现如图1B。见附图2，其中图2A为尿液细胞原代培养第6天、7天、8天、9天、11天、13天、15天、17天明场拍照X100；图2B为尿液细胞原代培养第6天、7天、8天、9天、11天、13天、15天、17天明场拍照X200；图2C为尿液细胞原代培养第6天、7天、8天、9天、11天、13天、15天、17天明场拍照X400，可见尿液细胞呈梭形如“米粒”，且细胞为贴壁生长型细胞，且有密度依赖性生长的特点。
本实施例还对尿液细胞传代能力进行了观察，尿液细胞原代培养于六孔板，当密度达80％左右时开始传代，以1：3传代；从第4代开始细胞生长速度变缓，并出现一些空泡状和多分支状细胞。见附图3，其中P0为尿液细胞原代细胞，P1为尿液细胞第一代，P2为尿液细胞第二代，P3尿液细胞第三代，P4为尿液细胞第四代，P5为尿液细胞第五代明场拍照X100；可见细胞数目变少，生长活力下降。见附图4，其中横坐标为尿液细胞传代次数，纵坐标为尿液细胞细胞密度；本实施例对尿液细胞6个样本进行多次传代细胞计数后发现，尿液细胞数目从第3代以后开始逐渐减少，说明细胞活力下降。
本实施例还对上述培养的细胞进行了尿液细胞形态学观察，见附图5和附图6，可见尿液细胞原代培养从第7天开始出现细胞，细胞形态有圆形、梭形、多边形、不规则形等，此后细胞生长速度较快，以梭形细胞占细胞形状的大部分，不规则形细胞数目逐渐上升。
本实施例还进行了尿液捐献者的年龄、性别以及捐献尿液量与培养成功率之间的而关系的分析，见表1，本实施例通过SPSS相关性双变量斯皮尔曼统计分析发现尿液捐献者年龄、性别、尿液捐献量与尿液细胞培养是否成功并无相关性。
表1年龄、性别、尿液量与培养成功率相关性分析
| 相关系数R | P | |
| 年龄 | -0.31 | 0.043 |
| 性别 | -0.157 | 0.314 |
| 尿液量 | 0.071 | 0.651 |
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种尿液细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将所有待使用实验用具在超净台紫外灯下灭菌30min，备用；向四孔板的每个孔中均加入配制好的0.1％明胶0.5ml，放入37℃培养箱中孵育30-60min；
S2：配制HUC1培养基，所需试剂及其体积如下：DMEM:F1244.15ml，FBS5ml，P/S 0.5ml，REGM Bullet Kit 50ul；配制HUC2培养基50ml，所需试剂及其体积如下：REBM 22.15ml，DMEM:F1222ml，FBS 5ml，P/S 0.5ml，REGM Bullet Kit 50ul；备用；
S3：尿液取样
取捐赠者尿液样本100ml，要求捐赠者饮用足够的水，并连续一周采集单个样本，避免第一次排尿；样品在容器中收集并保存在水浴中，尿液的前1/3舍弃，取后2/3的尿液于无菌培养瓶中，取完尿液后立即用50ml离心管分装；细胞分离与清洗：将分装多管后的尿液在离心机中以1500rpm离心10min，离心后取出，在超净台中轻缓倒出上清，每管剩余0.5ml尿液，向剩余的0.5ml尿液中加入之前配置好的细胞洗涤液1-2ml，细胞洗涤液含1％双抗的PBS，吹打混匀后将多管尿液合并于15ml离心管中，再次以1500rpm离心10min，倒去上清后获得细胞沉淀，将洗过的细胞重新聚集起来；
S4：尿液细胞接种
取步骤S1中的四孔板，吸出四孔板中的明胶，取500ul HUC1浸润四孔板；将第二次离心好的尿液倒出，留管底200-400μl含细胞的溶液，随后每管加入HUC1培养基1-2ml，每一个孔可接种500ul含细胞的培养基，加入HUC1后反复吹打混匀后接种至四孔板，接种细胞之后，在四孔板上做好标记，并放入5％CO2、37℃细胞培养箱中培养；
S5：细胞培养和换液
原代细胞接种培养24h后即第二天时在显微镜下观察细胞，可见漂浮的尿液中残留的细胞，轻柔地更换培养基以去除漂浮细胞，此时使用HUC1进行全量换液，第三天时将原代培养基更换为扩大培养基，使用HUC2培养基进行全量换液，第四天不换液，第五天HUC2全量换液，第六天不换液，第七天HUC2半量换液，之后每隔一天后HUC2半量换液，直到细胞密度达70％以后传代。
2.根据权利要求1所述的一种尿液细胞培养方法，其特征在于，步骤S2中的HUC1培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含有hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000；步骤S2中的HUC2培养基中含有1％青-链霉素和10％胎牛血清，还含hEGF，Hydrocortisone，Epinephrine，Insulin，triiodothyronine，Transferrin，GA-1000。
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