CN107523472B

CN107523472B - 抗菌和可循环利用的细胞捕获装置及其循环方法

Info

Publication number: CN107523472B
Application number: CN201710592843.9A
Authority: CN
Inventors: 王本; 惠兰兰; 苏逸
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2017-07-19
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2019-08-16
Anticipated expiration: 2037-07-19
Also published as: CN107523472A

Abstract

本发明公开了一种抗菌和可循环利用的细胞捕获装置及其循环方法。该装置由基底和纳米氧化锌材料组成。纳米氧化锌经过弱酸溶液的处理可以得到有效的无损害的捕获细胞的释放，同时在保留的氧化锌材料上进行活化可用于下一轮的细胞捕获和释放，本发明提供的装置结构可以实现细胞，特别是针对循环肿瘤细胞(CTCs)捕获和释放的整合，实现循环利用的目的，同时捕获过程中避免了细菌的感染，克服了过去方法策略中只能达到对CTCs的单纯物理计数的限制，以及使用环境和无菌处理的要求，使人们对CTCs的生物分析成为可能，为临床上癌症病人的早期诊断、伴随诊断和个性化治疗提供了很好的技术平台。

Description

抗菌和可循环利用的细胞捕获装置及其循环方法

技术领域

本发明属于现代医学技术，具体涉及一种细胞或者微生物分选器件，特别涉及一种肿瘤细胞分选富集的生物分选系统及其制作工艺。

背景技术

癌症是发达国家第一位、发展中国家第二位的死亡病因。从临床上讲，造成癌症患者死亡率高的主要原因是疾病诊断的延迟和治疗方案的不恰当。从生理上来说，癌症造成的死亡大多数是由于肿瘤细胞通过血源性途径迁移到全身其他器官导致的。在这个过程中，转移癌细胞即循环癌细胞(circulating tumor cells,CTCs)在癌症转移中起着关键的作用。越来越多的证据表明肿瘤细胞从原发部位转移到其他部位在癌症发生的早期就已经发生。因此，一方面CTCs为癌症病人的早期诊断提供了一个有效的渠道。另一方面，它们也可以提供转移性恶性肿瘤的相关生物学信息。

CTCs往往具有以下特点：外周血中CTCs的含量极少，大约每1mL血液中含有1-100个CTCs，因此从外周血中分选CTCs面临巨大的技术挑战；作为上皮细胞的CTCs往往比血细胞大很多；CTCs的变形性较大，而且，癌细胞越软，侵袭转移能力越强。现有的CTCs分选富集方法有以下几种方法：(1)基于细胞大小的微过滤设备。(2)基于抗原抗体之间的免疫连接分选系统，即采用anti-EpCAM的抗体或anti-vimentin的抗体特异性修饰CTC分选的方法。该方法后来发展成为目前CTCs检测领域唯一经美国FDA认证的产品CellSearch^TM即依赖于抗原抗体的免疫连接。体外培养的癌细胞确实和体内的血细胞大小有显著差异，但是已有报导证明进入到血液系统的CTC尺寸和体外培养的同种癌细胞差别很大，更接近于体内血细胞的大小并且依赖于大小分选CTC特异性不高，会导致低纯度；目前，很多捕获装置缺乏对细胞进行收集富集，以及无菌保护的手段，同时大部分装置都是一次性的，不能重复利用造成高成本和浪费。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种诸如循环肿瘤细胞(CTCs)分选和富集的抗菌和可循环利用的细胞捕获材料平台。

本发明的技术方案如下：

一种抗菌和可循环利用的细胞捕获材料平台由如下步骤制备：

1)在模板上利用磁控溅射的方法长上纳米氧化锌晶种层，将有晶种层的模板与作为生长液的溶液孵育得到纳米氧化锌层；生长液是硝酸锌和乌洛托品的混合溶液，生长液中两种溶质浓度都是10mM；

2)进行等离子蚀刻，之后，将装置浸泡体积分数为4％的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷的乙醇溶液，室温孵育1小时，清洗后将装置浸泡在乙腈配置的10mM的N,N’-二琥珀酸亚胺碳酸酯溶液中，室温孵育10分钟，清洗，然后，装置加入用磷酸缓冲液配制的10μg/mL的neutravidin，室温孵育1小时，清洗，之后加入用PBS配制的1％BSA稀释的10μg/mL生物素连接的特异性抗体，比如anti-EpCAM或anti-vimentin抗体，室温孵育1小时，清洗，所述的每次清洗都是浸泡在PBS溶液中，放在摇床上5分钟；最后，用PBS配制的5％的BSA溶液进行封闭，室温1小时来减少血细胞非特异性粘附，得到抗菌和可循环利用的细胞捕获装置。

