KR20140016896A - 생물학적 물질의 고도로 특이적인 포획 및 방출을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

생물학적 물질의 고도로 특이적인 포획 및 방출을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

하이드로겔 조성물 및 하이드로겔 조성물의 제조방법이 본 명세서에 개시된다. 더 나아가, 마이크로유체 장치에서 조성물을 이용하는 방법을 포함하여, 개시된 하이드로겔 조성물을 사용하여 샘플로부터 생물학적 물질을 특이적으로 포획하고 방출시키는 방법이 개시된다.

Description

생물학적 물질의 고도로 특이적인 포획 및 방출을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR HIGHLY SPECIFIC CAPTURE AND RELEASE OF BIOLOGICAL MATERIALS}
연방정부 지원된 연구 또는 개발
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health) 및 미국국립과학재단(National Science Foundation)으로부터 각각 승인번호 R01-EB009327 및 CBET 0932195 하의 승인을 통해 지원받았다. 따라서, 미국정부는 본 출원에 대해 특정 권리를 가진다.
우선권 주장
본 개시내용은 2011년 2월 3일 출원된 미국 가특허출원 제61/439,166호의 우선원을 주장하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 의학 및 유전자조작에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 분야는 조직공학 및 재생의학에 대한 생물학적 물질, 예컨대 세포의 단리에 관한 것이다.
세포 단리 기법은 성장, 게놈 및 단백질 유전정보(proteomic) 조사를 고려하는, 구체적 집단의 연구에서 필수적인 성분이다. 임의의 표면에 부착된 세포의 분리는 부착에 대한 힘의 규모보다 더 큰 힘의 적용을 필요로 한다. 유체 전단력은 세포 분리를 위한 단순한 방법이 되는 것으로 나타났다. 비록 이 방법이 국소적이고 단순한 세포 방출 방법이지만, 유체 전단에 과도한 노출은 세포 손상 및 생존 능력의 감소를 야기한다. 대안의 접근은 트립신과 같은 효소를 사용하여 포획 표면에 결합된 단백질 리간드를 절단하는 것이다. 그러나, 효소 노출은 세포막 및 당질피질(glycocalyx)의 파괴에 기인하여 형태적 변화를 야기할 수 있는데, 이는 세포 활성의 손실을 유발한다. 더 나아가, 효소 분해는 세포 그 자체의 거동과 화학적 구성 둘 다에 직접적으로 영향을 미쳤다.
세포 단리에서 형광 활성 세포 분류(fluorescent activated cell sorting:FACS) 및 자기 활성 세포 분류(magnetic activated cell sorting: MACS)와 같은 현존하는 기법은 조직공학과 같은 분야에서 단점을 가진다. 통상적인 세포 단리 방법인 FACS는 세포 생존력에 해로울 수 있는 제한된 처리량을 나타낸다. FACs 방법은 다중 복합체에 대해 그것의 능력이 제한되는데, 이는 샘플 처리 시간이 실질적으로 감소되도록 한다.
이런 제한은 세포 환경에 대한 물리적 또는 화학적 동요 없이 미세-규모 장치에서 세포와 같은 생물학적 물질을 포획하고 방출하는 일반적인 기법을 확립하는 것에 대한 필요를 설명한다. 특정 세포에 고 특이성을 가지며, 세포의 거동 및 구성을 변경하지 않고 포획 세포를 방출시키는 표면 및 겔에 대한 필요가 남아있다.
본 개시내용은 세포와 같은 생물학적 물질의 포획 및 방출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 포획은 고도로 특이적이다.
일 양태에서, 개시된 하이드로겔 조성물은 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함한다. 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제와 컨쥬게이트되거나 또는 배합되어 하이드로겔을 형성하고, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함한다. 더 나아가, 본 명세서에 개시된 양태에서, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트된다.
일부 실시형태에서, 분지된 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글라이콜 분자이다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암(arm) 분자이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체(peptidomimetic) 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산이다.
일부 실시형태에서, 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLK1, CD45, CD31, CD34 및 sca-1에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 양태에서, 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고 방출하는 개시된 방법은 수용된 유체에 대한 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함한다. 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하며, 이때 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되거나 또는 배합되어 하이드로겔을 형성한다. 본 명세서에 개시된 특정 양태에서, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트된다. 해당 방법은 하이드로겔에 표적 생물학적 물질을 결합시키는데 효과적인 조건하에 하나 이상의 챔버 내로 표적 및 비표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계 및 방출제를 사용하여 표적 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 샘플로부터 미결합 비-표적 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고, 방출하는 개시된 방법은 수용 유체에 대해 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함한다. 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하는데, 이때 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되어 하이드로겔을 형성한다. 특정 양태에서, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트된다. 더 나아가, 해당 방법은 하이드로겔 조성물에 대해 생물학적 물질을 결합시키는데 효과적인 조건하에서 장치의 제1 챔버 내로 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계 및 방출제를 사용하여 결합된 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 포함한다. 해당 방법은 또한 제2 챔버에서 방출제를 중화시키는 중화제와 방출제를 접촉시키는 단계 및 하이드로겔 조성물로 코팅한 표면을 포함하는 제3 챔버 내로 제2 챔버의 내용물을 제공하는 단계를 포함하되, 하이드로겔 조성물에 대해 표적 생물학적 물질을 결합시키는데 효과적인 조건하에서, 제3 챔버 내 결합제는 (a)에서 사용된 것과 상이한 결합제이다. 추가로, 해당 방법은 방출제를 사용하여 결합된 표적 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 방출된 생물학적 물질에 배양 배지를 첨가하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 상이한 결합제를 (d) 내지 (f)를 사용하여 반복하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 하이드로겔 조성물로부터 방출 후 표적 생물학적 물질을 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법에서 사용된 생물학적 물질은 세포, 단백질, 용질 또는 미립자이며, 방출제는 킬레이트제, 효소 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 세포는 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 전구 세포, 말초혈액 조혈모세포 줄기 세포, 내피 전구 세포, 혈중 종양 세포, 성숙 혈중 내피 세포, 양막 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 장 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 또는 암 줄기 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 샘플로부터 포획된 살아있는 세포이다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법에 사용된 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 시트르산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법은 살아있는 세포를 배양하거나, 검출하거나, 분석하거나 또는 형질전환하는데 효과적인 조건하에서 살아있는 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 하이드로겔 조성물의 제조 방법이 개시된다. 해당 방법은 완충제 중에서 분지된 폴리머 분자를 하나 이상의 결합제와 반응시키는 단계 및 분지된 폴리머-결합제 용액을 적어도 하나의 알긴산 분자와 반응시켜 작용기화된 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함한다. 작용기화된 하이드로겔은 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되고 추가로 적어도 하나의 알긴산 분자에 컨쥬게이트된 각각의 분지된 폴리머 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 분지된 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글라이콜 분자이다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암 분자이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산이다.
일부 실시형태에서, 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLK1, CD45, CD31, CD34 및 sca-1에 대해 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 개시된 마이크로유체 장치는 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 챔버 및 기판을 포함한다. 하나 이상의 챔버는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하며, 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함한다. 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제와 컨쥬게이트되거나 배합되어 하이드로겔을 형성한다. 추가로, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트된다. 또한, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 결합제에 컨쥬게이트된다. 또한 결합된 표적 생물학적 물질을 중화제와 혼합시키기 위한 혼합 챔버가 포함된다. 더 나아가, 특정 양태에서, 하나 이상의 추가적인 표면은 하이드로겔 조성물로 코팅된다. 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하며, 이때 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되어 하이드로겔을 형성한다. 또한, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나는 알긴산 분자에 컨쥬게이트된다. 더 나아가, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나는 단계 (i)의 결합제와 상이한 결합제에 컨쥬게이트된다.
일부 실시형태에서, 개시된 장치의 분지된 폴리머는 폴리에틸렌 글라이콜 분자이다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암 분자이다.
일부 실시형태에서, 개시된 장치에서 사용된 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산이다.
일부 실시형태에서, 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLK1, CD45, CD31, CD34 및 sca-1에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다음의 도면은 단지 예시의 목적을 위해 제시되며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다:
도 1은 항체의 표준 용액(0.1㎎/㎖ 및 0.05㎎/㎖ 항체)과 비교하여 PEG- 및 항체-작용기화된 하이드로겔(겔 II 내지 VII)의 적외선 스펙트럼의 다이어그램 표현을 도시한 도면. 측정이 벌크 측정임을 주의한다.
도 2는 하이드로겔-코팅 마이크로 유체 장치 내에서 접근가능한 항체의 정성적 측정의 다이어그램 표현을 도시한 도면.
도 3a는 PEG- 및 항체-작용기화된 하이드로겔로 코팅된 마이크로유체 장치 내에서 전혈로부터 포획된 내피 전구 세포(endothelial progenitor cell: EPC)의 수율을 나타내는 다이어그램 표현을 도시한 도면.
도 3b는 PEG- 및 항체-작용기화된 하이드로겔로 코팅된 마이크로유체 장치 내에서 전혈로부터 포획된 EPC의 순도를 나타내는 다이어그램 표현을 도시한 도면.
도 4a 내지 c는 상이한 겔 유형에서 구조적 차이를 나타내는 그래프 표현을 도시한 도면. 도 4a에서, 모든 시약(PEG, 항체, 알긴산을 포함)은 겔 유형 II 내지 IV에서 함께 조합된다. 도 4b에서, 겔 유형 V는 2-단계 프로토콜을 이용하는데, PEG, 항체, EDC 및 설포-NHS는 단일의 제1 단계에서 조합된다. 도 4c에서, 겔 유형 VI 내지 VII은 다른 성분과 혼합 전 PEG 및 항체의 사전 혼합 단계를 가진다.
도 5a 내지 c는 마이크로유체 어레이 전- 및 후- 주입되고 방출된 현탁액의 정성적 표현을 도시한 도면. 주입된 집단(도 5a에 도시)은 각 농도에서 칩 내의 고정 효과(도 5b에서 도시)에 기인하여 100,000 내지 200,000 세포/㎖의 농도로 제한된다. 도 5c에서, 세포는 24-웰 플레이트 내로 방출되고, 세포 밀도의 주목할만한 감소가 관찰되었다. 스케일바는 100㎛를 나타낸다.
도 6a 내지 d는 개선된 포획 효율 및 순도 수율을 고려하는 항체-작용기화된 알기네이트의 최적화를 도시한 도면. 도 6a는 샘플 및 조제물이 각각 하나의 변수가 다른 5가지 시나리오로 나뉘어지는 것을 도시한다. 도 6b는 주입된 집단에 대해 이들 시나리오의 순도 수율을 비교한다. 순도%를 정량화하는 것은 주입된(도 6c) 및 방출된(도 6d) 세포에 대해 유세포 분석기를 통해 수행되었다.
도 7a 내지 f는 Wnt3a 단백질의 부재시 풍부화되지 않은 집단에 대해 방출된 세포의 연령 진행을 도시한 도면. 풍부화되지 않은 오가노이드(organoid) 진행(도 7a 내지 c에 의해 도시)은 관련없는 집단으로 둘러싸인 유의하게 더 큰 낭종-유사 오가노이드를 수득하였다. 도 7d 내지 f는 단일 세포 현탁액으로부터 유래된 풍부화된 오가노이드의 4-일 진행을 도시한다. 도 7d는 제2일에 단일 세포의 확장을 도시하고, 도 7e는 제3일에 유발된 과다형성을 도시하며, 도 7f는 제4일에 주위의 분비 아포토시스 세포와 함께 주목되는 작은 내강 형성을 도시한다.
