CN211394494U - 一种三维细胞培养装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维细胞培养装置，属于细胞培养技术领域。本发明的三维细胞培养装置，包括中空管状壳体、沿中空管状壳体轴向贯穿的流体通道、细胞培养层、与外界连通的流体入口和流体出口以及端部的密封结构，所述细胞培养层部分或完全覆盖在流体通道外表面，所述流体入口和流体出口分别与流体通道相连通，所述细胞培养层以及与细胞培养层相接触的流体通道分别具有多孔结构。本发明装置可以在细胞的三维培养过程中进行精准的原位监测研究，有利于在三维尺度开展细胞实验，如药物、环境介质等对目标细胞的影响。

Description

一种三维细胞培养装置

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，更具体地说，涉及一种三维细胞培养装置。

背景技术

细胞培养是指将生物细胞置于人工环境下培养，该人工环境含有合适的表面以支撑细胞生长，提供细胞生长所需的营养物质及适宜的温度、湿度、酸碱度与气体环境。在此体系下，研究者可以方便的研究细胞对于外界环境变化的应激反应，例如培养方式、治疗药物、其他种类细胞、致癌因子、病毒等对目标细胞生长的影响。目前，细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础生物学技术之一。

传统的二维细胞培养如培养基环境下，细胞在培养基表面以二维方式单层生长。三维细胞培养与传统的二维细胞培养不同，是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。与二维细胞培养相比，三维细胞培养更接近于模拟体内环境并且细胞间相互作用更加明显。目前，三维细胞培养被广泛应用于细胞与生长因子、细胞和药物之间的相互作用，不断增加的证据也证明，三维细胞培养可以促进对在正常和病理条件中结构-功能关系的了解。

现有技术三维培养系统虽然较二维培养有了比较明显的改善，但是仍然存在着很多缺陷。由于整个培养系统是粘度比较大的凝胶态，首先不利于营养物质向位于支架深处的细胞的传输，同时也不利于细胞代谢产物的排出。此外，该类培养系统也不利于细胞与贴附支架的分离，导致细胞难以收获，而且支架材料也难以回收再利用。这种凝胶态的三维培养系统大多也难于对所培养的细胞进行随时的动态观察。

经检索，现有技术中公开了相关的申请案，例如，中国专利申请号为200780018180.4，申请公开日为2009年6月3日的专利申请文件公开了一种用于培养离体分离的前脂肪细胞的方法，包括将前脂肪细胞引入到三维支持物基质中，和容许所述细胞在所述支持物基质中体外分化为脂肪细胞，所述的基质可以是胶原基质。再如，中国专利申请号为201110397867.1，申请公开日为2013年6月5日的专利申请文件公开了一种三维细胞培养支架的制备方法，该方法包括如下步骤：a)称取1～10g的聚合物溶于10～100mL的有机溶剂中，配成聚合物溶液；b)称取0～500mg增塑剂，加到上述聚合物溶液中，混合均匀；c)称取羟基磷灰石胶纳米颗粒、银纳米颗粒、氧化锌纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒各0～2g，加入到步骤b处理的溶液中，混合均匀，获得纺丝原液；d)将所述纺丝原液注入到静电纺丝设备中，在静电纺丝设备的接收装置上获得纺丝；e)将所获得的纺丝进行烘干处理，即制得三维细胞培养支架。该申请案还提供一种基于所述三维细胞培养支架制备方法所获得的三维细胞培养装置；所述培养装置可为培养的细胞提供无毒的具有生物相容性的生长环境，其利用不同方法及材料建立各种支架或和不同基质，使细胞在培养时呈空间立体方式生长，让细胞在培养时其生长环境与生长模式更接近于生物体内，用于实验时结果将更为可信。然而，该细胞培养材料的制备复杂、成本高，且无法解决细胞代谢产物无法排出的问题，并且，在用于细胞监测时和传统二维培养中采用的侵入式测定手段类似，使用染料等化学物质可能会损伤甚至杀死细胞。

