CN113083383A - 微流控芯片装置、制备方法及土壤微生物群落培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微流控芯片装置、制备方法及土壤微生物群落培养方法。所述微流控芯片装置用于模拟土壤矿物微界面，所述微流控芯片装置包括盖玻片和设置于所述盖玻片上的微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片主体和设置于所述芯片主体下表面的多个微柱，且所述芯片主体下表面和/或所述微柱表面修饰有矿物。本发明可以更加真实地反映自然土壤孔隙结构及矿物表面的情况，并通过改变微柱的直径及修饰矿物的种类，使得微流控芯片装置可以用来模拟不同土壤矿物的表面，能够原位培养土壤生物膜。

Description

微流控芯片装置、制备方法及土壤微生物群落培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及微流控芯片装置、制备方法及土壤微生物群落培养方法。
背景技术
自然环境中微生物大多以生物膜的形态存在。生物膜是指相互粘附或附着于表面、界面的由自身分泌基质包裹的微生物群体，具有空间、生物化学性质异质性，且比单一浮游细胞具有更高的组织水平，可以保护内部细胞抵御干旱、高盐、高温等不利外部条件。生物膜结构因环境和物种不同而呈现出较大的差异性，常见的结构包括：带状、波纹状、丝状等。培养环境不同，生物膜会发育出不同的结构以适应自身生长。
土壤是地球生态系统中性质和过程最为复杂的组成部分，是地球五大细菌栖息地之一。据统计，平均每克土壤含近十亿个微生物细胞。土壤微生物虽然体积小，但具有活性，在土壤生态系统过程中扮演着污染物清洁者和大分子物质分解者等角色。土壤微生物聚集在矿质颗粒、植物根系等表面，形成土壤生物膜。研究表明，土壤生物膜对元素循环、土壤健康以及作物生长等存在影响。所以，有必要了解土壤生物膜群落的形成过程及特性。
以往常用玻璃珠或人工土壤模型系统模拟土壤生态系统的空间和化学异质性或用微电极、断层扫描对土壤进行原位分析，这些研究为阐明土壤功能提供了重要见解，但无法表征微生物在微尺度下的菌-矿相互作用，而研究表明，土壤微生物几乎都在微米尺度范围内活动，且土壤具有巨大的时空异质性和不透明性，种种原因限制了微尺度土壤生物膜研究。
发明内容
本发明解决的问题是现有技术中对土壤生物膜群落的形成过程及特性的研究局限于传统的采用玻璃珠或人工土壤模型对土壤生态系统的时空异质性进行研究或者采用微电极、断层扫描直接对土壤进行原位分析，限制了土壤生物膜在微尺度上的进一步研究。
为解决上述问题，本发明提供一种微流控芯片装置，用于模拟土壤矿物微界面，所述微流控芯片装置包括盖玻片和设置于所述盖玻片上的微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片主体和设置于所述芯片主体下表面的多个微柱，且所述芯片主体下表面和/或所述微柱表面修饰有矿物。
较佳地，所述微柱在所述芯片主体的下表面呈行列均匀分布，且位于相邻行或相邻列的所述微柱错位分布。
较佳地，每个所述微柱的直径和/或高度与相邻所述微柱的间距相等。
较佳地，所述芯片主体内设置有进口和出口，所述进口包括培养基入口和细菌接种入口，所述进口和所述出口均分别与所述微柱之间的空隙连通。
本发明还提供一种微流控芯片装置的制备方法，包括：
制备芯片母模，所述芯片母模包括模本体和设置于所述模本体上的多个模柱；
对所述芯片母模进行硅烷化修饰，并将PDMS与固化剂按质量比10:1混合，得到PDMS预聚液；
将硅烷化修饰后的芯片母模置于所述PDMS预聚液中，并于80℃烘箱中固化20min；
待PDMS预聚液充分固化后，将其从所述芯片母模中剥离下来，切割成型，得到PDMS微流控芯片；
对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰，得到微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片主体和设置于所述芯片主体上的多个微柱；
在所述微流控芯片上设置进口和出口；
将所述微流控芯片与盖玻片键合，得到微流控芯片装置。
较佳地，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：明胶加热溶解并冷却至室温，加入硫酸铬钾，室温搅拌得到明胶/铬溶液；将所述明胶/铬溶液通入所述PDMS微流控芯片中，再通入矿物溶液，用氮气吹干，清洗烘干后得到所述微流控芯片。
