CN115074264B - 三维细菌生物膜的制备方法、生物膜、测试方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种三维细菌生物膜的制备方法，该方法基于微阵列芯片，包括：S11，将海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液按照第一预置配比配置，得到混合后的预聚液；S12，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满所述混合后的预聚液；S13，将S12得到的微阵列芯片进行紫外光照，得到凝固在深井微阵列中的三维培养水凝胶，该三维培养水凝胶用于培养三维细菌生物膜。本公开还提供了一种维细菌生物膜、测试方法及其应用。

Description

三维细菌生物膜的制备方法、生物膜、测试方法及应用
技术领域
本公开涉及生物检测技术领域，具体涉及一种三维细菌生物膜的制备方法、细菌生物膜、测试方法及其应用。
背景技术
细菌感染一直是威胁全球健康的重大公共卫生问题，抗细菌感染一直是临床治疗的难点，尤其是细菌生物膜相关的感染由于其极高的复发性和对抗生素高度的耐受性，更加大了临床治疗的难度。仅在美国，每年就有1700万新增的生物膜相关细菌感染的病例，这将导致约940亿美元的公共卫生花费以及约55万的新增死亡病例。在生物宿主体内，细菌常以集合体的形式粘附并生长于生物体表面或三维基质环境中。这些存在于体内三维环境中的生物膜是导致生物膜相关疾病如呼吸道感染、骨科感染、心脏瓣膜感染等疾病主要的病灶来源。细菌生物膜在宿主体内的生长过程可以分为四个阶段：黏附、生长、成熟、解黏附这四个过程。解黏附的细菌具有再次黏附在宿主体内并发展成熟的风险，因此这四个过程再体内是不断循环发生的。细菌生物膜被发现在常被包被于宿主胞外基质中，直径甚至超过1000μm。而一旦在宿主内形成三维细菌生物膜并且以生物膜的形式诱发感染，细菌群体对抗生素的抵抗性将增加10～1000倍。因此用标准的抗菌治疗策略对于生物膜相关的细菌感染常常是无效的。而对于三维基质环境内生物膜的药物敏感性测试在克服以上临床问题中是至关重要的。
目前传统对于抗生素敏感性测试的主要途径是基于多孔板在悬浮培养液中检测其存活率。而悬浮培养环境下细菌对于抗生素的敏感性较高，无法有效为体内的生物膜防控提供有意义的参考。因此，急需发展出可模拟细菌生物膜在三维环境下生长状态的体外培养体系以用于药物敏感性测试系统。目前体外构建生物膜的方法包括将菌液涂布于载玻片上或者基于气-液或者气-固界面静置得到生物膜具体有试管法、平板膜片法、管路法和流室法。然而，由以上传统方法得到的生物膜通常为二维产物，不定量且成分不稳定，而要实现体外药物敏感性测试需要实现可控量产的生物膜。尽管加拿大卡尔加里大学生物膜研究小组研发的卡而加里生物膜装置(Calgarybiofilm dvice，CBD or MBEC)以作为抗生素药物敏感性测试的体外模型。但该方法仅实现了在体外平行重复的二维生物膜的药物测试要求，仍无法模拟细菌在体内三维基质环境中形成的生物膜形态及生长状态。
发明内容
为了解决现有技术中上述问题，本公开提供了一种三维细菌生物膜的制备方法、细菌生物膜、测试方法及其应用，该方法基于微阵列芯片培养可形成类似于宿主内生物膜状态的三维细菌生物膜微克隆，且该培养体系可实现高通量稳定重复，从而实现了三维生物膜培养的体外药物测试体系。
本公开的第一个方面提供了一种三维细菌生物膜的制备方法，该方法基于微阵列芯片，包括：S11，将海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液按照第一预置配比配置，得到混合后的预聚液；S12，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满所述混合后的预聚液；S13，将S12得到的微阵列芯片进行紫外光照，得到凝固在所述深井微阵列中的三维培养水凝胶，该三维培养水凝胶用于培养三维细菌生物膜。
进一步地，该三维培养水凝胶的刚性与所述第一预置配比及所述紫外光照的时长呈正相关。
进一步地，第一预置配比为所述海藻酸盐预聚液、所述光引发剂溶液、所述HEPES缓冲液及所述致病菌液的体积比，该体积比为20∶1∶2∶2～20∶2∶2∶2。
进一步地，该方法还包括：S14，将所述S13得到的微阵列芯片浸泡在微生物培养基中，并放置于培养箱内恒温培养预置时长，得到生长在所述深井微阵列中的三维细菌生物膜。
