ES2871137T3 - Método de diferenciación de células particulares a partir de la mezcla de células heterogéneas - Google Patents

Método de diferenciación de células particulares a partir de la mezcla de células heterogéneas Download PDF

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Abstract

Un método de diferenciación de células particulares a partir de una mezcla de células heterogéneas en una muestra de sangre, en el que las células particulares comprenden bacterias, comprendiendo el método: (a) la provisión de una muestra de sangre líquida sobre la base de agua que contiene una mezcla de células heterogéneas; (b) la recolección de, al menos, una parte de la muestra, la introducción de la parte recolectada de la muestra en un medio poroso y la inmovilización de las células heterogéneas en el medio poroso; (c) la aplicación de un primer estímulo bioactivo al medio poroso para causar la división de las bacterias solo como dichas células particulares, y la aplicación de, de manera adicional, otro segundo tipo de estímulo bioactivo al medio poroso en la etapa (c); y (d) la diferenciación de las células particulares a partir de otros tipos de células a través de la formación de imágenes microscópicas, en el que el cultivo o la purificación de las células heterogéneas se omite después de la provisión de la muestra y antes de la aplicación del primer estímulo bioactivo, en el que se aplica un medio nutritivo para el crecimiento de las células bacterianas como el primer estímulo bioactivo para el cultivo, de manera selectiva, solo de la célula bacteriana, pero no de las células sanguíneas, en el que se aplica un fármaco para impedir el crecimiento de las células particulares como el otro segundo tipo de estímulo bioactivo, de manera simultánea, con o después de la aplicación del primer estímulo bioactivo, y en el que las células particulares se diferencian mediante la observación de microcolonias formadas como resultado de la división de las células bacterianas particulares cuando se presentan.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de diferenciación de células particulares a partir de la mezcla de células heterogéneas
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un método de diferenciación de células particulares a partir de una mezcla de células heterogéneas.
Antecedentes
Los líquidos sobre la base de agua que contienen mezclas de diversos tipos de células se presentan en ambientes naturales y humanos. Por ejemplo, una gran cantidad de especies microbianas se mezclan en una muestra líquida sobre la base de agua que se toma del río o el mar. La sangre humana incluye, de manera esencial, células sanguíneas que consisten en eritrocitos, leucocitos y trombocitos. En un caso especial, la sangre humana puede incluir, además, células1 tumorales circulantes o eritrocitos infectados con protozoos (p. ej., parásitos de la malaria), bacterias o virus. Las células particulares tales como las células tumorales circulantes o las células bacterianas deben diferenciarse a partir de varios tipos de células heterogéneas que se presentan en muestras derivadas de ambientes naturales y humanos. Esto resulta esencial para diagnosticar el estado de las muestras o comprender las condiciones patológicas de los pacientes.
Se utiliza un método molecular genético para determinar si se presentan células particulares en una muestra que contiene una mezcla de células heterogéneas. Este método se lleva a cabo mediante la construcción de cebadores que amplifican un gen que se presenta solo en células particulares y la realización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar la presencia o ausencia de células2 particulares. Otro método de determinación de la presencia de células particulares se lleva a cabo mediante la propagación de una muestra que contiene una mezcla de células heterogéneas en portaobjetos de vidrio, mediante tinción selectiva de células particulares y observación de las células particulares con un microscopio3. Se conoce, además, un método de citometría de flujo sobre la base del uso de un material fluorescente que se une, de manera específica, a la superficie de células4 particulares. Existe un método alternativo sobre la base de una diferencia de tamaño, densidad o grado de deformación entre las células en un microfluido5 Sin embargo, tanto el método molecular genético como el método sobre la base de la propagación se llevan a cabo después de muerte celular y requieren el uso de equipos de PCR de alto coste y microscopios de gran aumento. El método de citometría de flujo requiere, además, un instrumento analítico de alto coste. El método sobre la base de una diferencia de tamaño, densidad o grado de deformación entre las células en un microfluido presenta una limitación crítica en cuanto a que su uso no se permite cuando la diferencia es insignificante. De este modo, existe la necesidad de un método más eficiente de determinación de la presencia de células particulares en una muestra que contiene una mezcla de células heterogéneas.