较佳地，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为表面氨基修饰试剂，采用浸泡法对矿物进行氨基硅烷化修饰，得到表面改性后的矿物；以二苯甲酮为修饰试剂，对所述PDMS微流控芯片进行表面修饰；将所述表面改性后的矿物的悬浮液注入进行表面修饰后的PDMS微流控芯片内，并在紫外线作用下反应，得到所述微流控芯片。
较佳地，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：配置矿物悬浮液，将所述矿物悬浮液注入所述PDMS微流控芯片内，并将所述PDMS微流控芯片内部烘干，得到所述微流控芯片。
较佳地，所述矿物包括针铁矿、蒙脱石和高岭石中的一种。
本发明还提供一种土壤微生物群落培养方法，基于如上所述的微流控芯片装置或如上所述的微流控芯片装置的制备方法所获得的微流控芯片装置，所述土壤微生物群落培养方法包括：
将所述微流控芯片装置连入微流控培养系统，并对所述微流控培养系统进行杀菌消毒；
向所述微流控培养系统中通入设定量的菌液，并关闭所述微流控培养系统的进出口，所述微流控培养系统静置设定时间；
打开所述微流控培养系统的进出口，以设定流速向所述微流控培养系统中通入培养基，进行细菌培养。
本发明提供的微流控芯片装置，通过在芯片主体的下表面设置多个微柱，并在芯片主体下表面和/或微柱表面进行矿物修饰，更加真实地反映自然土壤孔隙结构及矿物表面的情况，并通过改变微柱的直径及修饰矿物的种类，使得微流控芯片装置可以用来模拟不同土壤矿物的表面，能够原位培养土壤生物膜，从而可以进一步借助激光共聚焦显微镜、荧光染色技术、测序技术、生物信息学分析方法等方法对土壤生物膜形成机制及生物膜群落中微生物的相互作用进行研究。
本发明基于微流控芯片装置培养土壤微生物，在激光共聚焦显微镜下，可以了解生物膜结构的生长变化以及土壤微生物群落结构的变化；并利用恒压泵高通量培养从土壤中提取的细菌，用土壤浸提液培养细菌，通过16S rRNA研究土壤生物膜不同生长阶段中细菌群落结构的变化，分析出细菌的优势门类。本发明所提供的模拟土壤不同颗粒大小的微流控芯片可以实现土壤微生物的原位、高通量研究，适用于土壤微生物与环境因素之间以及土壤微生物之间的相互作用机理探索。
附图说明
图1为本发明实施例中PDMS微流控芯片硅片母模的设计结构图；
图2为本发明实施例中PDMS微流控芯片硅片母模的扫描电镜图；
图3为本发明实施例中PDMS微流控芯片的显微镜照片；
图4为本发明实施例中修饰有不同矿物的微流控芯片的显微镜照片；
图5为本发明实施例中微流控芯片的制作模式图；
图6为本发明实施例中微流控培养系统的组成图；
图7为本发明实施例中培养36h得到的土壤生物膜的激光共聚焦图像；
图8为本发明实施例中培养48h得到的土壤生物膜的激光共聚焦图像；
图9为本发明实施例中培养96h得到的土壤生物膜的激光共聚焦图像；
图10为本发明实施例中培养108h得到的土壤生物膜的激光共聚焦图像；
图11为本发明实施例培养得到的土壤生物膜的细胞与EPS各组分及EPS组分两两间不同培养时间下的Mander共定位系数图；
图12为本发明实施例培养得到的土壤生物膜的EPS各组分及EPS组分两两间的Mander共定位系数图；
图13为本发明实施例培养得到的土壤生物膜在不同培养时间下每一种组分在一对组分中的共定位贡献度图；
图14为本发明实施例培养得到的土壤生物膜在不同培养时间下细菌丰富度变化图。
附图标记说明：
1-微流控芯片装置；11-培养基入口；12-细菌接种入口；13-出口。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
土壤生物膜的形成及特性研究对土壤健康及作物生长等具有重要作用，通过人工模拟土壤颗粒，搭建土壤微生物培养系统，监控土壤生物膜的形成过程并结合一些微观手段研究土壤生物膜的特性，不失为一种简便且能够原位研究土壤微生物的方法。而由于土壤中微生物群体具有高度的多样性，因此人工模拟的土壤颗粒与自然土壤性质之间的接近度越大，可信度越大，越有助于土壤生物膜的研究，即模拟的土壤颗粒越接近自然土壤，越能够体现研究的客观真实性，越具有代表性，也为深刻理解自然土壤生物膜驱动的生物地球化学过程与生态环境效应提供科学依据。
本发明实施例提供的微流控芯片装置1，可以模拟不同的土壤矿物微界面，由此可以原位培养土壤生物膜，并借助激光共聚焦显微镜(CLSM)，了解生物膜结构的生长变化及土壤微生物群落结构的变化情况。