进一步地，海藻酸盐预聚液为1.5％～2.5％浓度的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液，其制备方法包括：S101，将1.5％～2.0％浓度的高碘酸钠和海藻盐混合后在室温下静置第一预置时长；S102，将所述S101得到的混合溶液加入乙二醇进行逐滴淬灭反应第二预置时长，并将得到的混合溶液采用去离子水透析第三预置时长后进行冷冻干燥，得到粗提物；S103，将所述粗提物溶解于MES缓冲液中第四时长，并用去离子水透析第五预置时长后进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末；S104，将质量为1.5g～2.5g的所述甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末溶解于100ml的DPBS缓冲液中，得到所述浓度为1.5％～2.5％的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液。
进一步地，致病菌液为大肠杆菌液、绿脓杆菌液、蜡样芽孢杆菌液、金黄色葡萄球菌液及嗜热链球菌液中的一种或多种。
进一步地，混合后的预聚液中的细菌浓度为1×104cfu/mL～1×107cfu/mL。
进一步地，S12中在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满所述混合后的预聚液之前，该方法还包括：将所述微阵列芯片进行预处理，所述预处理包括灭菌处理和表面亲水性处理。
进一步地，灭菌处理为75％乙醇浸泡或高压灭菌，所述表面亲水性处理为表面等离子体处理或紫外光照处理或或浓硫酸催化表面枝接处理。
进一步地，将所述微阵列芯片进行预处理，包括：采用75％乙醇浸泡所述微阵列芯片，得到灭菌后的所述微阵列芯片；将灭菌后的微阵列芯片进行表面等离子或紫外光照处理或浓硫酸催化表面枝接处理，得到预处理后的微阵列芯片。
进一步地，该微阵列芯片的制备方法包括：S01，采用光刻蚀技术制备光刻微柱模板，该光刻微柱模板包括周期性的微柱阵列；S02，将PDMS预聚液和凝固剂按照第二预置配比混合后浇注在所述光刻微柱模板上，并在真空泵中去除气泡；S03，将去除气泡后的所述光刻微柱模板进行薄膜凝固和脱模处理，得到微阵列芯片。
进一步地，第二预置配比为10∶1～20∶1。
进一步地，周期性的微柱阵列中的每个微柱的横截面直径为200μm～800μm，高度为200μm～400μm，且所述周期性的微柱阵列中的任意两个微柱的圆心距为200μm～800μm。
本公开的第二个方面提供了一种三维细菌生物膜，由如本公开第一个方面提供的三维细菌生物膜的制备方法制备。
本公开的第三个方面提供了一种三维细菌生物膜的测试方法，包括：S21，采用微阵列控制系统向生长有三维细菌生物膜的微阵列芯片上输入待测化合物溶液；S22，将待测化合物溶液处理后的所述三维细菌生物膜进行死活细菌染色；S23，根据死活细菌染色结果对所述三维细菌生物膜进行定量分析，得到所述三维细菌生物膜对所述待测化合物溶液的测试结果。
进一步地，将所述待测化合物溶液处理后的所述三维细菌生物膜进行死活细菌染色，包括：在放置所述微阵列芯片的无血清培养基中加入DMAO荧光染料和EthD-IIIL荧光染料，以使所述三维细菌生物膜中的细菌被染色区分；其中，所述MAO荧光染料用于染色活细菌和死细菌，所述EthD-IIIL荧光染料用于染色细胞膜受损的死细菌。
本公开的第四个方面提供了一种如本公开第二个方面提供的三维细菌生物膜在筛选药理性化学物、待测药理学化合物及生物分子上的应用。
本公开相比现有技术至少具备以下有益效果：
(1)、通过制备不同机械刚度的三维培养水凝胶可以模拟病原菌在宿主内定植的生理性刚度。
(2)、致病菌在该三维培养甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)水凝胶中的三维生长状态与病原菌在宿主组织内的生长状态和生化特征高度接近，可以模拟病原菌在宿主组织内的定植过程。
(3)、本公开提供的方法制备的三维细菌生物膜，原料和比例安全，具有极好的生物相容性，有利于细菌生物膜活性的保持。
(4)、该培养体系制备过程简便，成本较低，同时可实现高通量大规模制备，以用于针对生物膜相关疾病的药物筛选。
附图说明