도 8a 내지 d는 Lgr5 기본 배지 구성요소 및 Wnt3a의 존재에서 풍부화된 및 풍부화되지 않은 오가노이드를 도시한 도면. 도 8a는 풍부화되지 않은 집단이 Wnt3a의 존재에서 플레이트 효율의 임의의 증가를 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 도 8c는 주입된 배양물에서 형성된 오가노이드의 대다수가 아포토시스 세포를 은닉하는 낭종-유사 구조를 발현시킨다는 것을 나타낸다. 도 8b는 풍부화된 집단은 더 많은 단일 유래 오가노이드 증식을 유발하는 플레이팅 효율에서 증가가 있다는 것을 나타낸다. 도 8d는 풍부화된 세포가 유사한 시점에 wnt3a 부재 연구 (d)와 유사한 형태를 나타낸다는 것을 보여준다.
도 9a 내지 d는 개시된 마이크로유체 단리 기법이 사용된 후 풍부화된 오가노이드를 도시하는 공초점 압축 이미지를 나타낸다. 도 9c는 구형 오가노이드 내 중공 특성을 나타내는 형성된 내강을 도시한다. 도 9a는 무활동(quiescence)을 나타내는 Sox9 발현을 나타내는 CD24의 정점의 국소화를 도시한 도면. 도 9b는 단리 포획 항체인 GPR49/Lgr5 (b)가 중심 구역 내에서 우세하지만, 발현은 CD24와 비교하여 더 낮다는 것을 도시한다.
도 10a 내지 d는 z-면에서 압축된 풍부화되지 않은 오가노이드 공초점 이미지를 나타낸다. 오가노이드는 배양물에서 4일 후 마트리젤(matrigel)로부터 추출되었다. 아포토시스 세포는 중앙 구역 내에서 주목할 만한 반면(도 10c), 오가노이드의 형태는 구체 및 평면이다. CD24 발현(도 10a)은 중앙 구역에서 다양한 수준의 강도로 정점으로 국소화된다. GPCR49/Lgr5는 화살표 CD24가 발현되는 위치에서 더 낮은 강도로 존재한다. GPCR49/Lgr5 발현의 주목할만한 존재는 CD24 오버레이에 의해 능가되었다(도 10d).
도 11a 내지 d는 다중의 표면 마커에 대해 접착-기반 세포의 마이크로 유체 분리의 일 실시형태를 위한 장치의 순서를 나타낸다. 장치로부터 포획 및 방출 후(도 11a), 세포 발현 마커(1)는 세포 현탁액에 존재하는 에틸렌 다이아민 테트라아세트산(ethylene diamine tetraacetic acid: EDTA)을 중화시키기 위해 염화칼슘 용액이 공동 주입되는 장치 내로 유입된다(도 11b). 장치의 다른 부분(도 11c)은 염화칼슘 용액과 세포 현탁액을 혼합한다. 최종적으로, 도 11d에서 챔버는 마커(2)에 대해 세포를 포획하며, 그 다음에 EDTA 용액의 주입을 사용하여 용리될 수 있다.
도 12는 이중-마커 분리에서 다중 스테이지 포획-방출 장치 시스템의 성능을 나타낸다.
본 발명은 세포와 같은 생물학적 물질의 고도록 특이적인 포획 및 방출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 하이드로겔을 형성하기 위해 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되거나 또는 배합된 다수의 알긴산 분자를 포함하는 하이드로겔 조성물이 개시된다.
일부 실시형태에서, 개시된 방법 및 조성물은 포획 세포를 비파괴적으로 방출하는 추가적인 능력을 지니는 이종성 현탁액으로부터 표적 세포 유형의 선택적 포획을 위한 표면 코팅을 제공한다. 본 명세서에 개시된 조제물 및 기법은 세포와 결합하고, 세포를 방출시키는 능력을 가지지만, 중요한 비-특이적 세포 접착이 되기 쉬운 알기네이트 하이드로겔의 변경된 화학적 조성물을 고려하는데, 이는 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol): PEG)과 같은 분지된 폴리머 또는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 플루오로카본 및 실리콘을 포함하는, 세포 및 단백질 부착을 억제하는 것으로 알려진 화학적 작용기를 지니는 분지된 폴리머를 가진다. 하이드로겔 구조 내로 분지된 폴리머의 함입은 또한 결합제(예를 들어, 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산)에 의한 알기네이트 프레-폴리머의 작용기화를 가능하게 하는 방식으로 수행되어, 포획의 특이성을 제공한다.
일부 실시형태에서, 합성 기법은 마이크로유체 채널과 같은 좁고 막힌 구조 내에서 하이드로겔의 인시츄(in situ) 어셈블리를 위해 설계된다. 본 명세서에 개시된 어셈블리 기법은 특정 유형의 물질에 대한 필요 없이, 임의의 물질로부터 만들어진 채널의 코팅을 가능하게 한다. 전혈로부터 이 접근을 사용하여 포획되고 분리된 세포의 유세포 분석은 과정이 화학적으로 및 생물학적으로 비파괴적이며; 구체적으로는 세포 생존력 또는 표현형 동일성의 변화가 전혀 없거나 거의 없다는 것을 나타내었다. 더 나아가, 하이드로겔 구조 내에서 PEG와 같은 분지된 폴리머의 포함은 공지된 하이드로겔 포획 시스템과 관련된 다수의 문제를 극복한다.
문헌은 전기 퍼텐셜 또는 작은 온도 변화와 같은 외부 자극이 적용될 때 세포 분리를 용이하게 할 수 있는 표면 코팅의 설계를 기재한다. 전자의 예는 전기감응성 화학 작용기를 통해 표면에 결합된 리간드로 이루어진 표면 코팅이다. 전기감응성 퀴논 에스터는 전기 퍼텐셜의 적용 시 락톤으로 화학적 변화를 겪는다. 이 접근은 포획 장치 내로 전극의 포함 및 방출 변수의 주의 깊은 최적화를 필요로 한다. 37℃에서 소수성이고 20℃에서 친수성인 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드)와 같은 열적으로-반응성인 폴리머의 사용은 다른 최근에-기재된 접근이다. 소수성 표면은 세포에 부착되며, 그것의 변형은 거의-완전한 세포 방출을 초래한다.
이러한 방법의 단점은 저유동 상황에서 부착 특이성의 결여 및 37℃의 생리적 온도 미만의 온도로 낮춰지는 잠재적 부작용이다. 알기네이트 하이드로겔은 마이크로유체 시스템에서 세포 포획 및 방출을 위해 사용될 수 있지만, 비-부착 분자에 의한 화학적 변형 없이, 이들 하이드로겔은 비-특이적 세포 및 단백질 부착이 극도로 쉬우며, 고효율의 세포 방출을 갖지 않는다.
본 개시내용의 이점은 수용체-리간드 상호작용을 통한 선택적 포획을 고려한다는 것이다. 더 나아가, 개시된 방법 및 장치는 정지세포(static cell) 배양물에서 또는 유체-기반 세포 분리에서 기판으로부터 표적 세포를 방출시킨다. 본 개시내용은 세포 분리를 위한 기계적, 효소적, 전기적 또는 광학적 계면을 필요로 하지 않는다. 개시된 방법 및 장치는 생물학적 환경에 대한 광대한 물리적 또는 화학적 교란 없이 사용될 수 있다. 반면에 선행 기술은 외부 자극을 필요로 하거나 또는, 예를 들어 세포 환경을 위태롭게 하는 물리적 또는 화학적 교란을 필요로 한다.
본 개시내용은, 예를 들어 줄기 및 전구 세포 집단을 단리시키기 위한 생물학적 물질을 선택적으로 포획하고 방출하기 위해 사용될 수 있다. 단리된 집단은 유전자 조작된 스캐폴드 상에서 시딩을 위해 사용될 수 있다. 유전자조작된 교체 기관 및 재생 의학은 일반적으로 기능적 기관을 생성하는 희귀 세포를 필요로 한다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 본 명세서에 참고로서 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하는 본 명세서로 조절할 것이다. 추가적으로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 방법 및 물질은 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 이하에 기재된다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 특허청구범위에 사용된 특정의 용어는 본 명세서에서 수집된다. 달리 정의되지 않는다면, 본 개시내용에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 개시내용에서 제공되는 그룹 또는 용어에 대해 사용되는 정의는 달리 표시되지 않는다면 개별적으로 또는 다른 그룹의 부분으로서 본 개시내용을 통해 해당 그룹 또는 용어에 적용된다.
본 개시내용에 사용된 용어 "화합물" 및 "화합물들"은 본 개시내용의 화합물 및 이들의 임의의 및 모든 가능한 이성질체, 입체이성질체, 거울상체, 부분입체이성질체, 호변체, 약제학적으로 허용가능한 염 및 용매화합물을 지칭한다.
일반적으로, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용에 개시된 임의의 적절한 성분을 포함하거나, 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지도록 대안적으로 조제될 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 추가적으로 또는 대안적으로 선행기술 조성물에 사용되거나 또는 다르게는 본 명세서의 기능 및/또는 목적의 달성에 필요하지 않은 임의의 구성성분, 물질, 성분, 보조제 또는 종이 회피되거나 또는 실질적으로 없도록 조제될 수 있다.
단수의 용어는 본 개시내용에서 물품의 문법적 대상의 하나 이상의 것(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용된다. 예로서, "구성요소"는 하나의 구성요소 또는 하나 이상의 구성요소를 의미한다.
용어 "또는"은 달리 표시되지 않는다면 본 개시내용에서 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되며, 이와 상호호환적으로 사용된다.
용어 "약"은 본 개시내용에서 주어진 수치적 값 + 또는 - 주어진 수치적 값의 20%를 의미하기 위해 사용된다.
"하이드로겔"은 상대적으로 다량의 물이 존재하는 하나 이상의 분자의 3-차원, 반고체 네트워크이다. 일부 예에서, 하이드로겔은 폴리머일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "폴리머"는 모노머로 구성된 구조이다.
"모노머"는 서로 반응하거나 또는 다른 유형의 모노머와 반응하여 폴리머를 형성할 수 있는 하나 이상의 기를 갖는 분자이다. 모노머의 비-제한적 예는 "비닐"로서 알려진 플라스틱을 제공할 수 있는 비닐 클로라이드이다. 비닐 모노머의 다른 비-제한적 예는 폴리아크릴아마이드 겔로서 알려진 겔을 제공할 수 있는 아크릴아마이드이다.
일반
본 개시내용은 부분적으로 알기네이트 하이드로겔을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 알긴산은 2가의 양이온으로 존재한다. 이러한 조성물은 킬레이터의 존재에서 용이하게 분해가능하다. 추가로, 현재 개시된 하이드로겔은 생체적합하며, 세포-부착 분자에 의해 작용기화(즉, 컨쥬게이트)될 수 있다. 알기네이트 하이드로겔은 결합제에 의해 작용기화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "결합제"는 다른 분자 또는 복합체 구조에 결합되는 분자를 의미한다. 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 및 핵산을 포함한다. 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLK1, CD45, CD31, CD34, sca-1 및 다양한 다른 단백질에 대해 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
알기네이트 하이드로겔은 또한 폴리에틸렌 글라이콜("PEG")과 같은 분지된 폴리머 또는 세포 및, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 플루오로카본 및 실리콘을 포함하는, 단백질 부착을 억제하는 것으로 알려진 화학적 작용기를 지니는 분지될 폴리머를 포함할 수 있다. PEG는 결합제에 컨쥬게이트되거나 또는 배합될 수 있다(즉, 작용기화될 수 있다). 추가로, PEG는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되거나 또는 배합되어 하이드로겔을 형성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 하이드로겔은 각 암의 말단에서 주요 아민 종결을 지니는 4-암 PEG 분자를 이용한다. 4-암 PEG 분자는 알긴산, 결합제 또는 링커와 같은 다른 작용제에 의한 작용기화를 위해 4개의 부착 지점을 가진다. 특정 실시형태에서, 각각의 4-암 PEG 분자 중 하나의 암은 알기네이트 하이드로겔 백본에 대한 카복실산 기에 결합되고, 결합제에 의한 작용기화를 위해 3개까지의 1차 아민 기를 이탈한다. 4-암 배열은 하이드로겔의 결합제(예를 들어, 항체) 함량의 3배를 고려하며, 비-페길화된(PEG-y-lated) 알기네이트 하이드로겔에 비해 비-특이적 세포 결합에 대한 보호를 제공한다.
