CN111635545B - 一种肿瘤细胞捕获用的仿生取向叶片结构材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分析检测技术领域的生物功能材料及其制造方法，具体涉及一种用于捕获肿瘤细胞的仿生取向叶片结构材料及其制备方法和用途。本发明的仿生取向叶片结构材料，以植物叶片为模板，其表面具有与所述植物叶片表面结构互补的结构。仿生取向叶片结构材料表面具有沟槽，沟槽包括大沟槽和小沟槽，小沟槽位于大沟槽上，大沟槽宽度D1范围为50～300μm，小沟槽宽度D2的范围为1～40μm。本发明的仿生取向叶片结构材料能够有效地富集肿瘤细胞，实现不同种类肿瘤细胞的捕捉，对肿瘤细胞和人乳腺癌细胞(MCF‑7细胞)的捕获率在70％以上，有望用于癌症患者的早期诊断、检测、分析，癌细胞的去除以及血液净化。
Description
技术领域
本发明涉及一种分析检测技术领域的生物功能材料及其制造方法，特别涉及用来捕获肿瘤细胞的生物功能材料及其制造方法和用途。具体地，本发明涉及一种用于捕获肿瘤细胞的仿生取向叶片结构材料及其制备方法和用途。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)是通过实体肿瘤脱落进入血液的恶性细胞，可以通过血液传播至远端组织，形成转移灶。90％的癌症相关的死亡都源于肿瘤细胞的扩散转移，因此CTCs的分离和检测对肿瘤的监测和诊断具有重要意义。但是，CTCs在外周血中的含量极低(每毫升血液一到几百个)，严重阻碍了CTCs的精确计数和深入研究。因此，CTCs的富集方法需要具备高效性和高选择性。
CTCs的检测技术主要依靠肿瘤细胞与血细胞的物理性质差异(如尺寸、密度、电荷等)和依靠抗原抗体识别的生化性质差异。目前CTCs的富集方法主要有过滤法、免疫磁珠法、微流控芯片法。这些方法具有一定的不足，比如成本昂贵，制备方法复杂或捕获率低等。
研究发现，微纳米结构基底通过提供局部形貌相互作用来增强细胞粘附和用于接枝捕获剂的大表面积，应用于CTCs的捕获能够提高细胞捕获效率、纯度、灵敏度和再现性。文献Adv.Mater.2019,1903663，Adv.Funct.Mater.2020,1909306综述了近年来应用微纳米材料基底捕获CTCs的方法和技术。虽然这些方法提升了CTCs的富集效果，但是仍具有制备方法复杂，合成材料表面棱角尖锐等的缺陷。
仿生取向叶片结构材料是一种源自天然的纳米材料，来源广泛，廉价易得。取向叶片表面具有多级结构，有利于CTCs伪足与其相互作用，目前尚未有报道利用仿生取向叶片结构表面材料用于捕获循环肿瘤细胞的方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于肿瘤细胞捕获的仿生取向叶片结构材料，并提供了其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种仿生取向叶片结构材料，以植物叶片为模板，所述仿生取向叶片结构材料的表面具有与所述植物叶片表面结构互补结构。
上述技术方案中，进一步地，所述仿生叶片材料表面具有沟槽，所述沟槽包括大沟槽和小沟槽，所述小沟槽位于大沟槽上，
所述大沟槽宽度D1范围为50～300μm，小沟槽宽度D2的范围为1～40μm。通过沟槽宽度控制在上述范围，可以更有效的发挥沟槽结构的作用，增强细胞的粘附和捕获。
优选地，大沟槽宽度D1范围为70～100μm，小沟槽宽度D2的范围5～30μm。
上述技术方案中，进一步地，所述植物叶片为具有平行叶脉结构的植物叶片。
上述技术方案中，进一步地，所述的植物叶片为单子叶植物叶片。
优选地，植物叶片选自水稻叶片或小麦叶片。
上述技术方案中，所述仿生取向叶片结构材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物叶片固定、脱水、干燥，得到干燥的植物叶片；
