WO2017105089A1 - 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법 - Google Patents

이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법 Download PDF

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정용균
최정일
유정헌
김동영
정현용
한상권
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주식회사 퀀타매트릭스
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    • C12N2533/70—Polysaccharides

Definitions

  • the technology disclosed herein relates to a method of distinguishing a particular cell from a mixture of heterologous cells.
  • a molecular genetic method for identifying specific cells in a sample containing a mixture of heterologous cells. This is to check the presence of cells by preparing a primer (a primer) for amplifying a gene having only a specific cell and performing a polymerase chain reaction (PCR) 2 . Or a sample containing a mixture of two kinds of cells smeared on a slide glass after which there is a method of observing through a microscope after a stain specific cells 3. Another method is to use flow cytometry using fluorescent materials that adhere to the surface of other specific cells 4 . Alternatively, microfluidic separation can be achieved by using differences in size, density, and degree of transformation between cells 5 .
  • a sample of an aqueous liquid containing a mixture of heterogeneous cells (b) taking an amount of at least a portion of said sample and fixing it in a porous medium; (c) culturing the specific cells by applying a bioactive stimulus to the porous medium to cause growth of only specific cells in the mixture of heterologous cells; And (d) distinguishing the specific cell from other types of cells by microscopic imaging.
  • FIG. 1 shows a sample in which heterologous cells are mixed according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows heterologous cells immobilized on a porous medium according to one embodiment of the invention.
  • Figure 3 illustrates the step of applying a selective physiological activity stimulation to react only specific cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the step of observing the population of a specific cell cultured by selective stimulation under a microscope according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the results of microscopic observation before and after the selective physiological stimulation applied to the blood culture medium mixed with S. aureus bacteria and blood cells.
  • the inventors have developed a method of distinguishing specific cells from an aqueous liquid sample mixed with various cells derived from the natural environment and the human body.
  • the present invention in order to distinguish specific cells in a mixed state of heterogeneous cells, these cells are fixed in a porous material and then bioactive stimulation for selectively growing only specific cells that are desired to be distinguished is then formed. It provides a method for identifying microcolony through microscopic observation.
  • cancer cells when cancer cells are mixed in the blood, only a few cancer cells are present as compared to the number of blood cells.
  • the introduction of a human epithelial cell medium that only divides cancer cells can be used as a physiological stimulus. Then, the cancer cells divide by the physiological activity stimulation and the blood cells do not divide, and after a certain time, the microscope can confirm the presence of cancer cells.
  • the size of the blood cells is about 7-15 ⁇ m and the size of the bacteria is 1-2 ⁇ m.
  • bacteria divide every 30 minutes on average, and after several hours, they form a larger cell population than blood cells.
  • heterologous cells 120 can be either prokaryotic or eukaryotic, for example mammalian cells, tumor cells, hematopoietic cells, prokaryotes (bacteria, indigo bacteria, archaea), filamentous fungi, yeast, modified bacteria, choliform bacteria , Unicellular algae or protozoa.
  • the sample may include microorganisms causing the disease, and may include viruses, rickettsia, bacteria (cocci, bacilli, helix, actinomycetes), fungi or protozoa.
  • the sample including heterologous cells 120 may be derived from living bodies, animals, plants, and the like, and may be derived from various natural environments such as seawater, river water, wastewater, and soil. When the sample is derived in vivo, the heterologous cells 120 may be various cells contained in blood, pus and secretion.
  • the porous medium 210 including the heterologous cells 220 may use a material that becomes solid in a liquid phase. That is, the heterologous cells 220 may be dispersed in a liquid medium in a container 230 such as a microwell, and then gelled and fixed under an appropriate physical or chemical environment change.
  • the liquid medium may comprise at least about 95% water and may be solidified by the presence of solidifying materials contained therein.
  • solidifying materials contained therein.
  • 0.5 to 4% by weight of the solidifying material may be used in the liquid medium.
  • agar or agarose may be used as the solidifying material.
  • the porous medium 210 may be made of a material such as a hydrogel or a porous membrane.
  • the hydrogel may be a natural or synthetic polymer material.
  • the hydrogel may include collagen, fibrin, agarose, agar, atri, matrigel, alginate, gelatin, and the like.