추가로, 방법은 본 명세서에 개시된 하이드로겔의 제조에 대해 개시된다. 하이드로겔 조성물의 제조방법은 완충제 중에서 폴리에틸렌 글라이콜 분자를 하나 이상의 결합제와 반응시키는 단계 및 폴리에틸렌 글라이콜-결합제 용액을 적어도 하나의 알긴산 분자와 반응시켜 작용기화된 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하되, 작용기화된 하이드로겔은 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되고, 추가로 적어도 하나의 알긴산 분자에 컨쥬게이트된 폴리에틸렌 글라이콜 분자의 각각을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법은 PEG 분자와 같은 분지된 폴리머에서 적어도 하나의 부착지점이 알기네이트 겔 매트릭스와 결합을 위해 이용가능하고, 항체와 같은 결합제에 의한 작용기화를 위해 적어도 하나의 다른 부착 지점을 이탈하는 것을 보장한다. 항체는, 이하에 제한되는 것은 아니지만, GPR49, LGR5, CD24, FLKl, CD45, CD31, CD34, sca-1 및 다양한 다른 단백질에 대해 항체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 해당 방법은 항체와 같은 결합제에 알긴산을 컨쥬게이트하는 단계 및 PEG와 같은 분지된 폴리머에 항체/알긴산 컨쥬게이트를 제공하여 하이드로겔을 형성하는 단계를 수반한다. 알긴산-항체 컨쥬게이트는 아민-종결된 PEG 분자와 반응된다. 특정 실시형태에서, 아민-종결된 PEG 분자는 4-암 PEG 분자이다. 다른 실시형태에서, 결합제, 항체 및 PEG는 항체/알긴산/PEG 하이드로겔을 만들기 위해 동시에 반응된다. 또 다른 실시형태에서, PEG 및 결합제는 컨쥬게이트된다. 이들 실시형태에서, 컨쥬게이트는 알긴산과 반응된다.
일부 양태에서, 해당 방법은 플루오렌일메틸옥시카보닐(fluorenylmethyloxycarbonyl: FMOC) 기와 같은 보호기를 이용하여 1차 아민 기에 대한 결합제 컨쥬게이션을 거쳐서 제어를 달성하는 단계를 추가로 포함한다. 해당 방법은 또한 장치의 내부 표면을 코팅하기 위해 마이크로 유체 장치에 항체/알긴산/PEG 하이드로겔을 첨가하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 하이드로겔은 인시츄로 형성되고, 장치의 하나 이상의 챔버의 내부 표면을 코팅하도록 한다.
또한 본 명세서에 개시된 마이크로유체 세퍼레이터를 사용하여 복합체 배지로부터 세포를 분리시키는 방법이 개시된다. 일 양태에서, 개시내용은 기판을 포함하는 마이크로유체 장치; 및 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하되, 하나 이상의 챔버는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하고, 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 폴리에틸렌 글라이콜 분자를 포함하며, 이때 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 다수의 기를 포함하며, 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되며, 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 결합제에 컨쥬게이트된다. 본 명세서에 개시된 장치는 결합된 표적 생물학적 물질을 중화제와 혼합하기 위한 혼합 챔버 및 하이드로겔 조성물로 코팅된 하나 이상의 추가적인 표면을 추가로 포함한다. 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 폴리에틸렌 글라이콜 분자를 포함하며, 이때 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트된다. 더 나아가, 각각의 폴리에틸렌 글라이콜 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 단계 (i)의 결합제와 상이한 결합제에 컨쥬게이트된다.
개시된 장치에서 다양한 기판이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당 기판은 실리카-함유 재료(예를 들어, 유리, PDMS)이다. 일부 실시형태에서, 기판은 폴리머 재료(생체적합한 재료와 생체적합하지 않은 재료 둘 다)이고, 폴리머는 그 자체에 결합되거나 또는 다른 실리카 기판에 결합된다. 일부 실시형태에서, 기판은 섬유-강화 플라스틱을 포함하는, 에폭시와 같은 열경화성 수지이다. 일부 실시형태에서, 기판은 금속(예를 들어, 금, 은, 백금, 구리, 알루미늄); 금속 합금; 금속 산화물(산화구리, 산화알루미늄, 산화은, 산화 인듐 주석 등); 이하에 제한되는 것은 아니지만, 반도체 및 자성재료를 포함하는 무기 재료이다. 일부 실시형태에서, 기판은 실리카, 폴리머, 금속 또는 본 명세서에 기재된 무기 재료의 조합이다.
당업계에 공지된 마이크로유체 장치는 본 명세서에 개시된 방법에 대해 이용될 수 있다. 해당 방법은, 예를 들어 혈관 조직공학 또는 생체내 혈관 조직의 세포기반 재생 회복에서 이후의 사용을 위해 혈액으로부터 EPC를 분리시키는데 사용될 수 있다. 해당 방법은 알긴산/PEG 하이드로겔이 인시츄로 마이크로유체 장치에서 형성되도록 하는 단계를 수반한다. 해당 방법은 샘플을 장치에 제공하는 단계 및 특정 세포 유형과 같은 표적 생물학적 물질을 포획하기 위해 결합제를 하이드로겔에 컨쥬게이션시키는 단계를 추가로 수반한다. 샘플은 장치를 통과하게 되며, 방출제를 사용하여 포획된 세포는 방출된다. 특정 실시형태에서, 방출제는, 예를 들어 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediammetetraacetic acid: EDTA), 에틸렌 글라이콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid: EGTA) 및 시스트산 나트륨과 같은 킬레이트제를 포함하는 방출 완충제이다. 이들 실시형태에서, 샘플은, 이하에 제한되는 것은 아니지만, 전혈, 혈청, 침, 림프, 담즙, 소변 및 임의의 다른 생물학적 유체를 포함한다.
일부 양태에서, 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고 방출시키는 방법은 유체를 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하되, 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함한다. 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하며, 이때 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 분지된 폴리머 분자의 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트된다. 더 나아가, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트된다. 해당 방법은 하이드로겔 조성물에 대해 표적 생물학적 물질을 결합시키고, 방출제를 사용하여 표적 생물학적 물질을 방출시키기에 효과적인 조건하에서 하나 이상의 챔버 내로 표적 및 비-표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플로부터 미결합 비-표적 물질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고 방출시키는 방법은 (a) 유체를 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계를 포함하되, 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 적어도 하나의 표면을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하이드로겔 조성물은 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하되, 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트된다. 더 나아가, 해당 방법은 (b) 하이드로겔 조성물에 생물학적 물질을 결합시키기에 효과적인 조건하에서 장치의 제1 챔버 내로 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계; (c) 방출제를 사용하여 결합된 생물학적 물질을 방출시키는 단계; 및 (d) 제2 챔버에서 방출제를 중화시키기 위해 방출제를 중화제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 해당 방법은 (e) 하이드로겔 조성물에 표적 생물학적 물질을 결합시키기에 효과적인 조건 하에서, 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하는 제3 챔버 내로 제2 챔버의 내용물을 제공하되, 제3 챔버 내 결합제는 (a)에서 사용된 것과 상이한 결합제인 단계; 및 (f) 방출제를 사용하여 결합된 표적 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 수반한다.
도 11 a 내지 d는 다중 챔버를 사용하는 장치 및 방법을 도시한다. 도 11a 내지 d에서, 샘플은 제1 알기네이트-기반 포획 스테이지 내로 주사기 펌프를 통해 주사되었다("마커 1 단리"/도 11a). 이 스테이지는 2-방향 밸브인 스테이지 B에 연결되었다. 그것의 "폐쇄된" 구성에서, 이 밸브는 스테이지 A로부터의 폐기물이 수집 튜브를 통과하도록 한다. 폐기물이 통과된 후, 폐기물 스트림은, 예를 들어 핀치 밸브를 사용하여 폐쇄되었다(도 11b). 염화칼슘의 목적은 스테이지로부터 나타나는 세포 현탁액 중에서 EDTA를 중화시키는 것이다(도 11a). 염화칼슘 용액과 이 세포 현탁액의 혼합을 보장하기 위해서, 조합된 결과물(이는 층류에 있음)은 헤링본(herringbone) 특징을 함유하는 혼합 챔버(도 11c) 내로 보내졌다. 그 다음에 혼합된 용액은 제2 포획 분자에 대한 세포 발현 수용체가 포획되는 스테이지로 유입되었다(도 11d). 분리 과정의 최종 단계는 스테이지 A(도 11a) 주입구 내로 EDTA 용액의 주입이었는데, 이는 스테이지 B(도 11b)로부터 포획된 세포를 방출시킨다. 이 용액은 과량의 배양 배지를 함유하는 튜브 내에서 수집되어 세포 상에서 EDTA의 어떤 해로운 효과를 최소화한다.
일부 실시형태에서, 해당 방법은 방출된 생물학적 물질에 배양 배지를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (d) 내지 (f)는 상이한 결합제를 사용하여 반복될 수 있다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 하이드로겔 조성물로부터 방출 후 표적 생물학적 물질을 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 해당 방법은 살아있는 세포를 포함하는 세포를 배양하거나, 검출하거나, 분석하거나 또는 형질전환하는데 효과적인 조건 하에서 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는, 이하에 제한되는 것은 아니지만 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 전구 세포, 말초혈액 조혈모세포 줄기 세포, 내피 전구 세포, 혈중 종양 세포, 성숙 혈중 내피 세포, 양막 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 장 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 암 줄기 세포를 포함하는 희귀 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 샘플로부터 포획된 살아있는 세포이다. 일부 실시형태에서, 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 시트르산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
도 4a 내지 c는 하이드로겔의 생성을 위한 다양한 합성 방법을 도시한다(지정된 겔 유형 I 내지 VII). 겔 유형 II 내지 VII로부터 EPC 포획 수율 및 순도의 점진적인 개선을 나타낸다. 도 4a에서, 모든 시약(PEG, 항체, 알긴산을 포함)은 겔 유형 II 내지 IV에서 함께 조합된다. 도 4b에서, 겔 유형 V는 2-단계 프로토콜을 이용하는데, 이때 PEG, 항체, EDC 및 설포-NHS는 단일의 제1 단계에서 조합된다. 도 4c에서, 겔 유형 VI 내지 VII은 다른 성분과 혼합되기 전 PEG 및 항체와 사전-혼합된다. 사전-혼합으로 PEG 쇄 중에서 항체 분자를 최적으로 분산시킨다.
항-CD34 항체의 부착 효과는 겔 유형 I 및 II를 비교하는 것에 의해 명백하다(도 3a). 도 3a 내지 b는 헤파린 튜브에 수집된 300㎕의 전혈이 개개의 마이크로유체 장치 내로 직접 주입되고, 10개의 장치가 동시에 실행된 후 결과를 도시한다. 각 장치로부터 방출된 세포를 단일 현탁액 내로 풀링시켜, 유세포 분석기에 의해 열거하도록 하였다. 보고된 데이터는 3㎖의 전체 혈액 부피로부터 회수된 EPC에 대한 수율 및 순도를 나타낸다. 에러바는 EPC의 3회의 독립적 측정에 기반한 표준 편차 및 동일 샘플에 의해 만들어진 전체 세포 수를 나타낸다. 10k MW PEG(겔 유형 II 대 IV)의 함입에 의해 증가된 수율 및 순도가 관찰되었다. 개시된 방법 및 조성물은 또한 입체적 힘과 같은 크기 제한이 세포 결합 효율에 영향을 미치지 않는다면, 20k MW PEG뿐만 아니라 다른 분자량 PEG 분자와 함께 사용될 수 있다.