为了更完整地理解本公开及其优势，现在将参考结合附图的以下描述，其中：
图1示意性示出了根据本公开一实施例的制备微阵列芯片的流程图；
图2示意性示出了根据本公开一实施例的制备微阵列芯片的结构示意图；
图3示意性示出了根据本公开一实施例的基于微阵列芯片进行三维培养细菌生物膜的流程图；
图4示意性示出了根据本公开一实施例的基于微阵列芯片进行三维培养细菌生物膜的结构示意图；
图5示意性示出了根据本公开一实施例的制备1.5％～2.5％浓度的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液的流程图；
图6示意性示出了根据本公开一实施例的细菌生物膜在三维培养甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶中生长状态图；
图7示意性示出了根据本公开一实施例的微阵列芯片中形成高通量生物膜阵列图；
图8示意性示出了根据本公开一实施例的三维培养细菌生物膜在不同机械刚度水凝胶中的生长曲线图；
图9示意性示出了根据本公开一实施例的基于三维培养细菌生物膜的测试方法流程图；
图10示意性示出了根据本公开一实施例的基于三维培养细菌生物膜的测试方法的测试系统的结构示意图；
图11示意性示出了根据本公开一实施例的三维水凝胶中细菌生物膜对抗生素的耐药性与生长刚度的关系示意图。
具体实施方式
以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本公开实施例的全面理解。然而，明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
应该理解的是，当元件(诸如层、膜、区域、或基底)描述为在另一元件“上”时，该元件可直接在该另一元件上，或者也可存在中间元件。而且，在说明书以及权利要求书中，当描述有元件“连接”至另一元件时，该元件可“直接连接”至该另一元件，或者通过第三元件“连接”至该另一元件。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本公开。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。以及，在此使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有本领域技术人员通常所理解的含义，除非另外定义。应注意，这里使用的术语应解释为具有与本说明书的上下文相一致的含义，而不应以理想化或过于刻板的方式来解释。
本公开实施例提供一种三维细菌生物膜的制备方法，该方法基于微阵列芯片，包括：S11，将海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液按照第一预置配比配置，得到混合后的预聚液；S12，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满混合后的预聚液；S13，将S12得到的微阵列芯片进行紫外光照，得到凝固在深井微阵列中的三维培养水凝胶，该三维培养水凝胶用于培养三维细菌生物膜。
本公开实施例提供的三维细菌生物膜的制备方法基于微阵列芯片培养可形成类似于宿主内生物膜状态的三维细菌生物膜微克隆，且该培养体系可实现高通量稳定重复，从而实现了三维生物膜培养的体外药物测试体系。
需说明的是，本公开实施例中，PDMS是指聚二甲基硅氧烷其，具有极强的可塑性，用以作为微阵列系统的原料。HEPES化学名为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，是一种两性有机化学缓冲剂，pH值介于6.0和8.0之间。“阵列”被定义为相似或者相同物体的有序排列。通常，阵列中的物体可以分为行和列。细菌生物膜的阵列使生物膜的有序排列，深井阵列是深井的有序排列。在生物学中，样品阵列或生物材料(微阵列)用于高通量分析。水凝胶是包含亲水性聚合物链的网状物的三维基质。深井是能够容纳液体或者其他生物体的腔，深井通常为圆柱体，深井的深度是指圆柱体的高度，深井可以具有任意形状，包括锥形、正方体等。
图1和图2分别示意性示出了根据本公开一实施例的微阵列芯片的制备方法流程图及该微阵列芯片的结构示意图。如图1所示，该制备方法包括：
S01，采用光刻蚀技术制备光刻微柱模板，该光刻微柱模板包括周期性的微柱阵列。