El documento6 de patente 1 divulga un sistema de prueba de susceptibilidad a antibiótico rápido sobre la base de inmovilización bacteriana mediante el uso de un agente gelificante, la difusión de antibióticos y el rastreo de células bacterianas individuales. El método de prueba incluye: la provisión de una solución mixta de un agente gelificante (agarosa) y una muestra que comprende microbios (muestras complejas tales como biopelículas) a un dispositivo gelificante; la solidificación de la solución de mezcla para formar una película delgada sólida en la que el microbio se encuentra inmovilizado; el suministro de un agente bioactivo a la película delgada sólida y la posibilidad de que el agente bioactivo se difunda en la película delgada sólida; y la formación de imágenes microscópicas (por intervalos) de las respuestas individuales de las células microbianas individuales y las colonias formadas con respecto al agente bioactivo, y la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) del agente bioactivo sobre la base del análisis de las imágenes para obtener resultados de AST.
J. Choi7 (2012) describe un sistema de canales de microfluidos para la prueba de susceptibilidad a antibióticos (AST) para reducir tanto la cantidad de bacterias como el tiempo de prueba de manera drástica. El sistema de canales de microfluidos sobre la base de agarosa fija las células bacterianas y rastrea el crecimiento de una célula individual para reducir el tiempo del ensayo AST y para determinar las MIC de los antibióticos. En este sistema, las bacterias de laboratorio convencionales y cuatro bacterias convencionales se sometieron a prueba con varios tipos de antibióticos para determinar los valores de MIC.
El documento8 de patente 2 describe un método de detección de la presencia de microorganismos en especímenes clínicos y no clínicos mediante el uso de un cambio de metabolismo detectable que ocurre dependiendo de la presencia o el crecimiento de un microorganismo.
Referencias
1. V. Plaks, C. D. Koopman, Z. Werb, Circulating Tumor Cells, Science, vol. 341, núm. 6151, p. 1186-1188, 2013.
2. A. Moody, Rapid Diagnostic Tests for Malaria Parasites, Clinical Microbiology Reviews, vol. 15, núm. 1, p. 66-78, 3. M. A. Jensen, J. A. Webster, N. Straus, Rapid Identification of Bacteria on the Basis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spacer Polymorphisms, Applied and Environmental Microbiology, vol. 59, núm. 4, p. 945­ 952, 1993.
4. K. Czechowska, D. R. Johnson, J. R. van der Meer, Use of Flow Cytometric Methods for Single-Cell Analysis in Environmental Microbiology, Current Opinion in Microbiology, vol. 11, núm. 3, p. 205-212, 2008.
5. H. T. K. Tse, D. R. Gossett, Y. S. Moon, M. Masaeli, M. Sohsman, Y. Ying, K. Mislick, R. P. Adams, J. Rao, D. Di Carlo, Quantitative Diagnosis of Malignant Pleural Effusions by Single-Cell Mechanophenotyping, Science Translational Medicine, vol. 5, núm. 212, p. 212ra163, 2013.
6. Documento de patente 1: US 2013/196364 A1
7. Jungil Choi: "Rapid Antibiotic Susceptibility Test Based on the Microfluidic Agarose Channel With Single Cell Imaging Process", Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, 1 de noviembre de 2012
8. Documento de patente 2: KR 20000071045 A1
Descripción detallada de la invención
Medios para resolver los problemas
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de diferenciación de células particulares como se establece en la reivindicación 1. Realizaciones preferidas se presentan en las reivindicaciones dependientes.