도 4b에서, 합성의 제1 단계는 제2 단계에서 알긴산의 첨가 전 커플링제 EDC 및 설포-NHS와 PEG 및 항체의 조합이다. 겔 유형 IV에 대해, 겔 유형 V는 약간 더 큰 EPC 포획을 제공하지만, 더 낮은 정도의 산란(scatter)을 지니는데, 이는 PEG와 항체 분자의 더 양호한 혼합을 표시한다. 겔 유형 V의 접근가능한 항체 함량은 겔 유형 IV의 항체 함량과 유사하고(도 2), 이는 더 양호한 PEG-항체 혼합이 특징적 인자라는 것을 입증한다. 도 2에서, 바이신코니닌산(bicinchoninic acid: BCA) 분석 키트를 이용하여 각 장치를 통해 유동되는 용액에 접근가능한 상대적 양의 항체를 측정하였다. 더 낮은 흡광도는 더 많은 양의 접근가능한 항체와 관련된다. 에러바는 각 겔 유형에 대해 8회의 독립적 측정에 기반한 표준 오차를 나타낸다. 더 양호한 혼합은 또한 하이드로겔 표면 상에서 PEG 및 항체 분자를 더 효과적으로 배치시키는데, 이는 더 높은 EPC 순도가 겔 유형 IV에 비해 겔 유형 V에 의해 얻어지는 것과 일치된다. PEG- 및 항체-작용기화된 알긴산 용액에서 PEG 입자는 거의 관찰되지 않았는데, 이는 더 양호한 PEG-항체 혼합과 일치된다.
겔 유형 VI 및 VII에 대한 2-단계 합성 프로토콜은 EDC 및 설포-NHS의 존재를 제한하지 않고 '영향을 받지 않는' 혼합을 위해 항체 및 PEG 분자에 대한 시간을 제공함으로써 사전-혼합되도록 한다. 사전-혼합이 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 필수적으로 필요하지는 않지만, 겔 유형 VI 및 VII를 겔 유형 V와 비교할 때 알 수 있는 바와 같이, 더 긴 혼합 시간은 수율 및 순도에 관해서 EPC 포획 성능을 개선시킬 수 있다. 겔 유형 VI에 비해 겔 유형 VII에 대해 더 긴 혼합 및 인큐베이션 시간이 제공되며, 양호한 수율(~104 EPC가 회수됨) 및 순도(74%)도 마찬가지로 제공된다.
동등물
당업자는 본 명세서에 기재된 구체적 실시형태에 대해 단지 일상적인 실험, 수많은 동등물을 사용하는 것을 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 동등물은 다음의 특허청구범위의 범주에 포함되는 것으로 의도된다.
실시예
실시예 1 - 마이크로유체 포획 및 방출 설계
실시예 1은 세포와 같은 생물학적 물질의 고도로 특이적인 포획 및 방출을 위한 방법 및 조성물을 기재한다.
재료 및 기기
유리 슬라이드, EDC, 설포-NHS, EDTA, MES 완충제, 마이크로 바이신코니닌산(bicinchoninic acid: BCA) 단백질 분석 키트 및 헤파린 진공 튜브를 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(뉴저지주 페어론에 소재)으로부터 구입하였다. 마이크로유체 장치 제작을 위해, SU-8 포토레지스트 및 현상액을 마이크로켐(MicroChem)(매사추세츠주 뉴턴에 소재)으로부터 얻었고; 실리콘 탄성중합체 및 경화제를 다우 코닝(미시간주 미들랜드에 소재)으로부터 얻었다. 인산염-완충 식염수(Phosphate-buffered saline: PBS; 1X, 칼슘 또는 마그네슘 없음)를 메디아테크(Mediatech)(버지니아주 헌던에 소재)로부터 구입하였다. 포획 항체, 단클론성 마우스 항-인간 CD34 및 염소 항-인간 FLK-1을 산타 크루즈 바이오테크놀로지(캘리포니아주 산타크루즈에 소재)로부터 얻었다. 항-인간 CD133-PE, 항-인간 CD45-FITC 및 항-염소 IgG-PerCP 항체를 이바이오사이언스(eBioscience)(캘리포니아주 샌디에고에 소재)로부터 얻었다. 토끼 IgG를 벡터 랩스(Vector Labs)(캘리포니아주 벌링게임에 소재)로부터 구입하였다. 염화칼슘 2수화물 및 알긴산을 시그마(Sigma)(미주리주 세인트 루이스에 소재)로부터 구입하였다. 10,000(10k MW) 및 20,000(20k MW)의 분자량을 지니는 아민-종결된 4-암 PEG(PEG-NH2)를 레이산 바이오(Laysan Bio)(앨라배마주 아랍에 소재)로부터 구입하였다.
마이크로유체 세포 포획 장치 설계
장치는 문헌[Nagrath et al, Nature, 450 (7173), 123-U10 (2007)]에 의해 사용된 것과 유사한 포스트 어레이 설계를 사용하였다. 유체 스트림의 붕괴를 달성하고, 최적의 포획을 달성하기 위해, 포스트를 문헌[Gleghorn et al, Lap Chip, 10(1), 27-29 (2010)]에 기재된 것과 같은 6각형 레이아웃으로 배열하였다. 포스트는 100㎛의 직경 및 센터 간에 150㎛의 횡방향 간격을 가졌다. 행은 중심 간에 125㎛의 간격을 가지며, 각각은 50㎛만큼의 오프셋이 있다. 포스트 어레이의 길이는 0.7 ㎝이고 폭은 0.5 ㎝이다. 포스트 높이는 이하에 기재하는 바와 같이 소프트 리소그래피에 의해 제작된 장치에 대해 대략 50㎛이었다.
폴리(다이메틸 실록산)(poly(dimethyl siloxane): PDMS) 장치 제작을 위해, 실리콘 탄성중합체 및 경화제를 10:1(w/w) 비로 혼합하였고, 네거티브 마스터(negative master) 웨이퍼의 상단에 부었으며, 탈기시키고, 65℃에서 밤새 경화시켰다. 그 다음에 PDMS 레프리카(replica)를 웨이퍼에서 빼낸 후 19-게이지 블런트-노즈(blunt-nose) 바늘로 주입구 및 배출구 구멍을 뚫었다. 레프리카 및 유리 슬라이드를 PX-250 플라즈마 챔버 내 산소 플라즈마(30초 동안 8% 산소로 100 mW)에 노출시켰고, 즉시 서로 접촉되게 두었다. PDMS와 유리 사이의 비가역적 결합은 65℃에서 5분 동안 소성시킴으로써 완료되었다.
PEG /항체- 작용기화된 하이드로겔 합성
7가지 상이한 하이드로겔 조제물을 이 연구에서 조사하였고, 이들을 겔 유형 I 내지 VII로서 지정한다. 겔 유형 I에 대해, 45㎎의 알긴산, 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS 및 20㎕ 비활성 IgG(1 g/㎖)를 2 ㎖의 MES 완충제 용액에 첨가하였고, IKA 울트라 튜락스 튜브 분산기(Ultra Turrax Tube Disperser)를 사용하여 29분 동안 혼합하였고, 60분 동안 인큐베이션시켰다. 겔 유형 II에 대해, 45㎎의 알긴산, 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS 및 100㎕ 항-인간 CD34(200㎍/㎖)를 2 ㎖의 MES 완충제에 첨가하였고, 앞에서와 같이 혼합하였으며, 60분 동안 인큐베이션시켰다. 겔 유형 III에 대해, 45㎎ 알긴산, 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS, 22.5㎎ 20k MW PEG 및 100㎕ 항 양 CD34를 2 ㎖의 MES 완충제에 첨가하였고, 29분 동안 혼합하였으며, 60분 동안 인큐베이션시켰다. 45㎎ 알긴산, 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS, 22.5㎎ 10k MW PEG, 및 100㎕ 항 양 CD34으로 이루어진 겔 유형 IV를 2 ㎖의 MES 완충제에 첨가하였고, 29분 동안 혼합하였으며, 60분 동안 인큐베이션시켰다. 2 ㎖의 MES 완충제 중에서 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS, 22.5㎎ 10k MW PEG 및 100㎕, 항 양 CD34를 29분 동안 혼합한 다음 45㎎의 알긴산을 첨가한 후, 29분 혼합하고 60분 인큐베이션 시킴으로써 겔 유형 V를 만들었다. 2 ㎖의 MES 완충제 중에서 22.5㎎ 10k MW PEG와 100㎕ 항체를 혼합하고, 각각 10분 및 29분 동안 혼합하며, 추가적으로 각각 15분 및 60분 동안 인큐베이션시킴으로써 겔 VI 및 VII을 형성하였다. 4.8㎎ EDC, 13.2㎎ 설포-NHS 및 45㎎ 알긴산을 혼합물에 첨가하였고, 29분 동안 혼합하였으며, 60분 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 단계 후, 각 겔 유형에 대해 각각의 작용기화된 알긴산 용액을 슬라이드-에이-라이저(Slide-A-Lyzer) 투석 카세트 10,000 분자량 컷오프(피셔(Fisher)) 내로 주입하였고, MES 완충제에 대해 48시간 동안 투석하여 미반응 설포-NHS 및 EDC를 제거하였다. 표 1은 각 겔 유형에 대해 합성 단계 및 성분을 요약한다. 단계 1 및 2는 각각의 시약에 대한 조합에 따르는 프로토콜의 순차적 특성을 나타낸다.
Figure pct00001
적외선 분광학
작용기화된 알긴산 샘플을 스패튤러를 사용하여 폴리(테트라플루오로에틸렌)(PTFE) 샘플 카드(뉴저지주 가필드에 소재한 크리스탈 랩스(Crystal Labs)) 상에 펼쳤고, 4시간 동안 걸쭉해지게 하였다. 그 다음에 카드를 펌킨 엘머(Perkin Elmer) 1000 퓨리에-변환 적외선(Fourier-transform Infrared: FTIR) 분광기 내로 삽입하였다. 638 ㎝-1에서 흡광도를 분석하였고, 각 겔 유형과 비교하였다. 항체 분자가 PEG-NH2와 성공적으로 컨쥬게이션될 때 형성된 아마이드 결합과 관련된 이 피크는 하이드로겔 내 항체 부하의 측정이다.
마이크로유체 장치 내의 인시츄 하이드로겔 형성
탈이온수 중의 CaCl2의 1 g/㎖ 용액을 각 장치에 주입하였고(수동으로, 1 ㎖ 주사기를 사용하여), 밤새 인큐베이션시켰다. 그 다음에 CaCl2 용액을 수동으로 1 ㎖ 주사기를 사용하여 회수하였다. 각 겔 유형에 대해 준비한 PEG- 및 항체-작용기화된 알기네이트 용액을 수동으로 장치 내로 주입하였고, 1시간 동안 흡착시켰다. 다음에, 장치를 10㎕/분에서 10분 동안 하버드 애퍼래터스(Harvard Apparatus) PHD 2000 주사기 펌프(매사추세츠주 홀리스턴에 소재)를 사용하여 MES 완충제로 세정한 다음, 10㎕/분에서 10분 동안 MES 완충제 중의 100mM CaCl2 용액으로 세정하여 마이크로채널의 벽 상에서 얇은 하이드로겔 층을 형성하였다. 최종적으로, 장치를 5㎕/분에서 10분 동안 MES 완충제로 세정하여 미반응 CaCl2를 제거하였다.
BCA 단백질 분석
BCA 단백질 분석 용액을 제조업자 설명서에 따라 제조하였다. 그 다음에 용액을 5㎕/분에서 40분 동안 각 장치 내로 주입하였다. 결과물을 마이크로플레이트 내에서 수집하였고, 바이오테크 파워웨이브(Bio-Tek Powerwave) XS 분광기를 사용하여 562㎚에서 흡광도를 측정하였다.