  • the porous medium 210 may be initially liquid and then solidified by various conditions, including temperature, light, pH, pressure, vibration, and the like.
  • porous media that are liquid at high temperatures may gel at low temperatures.
  • Samples taken from a living or natural environment may omit a separate culture or purification process prior to the application of a bioactive stimulus.
  • the sample can be solidified by omitting the pure culture step and immediately mixing with the solidifying material.
  • the sample can be, for example, a positive blood culture sample.
  • various blood cells and bacteria can be fixed together in a porous medium.
  • the culture process to increase the number of bacteria takes about 1 to 2 days.
  • a sample having a specific cell concentration that can be easily observed even if this process is omitted is omitted. If it is possible to omit the culture process.
  • the concentration of specific cells desired is, for example, 10 3 to 10 5 CFU / ml.
  • the fixation to the porous medium 210 is a three-dimensional fixation of heterogeneous cells 220 dispersed in the liquid porous medium 210 in the matrix of the porous medium 210 through the gelation process of the porous medium 210. Will be.
  • the kinetic cells are fixed at specific positions through the gelation process, so that changes in each cell can be easily observed under a microscope with respect to the fixed positions for each cell in the observation area.
  • the pore size in the porous medium 210 may be 1 nm to several mm. In the presence of the pores, various heterogeneous cells 220 can be easily fixed to each other. Given the size of the cells, the pore size may preferably be from 1 to 100 ⁇ m.
  • the thickness of the porous matrix having the form of the solidified porous medium 210 is not particularly limited as long as the fixed population of heterogeneous cells can be observed through a microscope. For example, it may have a range of several micrometers to several mm. Forming a mixture of the sample and the immobilizing agent may further comprise the step of culturing while supplying a culture medium.
  • FIG. 3 illustrates the step of applying a selective physiological activity stimulation to react only specific cells according to an embodiment of the present invention.
  • Selective bioactive stimulation 310 is one selected from the group consisting of genetic material expressing a specific gene, medium to selectively grow only specific cells, specific laser wavelength, specific temperature, specific pressure, specific chemicals and specific cells It includes the above.
  • the stimulus 310 may be applied continuously or intermittently with time.
  • the stimulus 310 may be applied to some or all of the heterologous cells in the sample, preferably to all of the heterologous cells.
  • the bioactive stimulation 310 causes only a specific type of cell 320 to grow selectively.
  • bioactive stimuli may be additionally applied to the porous medium in addition to the bioactive stimuli.
  • the additional bioactive stimulus may be applied simultaneously or after the original initial stimulus. For example, when a nutrient medium capable of growing a specific cell is applied as a physiological stimulus and a drug that prevents the growth of the specific cell is applied as the additional physiological stimulus, the growth of the specific cell is observed. You can check your sensitivity.
  • Figure 4 shows the step of observing the population of a specific cell cultured by selective stimulation under a microscope according to an embodiment of the present invention.
  • Cells are divided by the selective physiological stimulation.
  • the divided cells form a colony larger than the initial size because they divide in a fixed state. This may be observed under a microscope 410 to differentiate cells selectively responding to physiological activity stimulation through a size change.
  • the process of distinguishing the specific cells may be performed by observing that the microcolon 420 is formed by the division of the specific cells.
  • the microscopic imaging performs microcolonies 420 of cells to be distinguished at observable magnifications.
  • the size of the observable microcolon 420 may be at least 10 ⁇ m, preferably at least 20 ⁇ m, more preferably at least 30 ⁇ m, even more preferably at least 50 ⁇ m.
  • a specific cell can be quickly distinguished in a typical time of 2 hours or more, preferably 3 to 5 hours.
  • microcolonies 420 can be observed in the bright or dark field and preferably in the bright field. Since the cells are spatially fixed in the porous medium, time-series changes such as cell growth and division can be tracked when imaging the entire region over time.
  • the microscopic imaging may be performed by tracking a change in the occupied area of the heterologous cells present in the observation area by imaging the observation area for each incubation time.
  • the imaging process may be a method of obtaining an image by using a Charge Coupled Device (CCD) method or a Complementary Metal Oxide Semiconductor (CMOS) method camera when the microscope 410 is observed, and converting the image into digital data by a coded program.