优选的，所述的模板为利用MEMS技术紫外光刻获得的PDMS基底模板。

优选的，所述的PDMS基底模板上设置高80μm，直径160μm，周期分布的圆柱，任意两圆柱的圆心间距为240μm。

优选的，所述的PDMS基底模板的长为3cm，宽为2cm。

优选的，所述的步骤1)孵育的温度为90℃，时间为48h。

优选的，所述的步骤1)中的磁控溅射条件为在120℃条件下作用30min，晶种层厚度为400-600nm。

所述抗菌和可循环利用的细胞捕获装置的循环方法步骤如下：

1)细胞捕获

用锡箔纸制成凹槽，将血液样本加入到凹槽中孵育1小时；利用抗菌可循环的细胞捕获装置对特定类型的细胞进行捕获；

2)细胞释放

在捕获完细胞并经过清洗的装置中加入酸溶液孵育，3分钟后加入PBS终止释放，通过离心收集捕获细胞；所述的酸溶液为PBS中加入0.1M盐酸溶液至pH为5.6时的溶液；

3)活化再循环

进行等离子蚀刻，之后，将装置浸泡在乙醇配制的体积分数为4％的(3-氨丙基)三甲氧基硅烷，室温孵育1小时，清洗后将装置浸泡在乙腈配置的10mM的N,N’-二琥珀酸亚胺碳酸酯溶液中，室温孵育10分钟，清洗，然后，装置加入用磷酸缓冲液配制的10μg/mL的neutravidin，室温孵育60分钟，清洗，之后加入用PBS配置的1％BSA稀释的10μg/mL生物素连接的特异性抗体，比如anti-EpCAM或anti-vimentin抗体，室温孵育1小时，清洗，每次清洗都是浸泡在PBS溶液中，放在摇床上5分钟，最后，用PBS配制的5％的BSA溶液进行封闭，室温1小时来减少血细胞非特异性粘附，活化后的装置即可再进行细胞捕获和释放。

本发明制作的是一种牢固长在基底模板上的纳米氧化锌材料以及结合在上面的各种化学材料构成的材料平台或器件。按照本发明的方法获得的装置具有良好的细胞捕获效率，对于乳腺癌MCF7细胞系，依赖于anti-EpCAM抗体的装置可达85.47±1.88％的捕获效率；释放的细胞在处理2-3min时有大约90％以上的活性；而且重复利用装置时捕获效率不受影响；

本发明针对循环肿瘤细胞(CTCs)分选富集的装置和材料，该装置优选的方案由有精密结构的PDMS基底和纳米氧化锌材料组成。特别地，纳米氧化锌经过弱酸溶液的处理可以得到有效的无损害的捕获细胞的释放，同时在保留的氧化锌材料上进行活化可用于下一轮的细胞捕获和释放，达到了循环利用的目的；同时，氧化锌材料有强的抗菌能力。本发明提供的基于氧化锌涂层的装置和材料结构可以实现细胞，特别是针对循环肿瘤细胞(CTCs)捕获和释放的整合，首次实现了循环利用的目的；该装置和材料结构在制备、分发，以及使用过程中无需灭菌，允许细胞分选在任意开放体系进行而没有细菌污染顾虑；克服了过去方法策略中只能达到对CTCs的单纯物理计数的限制，使人们对CTCs的生物分析成为可能；为临床上癌症病人的早期诊断、伴随诊断和个性化治疗提供了很好的技术平台，有望发展成为医院临床检验的常规化设备，因此具有广泛的应用前景和市场空间。

附图说明

图一是基于微电子机械系统(MEMS)技术和化学偶联方法制备的多层次不规则表面结构。(a)以上皮细胞黏附因子EpCAM或波形蛋白vimentin抗体修饰为典型实例的不规则和亲水界面的制作过程简图。(b)宽2cm，长3cm密集排列柱子的捕获装置图像。(c)任意3个圆柱以等边三角形的方式排列。在CTC捕获装置表面(d)第一次和(e)第二次生长氧化锌纳米材料的扫描电镜图。

图2是具有分层柱阵列的不规则表面的细胞捕获性能。通过将DAPI染色的两种乳腺癌(a)MCF7和(b)MDA-MB231细胞掺入PBS、来自健康志愿者处理血或全血制备模拟样品，并将肿瘤细胞稀释成10至10000个/mL的一系列浓度范围，获得捕获效率的回归分析。白细胞在PDMS和氧化锌纳米材料生长的界面上的非特异性粘附的(c)荧光图像和(d)定量分析结果。(e)PDMS直接吸附抗体和我们的装置的捕获效率。