채혈
노스이스턴 유니버시티 임상시험심사위원회(Northeastern University Institutional Review Board)에 의해 승인된 프로토콜 하에 건강한 지원자로부터 인간 전혈을 헤파린 수집 튜브에 회수하였다.
EPC 포획 실험
전혈을 5㎕/분에서 60분 동안 마이크로유체 포획 장치 내로 주입하였다. 그 다음에 각 장치를 10㎕/분으로 5분 동안 MES 완충제에 의해 세정하였다. 포획한 세포의 방출을 위해, PBS 중에서 EDTA의 50mM 용액을 10㎕/분로 10분 동안 주입하였고, 배출물을 1.5 ㎖ 마이크로원심분리기 튜브 내로 수집하였다. 각각의 개별 실험은 10 마이크로유체 장치를 포함하였다. 각 장치에 300㎕의 혈액을 상기 구체화한 속도로 통과시켰다. 각 장치로부터 방출시킨 세포를 단일 현탁액 내로 풀링시켜 유세포 분석기에 의해 열거되도록 하였다. 도 3a 내지 b에서 보고한 데이터는 전체 3㎖의 혈액 부피로부터 회수한 EPC에 대한 수율 및 순도를 나타낸다.
유세포 분석기
EPC 열거를 위해, 각 장치로부터 방출된 세포를 각각 10㎕의 항-인간 CD 133 PE, 항-인간 CD45 FITC, 항-염소 FLK-1 및 항-염소 IgG PerCP와 혼합하였다. 혼합물을 30분 동안 암실에 저장하였고, 130 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 디캔팅시켰고, 세포를 벡크만 쿨터 셀 랩 퀀터(Beckman Coulter Cell Lab Quanta) SC 유세포 분석기를 사용하여 열거를 위해 PBS 중의 200㎕에서 현탁시켰다. CD133+, CD45- 및 FLK-1 +인 세포를 EPC로서 카운팅하였다.
결과
도 1은 1- 또는 2-단계 합성 프로토콜로부터 나타나는 작용기화된 알긴산 용액 내에서 항체 로딩의 정량화를 위한 적외선 분광학 데이터를 나타낸다. 알려진 항-CD34 농도의 표준 용액과 비교할 때, 모든 알긴산 용액은 0.05 내지 0.06㎎/㎖의 유사한 항체 함량을 가진다.
도 2는 BCA 분석 키트를 사용하여 만들어진 상대적 전체 단백질 측정을 나타낸다. BCA 용액은 항체와 같은 단백질과 접촉하게 됨에 따라 더 투명해진다. 따라서, 하이드로겔-코팅된 마이크로유체 장치를 통해 이 용액을 유동시킴으로써, 각 겔 유형 상에서 접근가능한 항체의 양을 비교할 수 있다. 장치를 나간 용액의 단백질 함량은 도 2에서 겔 유형의 기능으로서 나타내며, 캘리브레이션된 질량 또는 농도보다는 오히려 임의의 단위의 흡광도로 표현한다. 상대적 측정으로 각 겔 유형 사이의 접근가능한 항-CD34 포획 항체를 비교한다. 도 2는 겔 유형 I 내지 VII로부터 접근가능한 항체의 증가를 보여주지만, 혼합물에 첨가된 항체의 전체 양은 일정하게 남아있는데(도 1), 이는 겔화된 표면과 항체 사이의 컨쥬게이션 효율의 증가를 나타낸다.
도 3은 하이드로겔-코팅된 마이크로유체 장치를 사용하여 전혈로부터 EPC의 포획에 대한 수율 및 순도 데이터를 나타낸다. 도 3a에서, 겔 유형 I은 그것에 컨쥬게이션된 비활성 항체를 가지며, 예상한 바와 같이 무시해도 될 정도의 EPC 부착을 나타낸다. 항-CD34 항체를 함유하는 겔 유형 II는 높은 정도의 산란을 가질 지라도, 겔 유형 I에 비해 상당히 더 높은 EPC 접착을 나타낸다(p < 0.005). 그러나, 겔 유형 II로 달성된 포획의 순도는 상대적으로 낮다(~23%; 도 3b). 하이드로겔 구조에 4-암 PEG를 첨가하는 것의 효과는 겔 유형 II를 IV와 비교함으로써 명확하게 나타나며, 그 외에 전체 합성 프로토콜은 동일하다. 4-암 10k MW PEG 분자의 분지된 아민 말단은 더 큰 전반적인 EPC 부착에서 반영되는 바와 같이 더 큰 수준의 항체 컨쥬게이션에 대한 기회를 제공한다(도 3a). 비-특이적 결합의 억제는 순도의 증가를 초래한다(도 3b; 겔 유형 IV). 흥미롭게도, 20k MW PEG(겔 유형 III)의 사용은 동일 합성 조건 하에서 10k MW PEG(겔 유형 IV; p < 0.005)에 비해 상당히 더 낮은 EPC 포획 수율을 초래하며, 순도는 비슷하다.
겔 유형 V 내지 VII에서, 조합 시약에 대한 2단계 프로토콜을 따른다. 겔 유형 V에서, 4-암 PEG에 항체 분자의 컨쥬게이션을 알긴산을 도입하기 전 먼저 수행한다. 이 조제물은 겔 유형 IV에 비해 EPC 포획의 수율 및 순도가 개선되었다. EDC 및 설포-NHS가 알긴산에 의한 제2 단계에 첨가되고, 제1 단계는 PEG 및 항체와 함께 혼합되는 것으로 제한되도록 2-단계 프로토콜을 변형시켰다. 제1 단계에 대해 혼합 및 인큐베이션에 짧은 시간이 제공될 때(겔 유형 VI에 대해 각각 10분 및 15분), 수율은 겔 유형 V에 비해 개선되지 않았지만, 순도는 더 높았다. 더 높은 혼합 및 인큐베이션 시간을 다음에 시험하여(겔 유형 VII에 대해 각각 29 및 60분) 항체 분자와 PEG 분자의 더 큰 혼합 및 얽힘(entanglement)을 달성하였다. 이 조제물은 겔 유형 VI 및 VII에 비해 상당히 더 높은 수율 및 순도를 제공하였다(각각 p <0.005 및 p < 0.01).
실시예 2 - GPR49 / Lgr5 를 사용하는 줄기 세포의 마이크로유체 포획 및 방출
수용체
실시예 2는 2가지의 결합제, 구체적으로 GPR49 및 Lgr5 항체 수용체를 사용하는 장 줄기 세포의 마이크로유체 포획 및 방출을 위한 장치 및 방법을 개시한다.
장 시스템 내의 조사중인 다중-효능 및 조용한(quiescent) 줄기 세포에 대한 푸쉬는 최근 우세하였다(David, H.S. et al., Current View: Intestinal Stem Cells and Signaling. Gastroenterology 2008, 134 (3), 849-864.; Montgomery, R. K. et al., Promininl (CD 133) as an Intestinal Stem Cell Marker: Promise and Nuance. Gastroenterology 2009, 136 (7), 2051-2054.). 그러나, 현존하는 방법은 혼성화된 마우스 모델 및 형광 마커에 의존하였다. 이 개시내용은 형광 마커 및 친화도 포획과 결합된 마이크로유체를 수행함으로써 세포 분류기에 대한 필요를 피한다.
장 줄기 세포를 특성규명하고 확인하는 것은 소화기학 커뮤니티 내의 다수의 정밀조사 하에 있었다. (Sangiorgi, E., et al., Bmil is expressed in vivo in scrutinys. Nat Genet 2008, 40 (7), 915-920; Snippert, H. J. et al, Prominin-1/CD133 Marks Stem Cells and Early Progenitors in Mouse Small Intestine. Gastroenterology 2009, 136 (7), 2187-2194; Bjerknes, M. et al., Intestinal epithelial stem cells and progenitors. Method Enzymol 2006, 419, 337-383; Barker, N., et al, The intestinal stem cell. Gene Dev 2008, 22 (14), 1856-1864).
이들 세포가 음와 영역(crypt zone) 내 체류하는 경우의 상충되는 모델은 +4 표지 보유 세포(Label retaining cell: LRC) 모델 및 음와 기반 컬럼 세포(crypt based columnar cell: CBC) 모델에 구속되었다. 최근까지, 장 줄기 세포 집단에 대한 특성규명 마커는 BMI-1, 무사시(Mushashi)-1 및 세포내 구역으로 제약된 다른 조용하고 활성인 사이클링 마커에 의존하였다. 베이커(Barker) 등은 류신 결합된 G-단백질 수용체(Lgr5)로서 공지된 수용체에서 활성 주기 장 줄기 세포 체류를 위해 암호화하는 유전자를 발견하였다(Barker, N., et al., Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature 2007, 449 (7165), 1003-U1). 혼성화된 마우스에서 이들 유전자의 과발현은 GFP-FACS 분류와 커플링되었는데, 이는 개발된 시험관내 배양 시스템 및 이들 세포 유형의 게놈 분석을 고려한다. 문헌[Sato, T., et al, Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009, 459 (7244), 262-U147]. 상업적으로 입수가능한 항체를 이용하는 것은 Lgr5 수용체를 표적화하는 이들 줄기 세포 서브타입의 세포밖 염색을 고려한다. (Olsen Hult, L. T., et al., EP Receptor Expression in Human Intestinal Epithelium and Localization Relative to the Stem Cell Zone of the Crypts. PLoS One 2011, 6 (10), e26816). 이들 항체를 실행하는 것은 야생형 래트 조직으로부터 항체에 의해 작용기화된 알기네이트를 이용하는 이들 표적 세포의 선택적 포획 및 방출을 고려한다.
정반대로, 이들 예는 처리되는 다중복합체 및 거대 샘플 용적을 고려하는 한편, 회피된 표적 집단의 생존력을 유지한다. 다른 그룹에 의한 이전의 연구에서, 배양 방법은 단일 세포로부터 유래된 과다형성 및 오가노이드 형성 단위를 유발하도록 개발되었다. (Sato, T. et al, Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009, 459 (7244), 262-U147). 이들 세포는 이들 단위 내로 발생되는 간충직 틈새를 필요로 하지 않으며, 분화 신호를 유발하는 성장 인자에 의존한다. 배양물 내 lgr5 세포는 6% 플레이팅 효율을 가지는 것으로 보고되었고(Sato 2009); 최근의 발생은 파네스(Paneth) 세포를 통한 신호처리가 필요하다는 것을 암시하였다. (Sato et al., Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 2011, 469 (7330), 415-+).
이 예에서, 풍부화된 lgr5 양성 집단을 포획하였고, 개시한 방법을 사용하여 방출하였으며, 세포는 이전 그룹에 의해 생성된 유사한 형태적 반응을 수득하였다. 더 나아가, 배양물 내 wnt3a의 첨가는 플레이팅 효율의 증가를 용이하게 하였다. 공초점 현미경과 결합된 면역조직화학 분석은 중심 내강 내에서 lgr5 및 cd24 발현을 밝혔는데, 이는 최근의 보고와 일치된다. (문헌[Gracz, A. D. et al., Sox9 expression marks a subset of CD24-expressing small intestine epithelial stem cells that form organoids in vitro. Am J Physiol - Gastr L 2010, 298 (5), G590-G600] 참조).
이 예에서, 공유적으로 결합된 길항적 GPR49/Lgr5를 갖는 알기네이트 하이드로겔에 의해, 포획 및 방출 메커니즘은 킬레이션 방출과 함께 칼슘과 하이드로겔의 교차결합에 있다. 이 예는 야생형 래트 결장 음와 분해물로부터 GPR49/Lgr5 양성 세포를 선택적으로 포획하고 방출하는 능력을 증명한다. 1-패스 접근을 통해, 출발 현탁액으로부터 49% GPR49/Lgr5의 최종 순도까지의 24-배 풍부화를 얻었다. 제공된 마이크로유체 플랫폼은 표적 세포의 생존력을 보유하는 한편, 다중복합체 샘플에 대한 능력을 마지막 사용자에게 제공하였다. 본 개시내용은 공동배양물과 함께 적용 및 조직공학 분야의 진보에 있어서 가능성을 갖는 장 줄기 세포 단리를 고려한다.