De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un método de diferenciación de células particulares a partir de una mezcla de células heterogéneas en una muestra de sangre, en el que las células particulares comprenden bacterias, comprendiendo el método:
(a) la provisión de una muestra de sangre líquida sobre la base de agua que contiene una mezcla de células heterogéneas;
(b) la recolección de, al menos, una parte de la muestra, la introducción de la parte recolectada de la muestra en un medio poroso y la inmovilización de las células heterogéneas en el medio poroso;
(c) la aplicación de un primer estímulo bioactivo al medio poroso para causar la división de las bacterias solo como dichas células particulares, y la aplicación de, de manera adicional, otro segundo tipo de estímulo bioactivo al medio poroso en la etapa (c); y
(d) la diferenciación de las células particulares a partir de otros tipos de células a través de la formación de imágenes microscópicas,
en el que el cultivo o la purificación de las células heterogéneas se omite después de la provisión de la muestra y antes de la aplicación del primer estímulo bioactivo,
en el que se aplica un medio nutritivo para el crecimiento de las células bacterianas como el primer estímulo bioactivo para el cultivo, de manera selectiva, solo de la célula bacteriana, pero no de las células sanguíneas,
en el que se aplica un fármaco para impedir el crecimiento de las células particulares como el otro segundo tipo de estímulo bioactivo, de manera simultánea, con o después de la aplicación del primer estímulo bioactivo, y en el que las células particulares se diferencian mediante la observación de microcolonias formadas como resultado de la división de las células bacterianas particulares cuando se presentan.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una muestra que contiene una mezcla de células heterogéneas de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 2 muestra células heterogéneas inmovilizadas en un medio poroso de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 3 muestra la aplicación de un estímulo bioactivo selectivo al que sólo responden células particulares de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 4 muestra la observación microscópica de microcolonias de células particulares que se cultivaron después de la aplicación de un estímulo selectivo de acuerdo con una realización de la presente invención.
La Figura 5 muestra los resultados de la observación microscópica antes y después de la aplicación de un estímulo bioactivo selectivo en un caldo de hemocultivo que contiene una mezcla de bacterias S. aureus y células sanguíneas. Modo de llevar a cabo la invención
Los presentes inventores lograron desarrollar un método de diferenciación de células particulares a partir de una muestra de sangre que contiene varios tipos de células que derivan de un organismo vivo, en particular, del ser humano.
El método de diferenciación de células particulares a partir de una mezcla de células heterogéneas incluye, pero sin limitación, la inmovilización de las células heterogéneas en un material poroso, en el que las células particulares comprenden bacterias, la aplicación de un primer estímulo bioactivo al material poroso para el cultivo de manera selectiva de las bacterias como dichas células particulares de interés y la observación de microcolonias de las células particulares con un microscopio.
Cuando una muestra que contiene células heterogéneas se encuentra inmovilizada en un medio poroso, la diferenciación de células particulares de manera inicial resulta imposible porque las propiedades y las formas de las células no son discernibles. Cuando se aplica el estímulo bioactivo, las células particulares comienzan a dividirse para formar microcolonias, que resultan discernibles con respecto a otras células de fondo y se pueden observar, de manera visual, con un instrumento adecuado, tal como un microscopio.
En la presente invención, la muestra es una muestra de sangre que contiene bacterias. Las bacterias son, de manera inicial, difíciles de diferenciar a partir de células sanguíneas debido a que las bacterias presentan un tamaño de 7 pm a 15 pm y las células sanguíneas presentan un tamaño de 1 pm a 2 pm. Sin embargo, cuando se introduce un medio que causa la división celular solamente de bacterias, las bacterias solo se dividen una vez cada 30 minutos en promedio y forman colonias celulares más grandes con respecto a las células sanguíneas después del transcurso de varias horas, lo que da como resultado que las bacterias se puedan observar de manera visual.
Ahora, se describirán realizaciones ejemplares de la presente invención de manera más detallada con referencia a los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra una muestra que contiene una mezcla de células heterogéneas de acuerdo con una realización de la presente invención. La muestra se puede proporcionar en forma de un líquido 110 sobre la base de agua. Las células 120 heterogéneas pueden ser células procariotas o eucariotas o ambas. Los ejemplos de células heterogéneas incluyen células de mamíferos, células tumorales, células sanguíneas, procariotas (bacterias incluyendo cianobacterias y arqueas), hongos filamentosos, levaduras, mixomicetos, basidiomicetos, algas unicelulares y protozoos. La muestra puede incluir microorganismos patógenos. Los ejemplos de microorganismos patógenos incluyen bacterias tales como micrococos, bacilos, espirilos y bacterias Actinomyces. La muestra que incluye las células 120 heterogéneas se puede derivar de un organismo vivo, tal como un ser humano o un animal. Las células 120 heterogéneas pueden incluir células de sangre, pus y secreciones.