请参阅图1-5所示，所述微流控芯片装置1包括盖玻片和设置于所述盖玻片上的微流控芯片，其中，微流控芯片包括芯片主体和设置于芯片主体下表面的多个微柱，多个微柱在芯片主体的下表面均匀分布，且微柱铺满芯片主体的下表面，且芯片主体下表面和/或微柱表面修饰有矿物。矿物质是组成土壤的主要部分，本实施例通过在芯片主体下表面设置多个微柱，用以模拟土壤颗粒，通过在微流控芯片表面修饰矿物，使得模拟的土壤颗粒更接近于自然土壤。
应当理解，微柱在芯片主体的下表面呈行列分布，且相邻微柱之间形成空隙，以便于流体通过。优选地，如图1、3所示，本实施例中，位于相邻行或相邻列的微柱错位分布，即每行或每列的微柱与相邻行或相邻列的两个微柱之间的空隙对应。如此，在微流控芯片的底部形成行与行之间、列与列之间错位分布的微柱，错位分布的方式可以增加流体的紊流程度，更加符合自然土壤中孔隙结构复杂分布的形式，更好地模拟土壤结构。
优选地，每个微柱的直径和/或高度与相邻微柱的间距相等，更优选为每个微柱的直径、高度及相邻微柱的间距均相等。由此，可以用底部进行过矿物修饰且设置有多个微柱的微流控芯片来模拟土壤中的矿物颗粒，不同直径的微柱代表不同大小的矿物颗粒，比如微柱直径为20μm、50μm、100μm、200μm的微流控芯片分别用于模拟矿物颗粒为20μm、50μm、100μm、200μm的土壤。
微流控芯片由PDMS浇注而成，具体为采用光刻机制作的硅片作为微流控芯片的模板，芯片母模的整体设计如图1所示，做好的模板的扫描电镜图如图2所示，需要说明的是，图2是以模拟50μm土壤颗粒为例制作的微流控芯片母模的扫描电镜图，制作好的模板用PDMS浇注倒模，获得PDMS微流控芯片，PDMS微流控芯片的显微镜照片如图3所示，然后对PDMS微流控芯片进行表面矿物修饰，得到所述微流控芯片，修饰有不同矿物的微流控芯片的显微镜照片如图4所示。
具体地，首先制备微流控芯片，其中一种实施方式中，如图5所示，微流控芯片的制备主要包括两大步骤，分别为制备芯片母模和进行PDMS倒模。其中，芯片母模的制备步骤包括：如图5中a-d所示，(1)硅片的清洗；用丙酮清洗硅片以净化硅片表面，再使用异丙醇除去硅片表面残留的丙酮，随后烘干除去硅片表面水分以方便光刻胶粘附；(2)旋涂光刻胶；使用匀胶机把光刻胶均匀地旋涂于硅片表面，并注意观察旋涂质量，随后加热适当时间使光刻胶中的溶剂挥发，增强光刻胶与基片黏附以及胶膜的耐磨性，保证曝光时能进行充分的光化学反应；(3)曝光；用直写光刻机进行直写光刻，并通过紫外光照射将设计的结构转移到光刻胶上；(4)显影；把曝光过的基片用显影液除去应去掉的部分光刻胶，以获得精准的目标图案，结束后，对其清洗并在一定温度下烘烤，以彻底除去残留于胶膜中的溶剂或水分，增强胶膜抗蚀能力；(5)硅片刻蚀；将光刻胶作为掩蔽层，采用电感耦合等离子体(ICP)刻蚀硅片，从而获得与光刻胶上完全对应的图形；(6)去胶；采用等离子体法除去硅片上的光刻胶，制得芯片母模，芯片母模包括模本体和设置于模本体上的模柱。
PDMS倒模的制备步骤包括：如图5中e-f所示，(1)对上述制得的芯片母模进行硅烷化处理，以方便后续PDMS脱模；(2)按质量比10:1称取PDMS与固化剂于培养皿内，并在真空腔内抽真空至无气泡；(3)将进行硅烷化修饰后的芯片母模放入无气泡的PDMS中，再次抽真空至无气泡；(4)将芯片母模和PDMS放入80℃烘箱烘20min至PDMS完全固化；(5)取出固化的PDMS，用小刀将PDMS从硅片上剥离下来，并切至适宜大小，制得PDMS微流控芯片。
然后对制得的PDMS微流控芯片进行矿物修饰，修饰的矿物包括针铁矿、蒙脱石、高岭石等，修饰方法可以采用如下三种方法。第一种实施方式中，在微流控芯片表面修饰矿物包括：以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为表面氨基修饰试剂，采用浸泡法对矿物进行氨基硅烷化修饰，得到表面改性后的矿物；以二苯甲酮为修饰试剂，对微流控芯片表面(包括芯片主体下表面和/或微柱表面)进行修饰；将表面改性后的矿物的悬浮液注入微流控芯片内，并在紫外线作用下反应一定时间，得到表面修饰有矿物的微流控芯片。第二种实施方式中，在微流控芯片表面修饰矿物包括：明胶加热溶解并冷却至室温，加入硫酸铬钾，室温搅拌得到明胶/铬溶液；将明胶/铬溶液通入微流控芯片中，再通入矿物溶液，用氮气吹干，清洗烘干后得到表面修饰有矿物的微流控芯片。第三种实施方式中，在微流控芯片表面修饰矿物包括：配置矿物悬浮液，并将矿物悬浮液注入PDMS微流控芯片内，烘干后即得到表面修饰有矿物的微流控芯片。
最后制备微流控芯片装置1，包括：先用打孔器分别在上述制得的微流控芯片的两端打孔，具体是在芯片主体的两端打孔，其中一端为进口，另一端为出口13，进口处打孔数量为两个，如图1、6所示，其中一个孔作为培养基入口11，另一个孔作为土壤细菌接种入口12，出口13处打孔数量为一个，出口13处孔用于废液排出。然后采用等离子清洗机处理PDMS与盖玻片，以使得二者键合密封，并将键合好的芯片置于80-90℃加热板上加热8-10小时以加强键合效果，最终得到微流控芯片装置1，如图5中g-h所示。