  • CCD Charge Coupled Device
  • CMOS Complementary Metal Oxide Semiconductor
  • the method of distinguishing a specific cell from the mixed sample of heterologous cells can be used for various purposes. Identifying a particular microorganism in a sample that can be taken from the environment can confirm the contamination of the sample. Checking for the presence of certain bacteria in the blood helps to quickly identify the presence of bacteria in the patient's blood and quickly prescribe it. In addition, a very small number of circulating tumor cells present in the blood can be identified with high sensitivity in a short time to confirm the prognostic observation or metastasis of the chemotherapy of the patient. In addition, when treated with anticancer drugs, antibiotics and the like can be quickly search for a suitable treatment. In addition, it is possible to identify cells with specific genes so that the diagnosis or mutation of cancer can be confirmed in a short time.
  • Blood samples from patients infected with S. aureus bacteria were mixed with liquid agarose (Invitrogen's UltraPure agarose) and injected into 96-well microplates to fix bacteria and blood cells in porous materials. Agarose solidified to a porous structure below 36 ° C. Bacterial samples mixed with bacteria and blood cells were mixed with 0.5% agarose in a 1: 400 volume ratio at 45 ° C, immediately injected into microwell plates, and solidified at 25 ° C within 1 minute. The wells containing solidified agarose were supplied with a liquid culture-adusted Mueller-Hinton broth (CAMHB) as a bacterial culture medium for growth of bacterial cells only.
  • CAMHB liquid culture-adusted Mueller-Hinton broth
  • the microwell plate After observing the agarose inside through a microscope immediately after CAMHB feeding, the microwell plate was incubated at 37 ° C. After 4 hours of incubation, the inside of the agarose was again observed under a microscope. After microscopic observation, images were obtained using a CCD camera and the obtained images were processed to track bacterial cell growth.
  • Image data was converted to digital data by a program coded in C ++. I replaced the raw image data in RGB format with gray format and then erased the background data to get clear data without noise. The contrast was then increased to make the image binary.
  • the C ++ program detects the change in the initial image and the image after 4 hours of incubation. In the area where the original object was not detected, a new object is detected or a larger object than the initial detection is detected and recognized as a bacterial cell.
  • Figure 5 shows the results of microscopic observation before and after the selective physiological stimulation of the blood culture medium mixed with S. aureus bacteria and blood cells. Referring to FIG. 5, the process of fixation and bacterial growth in agarose of bacteria and blood cells is shown.

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Abstract

본 발명은 이종 세포들이 혼합된 샘플에서 특정 세포를 구별하는 방법에 관한 것이다. 이종 세포들이 혼합된 시료를 다공성 물질 속에서 고정을 한 다음 특정 세포만 반응하는 선택적 생리활성 자극을 부여한다. 이 후에 선택적 자극에 의해서 반응하여 분열된 특정 세포의 군집 형성을 현미경을 통해서 관찰할 수 있다. 본 발명을 통하여 혈액 내에 존재하는 순환 종양 세포의 유무를 확인할 수 있으며, 혈액 내에 존재하는 세균의 존재 뿐만 아니라 특정 유전자를 가진 세포의 존재를 편리하게 관측할 수 있다.

Description

이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법
본 명세서에 개시된 기술은 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법에 관한 것이다.
자연 환경과 인체 내에는 여러 가지 세포가 혼합된 수계 액체(water-based liquid)가 존재한다. 예를 들어 강이나 바다와 같은 곳에서 채취할 수 있는 수계 액체 샘플의 경우 수많은 종류의 미생물들이 혼합되어 있다. 또한 인체 내에 존재하는 혈액의 경우 적혈구, 백혈구, 혈소판으로 이루어진 혈구 세포가 기본적으로 포함되며 특별한 경우에 순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell)가 함께 존재하거나1, 말라리아와 같은 원충, 세균 또는 바이러스에 의해 감염된 적혈구가 함께 존재할 수 있다. 자연 환경 유래 샘플이나 인체 유래 샘플 내 존재하는 각종 이종 세포들로부터 순환 종양 세포나 세균 등의 특정 세포를 구별하는 것은 그 샘플의 상태를 진단하거나 환자의 병리학적 상태를 파악하는 데 필수적으로 필요하다.