La Figura 2 muestra las células 220 heterogéneas inmovilizadas en el medio 210 poroso. El medio 210 poroso incluyendo las células 220 heterogéneas es un material líquido que se puede gelificar. Esto es, las células 220 heterogéneas se dispersan en el medio líquido en un recipiente 230 tal como un micropocillo y se inmovilizan luego en el medio líquido cuando el medio líquido se gelifica en condiciones ambientales físicas o químicas apropiadas. Por ejemplo, el medio líquido puede incluir, al menos, aproximadamente el 95 % de agua y se puede gelificar en presencia de un agente gelificante. Por ejemplo, el gelificante se puede utilizar en una cantidad del 0,5 % al 4 % en peso, sobre la base del peso del medio líquido. Preferiblemente, el agente gelificante es agar o agarosa.
El medio 210 poroso se puede elaborar a partir de un hidrogel o una membrana porosa. El hidrogel puede ser un material polimérico natural o sintético. Los ejemplos de tales hidrogeles incluyen colágeno, fibrina, agarosa, agar, matrigel, alginato y gelatina.
El medio 210 poroso es, de manera inicial, un líquido y se puede gelificar en diversas condiciones, incluidas condiciones de temperatura, luz, pH, presión y vibración. Por ejemplo, el medio poroso es un líquido a una temperatura alta y se puede gelificar a una temperatura baja.
La muestra que se toma de un organismo vivo no se cultiva o purifica antes de la aplicación del primer estímulo bioactivo. De manera particular, la muestra se puede gelificar mediante la mezcla con un agente gelificante sin necesidad de un cultivo puro. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de hemocultivo positivo. En este caso, se pueden inmovilizar diversos tipos de células sanguíneas en conjunto con bacterias en el medio poroso. Se omite el cultivo puro de la muestra que requiere aproximadamente de 16 a 24 horas después del muestreo, lo que reduce en gran medida el tiempo de detección de las células particulares.
La muestra que se toma de un organismo vivo requeriría un tiempo de cultivo de ~ 1 a 2 días para aumentar el número de bacterias, sin embargo, este proceso se omite cuando la concentración de las células particulares en la muestra resulta lo suficientemente alta como para observar las células particulares. Cuando las células 220 heterogéneas se encuentran inmovilizadas en el medio 210 poroso, una concentración conveniente de las células particulares se puede encontrar, por ejemplo, en el rango de 103 a 105 CFU/ml. En este rango, las células particulares son fáciles de observar en la etapa posterior.
En este caso, se pueden obtener resultados convenientes en varias horas después del muestreo, acortando en gran medida el tiempo de análisis.
Los diversos tipos de células de la muestra se pueden introducir e inmovilizar en los poros del medio 210 poroso gelificado. Esto es, las células 220 heterogéneas dispersas en el medio 210 poroso líquido antes de la gelificación se encuentran inmovilizadas de manera tridimensional en la matriz del medio 210 poroso después de la gelificación. Como resultado, las células móviles en el medio líquido se fijan a las posiciones particulares después de la gelificación. Esta fijación facilita la observación microscópica de los cambios de las células en y alrededor de las posiciones fijas en áreas de observación.
Los poros del medio 210 poroso pueden presentar un tamaño de un nanómetro a varios milímetros. La presencia de los poros facilita la inmovilización de los diversos tipos de células 220 heterogéneas. Teniendo en cuenta el tamaño de las células, el tamaño de los poros es preferiblemente de 1 pm a 100 pm.
El espesor de la matriz porosa que toma la forma del medio 210 poroso gelificado no se encuentra, de manera especial, limitado siempre que las colonias de las células heterogéneas inmovilizadas se puedan observar con un microscopio. Por ejemplo, la matriz porosa puede presentar un espesor que varía de varios micrómetros a varios milímetros. El método puede incluir, además, el suministro de un medio de cultivo a la mezcla de la muestra y el gelificante y el cultivo de las células.