图3是靶细胞的回收和细胞富集装置的循环利用。(a)用于细胞捕获和释放的可循环装置的示意图。(b)用温和酸溶液反应1-5分钟后释放的细胞的回收率和活力的趋势图。(c)将DAPI染色的MCF7加入到从健康供体获得的处理血液中，通过模拟临床样品检测第1，第2，第3，第4，第5，第6，第11，第16和第21次循环中细胞的捕获效率。第一轮和其他八轮之间的捕获率没有显着差异。(d)在第一次生长的ZnO纳米晶体完全溶解后，用新生长的纳米晶体检测第1，第2，第3，第4，第5，第6，第11，第16，和第21次循环中相应细胞捕获效率。第一轮和其他八轮之间的捕获率没有显着差异。

图4是纳米ZnO晶体修饰的细胞捕获装置的抗菌功能。(a)通过600nm的光密度检测，LB液体培养基孵育环境细菌的10小时的生长曲线。对照组为细菌正常生长曲线包括生长期缓慢，对数期和稳定期；然而，纳米材料修饰组细菌增长缓慢，没有典型的细菌生长曲线。培养基孵育8小时，(b)对照组和(c)纳米材料修饰组的细菌菌落检测细菌活性。(d)对照组和纳米材料修饰组中细菌菌落数的定量统计。在六个重复的纳米材料修饰组的固体培养基上都没有菌落。(e)利用450nm的光密度测试，比较MCF7细胞正常生长和在ZnO纳米晶体生长的PDMS板上经过1小时捕获过程后再生长的情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次独立重复实验。

细胞培养基(DMEM、RPMI-1640等)及live/dead试剂盒购自Invigrogen，胎牛血清(FBS)和neutravidin购自Sigma-Aldrich，生物亲和素修饰的人源EpCAM抗体购自R&Dsystems，anti-vimentin抗体，anti-EpCAM抗体，生物亲和素修饰的vimentin抗体购自Abcam。(3-氨丙基)三甲氧基硅烷，N,N’-二琥珀酸亚胺碳酸酯(DSC)，硝酸锌六水(Zn(NO₃)₂·6H₂O)和乌洛托品购自Aladdin；Anti-PanCK检测抗体(FITC)及anti-CD45检测抗体(PE)购自Abnova；PDMS购自Dow Corning；cell counting kit-8购自Dojindo；LIVE/DEADViability/Cytotoxity Kit购自life technologies。

几种不同组织来源的模式癌细胞株均购自ATCC。细胞在相应培养基中生长至一定浓度，然后采用胰酶消化，收集细胞计数用于后续实验测试。如有必要，采用DAPI对细胞进行预标记。根据后续需要，将细胞以10－100,000个细胞/毫升的浓度分散于PBS，全血或处理血中。

实施例一，带有多个柱子的PDMS基底的合成

首先，用AutoCAD设计3D结构，并制作带有设计结构的硅片模具。PDMS预聚物和固化剂以质量比10:1混合之后倒在模具上，真空泵抽真空，在90℃加热板上加热2小时，从模具上揭下来就可以使用。如图1b和1c所示为带有圆柱的PDMS基底。

实施例二，氧化锌纳米材料的合成

利用磁控溅射的方法在120℃条件下作用30min后在干净的PDMS基底上长上一层400-600nm的晶种层，接下来，配制生长液，生长液由六水硝酸锌和乌洛托品组成的混合溶液，两种化合物终浓度均为10mM。将带有晶种层的PDMS板浸泡在生长液中，放在90℃加热板上孵育48小时。如图1d和1e为PDMS基底上生长有氧化锌纳米材料。

实施例三，捕获装置的活化。

纳米氧化锌材料生长好后，实施例二所得装置进行等离子蚀刻1分钟。之后，将装置浸泡在乙醇配制的4％(v/v)(3-氨丙基)三甲氧基硅烷，室温孵育1小时。清洗后将装置浸泡在乙腈配置的10mM的N,N’-二琥珀酸亚胺碳酸酯(DSC)溶液中，室温孵育10分钟，清洗。然后，装置加入用磷酸缓冲液(PBS)配制的10μg/mL的neutravidin，室温孵育60分钟，清洗。之后加入用PBS配置的1％BSA稀释的10μg/mL生物素连接的anti-EpCAM或anti-vimentin抗体。室温孵育1小时，清洗。每次清洗都是将装置浸泡在PBS溶液中，放在摇床上10分钟。最后，用PBS配制的5％的BSA溶液进行封闭，室温1小时来减少血细胞非特异性粘附。活化好的装置用于细胞捕获或者存放在4℃冰箱。整个制作过程如图1a所示。