因此，基于现有技术的缺陷，亟需发明一种新的细胞培养装置及方法。

发明内容

1.要解决的问题

针对于现有技术中三维细胞培养过程中无法进行精准的原位监测以及细胞代谢产物无法排出培养装置的问题，本发明提供一种新的三维细胞培养装置，实现对三维培养细胞的原位的、非破坏的观察和测定，同时能够将细胞代谢产物顺利排出，满足各种条件下的三维细胞培养，细胞培养效率高，培养方式灵活。

2.技术方案

为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种三维细胞培养装置，包括中空管状壳体、沿中空管状壳体轴向贯穿的流体通道、细胞培养层、与外界连通的流体入口和流体出口以及端部的密封结构，所述细胞培养层部分或完全覆盖在流体通道外表面，所述流体入口和流体出口分别与流体通道相连通，所述流体入口和流体出口分别与外界相连通，所述细胞培养层以及与细胞培养层相接触的流体通道分别具有多孔结构。

所述的中空管状壳体为装置外壳，主要起密封和保护作用，所述的细胞培养层为细胞生长提供空间，所述的细胞培养层部分或完全覆盖在流体通道外表面，其具有自我支撑能力，目标细胞在细胞培养层上三维生长。

所述流体通道与流体入口和流体出口分别连通，因此从流体入口通入的供养介质(营养物质等)首先进入流体通道中空内部，再通过流体通道、细胞培养层的多孔结构扩散到达目标细胞，细胞产生的胞外代谢物也可以通过扩散作用经过细胞培养层、流体通道通过流体出口排出，从而形成有效的循环，使得细胞生长环境不断得到更新，降低废弃物对细胞生长的不利影响。

根据实际目的，所述流体入口和流体出口还可以通过塞子或阀门进行关闭，从而使细胞培养在与外界隔绝条件下进行。

所述流体通道具有流体储存和流体输导的作用，可以在细胞培养过程中通过在流体入口连接一个或多个泵，从而使流体能够不间断的进行补充，为细胞生长提供有利条件。

作为本发明更进一步的改进，所述细胞培养层部分覆盖在流体通道外表面时，未被覆盖的所述流体通道由多孔结构或密封结构构成。

作为本发明更进一步的改进，所述细胞培养层以及与细胞培养层相接触的流体通道的组成材料包括半透膜、金属滤膜或水凝胶中的任意一种或其组合。为了防止细胞培养过程中材料的破裂以及材料对细胞生长的支撑作用，所述的流体通道和细胞培养层分别包括至少一层同向叠加的多孔材料。

作为本发明更进一步的改进，所述中空管状壳体上设置有可打开/关闭的盖体。

作为本发明更进一步的改进，所述密封结构包括密封盖，所述一端的密封盖上设置有与外界连通的气体进出结构，所述中空管状壳体由部分或全部透明材料构成，并设置观察窗口。透过观察窗口可对培养的目标细胞进行原位观测，如成像、显微镜观测及光谱分析。所述的气体进出结构包括气体进出口，可以通过气体进出口向装置内通入一种或多种气体，包括氧气、惰性气体等，从而为细胞培养提供所需的气体环境。