이종 세포들의 혼합물을 함유한 샘플에서 특정 세포가 있는지 확인하는 방법에는 분자 유전학적인 방법이 있다. 이는 특정 세포만 가진 유전자를 증폭하는 프라이머(primer)를 제작하여서 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 시켜서 세포의 유무를 확인하는 것이다2. 또는 이종 세포들의 혼합물을 함유한 샘플을 슬라이드 글라스에 도말한 뒤에 특정 세포만 염색을 한 뒤에 현미경으로 관찰하는 방식이 있다3. 기타 특정 세포의 표면에 특이적으로 붙는 형광 물질을 이용하여 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하는 방식이 있다4. 이와 다르게 미세 유체 상에서 세포 간의 크기나 밀도, 변형의 정도 차이를 이용해서 분리하는 방식도 존재한다5. 그러나 분자 유전학적인 방법과 도말을 하는 방법은 모두 세포를 사멸시킨 다음에 가능한 방식이고 고가의 PCR 장비와 고배율의 현미경 장비를 필요로 한다. 유세포 분석기를 이용한 방식의 경우도 고가의 장비가 필요하다. 미세 유체에서 세포의 크기나, 밀도, 변형의 정도 차이를 이용하는 방법은 그 차이가 미비한 경우 사용할 수가 없다는 결정적인 한계가 있다. 따라서 이종 세포들의 혼합물을 함유한 샘플에서 특정 세포가 있는지 확인하기 위한 좀 더 효율적인 방법이 요구된다.
[관련 선행 논문]
1. V. Plaks, C. D. Koopman, Z. Werb, Circulating Tumor Cells, Science, Vol. 341, No. 6151, p. 1186-1188, 2013.
2. A. Moody, Rapid Diagnostic Tests for Malaria Parasites, Clinical Microbiology Reviews, Vol. 15, No. 1, p. 66-78, 2002.
3. M. A. Jensen, J. A. Webster, N. Straus, Rapid Identification of Bacteria on the Basis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Ribosomal DNA Spacer Polymorphisms, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 59, No. 4, p. 945-952, 1993.
4. K. Czechowska, D. R. Johnson, J. R. van der Meer, Use of Flow Cytometric Methods for Single-Cell Analysis in Environmental Microbiology, Current Opinion in Microbiology, Vol. 11, No. 3, p. 205-212, 2008.
H. T. K. Tse, D. R. Gossett, Y. S. Moon, M. Masaeli, M. Sohsman, Y. Ying, K. Mislick, R. P. Adams, J. Rao, D. Di Carlo, Quantitative Diagnosis of Malignant Pleural Effusions by Single-Cell Mechanophenotyping, Science Translational Medicine, Vol. 5, No. 212, p. 212ra163, 2013.
본 발명의 일 측면에 의하면, (a) 이종 세포들의 혼합물을 함유한 수계 액체의 샘플을 제공하는 단계; (b) 상기 샘플 중 적어도 일부의 양을 채취하여 다공성 매질에 넣어 고정시키는 단계; (c) 상기 이종 세포들의 혼합물 중 특정 세포만 성장하게 하는 생리활성 자극을 상기 다공성 매질에 인가하여 상기 특정 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 현미경 이미징을 통해서 상기 특정 세포를 다른 종류의 세포들과 구별하는 단계를 포함하는 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법이 제공된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 이종 세포들이 혼합되어 있는 샘플을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 매질에 고정된 이종 세포들을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 특정 세포만 반응하도록 선택적인 생리 활성 자극을 인가하는 단계를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 선택적 자극에 의해서 배양된 특정세포의 군집을 현미경으로 관찰하는 단계를 나타낸 것이다.
도 5는 S. aureus 균과 혈구세포가 혼합된 혈액배양액을 대상으로 선택적 생리활성 자극 인가 전후의 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 자연 환경과 인체 내에서 유래된 다양한 세포가 혼합된 수계 액체상태의 샘플에서 특정 세포를 구별하는 방법을 개발하였다.
본 발명에서는 이종 세포들이 혼합된 상태에서 특정 세포를 구별하기 위해서 이들 세포들을 다공성 물질 속에 고정을 시킨 후에 구별하기를 원하는 특정 세포만 선택적으로 성장하게 하는 생리활성 자극을 가한 다음 상기 특정 세포가 형성하는 마이크로콜로니(microcolony)를 현미경 관찰을 통해서 확인하는 방법을 제공한다.