本实施例提供的微流控芯片装置1，在芯片主体的下表面设置了多个微柱，并在芯片主体下表面和/或微柱表面进行矿物修饰，更加真实地反映自然土壤孔隙结构及矿物表面的情况，并通过改变微柱的直径及修饰矿物的种类，使得微流控芯片装置1可以用来模拟不同土壤矿物的表面，从而可以进一步借助激光共聚焦显微镜、荧光染色技术、测序技术、生物信息学分析方法等进行土壤生物膜形成过程、生物膜群落中微生物的相互作用等更加深入的研究。
本发明另一实施例还提供了一种微流控芯片装置1的应用，使用方法包括基于微流控芯片装置1进行土壤微生物群落培养，用于分析土壤生物膜形成机制及研究土壤生物膜群落变化。
培养方法包括：(1)如图6所示，将微流控芯片装置1连入微流控培养系统，并对微流控培养系统进行杀菌消毒。具体过程为：通入75％的酒精对微流控培养系统进行杀菌处理，向微流控培养系统中通入培养基，以去除微流控培养系统内残余的酒精，防止其干扰后续细菌生长。(2)向微流控培养系统中通入设定量的菌液，并关闭微流控培养系统的进出口，微流控培养系统静置设定时间，以使得细菌完成微柱表面的初始吸附。(3)打开微流控培养系统的进出口，以设定流速向微流控培养系统中通入培养基，进行细菌培养实验。(4)采用激光共聚焦显微镜在设定时间点观察土壤生物膜，分析土壤生物膜的生物量和粗糙度，并用荧光染料标记法观测生物膜内多糖、蛋白和eDNA的分布及含量变化。
其中一些实施方式中，培养方法包括：(1)采用多通道微流控压力泵将多个微流控芯片装置1连入微流控培养系统，并对微流控培养系统进行杀菌消毒。(2)向微流控培养系统中通入设定量的菌液，并关闭微流控培养系统的进出口，微流控培养系统静置设定时间，以使得细菌完成微柱表面的初始吸附。(3)打开微流控培养系统的进出口，以设定流速向微流控培养系统中通入培养基，进行细菌培养实验。(4)待培养至取样时间时，依次取出若干个微流控芯片装置1样品，并取出微流控芯片装置1样品内的生物膜，进行Alpha多样性分析和细菌丰富度分析。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例以模拟土壤中50μm的矿物颗粒为例，制备一种微流控芯片装置1，包括：
1.1制备PDMS微流控芯片。
采用光刻机制作的硅片作为微流控芯片的模板，具体包括清洗硅片、旋涂光刻胶、曝光、硅片刻蚀、去胶；并将做好的模板用PDMS浇注倒模，获得PDMS微流控芯片；其中，微流控芯片的直径为50μm，高度为50μm，微柱之间的间距为50μm。
1.2在PDMS微流控芯片表面修饰矿物。
以修饰针铁矿为例，首先对针铁矿进行氨基硅烷化修饰，包括：(1)5g针铁矿混合在95％的乙醇中；(2)用1％醋酸调节溶液的pH＝4；(3)15min后逐滴加5g的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)；(4)为了提高反应效率，在120℃下高温处理12小时进行硅烷化处理；(5)处理后的针铁矿用95％乙醇洗涤两次，在100℃干燥5小时。
然后对PDMS微流控芯片的通道进行二苯甲酮(BP)表面修饰，包括：(1)向PDMS微流控芯片的通道中依次注入甲醇和去离子水彻底清洗；(2)低气压下向微流控芯片的通道中注入氮气使通道完全干燥；(3)然后将BP溶液(10wt.％乙醇)均匀注射到PDMS微流控芯片中，在室温下静置2min；(4)然后注入甲醇洗涤三次，氮气完全干燥；(5)将1g表面改性的针铁矿加入到20mL去离子水中，通过磁搅拌分散20分钟，得到矿物悬浮液；(6)将矿物悬浮液注入PDMS微流控芯片并暴露在紫外线下(90mJ/cm2,254nm)10min；(7)通过向芯片中注射去离子水冲洗掉反应后未结合的针铁矿的最终产物，从而在PDMS微流控芯片的表面完成矿物修饰，得到所需的微流控芯片，用于下一步组装微流控芯片装置1。修饰蒙脱石和高岭石的方式与针铁矿类似，如图4所示，为显微镜下观察的修饰不同矿物后的微流控芯片的照片，从图4中可以看到，矿物颗粒分布于微流控芯片表面，使得模拟的土壤结构更加接近自然土壤。
1.3制备微流控芯片装置1。
用手持式打孔器在微流控芯片的两端分别打孔，孔的外径为0.75mm；再采用等离子清洗机处理微流控芯片和盖玻片45s，并将键合好的芯片置于80℃加热板上加热8h，获得微流控芯片装置1。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，在PDMS微流控芯片表面修饰矿物的方式不同。本实施例中，仍以修饰针铁矿为例，采用明胶修饰法在PDMS微流控芯片表面修饰针铁矿，步骤如下：