(2)将所述干燥植物叶片固定后，浇注聚合物单体或预聚物和交联剂的混合液，待混合液固化后，将得到的聚合物从植物叶片表面剥离。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中固定用的固定液选自戊二醛固定液、多聚甲醛固定液、纳瓦申固定液、铬酸醋酸固定液、酒精-福尔马林固定液、福尔马林-丙酸-酒精固定液中的一种或多种。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中固定的时间为4～48小时。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(1)中干燥过程先采用梯度乙醇溶液浓度由低到高逐级脱水后再采用仪器干燥；对于乙醇溶液浓度的选择在0到100％区间内选择几个浓度设置梯度，可以选择本领域常用的梯度，15％、35％、50％、70％、83％、95％、100％；每个乙醇浓度浸泡时间为5-30分钟，优选为10～20分钟。仪器干燥选自选择烘干、真空干燥、冻干中的一种，优选为冻干干燥。冻干时间为4～48小时，优选为12～32小时。
上述技术方案中，进一步地，所述聚合物单体或预聚物为高分子聚合物单体或预聚物，优选为聚二甲基硅氧烷预聚物、乳酸、甲基丙烯酸甲酯、碳酸酯、氨基甲酸酯；所述交联剂为高分子交联用的交联剂，优选为过氧化二异丙苯、过氧化苯甲酰、二叔丁基过氧化物、过氧化氢二异丙苯、乙烯基三乙氧基硅烷。
上述技术方案中，进一步地，所述聚合物单体或预聚物和交联剂的质量比为2～100。
上述技术方案中，进一步地，所述步骤(2)中固化的方式为加热固化或紫外交联固化。当采用加热固化时，加热温度在60～80℃，加热时间为2～4小时。
本发明另一方面还提供了仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用。将捕获剂固载在仿生取向叶片结构材料表面，对肿瘤细胞进行捕获。
本发明的有益效果：本发明的仿生取向叶片结构材料能够有效地富集肿瘤细胞，实现不同种类肿瘤细胞的捕捉，具有廉价易得、操作简单的优势，可用于捕获外周血中的肿瘤细胞，经试验证明，本发明的仿生取向叶片结构材料对肿瘤细胞和人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)的捕获率在70％以上，有望用于癌症患者的早期诊断、检测、分析，癌细胞的去除以及血液净化。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的仿生水稻叶片结构材料表面的扫描电镜照片，比例尺为100μm；
图2是本发明实施例1制备的仿生水稻叶片结构材料表面侧剖面的扫描电镜照片，比例尺为300μm；
图3是图2的局部放大图；
图4是本发明实施例1中天然水稻叶片和仿生水稻叶片结构材料的对比图，比例尺均为300μm；a.天然水稻叶片,b.仿生水稻叶片；
图5是本发明实施例1中得到的仿生水稻叶片结构材料在捕获MCF-7癌细胞后的扫描电镜照片，比例尺为20μm；
图6细胞静态捕获实验捕获率数据图；
图7细胞动态捕获实验捕获的光学图像；a.仿生水稻叶片结构材料组，b.对照组；
图8实施例2中仿生小麦叶片结构材料捕获MCF-7癌细胞后的扫描电镜照片。
附图标记说明：
1：大沟槽；2：小沟槽；3：癌细胞。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例和试验例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例选用的叶片为天然水稻叶片，以购买于中科院细胞库的人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)为待捕获的循环肿瘤细胞模型，对本发明的捕获体系作进一步的阐述和验证，包括以下步骤：
1.制备用于捕获肿瘤细胞的仿生水稻结构材料
将若干片天然水稻叶片加入到30mL浓度为2.5％(v/v)的戊二醛溶液中，在4℃条件下浸泡24小时，得到固定水稻叶片。将固定后的水稻叶片用去离子水清洗3遍，去除残余的固定液。依次在15mL浓度为15％、35％、50％、70％、83％、95％的乙醇溶液中浸泡15分钟，然后在15mL乙醇中浸泡15分钟重复两次，得到脱水的叶片。将脱水后的水稻叶片冻干处理24小时。将干燥后的固定水稻叶片固定在平面基底上，在上面浇筑PDMS Sylgard 184中的基本组分和固化剂以质量比为10:1的混合液。将覆盖有混合液的水稻叶片在80℃温度条件下恒温2小时。在常温条件下，将聚二甲基硅氧烷聚合物固化在表面的水稻叶片的表面冷却，剥离水稻叶片表面的聚二甲基硅氧烷聚合物，该聚合物表面结构具有与水稻叶片表面结构互补的形状，聚合物表面用去离子水清洗3遍，常温条件下将聚合物表面烘干，得到仿生水稻叶片结构材料。