作为本发明更进一步的改进，所述流体通道在水平方向可以转动，可以使营养物质分布更加均匀，维持稳定的细胞生长状态，同时可以清楚的观察不同区域的细胞生长状态。

作为本发明更进一步的改进，所述的气体进出结构与密封盖设有气体过滤膜，从而为细胞提供更加适宜的气体环境。

作为本发明更进一步的改进，所述三维细胞培养装置的应用方法，包括以下步骤：

a)细胞培养前，将目标细胞添加至细胞培养层；

b)通过流体入口加入细胞培养所需供养介质，所述供养介质经过流体通道、细胞培养层时发生扩散，到达至目标细胞；

c)从流体入口不间断的补充供养介质，维持细胞培养的状态；目标细胞培养过程中产生的代谢废物同样可通过细胞培养层、流体通道的扩散，通过流体出口排出。

按照本发明的方法可以持续或间断的将供养介质补充给细胞，同时细胞产生的代谢废物可以不断排出，因此细胞生长环境能够及时有效的得到更新，提高细胞培养效率。

所需供养介质通常为液体状，所需供养介质包括生长介质、中性介质：例如水；pH调整剂或稳定剂；生长介质；细胞分化培养介质；激素；生长促进剂；染料，包括非毒性染料；生长抑制剂，例如内分泌干扰物，细胞毒性试验物质；体液：例如血液或者血制产品；致病原，如病毒、细菌、寄生虫或者真菌；微粒物质，如纳米粒子；物理实体：如石棉纤维；细胞生长、粘附或分化所需的基底物：如胶原蛋白、纤连蛋白；前体物；上述物质的混合物。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤a)中，可以将目标细胞加入至细胞培养层内部或直接添加至细胞培养层表面，所述步骤c)中可以通过连接一个多个泵的方式从流体入口补充供养介质。

作为本发明更进一步的改进，所述步骤a)中，还可以从流体入口通入含有目标细胞的流体，使所述流体通过扩散进入细胞培养层。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的三维细胞培养装置，包括中空管状壳体、沿中空管状壳体轴向贯穿的流体通道、部分或完全覆盖在流体通道外表面的细胞培养层以及与外界连通的流体入口和出口，被细胞培养层覆盖的流体通道和细胞培养层的多孔结构可以进行物质扩散，本发明的装置将细胞培养环境分为两个空间，一部分为细胞生长空间，另一部分主要为供养介质的储存输送空间，细胞生长空间无需含有液体，因此可实现目标培养细胞与供养介质的分开，从而使供养介质不会干扰到细胞的观测，在细胞培养过程中可以实现非破坏性的、精确的原位观测，有利于在三维尺度开展细胞实验，如药物、环境介质等对目标细胞的影响。而现有技术中的三维细胞培养装置其目标细胞存在于供养介质中，对细胞的研究通常需要细胞与供养介质分离后才得以进行，因此无法进行精确的原位观测。

(2)本发明的三维细胞培养装置，由于供养介质(营养物质等)首先进入流体通道内部，再通过流体通道、细胞培养层的多孔结构扩散，到达目标细胞，细胞产生的胞外代谢物也可以通过扩散作用经过细胞培养层、流体通道，通过流体出口排出，可以形成有效的循环，使得细胞生长环境不断得到更新，降低废弃物对细胞生长的不利影响，提高细胞培养效率。

(3)本发明的三维细胞培养装置，可以根据精准的原位观测结果随时对细胞培养条件进行调整，如添加合适的介质、气体环境等，有利于细胞培养或细胞研究的进行，同时该装置除了能够实现三维细胞培养，其通过扩散方式进行输送流体的设计还能还原血液流通时的动态环境，为生物化学和药物治疗研究提供更准确的动力学参数。

(4)本发明的三维细胞培养装置，本发明适用范围广、成本低、方便精确测量和观察，并且所述装置结构简单容易实现，具有良好市场应用前景，利于推广。

(5)本发明的三维细胞培养装置，可以通过控制多种不同实验条件来探究对目标细胞生长的影响，既能够将目标细胞加入到细胞培养层内部或直接添加至细胞培养层表面，还可以将含有目标细胞的流体通入流体通道，通过扩散至细胞培养层，待研究的物质(如待测污染物、细胞生长所需营养物质、待测药物等)也可以通过多种方式添加至装置内，可以根据不同细胞培养选择细胞最优的添加方式，还能够随时观察、记录细胞在的动态变化，本发明的添加方式灵活方便，适应不同种类的细胞培养的需要。

附图说明

图1为实施例1的三维细胞培养装置的透视图。

图中：1、中空管状壳体；2、流体通道；3、流体入口；4、流体出口；5、细胞培养层；6、密封盖；7、盖体；8、气体进出结构；801、气体进出口。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1

本实施例的三维细胞培养装置，如图1所示，包括中空管状壳体1、沿中空管状壳体1轴向贯穿的流体通道2、细胞培养层5、与外界连通的流体入口3和流体出口4以及端部的密封结构，所述细胞培养层5为部分或完全覆盖在流体通道2外表面，所述流体入口3和流体出口4分别与流体通道2相连通，所述流体入口3和流体出口4分别与外界相连通，所述细胞培养层5以及与细胞培养层5相接触的流体通道2分别具有多孔结构。