(1)将0.5g明胶在100ml超纯水中加热到56℃溶解3min，溶解完后冷却至室温；(2)加入0.1g硫酸铬钾，室温下搅拌10min来制备明胶/铬溶液；(3)明胶/铬溶液通0.5ml到PDMS微流控芯片里，再通入0.2g/L针铁矿溶液，用氮气吹干，最后用超纯水清洗、烘干，得到修饰有针铁矿的微流控芯片。
实施例3
为了验证实施例1提供的微流控芯片装置1能够模拟土壤矿物微界面，本实施例通过构建微流控培养系统，培养土壤微生物群落，研究土壤微生物生物膜的生长变化和群落结构。
首先进行微流控培养系统的构建。准备微流控芯片装置1、钢针、硅胶软管、注射器、平底针头、除气泡装置及注射泵等器材。具体参数为：0.8mm*0.15mm*10mm钢针，0.5*1.5mm硅胶软管、10mL注射器，0.8mm外径平底针头。如图6所示，微流控芯片装置1进口处的两个孔，一个用于与细菌接种入口12连接，另一个用于通培养液。微流控芯片装置1出口13处的一个孔用于与废液储瓶连接。
首先对硅胶软管与钢针进行高温高压灭菌，烘干后备用；其次，在超净台内将所有器材与微流控芯片装置相连通，通入75％的酒精对整套系统进行杀菌处理；消毒结束后，在超净台中更换装有培养基的注射器，以相同流速通入培养基以去除系统内残余的酒精，防止其干扰后续细菌生长。正式实验开始时，接入200μL OD600＝0.1的菌液，随后用止水夹夹住进出口及细菌接种入口12的软管，系统静置2h，以使细菌完成微柱表面的初始吸附；然后打开进出口止水夹，以0.5μL/min流速通入培养基进行土壤细菌培养实验。
供试土壤为江西鹰潭农田生态系统国家野外科学观测研究站红壤发育的水稻土，所用微生物为水稻土提取微生物，所用培养液为水稻土土壤浸提液，另外培养液中再添加微量元素SL-10溶液、亚硒酸盐-钨酸盐溶液、维生素溶液、氨基酸溶液、矿物盐溶液等成分(培养液的配置参见Nguyen T M,Seo C,Ji M,Paik M J,Myung S W,Kim J,EffectiveSoil Extraction Method for Cultivating Previously Uncultured SoilBacteria.Appl Env Microbiol,2018,84(24):e01145-18)。微流控芯片设计流速为0.5μL/min，分别在培养时间为36h、48h、96h和108h四个时间点在激光共聚焦显微镜(CLSM)下对土壤生物膜观察，如图7-10所示。观察前，通入2.5μmol/L LIVE BacLight细菌活染料(Invitrogen/Molecular Probes Eugene USA)对细胞染色20mins。采集的图像用Matlab分析生物量和粗糙度。
通过对CLSM图像的分析，可以将土壤生物膜在多孔介质中的生长划分为四个阶段：培养时间为0-36h时，细菌完成初始吸附并形成微菌落；培养时间为36-48h时为生物膜形成阶段；培养时间为48-96h时为生物膜发育阶段；培养时间为96-108h时为生物膜成熟阶段。
基于Matlab中编写代码定量解析激光共聚焦图像。从表1中可看出，生物膜厚度随培养时间的增加而增大，培养时间为108h时生物膜厚度达到最大值(12.00±1.97μm)，厚度值占微流控芯片装置空隙半径(25μm)的比率达到48％。培养时间为48h的生物膜厚度虽然较培养时间为36h的生物膜厚度略有增加但无显著差异，而培养时间为96h的生物膜厚度较培养时间为48h的生物膜厚度显著增加。土壤生物膜粗糙度的变化与生物膜厚度变化同步，培养时间为108h的生物膜厚度达到最大值(4.98±1.17)，较培养初期增加了3倍，且较培养时间为96h的生物膜粗糙度显著增加(如图7-10所示)。
表1生物膜不同生长阶段的结构参数
Figure BDA0002981411440000111
注：样品重复数N≥3，p＜0.05
本实施例还通过荧光染料标记法观测生物膜内多糖、蛋白和eDNA的分布及含量变化。具体为：避光条件下，通入200μL荧光染料混合液染色30mins。其中混合荧光染料溶液包括：(1)糖联复合物染料ConA，浓度为200μg/mL；(2)蛋白质染料SYPROTM Orangeproteingel stain，原液稀释100倍；(3)eDNA染料DDAO，浓度为100μg/mL；(4)细胞染料DAPI，浓度为10μg/mL。四种染料按等比例混合。采用STORM显微镜同时观察四种组分的情况。采用Matlab编程软件分析拍摄到的生物膜的胞外聚合物(EPS)组分变化图像，获取细胞与EPS各组分及两两EPS组分之间的共定位信息，其中EPS组分包括多糖(PS)、蛋白质(PN)和eDNA。