实施例四，细胞捕获实验

将10¹-10⁴个DAPI标记的癌细胞加入到1mL处理血中来模拟癌症病人外周血样本，未经处理的全血是从健康自愿者抽取。将健康人全血处理后得到一部分血细胞。整个处理过程如下：首先，全血和PBS以1:1的比例稀释，然后小心加入到含有与处理血相同体积的淋巴细胞分离液的15mL离心管中，4℃，650g离心25分钟，中间层的细胞被小心的转移到一个新的15mL离心管中，管中加有4-5mLPBS。4℃，400g离心20分钟，清洗。最后加入与全血相同体积的PBS得到处理血。将标记的癌细胞加入到处理血中得到模拟的临床样本。同时，装置活化，封闭并用锡箔纸制成凹槽。将模拟血加入到凹槽中孵育30分钟。最后，清洗去掉锡箔纸显微镜下观察。如图2a及2b所示，癌细胞在PBS和处理血液中都有很好的捕获效率。图2c、2d和2e表明与PDMS直接吸附抗体进行捕获相比较，生长有氧化锌的装置有低的白细胞的非特异性粘附。

实施例五，细胞释放

制备释放酸溶液：PBS中加入0.1M盐酸溶液至pH为5.6。捕获完细胞并经过清洗的装置中加入酸溶液孵育。3分钟后加入PBS终止释放，通过离心收集捕获细胞。捕获细胞的释放以及释放后装置的循环利用如图3a、3c和3d所示，多次循环利用的装置并没有降低捕获效率。

实施例六，细胞活性测试

细胞活性采用LIVE/DEAD试剂盒测试。将被捕获细胞置于2mMCalcein AM和2mMethidium bromide的PBS缓冲溶液中孵育30分钟。最终采用磷酸缓冲溶液清洗芯片，置于荧光显微镜下观察结果用程序计算法计数。捕获细胞的释放以及释放后细胞活性如图3b所示，弱酸处理2-3分钟有较好的释放率和捕获效率。

实施例七，环境菌的获得

为了模拟装置存储，运输及捕获细胞过程中的开放环境，将每孔含有3mL完全培养基的6孔板放在开放环境中，室温放置18小时后，经过离心将上清去掉。然后加入10mL LB液体培养基，37℃/200RPM的条件下过夜培养得到环境菌并用于接下来的氧化锌的抗菌检测。

实施例八，氧化锌纳米材料的抗菌作用

氧化锌纳米材料的抗菌作用通过测培养基的浊度作为细菌生长的定量分析检测方法并通过涂板来比较细菌活性。为了检测氧化锌纳米材料存在的情况下细菌的生长情况，每次试验用的环境菌都是新鲜准备的，用量程为2.5μL的移液枪将0.5μL新鲜的菌液加入到10mL LB液体培养基的培养管中，加入氧化锌纳米材料的管作为试验组，没有加入纳米材料的管作为正常对照组。细菌在37℃/200RPM的条件下生长。OD检测用200μL细菌培养基在600nm条件下检测，每隔2小时检测一次。同时做空白对照，因为培养基本身和纳米材料有一定的光吸收。OD检测过程中的第八个小时，将培养基稀释1x10⁵倍然后取200μL稀释培养基进行涂板。涂好的板倒置放置，37℃培养18个小时，对克隆计数。同时，不含纳米氧化锌材料的培养基作为对照组。如图4a、4b、4c、4d和4e所示氧化锌纳米材料确实有很强的抗菌作用。

实施例九，纳米氧化锌材料毒性检测

为了检测纳米氧化锌材料是否对捕获的细胞有毒性，我们用cell counting kit-8进行检测。首先，生长良好的MCF7细胞被平均分成两部分，一部分加入到覆盖有氧化锌纳米材料的PDMS制成的凹槽中，一部分加入到作为对照组的没有氧化锌材料的PDMS制成的凹槽中。接下来在5％CO₂，37℃培养1小时。离心后，将2组细胞都调整到2x10⁴/mL，并加入到96孔板中。细胞在5％CO₂，37℃培养24小时，之后加入含有cell counting kit-8检测溶液的完全液。同时，含有cell counting kit-8检测溶液的完全培养基200μL作为空白组。96孔板放置在5％CO₂，37℃培养箱中培养直到培养基颜色发生变化。然后用多功能酶标仪M5检测在450nm的光吸收值。如图4f所示，氧化锌材料引入到捕获装置时并没有对细胞造成任何毒害作用。