本实施例的流体通道2由金属滤膜制成，细胞培养层5由半透膜制成，该过程中营养物质可以透过金属滤膜、半透膜最终供给目标细胞，同样，细胞产生的废弃产物也可以通过扩散传送至流体通道2，通过流体出口4排出，由此，流体通道2中的营养物质可以间断的或连续的被替换，以提供更多营养物质的同时去除更多废弃产物，可以形成有效的循环。

所述中空管状壳体1为圆柱体，主要起密封和保护作用，所述细胞培养层5为细胞生长提供空间，所述的细胞培养层5具有自我支撑能力，细胞在细胞培养层5进行三维生长。

所述装置端部的密封结构为密封盖6，其中一端的密封盖6上设置有与外界连通的气体进出结构8，可以通过气体进出口801通入一种或多种气体，包括氧气、惰性气体等，从而为细胞培养提供所需的气体环境，或者用于不同的实验研究。

所述的中空管状壳体1设置为部分或全部透明，并设置观察窗口。所述的中空管状壳体1由部分或全部透明材料构成，并设置观察窗口。透过观察窗口可对培养的目标细胞进行原位观测，如成像、显微镜观测及光谱分析。观察窗口材料包括玻璃，组织培养塑料，氟化钙，氟化钡，硒化锌，实验室钻石，锗，光学玻璃，氟化锂，石英玻璃，氯化钠，溴化钾和氟化锶。选择不同材料的原因在于使得成像、显微镜观测、光谱分析所需的电磁辐射能够更好的进行。

本实施例的三维细胞培养装置的应用方法，具体包括以下步骤：

a)细胞培养前，首先将目标细胞添加至细胞培养层5；

b)通过流体入口3加入细胞培养所需营养物质，所述营养物质进入至流体通道2内部，经过流体通道2、细胞培养层5的多孔结构发生扩散，到达至目标细胞；

c)在细胞培养过程中可以通过连接一个多个泵的方式从流体入口3不间断的补充营养物质，维持较佳的细胞培养的状态；

d)目标细胞培养过程中产生的代谢废物同样可通过细胞培养层5、流体通道2扩散，通过流体出口4排出。

根据实际目的，所述流体入口3和流体出口4还可以通过塞子或阀门进行关闭，从而使细胞培养在与外界隔绝条件下进行。

实施例2

本实施例基本与实施例1相同，不同之处在于：在实施例1的基础上，所述流体通道2可以在水平方向可以转动，因此，由于扩散及重力双重作用，细胞培养层的不同区域接收到的营养物质浓度不同，细胞的生长状态不同，该转动的培养方式一方面可以全角度多视角的对培养状态的细胞进行观测，另一方面可以使营养物质能够分布更加均匀，使不同区域的细胞维持更好的生长状态，维持细胞生长的稳定性。

所述中空管状壳体1上设置有可打开/关闭的盖体7，可以通过打开/关闭盖体7存取细胞及添加营养物质。

所述流体通道2的构成材料为半透膜，所述细胞培养层5的构成材料为管状水凝胶，所述细胞培养层5部分覆盖在流体通道2的外表面，所述的流体通道2由两种材料构成，与细胞培养层5接触(覆盖)的部分由多孔材料构成，可以为金属膜或半透膜，与细胞培养层5不接触的部分由金属密封材料构成。或者通过以下方式实现：所述的流体通道2整体为金属密封材料，对其部分打孔，使其与细胞培养层5接触的部分具有多孔结构。