将上述仿生水稻叶片结构材料臭氧等离子体处理10分钟。在常温条件下，获得的处理后的仿生水稻叶片结构材料上沉积单宁酸涂层作为捕获剂，沉积单宁酸涂层的方法采用文献[Liwei Yang,Lulu Han,et al.Coating process and stability of metal-polyphenol film.Colloids and Surfaces A:Physicochem.Eng.Aspects 484(2015)197–205]中的方法。
在显微镜下观察所得仿生水稻叶片结构平面的结构，其中，图1示出了实施例1得到的仿生水稻叶片结构材料的扫描电镜图片(比例尺为100μm)，图1中清晰地示出在该材料表面分布着沟槽结构；图2示出了实施例1得到的仿生水稻结构平面的侧剖面的扫描电镜照片(比例尺为300μm)，从图2可知，在平面表层具有大沟槽以及小沟槽，其小沟槽位于大沟槽上；图4示出了实施例1中在对水稻叶片处理之前的干燥水稻叶片(a)与处理之后的仿生水稻叶片材料(b)对比图(比例尺均为300μm)，从图4可知，在处理之前，干燥水稻叶片表面具有沟槽结构，在经过处理之后，仿生取向表面完整的保留的了与水稻叶片表面结构相互补的结构。
接着，选取部分上述仿生水稻叶片结构材料，沿着样品取向垂直方向切割取截面，切面在扫描电子显微镜下分别放大300倍和1000倍拍照各100张，分别随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该切面的参数如下：
大沟槽宽度D1范围：58～136μm，平均值：77μm
小沟槽宽度D2范围：6～30μm，平均值：11μm
2.准备待测的肿瘤细胞样品：
取MCF-7细胞悬浮液100μL，用细胞计数器计数并计算其浓度。吸取一定量的上述细胞悬浮液，用DMEM细胞培养基稀释至1×105个细胞/mL。
3.细胞静态捕获实验：
将上述步骤1中沉积了单宁酸涂层的仿生水稻叶片结构材料放于细胞培养板中，然后将上述步骤2混合均匀的细胞悬浮液1mL滴加到仿生水稻叶片结构材料表面，然后置于细胞培养箱中，捕获时间为60分钟。
作为对照实验组1，对沉积了单宁酸涂层的平面聚合物(即在玻璃表面采用与步骤1相同的方法制备聚合物)表面也进行了相同的待测样品中的捕获肿瘤细胞实验。
捕获时间结束后，将捕获有肿瘤细胞的仿生水稻叶片材料用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，用质量浓度为4％的多聚甲醛水溶液固定捕获的癌细胞30分钟，将捕获的癌细胞浸泡在浓度为10μg/mL的DAPI水溶液中30分钟，达到染色的目的。最后在Olympus倒置荧光显微镜10倍下分别拍照(共计100张)，随机选取20张不同视野下的荧光照片，利用Image J软件对捕获的循环肿瘤细胞进行计数，计算捕获率。对照实验组1也按照上述步骤进行，并计算捕获率。
捕获率的计算方法如下：
将步骤1中的沉积了单宁酸涂层的仿生水稻叶片材料放入细胞培养板中(底面积为2cm2)。
捕获率＝[(x/Ax)/(N/A)]×100％(式1)
X：10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片中循环肿瘤细胞的补货数量；
Ax：10倍荧光显微镜下所照得的荧光照片视野大小；
x/Ax：实际捕获的细胞密度；
N：细胞的总投放量(本实施例中为“105个细胞/毫升”)
A：细胞培养板底面积(本实施例中为“2cm2”)
N/A：投放细胞的密度
通过(式1)计算每一个视野的捕获率，然后取所有视野的捕获率的平均值，即得到仿生水稻叶片结构材料对肿瘤细胞的捕获率。
上述实验结果表明，MCF-7癌细胞在沉积了单宁酸涂层的仿生水稻叶片结构材料粘附状态良好(参见图5，仿生水稻叶片结构材料对MCF-7癌细胞的捕获率达到85％，而对照实验组中，同样沉积了单宁涂层的平面材料对MCF-7癌细胞的捕获率仅为50％(图6)，表明该材料可以实现循环肿瘤细胞的高效捕获。
4.细胞动态捕获实验：
将上述步骤1中沉积了单宁酸涂层的仿生水稻叶片结构材料放于平行平板流动腔中，腔室中央置于Olympus倒置荧光显微镜10倍下观察，将上述步骤2混合均匀的细胞悬浮液自平行平板流动腔入口管注入，注入的速度为25mL/h。自显微镜视野下溶液充满腔体时开始计时2分钟，立即连续拍摄两张照片，间隔为1.67s(图7a)。