처음에 이종 세포들이 있는 시료를 다공성 매질에 고정시켰을 경우에는 각 세포들의 성상이 구분되지 않아 특정 세포를 구별할 수 없지만, 상기 생리활성 자극에 의해 시간이 지나면서 특정 세포가 분열을 하여 마이크로콜로니를 형성하면 배경에 있는 크기 변화가 없는 다른 세포들과 구분되어 현미경 등을 통하여 시각적으로 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 혈액에 암세포가 혼합되어 있는 경우 혈구 세포의 수에 비해 암세포는 극소수로만 존재한다. 이 경우 암세포의 존재를 확인하기 위해서 암세포만 분열을 하게 하는 사람의 상피 세포 배지의 도입을 생리활성 자극으로 이용할 수 있다. 그러면 상기 생리활성 자극에 의해 암세포는 분열을 하게 되고 혈구 세포는 분열하지 않으므로, 일정 시간이 지난 뒤 현미경으로 관찰하면 암세포의 존재 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 혈액 속에 세균이 존재하는 경우, 혈구 세포의 크기는 7~15 ㎛ 정도이고 세균의 크기는 1~2 ㎛이기 때문에 처음에는 세균을 구별하기 어렵다. 그러나 세균만 분열할 수 있는 배지를 넣어 주게 되면 세균은 평균적으로 30분에 한 번씩 분열하게 되고 수 시간이 지나면 혈구 세포보다 더 큰 세포 군집을 형성하므로 시각적으로 관찰할 수 있다.
이하 도면을 통해 본 발명의 다양한 구현예들을 좀더 구체적으로 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 이종 세포들이 혼합되어 있는 샘플을 나타낸 것이다. 상기 샘플은 수계 액체(110)의 형태로 제공될 수 있다. 이종 세포들(120)의 종류는 원핵세포 또는 진핵 세포 모두가 될 수 있으며, 예를 들어 포유류 세포, 종양세포, 혈구 세포, 원핵생물(세균, 남색세균, 고세균), 사상균, 효모, 변형균, 담자균, 단세포성의 조류 또는 원생동물 등이 될 수 있다. 상기 샘플에는 질병의 원인이 되는 미생물들이 포함될 수 있으며, 바이러스, 리케차(rickettsia), 세균(구균, 간균, 나선균, 방선균), 진균 또는 원충 등이 포함될 수 있다. 이종 세포들(120)을 포함하는 샘플은 인체, 동물체, 식물체 등의 생체 내에서 유래할 수 있고, 바닷물, 강물, 폐수, 토양 등의 다양한 자연 환경에서 유래할 수도 있다. 상기 샘플이 생체 내에서 유래한 것일 경우, 이종 세포들(120)은 혈액, 고름 및 분비액에 함유된 다양한 세포들일 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 다공성 매질에 고정된 이종 세포들(220)을 나타낸 것이다. 이종 세포들(220)을 포함하는 다공성 매질(210)은 액상에서 고상으로 되는 물질을 이용할 수 있다. 즉 이종 세포들(220)이 마이크로웰과 같은 용기(230) 내에서 액상 매질에 분산된 후 적절한 물리적 또는 화학적 환경 변화 하에서 겔화되어 고정될 수 있다.
예를 들어 상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 이에 포함된 고형화 물질의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 상기 고형화 물질이 0.5 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 고형화 물질로서 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다.
다공성 매질(210)은 하이드로젤(hydrogel)이나 기공을 가진 멤브레인(porous membrane) 등의 재질일 수 있다. 상기 하이드로젤은 천연 또는 합성 고분자 물질일 수 있다. 상기 하이드로젤은 콜라젠(collagen), 피브린(fibrin), 아가로즈(agarose), 한천(agar), 마트리젤(matrigel), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin) 등을 포함할 수 있다.
이러한 다공성 매질(210)은 처음에 액상이었다가 다양한 조건에 의해서 고형화될 수 있는데 그 조건은 온도, 빛, pH, 압력, 진동 등을 포함한다. 예를 들어 고온에서 액상인 다공성 매질이 저온에서 겔화될 수 있다.