本公开的实施例中，该步骤S01得到的光刻微柱模板101的结构图如图2a所示。具体地，该光刻微柱模板包括周期性的微柱阵列，该周期性的微柱阵列中的每个微柱的横截面直径为200μm～800μm，高度为200μm～400μm，且周期性的微柱阵列中的任意两个微柱的圆心距为200μm～800μm，该光刻微柱模板用于微流通道。
S02，将PDMS预聚液和凝固剂按照第二预置配比混合后在真空泵中去除气泡，并将去除气泡后的混合溶液浇注在光刻微柱模板上。
本公开的实施例中，PDMS预聚液和凝固剂按照第二预置配比混合后得到的混合溶液102在真空中去除气泡30分钟，并将去除气体后的该混合溶液102浇注在光刻微柱模板101上，该步骤S02得到的光刻微柱模板101的结构图如图2b所示。
具体地，PDMS预聚液和凝固剂的第二预置配比为10∶1～20∶1。优选地，为配置方便，该配置比取整数值，如PDMS预聚液和凝固剂的第二预置配比可以为10∶1、11∶1、12∶1、15∶1等。
S03，将S02步骤得到的光刻微柱模板进行薄膜凝固和脱模处理，得到微阵列芯片，该微阵列芯片上的周期性微柱阵列即为深井微阵列。
本公开的实施例中，经过步骤S03步骤处理后的微阵列芯片100的结构图如图2c所示，经过固化后可将光刻微柱模板101与混合溶液102形成的薄膜层分离，得到微阵列芯片100，该微阵列芯片用于后续的三维细菌生物膜生成。具体地，步骤S03中薄膜凝固的固化温度为65℃～85℃，固化时间为2h～6h。优选地，薄膜凝固的固化温度为65℃，固化时间为6小时。
图3和图4分别示意性示出了根据本公开一实施例的三维细菌生物膜的制备方法流程图及基于微阵列芯片的制备结构示意图。如图3所示，该制备方法基于如图2所示的微阵列芯片100，包括：
S11，将海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液按照第一预置配比配置，得到混合后的预聚液。
根据本公开的实施例，该海藻酸盐预聚液为1.5％～2.5％浓度的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液，其制备流程如图5所示，包括：S101，将1.5％～2.0％浓度的高碘酸钠和海藻盐混合后在室温下静置第一预置时长；S102，将S101得到的混合溶液加入乙二醇进行逐滴淬灭反应第二预置时长，并将得到的混合溶液采用去离子水透析第三预置时长后进行冷冻干燥，得到粗提物；S103，将该粗提物溶解于MES缓冲液中第四预置时长，并用去离子水透析第五预置时长后进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末；S104，将质量为1.5g～2.5g的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末溶解于100ml的DPBS缓冲液中，得到浓度为1.5％～2.5％的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液。
具体地，第一预置时长为6h～12h，第二预置时长为45min～2h，第三预置时长为48h～72h，第四预置时长为12h～24h，第五预置时长为48h～72h。需说明的是，本公开实施例中的多个时长及浓度为优选的数值，在实际应用过程中其他溶液的替换，并不代表其不能为其他数值范围的替换。
本公开的实施例中，该光引发剂溶液可以为光引发剂2959溶液，致病菌液可以为大肠杆菌液、绿脓杆菌液、蜡样芽孢杆菌液、金黄色葡萄球菌液及嗜热链球菌液中的一种或多种，这些细菌群体具有三维结构，通常为球形或者椭球形，并形成明显的胞外基质结构。其中，第一预置配比为海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液的体积比，该体积比为20∶1∶2∶2～20∶2∶2∶2，即海藻酸盐预聚液与HEPES缓冲液及致病菌液的体积比值保持不变，仅调节改变光引发剂溶液的体积比，得到不同浓度的混合后的预聚液，该混合后的预聚液中的细菌浓度为1×104cfu/mL～1×107cfu/mL。
S12，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满混合后的预聚液。