방법
동물
수컷 및 암컷 신생아 루이스(Lewis) 래트(찰스리버(Charles River))를 사용하였고, 미동부 표준시간에 따라 12시간 명/암 주기로 실온 조건하에 수용하였다. 전구 세포 단리 연구를 위해, 2 내지 5일령의 신생아 래트를 이용하였고, 참수를 통해 희생시켰다. 모든 연구 및 프로토콜은 노스이스턴 유니버시티의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee: IACUC)에 의해 승인받았다.
조직 분해
장 조직 샘플을 신생아 루이스 래트로부터 얻었다. 대장을 추출하였고, 측면으로 분할하였으며, 1 ㎜ 세그먼트로 단편화하였다. 단편화된 조직을 2mM EDTA 중에서 4℃로 30분 동안 인큐베이션시켰다. 조직을 용액으로부터 분리시켰고, 10분의 교반 동안 20 ㎖의 인산염 완충 식염수(PBS, 깁코(Gibco)) 중에 두었다. 그 다음에 상청액 유체를 수집하였고, 150xg에서 3분 동안 원심분리시켰으며; 펠렛을 수집하였고, 10 ㎖의 무혈청 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: DMEM, 셀그로(Cellgrow)) 중에서 현탁시켰으며, 150 x g에서 다시 원심분리시켰다. 펠렛을 5 ㎖의 무혈청 DMEM 용액 중에서 현탁시켰고, 100㎛ 셀 스트레이너(cell strainer)를 통해 여과시켰다. 그 다음에 용액을 20㎛ 셀 스트레이너를 통해 1 ㎖ 에펜도르프 튜브 내로 여과시켰다.
마이크로유체 세포 단리 장치 제작
조지 제이 코스타스 나노스케일 테크놀로지(George J. Kostas Nanoscale Technology) 및 노스이스턴 유니버시티의 제조 연구 센터에서 전통적인 소프트 리소그래피를 사용하여 마이크로유체 장치를 제작하였다. 장치의 물리적 치수 및 설계는 Hatch 등에 의해 기재된 장치의 치수 및 설계와 동일하였다. 이들 장치는 유리 슬라이드에 결합된 100㎛ 직경 기둥 패턴화된 폴리다이메틸실록산(PDMS)으로 이루어진다.
알기네이트 조제물
항체-작용기화된 알기네이트 반응은 6가지의 상이한 시나리오를 겪었지만, 시약의 화학량론적 비는 각 반응식을 통해 일정하게 남아있었다. 1940㎕ MES(서모-피셔(Thermo-fisher)), 04㎎ 항-GPCR GPR49(에이빔(Abeam)) 및 22.5㎎ 10 KD 4-암 스타 PEG()를 30분 동안 혼합하였다. MES pH를 ph 4.7 또는 6.0에서 보유되는 각각의 시나리오에 대해 변경하였고; pH를 NaOH에 의해 6.0의 pH로 적정하였다. 아말감을 시나리오 II에서 60분 동안 인큐베이션시켰지만, 이후의 시약은 남아있는 시나리오에 즉시 첨가하였다. 13.8㎎ 설포-NHS(피어스(pierce)), 4.8㎎ EDC(피어스(pierce)) 및 45㎎ 알기네이트(서모(thermo))를 첨가하였고, 60분 동안 혼합하였으며, 시나리오 II 중에서 다른 60분 동안 인큐베이션시켰다. 작용기화된 알기네이트를 10 KD 투석 카세트(서모(Thermo)) 내로 주입하였고, 48시간 동안 그것의 각 시나리오 pH에서 그것의 희석물인 MES 중에서 현탁시켰다.
채널 형성, 주입 및 방출
세포 분리를 위해 6각형 포스트 어레이를 지니는 마이크로 유체 장치를 이용하였다. 각 장치를 항-GPCR GPR49에 의해 작용기화된 알기네이트로 채웠고, 60분 동안 인큐베이션시켰다. 10㎕/분에서 100㎕의 pH 6 MES 완충제, 10㎕/분에서 100㎕의 100mM CaCl2 및 10㎕/분에서 100㎕의 0.1% 소 혈청 알부민을 통한 유동에 의해 채널을 형성하였다. 하버드 애퍼래터스(Harvard Apparatus) 주사기 펌프를 사용하여 정확한 유속을 얻었다. 얻은 세포 용액을 혼합하여 균질한 현탁액을 보장하였고, 200㎕를 1 ㎖ 주사기로 회수하였다. 3㎕/분의 속도로 각 장치를 통해 100 ㎖의 세포 용액 다음에 세정응 위해 3㎕/분으로 100㎕의 pH 6 MES 완충제를 펌프하였다. 그 다음에 100㎕의 100mM EDTA 용액을 10㎕/분의 장치를 통해 펌프하여 장치로부터 세포를 방출시켰다. 배양을 위해, 세포를 얼음 상에서 매트리겔(Matrigel)(BD 바이오사이언스(Bioscience))의 50㎕를 함유하는 에펜도르프 튜브 내로 방출시켰다.
유세포 분석법
출발(즉, 조직 분해물) 세포 현탁액과 단리된 세포 둘 다의 유세포 분석을 벡크만 쿨터 셀 랩 퀀터(Beckman Coulter Cell Lab Quanta) SC 유세포 분석기를 사용하여 수행하였다. 항-GPCR GPR49-RPE를 사용하여 주입되고 방출된 집단을 정량화하였다. 1차 및 2차를 각각 PBS 중에서 1:50으로 희석시켰다.
세포 배양물
방출 후 풍부화된 줄기 세포 집단을 매트리겔과 혼합하였고, 각 샘플을 웰 플레이트 내로 플레이팅하였으며, 10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. Lgr5 기본 배지는 다음의 구성요소를 함유하였다: 진보된 DMEM F-12, 5 ㎖ N2 보충물, 비타민 A가 없는 10 ㎖ B27, 5㎖ HEPES, 6.25 ㎖ 글루타맥스. 각 샘플을 350㎕의 Lgr5 기본 배지로 세정하여 세포 배양물로부터 EDTA를 제거하였다. 그 다음에, 17㎕의 ROCK 억제제(y-27632, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 10 ㎖의 Lgr5 배지에 첨가하였다. 486㎕의 이 용액을 다음의 농도에 대한 성장 인자에 덧붙여 각 웰 플레이트에 첨가하였다: 100 ng/㎖의 뮤린 노긴(Noggin)(페프로텍(Peprotech)), 100 ng/㎖의 뮤린 Wnt3A(페프로텍(Peprotech)), 50 ng/㎖의 래트 EGF(페프로텍(Peprotech)), 및 1 ㎍/㎖의 뮤린 알스폰딘(Rspondin)-1(알앤디 바이오사이언스(R&D Biosciences)). 각 성장 인자를 첨가한 후, 샘플을 37℃, 5% > C02에서 유지시킨 항습기 내로 이동시켰다. 세포 성장 2일 후, 배지를 리프레쉬시켰다. 소모한 배지를 제거하고, ROCK 억제제가 없는 Lgr5 배지를 각 웰 플레이트에 첨가한다. 성장 인자를 다음의 농도로 첨가하였다: 100 ng/㎖의 노긴(Noggin), 100 ng/㎖의 Wnt3A, 50 ng/㎖의 EGF 및 500 ng/㎖의 알스폰딘(Rspondin)-1.
오가노이드의 면역조직화학적 염색
풍부화된 오가노이드를 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰고, PBS 중에서 2mM 글라이신으로 세정하였다. 6 U/㎖ 디스파제(스템 셀 테크놀로지즈(stem cell technologies))를 첨가하였고, 1시간 동안 인큐베이션시켜 매트리겔로부터 오가노이드를 방출시켰다. 오가노이드를 3% BSA, 10% 염소 혈청, .1% 트리톤 X-100, 10mM HEPES 및 10mM 글라이신을 함유하는 200㎕ Lgr5 배지 차단 용액 내로 피펫팅하였다. 차단 용액에 대해 1:50의 각각의 항체, 즉 항-GPCR GPR49 및 항-CD24를 첨가하였고, 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 3시간 동안 오가노이드를 용액 밖, 알렉스플루오르(Alexfluor) 488, 알렉사플루오르(Alexafluor) 568 및 .5㎍/㎖ DAPI의 정규화된 농도를 함유하는 200㎕의 차단 용액 내로 피펫팅하였다. 오가노이드를 유리 커버 슬라이드에 장착하였고, 니콘(Nikon) 공초점 현미경을 통해 공초점 이미지를 촬영하였다.
결과
장 줄기 세포의 마이크로유체 풍부화
반응 pH 및 강화의 조절을 포함하는 실험 변수에 대한 변형은 폴드 Lgr5 풍부화 및 순도를 증가시킬 필요가 있었다(도 6a). 샘플 및 조제물을 5개의 시나리오로 나누었고(도 6a), 각각은 하나의 변수가 다르다. 이들 시나리오의 순도 수율을 주입된 집단과 비교하였다. 순도%의 정량화를 주입(도 6c) 및 방출(도 6c)에 대해 유세포분석기를 통해 수행하였다. 각 히스토그램을 측방산란 상황에 대해 EV로부터 게이트 제어하여 노이즈를 완화시켰고, 각 게이트를 각 샘플을 통해 전파하였다. *P < .0005, **P < .001, ***P > .05; n=3. Lgr5 포획에 대한 최적화는 유속, 강화, pH 및 반응 시간을 포함하는 4가지 변수를 포함하였다. 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin: BSA), 강화제는 채널을 가로지르는 유동과 일치되는 확립 및 알기네이트/항체 컨쥬게이트에 대한 비특이적 결합의 억제를 용이하게 하는 마이크로유체 채널 내의 파울링을 감소시켰다. 과정 IV 및 V에서 다른 BSA의 농도는 시스템 상에서 효과가 거의 없었고, 순도 수율에 영향을 미치지 않았다(도 6b). 3 내지 5㎕/분(시나리오 III 및 IV)으로 조절된 유속은 상당한 차이를 야기하였는데, 이는 더 높은 유속에서 표적 세포 상의 가능한 전단 효과를 암시한다(도 6b).
알기네이트 반응에서 pH 효과를 조사하여 4-암 스타 PEG, EDC 및 항체 상호작용을 개선시켰다. 시나리오 III과 VI를 비교할 때, 4.7에서 6.0으로 pH 변화는 Lgr5 양성 세포의 포획에서 알기네이트 하이드로겔의 효능에 유의한 전반적인 효과를 가졌다(p < .001). pH의 증가는 반응 부위를 탈양성자화하였고, 따라서 항체-PEG 및 알기네이트-EDC 컨쥬게이트의 반응 퍼텐셜을 증가시켰으며, 완료까지 전반적인 반응을 구동시킨다. 혼합 및 인큐베이션은 풍부화에서 통계적으로 유의한 효과가 없었다. 시나리오 III은 가장 큰 순도 수율을 초래하였고, Lgr5 양성 세포의 대략 49%의 순수한 집단이 방출되었으며; 이 조제물은 주사된 현탁액으로부터 24-배 lgr5 풍부화를 용이하게 하였다(도 6b). 마이크로유체 접근으로 생존력을 평가하였고, 대략 85%의 생존가능한 체류를 수득하였다(데이터 미제시).