分析结果如图11、12所示，其中，图11为细胞与EPS各组分以及EPS组分两两间分别在36h(图11-A)、48h(图11-B)、96h(图11-C)、108h(图11-D)的培养时间下的Mander共定位系数，图11的横坐标中cell/protein表示细胞与蛋白质，cell/polysaccharides表示细胞与多糖，cell/eDNA表示细胞与eDNA，protein/polysaccharides表示蛋白质与多糖，protein/eDNA表示蛋白质与eDNA，polysaccharides/eDNA表示多糖与eDNA，图11的纵坐标Manders＇Overlap Coefficient表示Mander共定位系数。图12为细胞与蛋白质、多糖、eDNA的Mander共定位系数，图12中的横坐标表示培养时间，纵坐标表示Mander共定位系数。
分析发现，培养时间为36h时的胞外蛋白质含量最高，而胞外多糖含量最低；培养时间为48h时则恰好相反，胞外多糖含量最高，而胞外蛋白质含量最低。胞外eDNA的相对含量在生物膜培养36h和48h时均保持居中水平；培养时间为96h和108h时的EPS蛋白质含量均处于最低水平，而eDNA含量升至最高，胞外多糖含量居中间水平。
如图11所示，在36h和48h培养时间下，胞外多糖与eDNA的共定位数值最大，36h时胞外多糖与eDNA的共定位数值为0.78，培养时间为48h时胞外多糖与eDNA的共定位数值为0.79；当生物膜进入生长后期，共定位优势组分转变成胞外蛋白质与胞外多糖，96h时胞外蛋白质与胞外多糖的共定位数值为0.77，培养时间为108h时胞外蛋白质与胞外多糖的共定位数值为0.87。
如图12所示，细胞与胞外蛋白质的重叠系数在培养时间为36h时最低，为0.22，即细胞与蛋白质只有22％的共定位比率，培养时间为108h时细胞与蛋白质的共定位程度最高，为0.58。细胞与eDNA的Mander共定位系数和细胞与胞外蛋白质的Mander共定位系数呈现相同趋势。细胞与胞外多糖的Mander共定位系数随时间增加而增加，至培养时间为108h时两者的重叠程度达到最大值0.49。胞外蛋白质与胞外多糖在培养早期的重叠程度明显低于培养后期，而胞外多糖与eDNA的重叠程度则与此相反，培养早期的胞外多糖与eDNA的重叠程度显著高于培养后期。胞外蛋白质与eDNA的Mander共定位系数整体和细胞与胞外蛋白质、细胞与eDNA的共定位系数变化一致，但胞外蛋白质与eDNA的Mander共定位系数的最小值在培养时间为96h出现，此时胞外蛋白质与eDNA的重叠系数为27％。
本实施例还对一种组分在一对共定位组分中的贡献程度进行了探究，结果如图13所示，图13表示不同培养时间下每一种组分在一对组分中的共定位贡献度，其中图13的纵坐标Overlap Coefficient k1 and k2，k1和k2为重叠系数。
由图13可以看出，对于细胞与蛋白质组，随着培养时间的增加，细胞的贡献程度逐渐增加，108h时达到最大值，而蛋白质的贡献度呈现先增加后减少的特点，48h是其拐点，并且仅在此时蛋白质的贡献度大于细胞。对于细胞与多糖组，细胞在培养时间为96h之前的贡献度几乎未发生改变，培养时间为96-108h期间，细胞贡献度逐渐增加，至108h达到最大贡献率0.93，多糖的贡献度呈现先增后减的规律，96h时贡献率达到最大值0.51，并且仅在此时多糖的贡献度大于细胞。对于细胞与eDNA组，细胞的贡献程度先降低，108h时略有增加，而eDNA的贡献度一直较低，数值在0.04-0.59范围内波动。在蛋白质和多糖组中，仅在96h时，多糖的贡献度大于蛋白质，且两种组分在培养期间内的贡献程度变化较大。对于蛋白质与eDNA组和多糖与eDNA两组来说，均呈现出eDNA在培养后期的贡献度更大的特点。
由上述分析可知，采用实施例1提供的用于模拟土壤矿物微界面的微流控芯片装置1所培养的土壤生物膜形成过程包括四个阶段，分别是初始吸附期(0-36h)、生物膜形成初期(36-48h)、生物膜发育期(48-96h)及生物膜成熟期(96-108h)。土壤生物膜厚度及粗糙度随培养时间的增加而增加，在生物膜培养早期，EPS组分以多糖和eDNA作用较为紧密，至后期则转变为蛋白质和多糖。
实施例4
本实施例采用多通道微流控压力泵连接30个独立的微流控芯片装置1同时培养生物膜，并设置12h、3h、48h、72h、96h、108h六个取样时间，每个时间点设置5组重复。设置压力泵的压力为0.1mba，通过流量传感器测得该压力下对应流速为0.5μL/min，即与注射泵流速保持一致。