根据本公开的实施例，为提高微阵列芯片的亲水性，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满混合后的预聚液之前，该方法还包括：将微阵列芯片100进行预处理，预处理包括灭菌处理和表面亲水性处理，该预处理过程对应的微阵列芯片如图4a所示。其中，灭菌处理为75％乙醇浸泡或高压灭菌，表面亲水性处理为表面等离子体处理或紫外光照处理或表面枝接处理。
具体地，将微阵列芯片进行预处理，包括：采用75％乙醇浸泡微阵列芯片20min～60min，优选浸泡30min，得到灭菌后的微阵列芯片；将灭菌后的微阵列芯片100进行表面等离子或紫外光照处理或浓硫酸催化表面枝接处理，得到预处理后的微阵列芯片100，其中，表面亲水性处理若采用表面等离子处理，处理时间优选1min～2min；若采用紫外光照处理，处理时间优选7min～10min。
本公开的实施例中，如图4b所示，在预处理后的微阵列芯片100上滴加并浸满S11步骤得到的混合后的预聚液201，并使得该混合后的预聚液浸润微阵列芯片100中的深井微阵列。
S13，将S12得到的微阵列芯片进行紫外光照，得到凝固在深井微阵列中的三维培养水凝胶，该三维培养水凝胶用于培养三维细菌生物膜。
本公开的实施例中，如图4c所示，将S12得到的微阵列芯片100进行紫外光照202，该紫外光照202诱导时长优选90s～120s，得到凝固在微阵列芯片100上的三维培养水凝胶。
根据本公开的实施例，为将S13步骤得到的三维培养水凝胶203在培养基的培养下得到三维细菌生物膜，如图4d所示，该方法还包括：
S14，将S13得到的微阵列芯片100浸泡在微生物培养基203中，并放置于培养箱内恒温培养预置时长，得到生长在深井微阵列中的三维细菌生物膜，该三维细菌生物膜中包含浓度为1×104cfu/mL～1×107cfu/mL的致病菌204。
具体地，培养箱内保持的恒温温度优选37℃，并可根据培养时间的不同，分别采用共聚焦显微镜对该维细菌生物膜中致病菌进行观察，可取培养时间为0.5天、1天、3天、5天、7天、10天等。
图6示意性示出了根据本公开一实施例的细菌生物膜在三维培养甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶中生长状态图。如图6所示，以金黄色葡萄球菌与大肠杆菌为例，利用共聚焦显微镜对该维细菌生物膜中培养了0.5天、1天、3天、5天、7天、10天的金黄色葡萄球菌液与大肠杆菌的状态分别进行观察，从图6可明显观察到金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌生物膜在三维环境中的生长周期均遵循黏附、增殖、成熟、离散这四个循环过程，符合自然界中观察到的生物膜生长周期规律。
图7示意性示出了根据本公开一实施例的微阵列芯片中形成高通量生物膜阵列图。如图7所示，图7a为没有荧光下的高通量生物膜阵列图，图7b为有荧光下的高通量生物膜阵列图，图7c是图7a和图7b叠加后的相差图，可以看到深井微阵列可以限制细菌生物膜的形状和大小，并且各孔间差异小，可以实现高通量培养。
根据本公开的实施例，三维培养水凝胶的刚性与第一预置配比及紫外光照的时长呈正相关，随着第一预置配比及紫外光照的时长的增加，该三维培养水凝胶的刚性增强。参见上述实施例所示的方法制备不同浓度的混合后的预聚液，本公开的实施例中，以下表1的配比为例：
表1不同刚度甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)水凝胶的配置
上表1中，2％MA代表2％浓度的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液，E0代表不同配比下的甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)水凝胶的杨氏模量，本公开中提到的杨氏模量(E0或Y0)是固体在载荷下的刚度或对弹性变形的抵抗力的量度，它将应力(每单位面积的力)与沿轴或线的应变(比例变形)相关联，E0的数值越大，代表水凝胶的刚性越大。一般地，刚度较软的水凝胶的E0在0～1kPa；刚度中等的水凝胶的E0在1～3kPa；刚度较强的水凝胶的E0在3～6kPa；刚度强的水凝胶的E0在大于6kPa。