作为对照实验组1，对沉积了单宁酸涂层的平面聚合物(即在玻璃表面采用与步骤1相同的方法制备聚合物)表面也进行了相同的待测样品中的捕获肿瘤细胞实验(图7b)。
动态捕获结束后，利用Image J软件对两张照片中静止的肿瘤细胞进行计数，即为粘附在材料表面的细胞个数，每个视野的面积为2mm2，计算得每mm2的肿瘤细胞粘附个数。对照实验组1也按照上述步骤进行，并统计单位mm2的肿瘤细胞粘附个数。
| 粘附细胞个数/mm<sup>2</sup> | |
| 仿生水稻叶片结构材料 | 100±22 |
| 对照组 | 28±6 |
上述实验结果显示，仿生水稻叶片结构材料对MCF-7癌细胞的单位面积粘附个数为100±22个，而对照实验组中，同样沉积了单宁酸涂层的平面材料对MCF-7癌细胞的单位面积粘附个数仅为28±6个，表明该材料可以促进流动状态下时肿瘤细胞的捕获。
实施例2
同实施例1中的制备方法，本实施例选用的叶片为天然小麦叶片，得到仿生小麦叶片结构材料。
将本实施例的仿生小麦叶片结构材料，在扫描电子显微镜下分别放大300倍和1000倍拍照各100张，分别随机选取20张不同视野下的照片，通过nanomeasure软件进行测量，得到该材料的参数如下：
大沟槽宽度范围：85～285μm，平均值：175μm，
小沟槽宽度范围：3～19μm，平均值：8μm；
同实施例1中的实验方法，将本实施例的仿生小麦叶片结构材料进行细胞静态细胞捕获实验和动态细胞捕获实验，仿生小麦叶片结构材料的静态捕获率为81％，动态捕获粘附细胞数为90±28个/mm2。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (8)
1.一种仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，所述仿生取向叶片结构材料以植物叶片为模板，采用聚合物单体或预聚物和交联剂得到聚合物，剥离叶片表面的聚合物作为仿生叶片结构材料，所述仿生取向叶片结构材料的表面具有与所述植物叶片表面结构互补的结构；所述仿生取向叶片结构材料表面具有沟槽，所述沟槽包括大沟槽和小沟槽，所述小沟槽位于大沟槽上，所述大沟槽宽度D1范围为50～300μm，小沟槽宽度D2的范围为1～40μm。
2.根据权利要求1所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述植物叶片为具有平行叶脉结构的植物叶片。
3.根据权利要求1所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述的植物叶片为单子叶植物叶片。
4.根据权利要求1所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述仿生取向叶片结构材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将植物叶片固定、脱水、干燥，得到干燥的植物叶片；
(2)将所述干燥植物叶片固定后，浇注聚合物单体或预聚物和交联剂的混合液，待混合液固化后，将得到的聚合物从植物叶片表面剥离;(3)将步骤（2）获得的与叶片互补结构的表面采用臭氧等离子处理；
所述步骤(1)中固定用的固定液选自戊二醛固定液、多聚甲醛固定液、纳瓦申固定液、铬酸醋酸固定液、酒精-福尔马林固定液、福尔马林-丙酸-酒精固定液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述步骤(1)中固定的时间为4～48小时。
6.根据权利要求4所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述聚合物单体或预聚物为高分子聚合物单体或预聚物；所述交联剂为高分子交联用的交联剂。
7.根据权利要求6所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述预聚物为聚二甲基硅氧烷预聚物；所述交联剂为乙烯基三乙氧基硅烷。
8.根据权利要求4所述的仿生取向叶片结构材料在捕获肿瘤细胞中的应用，其特征在于，所述聚合物单体或预聚物和交联剂的质量比为2～100。
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