所述气体进出结构8与密封盖6之间设有气体过滤膜，所述气体进出结构8包括气体进出口801，所述气体进出口801可以与气体提供装置相联通。

本实施例中的细胞培养层5的构成材料-水凝胶的制备过程，包括以下步骤：1)制备管状水凝胶；2)活化水凝胶表面；3)将ECM交联入活化的水凝胶表面。

试验中用到的试剂如下：40％丙烯酰胺溶液(Bio-Rad cat nr 161-0140)、交联剂-2％双丙烯酰胺(Bio-Rad cat nr 161-0143)或交联剂-2％DGT(DGT Research Ltd，UK)、1mol/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液(HSPE)(羟乙基哌嗪-N-2乙磺酸，Sigma-Aldrichcat nr 83264)、无菌磷酸盐(PBS)(Life Technologies cat nr 20012027)、10％过硫酸铵(APS)(Sigma-Aldrich cat nr A3678)、四甲基乙二胺(TEMED)(Sigma-Aldrich cat nrT9281)、苯基叠氮化物交联剂(Sulfo-SANPAH)(Thermo Scientific cat nr 22589)、二甲亚砜(DMSO)(Sigma-Aldrich cat nr D2438)、细胞外基质(ECM)(胶原，纤连蛋白或者合成肽)(Life Technologies cat nr A1048301)、超纯水、乙醇。

材料或仪器包括：0.45μm滤膜(Merck Millipore cat nr SLHV033RS)；无菌镊子、20ml无菌注射器、管子(内径6mm、长90mm*外径10mm*厚2mm)、无菌操作台。

所述步骤1)制备水凝胶支架具体操作步骤如下：

1-1)酸洗管状框架，再用超纯水冲洗，在超净台上风干；通过在超净台上喷洒70％乙醇进一步灭菌消毒。

1-2)在洁净操作台中将丙烯酰胺、交联剂、1mol/L的HSPE、超纯水按一定比例混合以制备具有不同硬度和孔径的水凝胶。例如，为了制备剪切量在9kPa的聚丙烯酰胺凝胶，需准备11.5％的丙烯酰胺和0.3％的双丙烯酰胺的混合液；10mL胶溶液能够制备出两个长90mm*外径10mm*厚2mm的管状水凝胶。在本实施例中的操作为：在无菌锥形管中，将2.875mL的40％丙烯酰胺储备液、1.5mL 2％双丙烯酰胺储备液、0.1mL浓度为1mol/L的HSPE储备液以及5.525mL超纯水充分混合，该胶溶液可以在4℃冰箱中至少保存三个月。

1-3)向1-2)步骤中所得胶溶液中加入1/100体积的10％APS，每10mL胶溶液加100μL APS；

1-4)向1-3)步骤中所得胶溶液中加1/1000体积的TEMED，每10mL胶溶液加10μLTEMED，迅速将所得溶液过0.45μm滤膜以灭菌，然后用移液枪吸取灭菌后溶液加入1-1步骤处理后的管状框架中，如果出现气泡，通过倾斜或者搅拌移除气泡后再转移。室温下，将其置于洁净操作台中至少1h，直到完全凝胶；凝胶完成后，移除管状框架，将所得的胶放入灭菌培养皿中，所得的胶可以储存在磷酸盐缓冲液(PBS)或超纯水中，4℃下可保存很长时间。

所述步骤2)活化水凝胶表面作用为使其可以附着细胞外基质(ECM)，其具体操作步骤如下：用DMSO配浓度为25mg/mL的sulfo-SANAPAH储备液，该储备液可以在-80℃下保存1年；解冻sulfo-SANAPAH储备液，移取120μL该溶液至2880μL超纯水中，3mL足够涂抹2个管状水凝胶；取所得的溶液1mL，加在管状水凝胶外表面，确保整个外表面都被覆盖。如果没有，重复该步骤直至覆盖均匀，然后将所得的胶至于365UV光下约10cm距离，活化10min，覆盖在在表面的sulfo-SANAPAH会变暗；再用3mL PBS冲洗所得胶至少3次，以去除多余的sulfo-SANAPAH。

所述步骤3)将ECM交联入活化的水凝胶表面具体操作步骤如下：

将选择的ECM溶于PBS或HSPES(0.1mg/mL)中，再将所得ECM溶液加入管状水凝胶管外表面(每个管状水凝胶需要0.5mL ECM溶液)，4℃下放置12h，ECM交联在水凝胶上。用灭菌过的PBS充分冲洗所得胶，4℃下，覆盖了ECM的胶可以在下PBS中保存两周。使用前可对该水凝胶进一步灭菌，方法为，在水凝胶上覆盖一层PBS薄层，置于紫外线条件下灭菌至少30min，得到三维细胞培养装置所需的管状水凝胶。