유세포 분석기를 통한 Lgr5 양성 세포의 유효성 및 열거
마이크로유체 장치 후 풍부화 능력 및 순도 수율을 결정하기 위해, 유세포 분석기를 사용하여 상이한 알기네이트/항체 조제물에 대한 양성 집단을 열거하였다. 측면 및 전방 산란 상황 내에서 초기 게이팅은 관련 없는 파편을 이동시켰다. 주입되고 방출된 장 분해물 현탁액을 PBS 중에서 항-GPCR GPR49-RPE와 컨쥬게이션시켰다. 항체 태그가 없는 대조군 집단을 동일한 방식으로 실행하여 노이즈 및 자동-형광을 매개시켰다. 주사되고, 방출된 집단을 동일한 방식으로 게이팅시켰고, 노이즈를 보상하기 위해 대조군에 대해 덮어씌웠다. 주사된 샘플은 장 분해물로부터 대략 2.3% Lgr5 양성 세포를 포함하였다(도 6c). 유세포 분석은 시나리오 III에서 방출된 것에 비해 표적 Lgr5 양성 집단의 24-배 풍부화를 도시하였다(도 6d).
풍부화된 세포는 과다형성 및 원숭이 세포 유래 오가노이드를 유발하였다
방출된 풍부화된 Lgr5 양성 세포를 매트리겔에 포매시켰고, 문헌[Sato et al; Single Lgr5 stem cells build crypt- villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009, 459 (7244), 262-U147]에 기재된 것과 유사한 조건 하에 성장시켰다. lgr5 양성 세포에 대한 배양 기법은 종 의존적 인자를 고려하기 위해 약간 변경된 성장 인자 구성요소를 포함하였다. 혼성화된 마우스 모델을 수행한 문헌 공급원에 대해 래트 내피 성장 인자(EGF) 및 뮤린 알스포딘(rspondin)-1을 사용하였다. 락 억제제(rock inhibitor)인 Y-26743를 사용하여 배양물 안정성을 개선시켰고, 단일 세포 현탁액에서 아노이키스(anoikis)를 방지하였다. 또한 마이크로유체 풍부 기법에서 억제제를 동시에 사용하였고, 플레이팅 효율의 증가가 초래되는 것을 관찰하였지만(데이터 미제시), 풍부화되지 않은 배양물에서 영향을 거의 나타내지 않았다(도 7a 내지 c). 풍부화된 단일 lgr5 세포로부터 오가노이드의 진행을 4일까지 살펴보았고, 풍부화되지 않은 집단과 비교하였다(도 7d 내지 e). 제2일에 성장을 주목하였고, 제3일에 과다형성 스테이지로 진행되었다. 과다형성의 증가와 결합된 작은 내강 형성을 제4일에 관찰하였다.
도 7a 내지 c는 풍부화되지 않은 오가노이드 발달이 외부 집단에 의해 둘러싸인 더 큰 낭종-유사 오가노이드를 수득한다는 것을 나타낸다. 도 7d 내지 f는 단일 세포 현탁액으로부터 유래된 풍부화된 오가노이드의 4일 진행을 나타낸다. 제2일에 단일 세포의 확장(도 7d)은 제3일에 과다형성을 유발하였고(도 7e), 제4일에 주위의 분비된 아포토시스 세포에 의해 주목되는 작은 내강 형성을 나타낸다(도 7f). 스케일 바는 100㎛를 나타낸다.
진행일에 방출된 lgr5 양성 세포를 풍부화되지 않은 집단과 동시에 배양시켰다. 풍부화되지 않은 현탁액을 방출된 집단과 동일한 부피로 시딩하였고, 동일 조건 하에 배양시켰다. 다수의 형태는 풍부화되지 않은 배양물에서 명백하였고, 이는 중심 내강을 지니는 오가노이드의 범위에 있으며 섬유아세포 형태에 대해 아포토시스 세포를 은닉한다(도 7c 및 8c). 풍부화되지 않은 현탁액의 성장률은 풍부화된 집단과 비교하여 더 가속화되었다. 플레이팅 효율은 배양 시스템에 Wnt3a의 첨가에 의해 풍부화된 집단 중에서 개선되었다(도 8b). 배양 배지에 wnt3a의 첨가는 파네스 세포로부터 독립 및 생존력을 지속시킨다(도 8d).
풍부화되지 않은 집단(도 8a)은 Wnt3a 단백질의 존재에서 플레이트 효율의 어떤 증가를 갖지 않는다. 주입된 배양물에서 형성된 대다수의 오가노이드는 아포토시스 세포를 은닉하는 낭종-유사 구조를 발현시켰다(도 8c). 반대로, 풍부화된 집단(도 8b)은 더 단일의 유래된 오가노이드 증식을 유발하는 플레이팅 효율을 증가시켰다. 풍부화된 세포는 유사한 시점에 wnt3a 부재 연구에 대해 유사한 형태를 나타내었다(도 8d). 배양물에서 제3일에 영상을 촬영하였고; 스케일바는 100㎛를 나타낸다.
공초점 현미경을 통한 풍부화된 및 풍부화되지 않은 된 오가노이드의 면역 염색
풍부화된 및 풍부화되지 않은된 오가노이드를 디스파제 처리를 통해 제4일에 배양물로부터 방출시켜 매트리겔을 분해시켰다. 염색한 오가노이드를 항-GPR GPRCR49, 항-CD24, 및 DAPI에 노출시켰고, 각각은 알렉사 플루오르(alexa fluor) 488(녹색) 및 524(적색)에 컨쥬게이트되었다(도 9 및 도 10). 공초점 현미경은 오가노이드 및 단백질 발현의 형태 결정을 용이하게 하였다. 풍부화되지 않은 오가노이드(도 10)는 중앙 구역 내에서 상당한 아포토시스 세포의 집단을 가졌다. 오가노이드는 배양 지속기간 동안 과다형성을 겪지 않았고, 타원형으로 밝은 CD-24 신호를 나타내었다. 항-Lgr5/GPRCR49 발현은 희미하였고(도 10b), 발현은 오가노이드의 내강 구역으로 제한되었다. 항-Lgr5/GPRCR49의 국소화는 상당히 낮은 CD24 집단에서 감소되었다(도 10a 내지 b).
풍부화되지 않은 배양물의 지형(topography)은 타원형 형태를 나타내었지만(도 10d), 풍부화 오가노이드는 구형이었다(도 9d). 중앙 구역은 CD-24(녹색) 및 항-Lgr5/GPCR49(적색)로 표현하였는데, 정점의 막에서 국소화되었다(도 9a 내지 b). CD-24 발현은 4개의 상이한 막을 따라 국소화되었고(도 9a), 발현은 풍부화되지 않은 오가노이드에 비해 강도가 더 낮았다. 국소화된 항-Lgr5/GPCR49는 정점의 막에서 중앙에 있었고, 2개의 막에서 발현되었다(도 9b). 마커 둘 다의 발현은 중앙 구역으로 철저히 제한되었는데, 이는 Sox9(CD-24) 및 Lgr5 게놈 경향과 일치한다. (Gracz, A. D. et al, Sox9 expression marks a subset of CD24-expressing small intestine epithelial stem cells that form organoids in vitro. Am J Physio l- Gastr L 2010, 298 (5), G590-G600; 14; Sei, Y. et al, A stem cell marker-expressing subset of enteroendocrine cells resides at the crypt base in the small intestine. Am J Physiol - Gastr L 2011, 300 (2), G345-G356).
토의
본 개시내용은 비용 효과적이며, 무형광 세포 단리 장치 및 조직공학과 같은 적용을 위한 방법의 개발에 대한 필요를 충족시킨다. 통상적인 장 줄기 세포 단리 방법은 혼성화된 마우스 모델 및 FACS와 같은 복합 기기에 의존한다. 본 실시예는 항-GPCR49/Lgr5와 결합된 알기네이트를 사용하는 장 줄기 세포 집단이 풍부화된 마이크로 유체 방법을 기재한다. 더 나아가, 풍부화된 lgr5 세포는 적절한 배양 배지 내에서 성장시켰다. 배지에 세포를 첨가한 후, 오가노이드 중앙 구역에서 Lgr5 발현과 일치되는 CD24 발현을 조사하였다. 이 실시예는 선택 표적 집단을 풍부화한 한편, 생존력, 발현 및 성장 형태를 보유하는 방법 및 장치를 기재한다.
이 실시예는 49%의 GPCR49/Lgr5 순도에 대해 24-배 풍부화가 가능한 1-패스 마이크로유체 알기네이트 포획 및 방출 모델을 기재한다. 강화제인 BSA를 사용하여 비-특이적 결합을 감소시켰다. 현상은 캐스케이드 효과를 만드는데, 이때 응집된 세포 유형은 알기네이트 코팅에 lgr5 양성 세포를 함유하며; 염색 세포의 즉시 주입은 분산물 중에서 용이하게 되도록 수행하였다. 반응 pH가 더 염기성으로 됨에 따라 알기네이트, EDC, 4-암 스타 PEG, 항-GPCR49/Lgr5 사이의 화학적 상호작용 및 안정성은 증가되었다.
이론에 의해 구속되지 않고, 반응 pH의 증가는 4-스타 PEG에서 활성 부위를 탈양성자화시켰는데, 이는 4개의 활성 부위에 대한 항체 상호작용을 제한할 수 있고, 따라서 흡착 효과를 만드는 알기네이트 매트릭스에 대한 공유 결합을 억제한다. 상호작용의 가능성은 캡핑 시약을 도입함으로써 감소되어 원치않은 부반응을 억제한다. 통상적인 방법과 대조적으로, 개시된 방법은 다중 복합체화를 위해 사용될 수 있는데, 이는 다수의 장치가 동시에 실행되게 하며, 처리량을 증가시킨다. 더 나아가, 개시된 방법은 장 줄기 세포를 형광-무표지 단리시키지만, 인시츄로 유사한 성장 형태를 보유한다.
주입되고 단리된 세포 집단의 배양물은 세포 조성물, 형태 및 가용성 인자, 구체적으로는 Wnt3a의 효과에 대한 정보를 제공하였다. 주입되고 방출된 샘플을 앞서 문헌에서 보고된 바와 유사한 방식으로 배양시켰다. Lgr5 풍부화되 집단 및 미변경 분해물의 형태적 성장을 조사하기 위해, 배양을 동시에 실행하여 증식 및 형태의 차이를 평가하였다. 풍부화되지 않은 집단 내 성장은 오가노이드와 오가노이드 사이에 상당한 형태적 변형을 가졌다. 다수의 오가노이드는 과다형성을 겪지 않았고, 낭종-유사 상태로 남아있는 반면, 나머지는 모놀리식(monolithic) 섬유아세포 층을 형성하였다. Wnt3a이 배양물 내에서 존재하든 부재이든, 풍부화되지 않은 오가노이드는 영향받지 않은 채로 남아있었고, 유사한 형태를 지속하였다. 풍부화되지 않은 집단은 필요한 Wnt 신호처리를 지속하는 파네스-lgr5 양성 세포의 이중선을 함유하며; 따라서, 중요하지 않은 효과를 보조 인자의 존재하에 주목하였다. Wnt3a의 부재시, 풍부화되지 않은 집단 중에서 플레이팅 효율은 풍부화된 현탁액보다 약간 더 높으며; 이는 장기간의 오가노이드 생존력을 개선시키는 파네스 세포 적소 신호처리를 표시한다는 것을 주목하였다. 풍부화된 오가노이드는 주입된 현탁액과 유사한 방식으로 플레이팅하였지만, 방출된 GPCR49/lgr5 양성 세포의 형태적 변화 및 플레이팅 효율에 상당한 차이가 존재하였다.