图8示意性示出了根据本公开一实施例的三维培养细菌生物膜在不同机械刚度水凝胶中的生长曲线图。将表1制备的四种不同配置的水凝胶加入脑心浸提液BHI培养基于48孔板中，培养5天，期间每天更换培养基，并于显微镜下观察细菌成像。如图8所示为不同刚性甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶的生长状态图，该不同刚性分别为0.85kPa、1.96kPa及5.12kPa。如图8b所示，在同一刚性的不同刚性甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶下，随着培养时间的增加，细菌生物膜的体积增大，说明该刚性下的甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶适合细菌的生长。如图8c所示，随着甲基丙烯酸海藻酸盐MA水凝胶的刚性增强，该水凝胶中的细菌生物膜的体积增大，说明不同刚性的水凝胶会影响同一种致病菌的生长状态，在一定刚性大小的水凝胶下，随着水凝胶的刚性增加，有助于致病菌的生长。
需说明的是，本公开的实施例中微生物培养基为适用于培养三维培养水凝胶的培养基，该三维培养水凝胶还可以为基质胶、琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、明胶、层粘连蛋白、透明质酸、纤维蛋白或者藻酸盐等。
图9示意性示出了根据本公开一实施例的基于三维培养细菌生物膜的测试方法流程图。如图9所示，该测试方法包括：
S21，采用微阵列控制系统向生长有三维细菌生物膜的微阵列芯片上输入待测化合物溶液。
S22，将待测化合物溶液处理后的三维细菌生物膜进行死活细菌染色。
S23，根据死活细菌染色结果对三维细菌生物膜进行定量分析，得到三维细菌生物膜对所述待测化合物溶液的测试结果。
根据本公开的实施例，如图10所示为本公开一实施例的基于三维培养细菌生物膜的测试方法的测试系统的结构示意图。如图10a所示为多个微流控芯片1000集成在同一基底上的结构示意图，图10b为每个微流控芯片1000结构放大图。
如图10b所示，每个微流控芯片1000包括微阵列控制系统200和多个微阵列芯片100，其中，多个微阵列芯片100构成细胞膜培养模块。具体地，如图10b所示，每个微阵列控制系统200至少包括：两个溶液入口、多层微流通道和溶液出口，其中，两个溶液入口分别用于通入高浓度药物和低浓度药物，多层微流通道自上向下纵向微流通道分支逐渐增加，每个微流分支间通过回型通道连接，以确保不同药物浓度溶液充分混合，最终形成浓度梯度，进入每个相对应药物浓度处理组，如图10b所示，每个微阵列控制系统200最终输出8个不同药物浓度的处理组。药物处理后的液体可由出口排出。
本公开的实施例中，微阵列控制系统200的制备方法可与微阵列芯片100的制备方法一致，即可使用光刻蚀原理制作微阵列控制系统模板，将PDMS预聚液(A液)和凝固液(B液)按照质量比20∶1充分混合后，浇注于微阵列控制系统模板上在真空中30min去除气泡，即得到微阵列控制系统200；其中，单个微流通道的宽度为40μm，高度为40μm。最后，将多个微阵列芯片100和微流体控制系统200在40℃～60℃下热封装2h～3h，然后对准拼接后固定在培养基底上，以实现微流体控制系统200对多个微阵列芯片100的同时控制，并保证物质交换的进行。本公开的实施例中，微阵列控制系统200中的微流体管道宽度优选150μm～800μm，高度优选10μm～40μm。需说明的是，将多个微阵列芯片100和微流体控制系统200还可采用化学键链接或物理粘合方法固定在培养基底上。
在封装且对准拼接构成的多个微流控芯片1000上，采用如图3所示的方法在每个微流控芯片1000上制备三维细菌生物膜，如将多个微阵列控制系统集成在同一个培养皿中，从而实现集中控制。通过蠕动泵集中通入包埋有金黄色葡萄球菌的甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)混合预聚液；并放置于紫外灯箱中照射2分钟诱导甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶聚合；设置蠕动泵的流速为50μL/h，通入DPBS去除通道中未聚合多余的甲基丙烯酸海藻酸盐水凝胶预聚液；最后，将微阵列芯片置于37℃培养箱中培养3天，观察到细菌在微阵列芯片的深井中形成有序的三维细菌生物膜。
本公开的实施例中，设置蠕动泵的流速为25μL/h，将多个微阵列芯片置于37℃培养箱中进行灌流，通过微流体控制系统200通入一种或者多种待测药物溶液，分别从入口处通入高浓度待测化合物溶液和低浓度待测化合物溶液，经过梯度稀释模块后，浓度梯度的化合物溶液进入对应的微阵列芯片100中。药物处理24小时后通过出口统一排出处理药物。具体地，该待测化合物溶液包括但不仅限于抗生素化合物，如氨卞青霉素、环丙沙星、庆大霉素、四环素以及新型待测抗菌化合物。