生物膜培养步骤如下：将30套压力泵体系下培养所需的装置高温高压灭菌后烘干备用，在超净台内将微流控芯片装置1的流通系统与储液瓶及压力泵气路系统连接完整，并在储液瓶中装入75％酒精，将连接完整的系统拿出超净台，打开气源，以10mba的压力值驱动储液瓶内的酒精流向微流控芯片装置，使微流控芯片装置能够进行消毒灭菌处理，灭菌过程持续4小时。灭菌完成后，再次将培养系统搬入超净台，在超净台中将储液瓶中的酒精换成培养基，以相同压力值和运行时间向微流控芯片装置供入培养基，以去除微流控芯片装置内残余的酒精，防止影响后续生物膜生长。随后分别在细菌接种入口12用1mL注射器向30个微流控芯片装置内注入200μL OD600＝0.1的菌液，用止水夹夹住进出口及细菌接种入口12，使系统静置2h，促使细菌完成微柱表面的初始吸附。最后，打开两端进出口的止水夹，以0.1mba压力值通入培养基，培养土壤菌群。
待培养至取样时间时，依次取出其中3个微流控芯片装置，堵住取走微流控芯片装置连接的气路，避免其与大气相通，干扰微流控培养系统的实际压力。在超净台中将1X PBS溶液装入1mL注射器，采取反复吸打的方式将微流控芯片装置内的生物膜冲出，保存于冻存管中，置于-80℃冰箱内，用于后续测序分析。
根据16S rRNA测序技术分析，本实施例的所有样品中细菌16S rRNA测序文库覆盖率为99.6-99.8％，说明测序深度合理，几乎包含了样品中所有的细菌，可用于微生物多样性分析。
首先对土壤微生物群落的Alpha多样性进行分析，分析结果如表2所示，表2为不同培养时间下土壤微生物群落的多样性和均匀度，从表2可看出，培养时间为12h时细菌样品的Simpson指数、Shannon指数和均匀度指数数值最大，分别为0.84±0.08、5.91±1.74、0.55±0.10，说明培养时间为12h时的细菌群落种类明显高于其它培养时间得到的细菌群落种类。培养时间为72h时细菌样品的Simpson指数、Shannon指数和均匀度数值最小，分别为0.17±0.09、1.10±0.65、0.12±0.06，这些数值显著低于初始接种液、培养时间为12h时的细菌群落和培养时间为48h时的细菌群落的各指数，与培养时间为36h、96h、108h时的细菌群落种类无显著差异。
初始接种液的Simpson指数和Shannon指数显著低于培养时间为12h时的细菌群落的Simpson指数和Shannon指数，但显著高于培养时间为72h时的细菌群落的指数，与培养时间为36h、48h、96h和108h时的细菌群落的指数无显著差异。培养时间为36h、48h、96h和108h时的细菌群落的Simpson指数和Shannon指数均无显著差异。
均匀度指数变化趋势与Simpson指数和Shannon指数变化趋势相似，呈现出培养时间为12h时细菌群落的均匀度指数最大，数值为0.55±0.10；培养时间为72h时细菌群落的均匀度指数最小，其值为0.12±0.06。
初始接种液细菌群落的均匀度指数显著低于培养时间为12时的细菌群落的均匀度指数，但与其余时间下细菌群落的均匀度指数无显著差异。培养时间为36h时细菌群落的均匀度指数显著低于培养时间为12h时细菌群落的均匀度指数，但与其余时间下细菌群落的均匀度指数无显著差异。培养时间为48h时细菌群落的均匀度指数显著低于培养时间为12h时细菌群落的均匀度指数，但显著高于培养时间为72h时细菌群落的均匀度指数，与其它时间细菌群落均匀度指数无显著差异。培养时间为96h和108h时细菌群落的均匀度指数显著低于培养时间为12h时细菌群落的均匀度指数，并与其它时间细菌群落均匀度指数无显著差异。
表2不同培养时间下土壤微生物群落的多样性和均匀度
Figure BDA0002981411440000151
Figure BDA0002981411440000161
同一列上标的abc表明存在显著差异(P<0.05)。
然后分析不同培养时间下细菌丰富度的变化，结果如图14所示。由图14可知，培养时间不同，优势细菌属也不相同。初始接种液中，地杆菌属(Terrabacter)和假节杆菌属(Pseudarthrobacter)最为丰富，其余细菌丰富度差异不大。培养12h细菌多样性最高，丰度也最高，在丰度Top20细菌属中，其优势细菌占14种。培养36-48期间各细菌属丰度较一致，未出现尤其丰富的细菌属。假单胞菌属(Pseudomonas)在培养72-108h期间较为丰富，且为培养72h时生物膜细菌群落中最丰富的细菌属。培养108h时细菌群落较培养72h和96h时细菌群落丰富度更高，在丰度Top20细菌属中，其优势细菌有3种，而培养72h和96h细菌群落丰度差异不显著。