La Figura 3 muestra la aplicación del primer estímulo bioactivo selectivo al que sólo responden células particulares bacterianas. El estímulo 310 bioactivo selectivo incluye medios para crecimiento selectivo de células particulares bacterianas. El estímulo 310 se puede aplicar de manera continua. De manera alternativa, el estímulo 310 se puede aplicar de manera intermitente a intervalos de tiempo predeterminados. El estímulo 310 se puede aplicar a algunas o todas las células heterogéneas en la muestra. Preferiblemente, el estímulo 310 se aplica a todas las células heterogéneas. El estímulo 310 bioactivo posibilita el crecimiento selectivo de las células 320 particulares.
Otro segundo tipo de estímulo bioactivo se aplica de manera adicional al medio poroso. El estímulo bioactivo adicional se puede aplicar de manera simultánea con o después de la aplicación del primer estímulo. Se aplica un medio nutritivo para el crecimiento de las células particulares como el primer estímulo bioactivo, y, al mismo tiempo o posteriormente, se aplica un fármaco para impedir el crecimiento de las células particulares como el segundo estímulo bioactivo adicional. Así, se puede examinar la sensibilidad de crecimiento de las células particulares con respecto al fármaco. La Figura 4 muestra la observación microscópica de microcolonias de las células particulares que se cultivaron después de la aplicación del primer estímulo bioactivo selectivo.
El estímulo bioactivo selectivo causa la división celular. Las células inmovilizadas se dividen para formar colonias más grandes en comparación con su tamaño inicial. Las células que han respondido de manera selectiva al estímulo bioactivo se pueden diferenciar por su variación de tamaño cuando se observan con un microscopio 410.
Esto es, las células particulares se pueden diferenciar mediante la observación de las microcolonias 420 formadas como resultado de la división de las células particulares. La formación de imágenes microscópicas se realiza mediante la toma de imágenes de las microcolonias 420 de las células diana con un aumento que se puede observar. Considerando el tamaño normal (1 pm a 2 pm) de bacterias, varias decenas a varios cientos de bacterias deberían reunirse para alcanzar un tamaño que se pueda observar. El tamaño que se puede observar de las microcolonias 420 es de al menos 10 pm, preferiblemente, al menos 20 pm, más preferiblemente, al menos 30 pm, incluso más preferiblemente, al menos 50 pm. Considerando el tiempo de las microcolonias 420 para alcanzar el tamaño de crecimiento que se puede observar, las células particulares se pueden diferenciar de manera rápida en poco tiempo, normalmente >2 horas, preferiblemente, de 3 a 5 horas
La presencia de las microcolonias 420 se puede observar en el modo de campo claro u oscuro, preferiblemente, en el modo de campo claro. Los cambios en series de tiempo del crecimiento y la división de las células se pueden rastrear mediante la formación de imágenes por intervalos de toda el área debido a que las células se encuentran espacialmente inmovilizadas en el medio poroso.
La formación de imágenes microscópicas se puede realizar mediante formación de imágenes por intervalos de la región diana durante el cultivo para rastrear los cambios en series de tiempo en el área ocupada por las células heterogéneas que se presentan en la región diana. El procedimiento de formación de imágenes se lleva a cabo mediante la toma de imágenes mediante el uso de un dispositivo de carga acoplada (CCD) o cámara de semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) cuando se realiza una observación con el microscopio 410 y la conversión de las imágenes en datos digitales, mediante el uso de un programa codificado.
El método de la presente invención resulta útil para determinar de manera rápida la presencia o ausencia de bacterias en una muestra de sangre de un paciente y prescribir un fármaco para el paciente.
La presente invención se explicará de manera más detallada con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no son limitantes.
Ejemplos
Experimento de diferenciación de bacterias a partir de muestras de sangre infectadas con las bacterias
Se cultivó y se muestreó la sangre de un paciente infectado con cepa de S. aureus. La muestra se mezcló con agarosa líquida (agarosa UltraPure, Invitrogen) y se inyectó en una microplaca de 96 pocillos para inmovilizar las bacterias y las células sanguíneas en el material poroso. La estructura porosa de la agarosa se formó mediante la gelificación a <36 °C antes de su uso. De manera específica, inmediatamente después de que la muestra de cultivo que contenía la mezcla de las bacterias y las células sanguíneas se mezcló con agarosa al 0,5 % en una proporción de volumen de 1:400 a 45 °C, la mezcla resultante se inyectó en una placa de micropocillos y se gelificó a 25 °C durante <1 min. Se suministró un caldo Mueller-Hinton líquido con cationes ajustados (CAMHB) como un caldo de cultivo bacteriano para crecimiento selectivo de las células bacterianas a los pocillos que contenían la agarosa gelificada. Inmediatamente después del suministro de CAMHB, el interior de la agarosa se observó con un microscopio y la placa de micropocillos se incubó a 37 °C. 4 h después de la incubación, se volvió a observar el interior de la agarosa con el microscopio. Para observación microscópica, se utilizó una cámara CCD para obtener imágenes. Las imágenes se procesaron para rastrear el crecimiento de las células bacterianas.