将待测化合物溶液处理后的三维细菌生物膜进行死活菌的定量测试分析，具体包括：将芯片在无血清培养基中加入DMAO和EthD-IIIL两种荧光染料，其中，DMAO是一种绿色核酸荧光染料，可染色活细菌和死细菌，EthD-III是一种红色核酸荧光染料，仅染色细胞膜受损的死细菌。将DMAO和EthD-III混合使用染色时具有完整细胞膜的细菌呈现绿色，而具有受损细胞膜的细菌呈现绿色和红色。通过死活细胞比例对药物的最小抑菌浓度(MIC)进行定量。
图11示意性示出了根据本公开一实施例的三维水凝胶中细菌生物膜对抗生素的耐药性与生长刚度的关系示意图。由图11可以看出，生长在不同机械环境中细菌生物膜对于红霉素的敏感性随着培养环境的刚度的增加而增加，红霉素对生长在三维基质刚度为5.12kPa甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)水凝胶中的三维细菌生物膜的MIC最大，约为192.6μg/mL；然而对于在悬浮培养下的金黄色葡萄球菌的MIC仅为20.83μg/mL。以上结果表明细菌在三维基质环境中对于抗生素的敏感性大大降低，其对抗生素的耐受性随着三维基质的刚度增加而增加。
需说明的是，本公开的实施例中，各试剂配比、制备参数等仅为优选的示例性说明，在实际应用过程中这些参数可以为其他参数的替换或优化，例如，具体的溶液泵入流速可根据具体的泵入溶液浓度而定。
本公开的实施例公开了一种三维细菌生物膜的制备方法、三维细菌生物膜、测试方法及应用，其相比现有技术至少具备以下有益效果：
(1)、通过制备不同机械刚度的三维培养水凝胶可以模拟病原菌在宿主内定植的生理性刚度。
(2)、致病菌在该三维培养甲基丙烯酸海藻酸盐(MA)水凝胶中的三维生长状态与病原菌在宿主组织内的生长状态和生化特征高度接近，可以模拟病原菌在宿主组织内的定植过程。
(3)、本公开提供的方法制备的三维细菌生物膜，原料和比例安全，具有极好的生物相容性，有利于细菌生物膜活性的保持。
(4)、该培养体系制备过程简便，成本较低，同时可实现高通量大规模制备，以用于针对生物膜相关疾病的药物筛选。
尽管已经在附图和前面的描述中详细地图示和描述了本公开，但是这样的图示和描述应认为是说明性的或示例性的而非限制性的。
本领域技术人员可以理解，本公开的各个实施例和/或权利要求中记载的特征可以进行多种范围组合和/或结合，即使这样的组合或结合没有明确记载于本公开中。特别地，在不脱离本公开精神和教导的情况下，本公开的各个实施例和/或权利要求中记载的特征可以进行多种组合和/或结合。所有这些组合和/或结合均落入本公开的范围。
尽管已经参照本公开的特定示例性实施例示出并描述了本公开，但是本领域技术人员应该理解，在不背离所附权利要求及其等同物限定的本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开进行形式和细节上的多种改变。因此，本公开的范围不应该限于上述实施例，而是应该不仅由所附权利要求来进行确定，还由所附权利要求的等同物来进行限定。

Claims (12)

1.一种三维细菌生物膜的制备方法，该方法基于微阵列芯片，其特征在于，
包括：
S11，将海藻酸盐预聚液、光引发剂溶液、HEPES缓冲液及致病菌液按照第一预置配比配置，得到混合后的预聚液；
S12，在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满所述混合后的预聚液；
S13，将所述S12得到的微阵列芯片进行紫外光照，得到凝固在所述深井微阵列中的三维培养水凝胶，该三维培养水凝胶用于培养三维细菌生物膜；所述三维培养水凝胶的刚性与所述第一预置配比及所述紫外光照的时长呈正相关；
S14，将所述S13得到的微阵列芯片浸泡在微生物培养基中，并放置于培养箱内恒温培养预置时长，得到生长在所述深井微阵列中的三维细菌生物膜；其中，
所述第一预置配比为所述海藻酸盐预聚液、所述光引发剂溶液、所述HEPES缓冲液及所述致病菌液的体积比，该体积比为20∶1∶2∶2～20∶2∶2∶2；
所述海藻酸盐预聚液为1.5％～2.5％浓度的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液，其制备方法包括：