由上述分析可知，采用实施例1的模拟土壤矿物微界面的微流控芯片装置所培养的土壤微生物群落培养至12h时，Simpson指数、Shannon指数和均匀度指数均最大；培养至72h时，上述三个指数值均最低。通过测序分析可知，变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门是生物膜细菌群落的优势门类。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种微流控芯片装置，其特征在于，用于模拟土壤矿物微界面，所述微流控芯片装置包括盖玻片和设置于所述盖玻片上的微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片主体和设置于所述芯片主体下表面的多个微柱，且所述芯片主体下表面和/或所述微柱表面修饰有矿物。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述微柱在所述芯片主体的下表面呈行列均匀分布，且位于相邻行或相邻列的所述微柱错位分布。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，每个所述微柱的直径和/或高度与相邻所述微柱的间距相等。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，所述芯片主体内设置有进口和出口，所述进口包括培养基入口和细菌接种入口，所述进口和所述出口均分别与所述微柱之间的空隙连通。
5.一种微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，包括：
制备芯片母模，所述芯片母模包括模本体和设置于所述模本体上的多个模柱；
对所述芯片母模进行硅烷化修饰，并将PDMS与固化剂按质量比10:1混合，得到PDMS预聚液；
将硅烷化修饰后的芯片母模置于所述PDMS预聚液中，并于80℃烘箱中固化20min；
待所述PDMS预聚液充分固化后，将其从所述芯片母模中剥离下来，切割成型，得到PDMS微流控芯片；
对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰，得到微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片主体和设置于所述芯片主体上的多个微柱；
在所述微流控芯片上设置进口和出口；
将所述微流控芯片与盖玻片键合，得到微流控芯片装置。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：明胶加热溶解并冷却至室温，加入硫酸铬钾，室温搅拌得到明胶/铬溶液；将所述明胶/铬溶液通入所述PDMS微流控芯片中，再通入矿物溶液，用氮气吹干，清洗烘干后得到所述微流控芯片。
7.根据权利要求5所述的微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：以3-氨基丙基三乙氧基硅烷为表面氨基修饰试剂，采用浸泡法对矿物进行氨基硅烷化修饰，得到表面改性后的矿物；以二苯甲酮为修饰试剂，对所述PDMS微流控芯片进行表面修饰；将所述表面改性后的矿物的悬浮液注入进行表面修饰后的PDMS微流控芯片内，并在紫外线作用下反应，得到所述微流控芯片。
8.根据权利要求5所述的微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，所述对所述PDMS微流控芯片进行矿物修饰包括：配置矿物悬浮液，将所述矿物悬浮液注入所述PDMS微流控芯片内，并将所述PDMS微流控芯片内部烘干，得到所述微流控芯片。
9.根据权利要求5所述的微流控芯片装置的制备方法，其特征在于，所述矿物包括针铁矿、蒙脱石和高岭石中的一种。
10.一种土壤微生物群落培养方法，其特征在于，基于如权利要求1-4任一项所述的微流控芯片装置或者如权利要求5-9任一项所述的微流控芯片装置的制备方法所获得的微流控芯片装置，包括：
将所述微流控芯片装置连入微流控培养系统，并对所述微流控培养系统进行杀菌消毒；
向所述微流控培养系统中通入设定量的菌液，并关闭所述微流控培养系统的进出口，所述微流控培养系统静置设定时间；
打开所述微流控培养系统的进出口，以设定流速向所述微流控培养系统中通入培养基，进行细菌培养。
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