생체 또는 자연 환경으로부터 채취된 샘플은 생리활성 자극의 인가 전에 별도의 배양 또는 정제 과정을 생략할 수 있다. 특히 채취된 샘플에 대해 순수 배양(pure culture) 단계를 생략하고 곧바로 고형화 물질과 혼합하여 고형화시킬 수 있다. 상기 샘플은 예를 들어 혈액 배양 양성 (positive blood culture) 샘플일 수 있다. 이 경우 각종 혈구 세포들과 박테리아가 다공성 매질에 함께 고정될 수 있다. 샘플링 후 16시간 내지 24시간 정도 걸리던 별도의 순수 배양과정을 생략함으로써 특정 세포를 검출하는 시간이 매우 단축될 수 있다.
더 나아가 생체 또는 자연 환경으로부터 채취된 샘플의 경우 균수를 늘리기 위한 배양 과정이 1~2일 정도 소요되는데, 샘플의 종류에 따라 이 과정을 생략하여도 관찰이 용이한 정도의 특정 세포 농도를 갖는 샘플일 경우라면 상기 배양 과정의 생략이 가능하다. 다공성 매질(210) 내에 이종 세포들(220)을 고정하였을 때 원하는 특정 세포들의 농도는 예를 들어 103 내지 105 CFU/ml 인 것이 추후 관찰 면에서 용이하다.
이 경우 샘플 채취 후 수 시간 내에 원하는 결과를 얻을 수 있으므로 분석시간이 매우 단축되는 장점이 있다.
상기 샘플 내의 다양한 세포들은 상기 고형화된 다공성 매질(210)이 가진 공극 내에 들어가면서 고정될 수 있다. 즉 다공성 매질(210)에의 고정은 액체 상태의 다공성 매질(210) 내에 분산된 이종 세포들(220)이 다공성 매질(210)의 겔화 과정을 통해 다공성 매질(210)의 매트릭스 내에 3차원적으로 고정되는 것이다. 그리하여 액상 매질 내에서는 운동성이 있는 세포들이 겔화 과정을 통해 특정 위치에 고정되므로 관찰 영역 내에서 세포 별로 고정된 위치를 중심으로 각 세포들의 변화를 현미경으로 용이하게 관찰할 수 있게 된다.
다공성 매질(210) 내 공극의 크기는 1nm 내지 수 mm일 수 있다. 상기 공극의 존재로 다양한 이종 세포들(220)이 각각 용이하게 고정될 수 있다. 세포의 크기를 고려할 때 상기 공극의 크기는 바람직하게는 1 내지 100 ㎛일 수 있다.
상기 고형화된 다공성 매질(210)의 형태를 갖는 다공성 매트릭스의 두께는 상기 고정된 이종 세포들의 군집을 현미경을 통하여 관찰할 수 있을 정도면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 수 ㎛ 내지 수 mm의 범위를 가질 수 있다. 상기 샘플과 고정화제의 혼합물을 형성한 후 배양 배지를 공급하며 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 특정 세포만 반응하도록 선택적인 생리 활성 자극을 인가하는 단계를 나타낸 것이다. 선택적인 생리활성 자극(310)은 특정 유전자를 발현시키는 유전 물질, 특정 세포만 선택적으로 자라게 하는 배지, 특정 레이저 파장, 특정 온도, 특정 압력, 특정 화학 물질 및 특정 세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 포함한다. 상기 자극(310)은 지속적으로 가할 수도 있고 시간에 따라 간헐적으로 가할 수도 있다. 상기 자극(310)은 상기 샘플 내의 이종 세포들 일부 또는 전부에 가해질 수 있으며, 바람직하게는 이종 세포들 모두에 가해질 수 있다. 생리활성 자극(310)에 의해 특정한 종류의 세포(320)만이 선택적으로 성장하게 된다.
몇몇 구현예에서 상기 생리활성 자극 이외에 다른 종류의 생리활성 자극을 추가적으로 상기 다공성 매질에 인가할 수 있다. 상기 추가적 생리활성 자극은 원래의 처음의 자극과 동시에 또는 이후에 인가될 수 있다. 예를 들어 특정 세포를 성장시킬 수 있는 영양 배지를 생리활성 자극으로 인가함과 동시에 상기 특정 세포의 성장을 막는 약물을 상기 추가적 생리활성 자극으로 인가하여 상기 특정 세포의 성장을 관찰할 경우 약물에 대한 감수성을 검사할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 선택적 자극에 의해서 배양된 특정세포의 군집을 현미경으로 관찰하는 단계를 나타낸 것이다.