Los datos de las imágenes se convirtieron en datos digitales mediante el uso de un programa codificado en C++. Los datos de las imágenes sin procesar en formato RGB se convirtieron en formato gris y luego, los datos de fondo se borraron para obtener datos claros y sin ruido. A continuación, las imágenes se convirtieron en binarias mediante el aumento del contraste. Se utilizó un programa en C++ para detectar diferentes áreas entre las imágenes iniciales y las imágenes que se obtuvieron 4 h después del cultivo. Los nuevos objetos detectados en áreas donde los objetos iniciales no habían sido detectados o los objetos detectados con un tamaño mayor que los objetos iniciales se reconocieron como células bacterianas.
La Figura 5 muestra los resultados de la observación microscópica antes y después de la aplicación del estímulo bioactivo selectivo al caldo de hemocultivo que contiene la mezcla de la cepa de S. aureus y las células sanguíneas. Con referencia a la Fig. 5, se rastrearon la inmovilización de las células bacterianas y las células sanguíneas en la agarosa y el crecimiento de las bacterias.
Después del tratamiento de la bacteria S. aureus y las células sanguíneas inmovilizadas en agarosa con el caldo de cultivo bacteriano, las células sanguíneas no crecieron pero la S. aureus creció y se dividió para formar colonias, que se observaron con un microscopio. La presencia de la bacteria S. aureus en el caldo de hemocultivo se diferenció de manera rápida a partir de las células heterogéneas en 4 h.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método de diferenciación de células particulares a partir de una mezcla de células heterogéneas en una muestra de sangre, en el que las células particulares comprenden bacterias, comprendiendo el método: (a) la provisión de una muestra de sangre líquida sobre la base de agua que contiene una mezcla de células heterogéneas;
(b) la recolección de, al menos, una parte de la muestra, la introducción de la parte recolectada de la muestra en un medio poroso y la inmovilización de las células heterogéneas en el medio poroso;
(c) la aplicación de un primer estímulo bioactivo al medio poroso para causar la división de las bacterias solo como dichas células particulares, y la aplicación de, de manera adicional, otro segundo tipo de estímulo bioactivo al medio poroso en la etapa (c); y
(d) la diferenciación de las células particulares a partir de otros tipos de células a través de la formación de imágenes microscópicas,
en el que el cultivo o la purificación de las células heterogéneas se omite después de la provisión de la muestra y antes de la aplicación del primer estímulo bioactivo,
en el que se aplica un medio nutritivo para el crecimiento de las células bacterianas como el primer estímulo bioactivo para el cultivo, de manera selectiva, solo de la célula bacteriana, pero no de las células sanguíneas,
en el que se aplica un fármaco para impedir el crecimiento de las células particulares como el otro segundo tipo de estímulo bioactivo, de manera simultánea, con o después de la aplicación del primer estímulo bioactivo, y en el que las células particulares se diferencian mediante la observación de microcolonias formadas como resultado de la división de las células bacterianas particulares cuando se presentan.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células heterogéneas se derivan de un organismo vivo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células heterogéneas que se dispersan en el medio líquido poroso antes de la gelificación se encuentran inmovilizadas de manera tridimensional en la matriz del medio poroso después de la gelificación.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la formación de imágenes microscópicas se realiza mediante la toma de imágenes de las microcolonias con un aumento que se puede observar.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la formación de imágenes microscópicas se realiza mediante la formación de imágenes por intervalos de la región diana durante el cultivo para rastrear cambios en series de tiempo en el área ocupada por las células heterogéneas que se presentan en la región diana.
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