S101，将1.5％～2.0％浓度的高碘酸钠和海藻盐混合后在室温下静置第一预置时长；
S102，将所述S101得到的混合溶液加入乙二醇进行逐滴淬灭反应第二预置时长，并将得到的混合溶液采用去离子水透析第三预置时长后进行冷冻干燥，得到粗提物；
S103，将所述粗提物溶解于MES缓冲液中第四预置时长，并用去离子水透析第五预置时长后进行冷冻干燥，得到甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末；
S104，将质量为1.5g～2.5g的所述甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液粉末溶解于100ml的DPBS缓冲液中，得到所述浓度为1.5％～2.5％的甲基丙烯酸海藻酸盐预聚液；
所述微阵列芯片的制备方法包括：
S01，采用光刻蚀技术制备光刻微柱模板，该光刻微柱模板包括周期性的微柱阵列；
S02，将PDMS预聚液和凝固剂按照第二预置配比混合后在真空泵中去除气泡，将去除气泡后的混合溶液浇注在所述光刻微柱模板上；
S03，将所述S02步骤得到的所述光刻微柱模板进行薄膜凝固和脱模处理，得到微阵列芯片。
2.根据权利要求1所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述致病菌液为大肠杆菌液、绿脓杆菌液、蜡样芽孢杆菌液、金黄色葡萄球菌液及嗜热链球菌液中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述混合后的预聚液中的细菌浓度为1×104cfu/mL～1×107cfu/mL。
4.根据权利要求1所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述S12中在微阵列芯片的深井微阵列中滴加并浸满所述混合后的预聚液之前，该方法还包括：
将所述微阵列芯片进行预处理，所述预处理包括灭菌处理和表面亲水性处理。
5.根据权利要求4所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述灭菌处理为75％乙醇浸泡或高压灭菌，所述表面亲水性处理为表面等离子体处理、紫外光照处理或浓硫酸催化表面枝接处理。
6.根据权利要求5所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
将所述微阵列芯片进行预处理，包括：
采用75％乙醇浸泡所述微阵列芯片，得到灭菌后的所述微阵列芯片；
将灭菌后的所述微阵列芯片进行表面等离子、紫外光照处理或浓硫酸催化表面枝接处理，得到预处理后的所述微阵列芯片。
7.根据权利要求1所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述第二预置配比为10∶1～20∶1。
8.根据权利要求7所述的三维细菌生物膜的制备方法，其特征在于，
所述周期性的微柱阵列中的每个微柱的横截面直径为200μm～800μm，高度为200μm～400μm，且所述周期性的微柱阵列中的任意两个微柱的圆心距为200μm～800μm。
9.一种三维细菌生物膜，其特征在于，
采用如权利要求1～8中任意一项所述的方法制备。
10.一种基于权利要求9所述的三维细菌生物膜的测试方法，其特征在于，
包括：
S21，采用微阵列控制系统向生长有三维细菌生物膜的微阵列芯片上输入待测化合物溶液；
S22，将所述待测化合物溶液处理后的所述三维细菌生物膜进行死活细菌染色；
S23，根据死活细菌染色结果对所述三维细菌生物膜进行定量分析，得到所述三维细菌生物膜对所述待测化合物溶液的测试结果。
11.根据权利要求10所述的三维细菌生物膜的测试方法，其特征在于，
所述将所述待测化合物溶液处理后的所述三维细菌生物膜进行死活细菌染色，包括：
在放置所述微阵列芯片的无血清培养基中加入DMAO荧光染料和EthD-IIIL荧光染料，以使所述三维细菌生物膜中的细菌被染色区分；其中，所述DMAO荧光染料用于染色活细菌和死细菌，所述EthD-IIIL荧光染料用于染色细胞膜受损的死细菌。
12.一种如权利要求9所述的三维细菌生物膜在筛选药理性化学物、待测药理学化合物及生物分子上的应用。
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