상기 선택적 생리활성 자극에 의해서 세포는 분열을 하게 된다. 분열된 세포는 고정된 상태에서 분열을 하였기 때문에 처음 크기보다 큰 군집을 형성한다. 이것을 현미경(410)으로 관찰하여 크기 변화를 통해 생리활성 자극에 선택적으로 반응한 세포를 구별할 수 있다.
즉 상기 특정 세포의 구별 과정은 상기 특정 세포의 분열에 의해 마이크로콜로니(420)가 형성됨을 관찰하여 수행될 수 있다. 상기 현미경 이미징은 구별하기 원하는 세포의 마이크로콜로니(420)를 관측 가능한 배율에서 수행한다. 통상 세균의 크기가 1~2 ㎛이라 할 때 상기 세균이 수십 내지 수백 개 모이면 관측 가능한 크기가 될 수 있다. 관측 가능한 마이크로콜로니(420)의 크기는 10 ㎛ 이상, 바람직하게는 20 ㎛ 이상, 더욱 바람직하게는 30 ㎛, 더더욱 바람직하게는 50 ㎛ 이상일 수 있다. 마이크로콜로니(420)의 관측 가능한 성장 시간을 고려하면 통상적으로 2 시간 이상, 바람직하게는 3시간 내지 5시간 정도면 특정 세포를 신속하게 구별할 수 있다.
마이크로콜로니(420)의 존재를 명시야 또는 암시야에서 관찰할 수 있으며 바람직하게는 명시야에서 관찰할 수 있다. 상기 세포들은 다공성 매질 내에 공간적으로 고정되어 있으므로, 전 영역을 시간별로 영상화하는 경우 세포의 성장, 분열과 같은 시계열적 변화를 추적할 수 있다.
상기 현미경 이미징은 관찰 영역을 배양 시간별로 영상화함으로써 상기 관찰 영역 내에 존재하는 상기 이종 세포들의 점유 면적의 변화를 시계열적으로 추적하여 수행하는 것일 수 있다. 영상화 과정은 현미경(410)으로 관찰시 CCD(Charge Coupled Device) 방식 또는 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 방식의 카메라를 사용하여 이미지를 얻고 이를 코드화된 프로그램에 의해 디지털 데이터로 변환하는 방식일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이종 세포들의 혼합 샘플에서 특정 세포를 구별하는 방법은 여러 가지 용도로 쓰일 수 있다. 환경에서 채취할 수 있는 시료에서 특정 미생물을 확인하게 되면 그 시료의 오염 정도를 확인할 수 있다. 혈액에서 특정 세균이 있는지 확인하는 방법은 환자의 혈액에서 균의 존재 유무를 빠르게 확인하여 신속하게 처방하는 데 도움이 된다. 또한 혈액 내에 극히 적은 수로 존재 하는 순환 종양 세포를 빠른 시간 내에 고감도로 확인하여 환자의 항암치료의 예후 관측이나 전이 정도를 확인할 수 있다. 또한, 항암제, 항생제 등을 처리하여 관찰할 경우 적합한 치료제를 신속하게 검색할 수 있다. 또한, 특정 유전자를 가진 세포를 확인할 수 있어서 암의 진단이나 돌연변이를 빠른 시간 내에 확인할 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 좀 더 상세히 설명하고자 하나 본 발명의 기술적 사상이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
박테리아 감염된 혈액 샘플로부터 박테리아 구별실험
S. aureus 박테리아에 감염이 된 환자의 혈액을 배양한 샘플을 액상 아가로즈(Invitrogen의 UltraPure agarose)와 혼합한 후 96웰 마이크로 플레이트에 주입하여 박테리아와 혈구세포들을 다공성 물질에 고정하였다. 아가로즈는 36℃ 미만에서 다공성 구조로 고화되었다. 박테리아와 혈구세포가 혼합된 배양샘플을 45℃에서 0.5% 아가로즈와 1:400 부피비로 섞은 후 즉시 마이크로웰 플레이트에 주입하고 25℃에서 1분 안에 고화시켰다. 고화된 아가로즈가 존재하는 웰에 박테리아 세포만의 성장을 위해 균 배양액인 액상의 CAMHB (cation-adusted Mueller-Hinton broth)를 공급하였다. CAMHB 공급 직후 현미경을 통해 아가로즈 내부를 관찰한 후, 마이크로웰 플레이트를 37℃에서 배양하였다. 4시간 배양 후, 다시 아가로즈 내부를 현미경으로 관찰하였다. 현미경 관찰시 CCD 카메라를 사용하여 이미지를 얻은 후 얻어진 이미지들을 가공하여 박테리아 세포 성장을 추적하였다.