Wnt3a의 부재시, 풍부화된 집단의 플레이팅 효율은 사전에 보고된 바와 같이 6%의 범위 내에 있었다. Wnt3a 결핍 세포의 연령 진행은 내강 형성 및 최후의 과다형성 개시를 나타내었다. 이들을 단일 Lgr5 유래 오가노이드의 사전에 보고된 형태에 따라 정렬시켰다. 분비된 아포토시스 세포는 풍부화된 오가노이드를 둘러싸는데, 이는 자기-지속(self-sustained) 특성을 나타내었고, 생체내 증식을 모방하였다. Wnt3a의 존재는 플레이팅 효율뿐만 아니라 형태적 변화의 증가를 유발하였다. Wnt3a 결핍 배양물에서 유사한 시점에, 형태는 낭종과 유사하였고, 전구체 표현형을 나타내었다. 이 구성요소의 첨가는 알-스폰딘1(r-spondin1)의 활성화를 용이하게 하였고, 직접적인 접촉 없이 파네스 세포 틈새를 지탱한다.
최근의 문헌은 장 줄기 세포가 두 개의 암호화된 유전자, 즉 Sox9 및 Lgr5에 잠재적으로 체류한다는 것을 시사한다. 이들 발현 경향은 세포의 세포내 및 세포외 구역에 결합되는데, 이는 각각 CD24 및 GPCR49에 의해 확인될 수 있다. 오가노이드 내의 발현 경향을 조사하기 위해, 공초점 현미경과 결합된 면역조직화학으로 이들 패턴에 대한 통찰을 제공한다. 풍부화되지 않은 기관은 중앙 구역 내 아포토시스 세포를 은닉하는 낭종-유사 형태를 나타낸다. CD24 발현은 중심 내강 내에서 정점의 막에 도시되지만, GPCR49/Lgr5는 저 발현 CD24 영역에서 양성 발현을 나타내었고; 이 경향은 이전에 발견된 게놈 발현과 유사하다. 정반대로, 풍부화된 오가노이드는 약간 상이한 형태를 나타내었지만, 유사한 면역-발현 패턴을 나타내었다. 이미지는 또한 임의의 아포토시스 세포를 은닉하도록 형성된 작은 중심 내강을 갖는 더 작은 오가노이드를 표시한다. CD24 및 GPCR49/Lgr5 발현은 후자와 유사한 패턴을 갖는 중앙 구역에 결합되었다. 제시된 이미지는 마이크로유체 풍부화 과정이 사전에 보고한 것과 같은 유사한 형태적 결과물을 보유하는 것을 회피한다.
실시예는 세포 분류 및 조직공학에 대해 사용될 수 있는 방법 및 장치를 개시한다. 실시예는 야생형 장 분해물로부터 장 줄기 세포 단리 기법을 기재한다. 현존하는 관례는 유전자이식 마우스 모델 및 이들 세포를 단리시키기 위한 복합 기기로 제한된다. 개시된 방법은 최종 수요자가 빠른 처리로 세포 서브타입을 단리시키는 한편, 세포 생존력을 보유하도록 한다.
실시예 3 - 다중 스테이지 포획 및 방출 장치 및 방법
이 실시예는 세포와 같은 생물학적 물질의 다중스테이지의 고도로 특이적인 포획 및 방출을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
표적 세포의 분리에서 제1 단계는 그것의 동일성이 2개의 상이한 표면 수용체에 의해 정해진다(예를 들어 CD31+와 FLK1+ 둘 다인 전혈로부터의 세포 집단). 도 11 a 내지 d는 각각 두 항체에 대해 포획 스테이지를 포함하는 알기네이트-하이드로겔 기반 장치의 구성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 2 이상의 항체를 고려한다.
도 11a 내지 d에서, 샘플을 제1 알기네이트-기반 포획 스테이지 내로 주사기 펌프를 통해 주입하였다("마커 1 단리"/도 11a). 이 스테이지를 2-웨이 밸브인 스테이지 B에 연결하였다. 그것의 "폐쇄된" 구성에서, 이 밸브는 스테이지 A로부터 폐기물이 수집 튜브를 통과하도록 하였다. 폐기물이 통과된 후, 폐기물 스트림을, 예를 들어 핀치 밸브를 사용하여 폐쇄시켰다(도 11b). 염화 칼슘의 목적은 스테이지로부터 나타나는 세포 현탁액에서 EDTA를 중화하는 것이다(도 11a). 염화칼슘과 이 세포 현탁액의 혼합을 보장하기 위해, 조합된 결과물(층류에 있음)을 헤링본 특징을 수용하는 혼합 챔버에 보냈다(도 11c). 그 다음에 혼합 용액을 제2 포획 분자에 대해 세포 발현 수용체가 포획되는 스테이지로 유입시켰다(도 11d). 분리 과정의 최종 단계는 스테이지 A(도 11a) 주입구에 EDTA 용액의 주입인데, 이는 스테이지 B로부터 포획 세포를 방출시킨다(도 11b). 이 용액은 과량의 배양 배지를 함유하는 튜브 내에서 수집되어 세포 상에서 EDTA의 어떤 유해한 효과를 최소화한다.
이 예는 미처리 전혈로부터 내피 전구 세포(EPC)를 단리시키는 이런 이중-스테이지 포획 시스템의 능력을 나타내었다. 목적은 CD34+/FLK1+인 세포를 포획하는 것이다. 도 12는 스테이지 A 및 스테이지 B로부터 나타나는 세포의 세포 계측수(유세포 분석기에 의해 얻음)를 나타낸다. 도 12에서, 다양한 집단은 CD34+ 세포의 범주를 나타내며, "전체" 열은 방출된 세포의 전체 수를 나타낸다. 제2 포획 장치의 목적은 제2 마커인 FLK-1를 발현시키지 않는 CD34+ 세포, 즉 또한 CD45+인 CD34+ 세포를 제거하는 것이다. 제1 포획 스테이지에 비해 제2 포획 스테이지로부터 나오는 CD45+의 수의 급격한 감소는 이런 풍부화를 나타낸다.
다른 양태, 변형 및 실시형태는 다음의 특허청구범위 범주 내에 있다.

Claims (26)

  1. 하이드로겔 조성물로서,
    다수의 알긴산 분자; 및
    다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하되,
    상기 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되거나 또는 배합되어 하이드로겔을 형성하고;
    각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하며,
    각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고;
    각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되는 것인 하이드로겔 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분지된 폴리머는 폴리에틸렌 글라이콜인 것인 하이드로겔 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암(arm) 분자인 것인 하이드로겔 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산인 것인 하이드로겔 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLKl, CD45, CD31, CD34 및 sca-1 단백질에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 하이드로겔 조성물.
  6. 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고 방출시키는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 유체를 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
    (b) 상기 표적 생물학적 물질이 하이드로겔 조성물에 결합하기에 효과적인 조건 하에서 상기 하나 이상의 챔버에 표적 및 비-표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계; 및
    (c) 방출제를 사용하여 표적 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 포함하되,
    상기 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하며, 상기 하이드로겔 조성물은
    다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하고,
    상기 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되거나 또는 배합되어 하이드로겔을 형성하며;
    각각의 상기 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 샘플로부터 미결합 비-표적 물질을 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 샘플로부터 표적 생물학적 물질을 포획하고 방출시키는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 유체를 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하는 마이크로유체 장치를 제공하는 단계;
    (b) 생물학적 물질이 하이드로겔 조성물에 결합하기에 효과적인 조건 하에서 상기 장치의 제1 챔버 내로 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 도입하는 단계;
    (c) 방출제를 사용하여 상기 결합된 생물학적 물질을 방출시키는 단계;
    (d) 상기 방출제를 중화제와 접촉시켜 제2 챔버 내에서 상기 방출제를 중화시키는 단계;
    (e) 상기 제2 챔버의 내용물을 상기 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하는 제3 챔버 내로 제공하는 단계; 및
    (f) 방출제를 사용하여 결합된 표적 생물학적 물질을 방출시키는 단계를 포함하되,
    상기 하나 이상의 챔버 중 적어도 하나는 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면을 포함하며, 상기 하이드로겔 조성물은
    다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하고,
    상기 다수의 알긴산 분자는 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되어 하이드로겔을 형성하며;
    각각의 상기 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되고,
    상기 제3 챔버 내 상기 결합제는 하이드로겔 조성물에 표적 생물학적 물질을 결합시키는데 효과적인 조건 하에서 (a)에서 사용된 것과 상이한 결합제인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방출된 생물학적 물질에 배양 배지를 첨가하는 단계를 더 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상이한 결합제를 사용하여 단계 (d) 내지 (f)를 반복하는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물로부터 방출된 후 상기 표적 생물학적 물질을 검출하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 세포, 단백질, 용질 또는 미립자이며, 상기 방출제는 킬레이트제, 효소 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 전구 세포, 말초혈액 조혈모세포 줄기 세포, 내피 전구 세포, 혈중 종양 세포, 성숙 혈중 내피 세포, 양막 줄기 세포, 간충직 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 장 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 암 줄기 세포인 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 세포는 상기 샘플로부터 포획된 살아있는 세포인 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA, EGTA 및 시트르산 나트륨으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 살아있는 세포를 배양하거나, 검출하거나, 분석하거나 또는 형질전환하는데 효과적인 조건하에서 살아있는 세포를 유지하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 하이드로겔 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 완충제 중에서 분지된 폴리머 분자를 하나 이상의 결합제와 반응시키는 단계; 및
    (b) 상기 분지된 폴리머-결합제 용액을 적어도 하나의 알긴산 분자와 반응시켜 작용기화된 하이드로겔을 형성하는 단계를 포함하되,
    상기 작용기화된 하이드로겔은 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되고, 적어도 하나의 알긴산 분자에 추가로 컨쥬게이트된 각각의 상기 분지된 폴리머 분자를 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 분지된 폴리머는 폴리에틸렌 글라이콜 분자인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암 분자인 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산인 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLKl, CD45, CD31, CD34 및 sca-1 단백질에 대해 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 마이크로 유체 장치로서,
    (a) 기판; 및
    (b) 표적 생물학적 물질을 포함하는 샘플을 수용하기 위한 하나 이상의 챔버를 포함하되,
    상기 하나 이상의 챔버는
    (i) 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면으로서, 상기 하이드로겔 조성물이 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하며,
    상기 다수의 알긴산 분자는 상기 분지된 폴리머 1 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되어 하이드로겔을 형성하고; 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되고, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 결합제에 컨쥬게이트된 것인, 상기 하이드로겔 조성물로 코팅된 표면;
    (ii) 결합된 표적 생물학적 물질을 중화제와 혼합하기 위한 혼합 챔버; 및
    (iii) 하이드로겔 조성물로 코팅된 하나 이상의 추가적인 표면으로서, 해당 하이드로겔 조성물이 다수의 알긴산 분자 및 다수의 분지된 폴리머 분자를 포함하고,
    상기 다수의 알긴산 분자는 상기 분지된 폴리머 분자 또는 하나 이상의 결합제에 컨쥬게이트되어 하이드로겔을 형성하며; 각각의 분지된 폴리머 분자는 다수의 기를 포함하고, 각각의 상기 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 기는 알긴산 분자에 컨쥬게이트되며, 각각의 분지된 폴리머 분자 중 적어도 하나의 다른 기는 단계 (i)의 상기 결합제와 상이한 결합제에 컨쥬게이트된 것인, 상기 하이드로겔 조성물로 코팅된 하나 이상의 추가적인 표면을 포함하는 것인 마이크로 유체 장치.
  23. 제22항에 있어서, 상기 분지된 폴리머 분자는 폴리에틸렌 글라이콜 분자인 것인 마이크로 유체 장치.
  24. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 결합제는 항체, 항체 단편, 펩타이드 모방체 화합물, 펩타이드, 소분자 또는 핵산인 것인 마이크로 유체 장치.
  25. 제23항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글라이콜 분자는 4-암 분자인 것인 마이크로 유체 장치.
  26. 제25항에 있어서, 상기 항체는 GPR49, LGR5, CD24, FLKl, CD45, CD31, CD34 및 sca-1 단백질에 대한 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 마이크로 유체 장치.
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