所述装置的应用步骤基本同实施例2，不同之处在于：

1)将含有供养介质的供给源与流体入口3相连，废弃流体收集管与流体出口4相连，形成一个完整的流体流通回路。

2)将目标培养细胞添加到细胞培养层5的外表面，包括3种方式，其中包括：a)打开盖体7，直接将目标培养细胞添加在管状水凝胶的外表面；b)在制备管状水凝胶过程中将目标培养细胞添加于ECM溶液，然后将ECM交联入活化的水凝胶；水凝胶在添加入细胞前，需在37.5℃的PBS中润洗；c)将目标培养细胞加入至流体入口3的供给流体中，细胞可以流体通道2的多孔结构扩散至细胞培养层5的水凝胶。

实施例3

本实施例基本与实施例1相同，不同之处在于：所述观察窗口具有开关功能，闭合观察窗口可以实现对目标培养细胞的原位测定，同时保持细胞生长环境的稳定，因而在测定过程中不会损伤甚至杀死细胞，打开可以进行与外界的物质交换。

除了对目标培养细胞的测定之外，也可以对流体通道的流体或对装置中加入的气体进行测定。

本发明的三维细胞培养装置能够同时或分别将细胞暴露于液体或气体介质。可开展的多项研究包括但不局限于：

1)进行细胞基本生存能力分析，例如试剂处理后细胞活力；2)测定细胞吸收微粒物质的量，如纳米粒子；3)测定细胞吸收一种或多种污染物/刺激源的量，例如评估生物修复的可靠性；4)测定光照或其他辐射对细胞生长的影响，如紫外线或电离辐射；5)监测气管上皮细胞，测定其在暴露于添加气体后的变化；6)监测细胞生长以提供替代组织；例如，测定最优培养条件参数加快替换血管生长；7)研究基本生物过程，例如细胞生长、分裂、细胞间相互作用和分化过程(干细胞经过放大到最终的分化细胞群落)；8)开展毒性试验；9)测定物质对细胞的影响，例如研究化学污染物或者化学疗法如何影响细胞；10)监测细胞间交互作用，例如不同类型细胞如何相互作用、相互附着；11)监测免疫细胞和自身细胞如何相互作用杀死病原体或者变异细胞；12)监测通过空气传播的物质在着陆过程中的生长。

Claims (7)

1.一种三维细胞培养装置，其特征在于：包括中空管状壳体(1)、沿中空管状壳体(1)轴向贯穿的流体通道(2)、细胞培养层(5)、流体入口(3)、流体出口(4)以及端部的密封结构，所述细胞培养层(5)部分或完全覆盖在流体通道(2)外表面，所述流体入口(3)和流体出口(4)分别与流体通道(2)相连通，所述流体入口(3)和流体出口(4)分别与外界相连通，所述细胞培养层(5)以及与细胞培养层(5)相接触的流体通道(2)分别具有多孔结构。

2.根据权利要求1所述的三维细胞培养装置，其特征在于：所述细胞培养层(5)部分覆盖在流体通道(2)外表面时，未被覆盖的所述流体通道(2)由多孔结构或密封结构构成。

3.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养装置，其特征在于：所述细胞培养层(5)以及与细胞培养层(5)相接触的流体通道(2)的组成材料包括半透膜、金属滤膜或水凝胶中的任意一种或其组合。

4.根据权利要求3所述的三维细胞培养装置，其特征在于：所述中空管状壳体(1)上设置有可打开/关闭的盖体(7)。

5.根据权利要求4所述的三维细胞培养装置，其特征在于：密封装置包括密封盖(6)，所述密封盖(6)的一端上设置有与外界连通的气体进出结构(8)，所述中空管状壳体(1)设置为部分或完全透明，并设置观察窗口。

6.根据权利要求5所述的三维细胞培养装置，其特征在于：所述流体通道(2)在水平方向可以转动。

7.根据权利要求5所述的三维细胞培养装置，其特征在于：所述气体进出结构(8)与密封盖(6)之间设有气体过滤膜。

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