이미지 데이터들은 C++로 코드화된 프로그램에 의해 디지털 데이터로 변환되었다. RGB 형식의 가공하지 않은 이미지 데이터를 그레이 형식으로 바꾼 다음 배경 데이터를 지워 노이즈 없이 선명한 데이터를 얻었다. 다음 콘트라스트를 증가시켜 이미지를 이진 형식이 되도록 하였다. C++ 프로그램은 초기 이미지와 4시간 후 배양 후 이미지에서 변화된 부분을 검출한다. 최초 물체가 검출되지 않았던 영역에서 새로운 물체가 검출되거나 최초 검출 시보다 크기가 커진 물체를 검출하여 박테리아 세포로 인식한다.
도 5는 S. aureus 균과 혈구 세포가 혼합된 혈액배양액을 대상으로 선택적 생리활성 자극 인가 전후의 현미경 관찰 결과를 나타낸 것이다. 도 5를 참조하면, 박테리아와 혈구세포의 아가로즈 내 고정 및 박테리아 성장의 추적과정을 나타낸다.
S. aureus 균과 혈구 세포가 혼합된 혈액배양액을 바로 아가로즈에 섞어 S. aureus 균과 혈구세포를 고정한 후 균 배양액을 처리하면, 혈구세포는 성장을 하지 않는 반면, S. aureus는 성장 및 분열을 하여 군집을 형성하는 것을 현미경으로 관찰할 수 있었다. 즉 혈액배양액 내의 이종 세포들 중에서 S. aureus 균이 존재함을 4시간 만에 신속하게 구분이 가능하다.

Claims (8)

  1. (a) 이종 세포들의 혼합물을 함유한 수계 액체의 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 샘플 중 적어도 일부의 양을 채취하여 다공성 매질에 넣어 고정시키는 단계;
    (c) 상기 이종 세포들의 혼합물 중 특정 세포만 성장하게 하는 생리활성 자극을 상기 다공성 매질에 인가하여 상기 특정 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 현미경 이미징을 통해서 상기 특정 세포를 다른 종류의 세포들과 구별하는 단계를 포함하는 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 이종 세포들은 생체 내 또는 자연 환경에서 유래된 것인 특정 세포를 구별하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 다공성 매질에의 고정은 액체 상태의 상기 다공성 매질 내에 분산된 상기 이종 세포들이 상기 다공성 매질의 겔화 과정을 통해 상기 다공성 매질의 매트릭스 내에 3차원적으로 고정되는 것인 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 샘플 제공 후 상기 생리활성 자극의 인가 전에 상기 이종 세포들에 대한 별도의 배양 또는 정제 과정이 생략된 것인 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 특정 세포의 구별 과정은 상기 특정 세포의 분열에 의해 마이크로콜로니가 형성됨을 관찰하여 수행되는 것인 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 현미경 이미징은 상기 마이크로콜로니를 관측 가능한 배율에서 수행하는 것인 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 현미경 이미징은 관찰 영역을 배양 시간별로 영상화함으로써 상기 관찰 영역 내에 존재하는 상기 이종 세포들의 점유 면적의 변화를 시계열적으로 추적하여 수행하는 것인 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
  8. 제 3항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 상기 생리활성 자극과 다른 종류의 생리활성 자극을 추가적으로 상기 다공성 매질에 인가하는 단계를 더 포함하는 이종 세포들의 혼합물로부터 특정 세포를 구별하는 방법.
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