实施例十，血液样本收集和处理

健康人在医院完成采血，且采用包含有EDTA抗凝剂的真空取血管获得，放置于4℃冰箱，拿到血液后尽快处理，越快越好。处理血获得的整个过程如下：首先，全血和PBS以1:1的比例稀释，然后小心加入到含有与处理血相同体积的淋巴细胞分离液的15mL离心管中，4℃，650g离心25分钟，中间层的细胞被小心的转移到一个新的15mL离心管中，管中加有4-5mL PBS。4℃，400g离心20分钟，清洗。最后加入与全血相同体积的PBS得到处理血待用。

实施例十一，混合抗体实验

其它步骤同实施例3，在实施例3加入用PBS配制的10μg/mL的neutravidin，室温孵育清洗后，加入的特异性抗体改为用PBS配置的1％BSA稀释的10μg/mL生物素连接的anti-EpCAM和anti-vimentin抗体(1:1(w/w))，室温孵育1小时，清洗，每次所述的清洗都是浸泡在PBS溶液中，放在摇床上5分钟；最后，用PBS配制的5％的BSA溶液进行封闭，室温1小时来减少血细胞非特异性粘附。

健康人及肿瘤病人均在医院完成，且采用包含有EDTA抗凝剂的真空取血管获得，放置于4℃冰箱，并在24小时内处理完毕。用PBS稀释血液(1:1(v/v))，再将淋巴细胞分离液和PBS稀释血溶液2:1(v/v)的比率小心加入到细胞分离液的界面。经过1500g离心5分钟，弃上清，重新悬浮在等体积的缓冲溶液中保存于4℃冰箱备用。

利用荧光显微镜对捕获细胞的大小、形状以及细胞核比例进行初步的形貌判断，进一步利用细胞角蛋白的荧光标记的方法，借助于荧光显微镜完成循环肿瘤细胞的最终鉴定。后续也可以根据PCR法或者单细胞测序方法对CTCs进行分子分析。结果显示用上皮和间质特征分子对应的混合抗体进行细胞捕获更准确，并且晚期乳腺癌病人血液中的癌细胞要比早期癌症病人多。

Claims

1.一种抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于由如下步骤制备：

1）在模板上利用磁控溅射的方法长上纳米氧化锌晶种层，将有晶种层的模板与作为生长液的溶液孵育得到纳米氧化锌层；所述生长液是硝酸锌和乌洛托品的混合溶液，所述生长液中两种溶质浓度都是10mM；将生长有纳米氧化锌层的模板作为后续处理的装置；

2）对步骤1）所得的装置进行等离子蚀刻，之后，将装置浸泡体积分数为4%的（3-氨丙基）三甲氧基硅烷的乙醇溶液，室温孵育1小时，清洗后将装置浸泡在乙腈配置的10mM的N,N’-二琥珀酸亚胺碳酸酯溶液中，室温孵育10分钟，清洗，然后，装置加入用磷酸缓冲液配制的10 µg/mL的neutravidin，室温孵育1小时，清洗，之后加入用磷酸缓冲溶液配置的1%BSA稀释的10µg/mL 生物素连接的特异性抗体，室温孵育1小时，清洗，每次所述的清洗都是浸泡在PBS溶液中，放在摇床上5分钟；最后，用PBS配制的5%的BSA溶液进行封闭，室温1小时来减少血细胞非特异性粘附，得到抗菌和可循环利用的细胞捕获装置；所述的特异性抗体为anti-EpCAM、anti-vimentin抗体或其混合。

2.根据权利要求1所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的特异性抗体为anti-EpCAM、anti-vimentin抗体混合，anti-EpCAM抗体和anti-vimentin抗体的质量比为1:1。

3.据权利要求1所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的模板为利用MEMS技术紫外光刻获得的PDMS基底模板。

4. 根据权利要求3所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的PDMS基底模板上设置高80µm，直径160µm，周期分布的圆柱，任意相邻的两圆柱的圆心间距为240µm。

5.根据权利要求3所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的PDMS基底模板的长为3cm，宽为2cm。

6.根据权利要求1所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的步骤1）孵育的温度为90℃，时间为48h。

7. 根据权利要求1所述的抗菌和可循环利用的细胞捕获装置，其特征在于所述的步骤1）中的磁控溅射条件为在120°C 条件下作用 30 min，晶种层厚度为400-600nm。