KR101290648B1 - 고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템 - Google Patents

고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템 Download PDF

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권성훈
최정일
나훈종
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서울대학교산학협력단
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Abstract

고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 박막형성용 구조물에 제공하는 단계; 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계; 생리활성물질을 상기 고체 박막에 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.

Description

고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 한 빠른 약물 검사 시스템{Rapid Antibiotic Susceptibility Test (RAST) system based on bacterial fixation, antibiotic diffusion and single cell growth tracking using gelling agents}
본 발명은 일반적으로 고형화제를 이용한 세균 고정, 약물 확산, 세균 단일 세포 추적과 이를 기반으로 하며 매우 신속한 약물 검사 시스템에 관한 것이다.
일반적으로 세포의 약물에 대한 반응을 관찰하기 위해서는 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에 세포를 넣은 다음 액체 상태의 약물을 주입하여 시간에 따른 세포의 변화를 광학 측정 장비를 이용해서 관측하여 통계적인 결과를 얻는 방식이 사용된다. 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우, 한천 배지에 균을 뿌리고 항생제를 흡수시킨 종이를 올린 다음 균의 성장을 관찰하는 KB-테스트 방법이 있다. 액체 배지에서의 microdilution test일 경우 항생제 감수성 시험을 위해 VITEK2, Microscan, Phoenix 등의 다수의 자동화 장비가 개발되었으며, 이러한 장비를 사용하여 항생제를 밀리미터 크기의 웰에 넣은 뒤에 균을 액체 배지와 함께 주입하여서 균의 성장을 탁도를 통해 통계학적으로 관측하여 결정할 수 있다.
기존에 서로 다른 약물에 대한 세포의 반응 검사를 수행할 때 세포를 액체 또는 고체 배지에 넣고 검사하고자 하는 약물을 액체 배지와 섞거나 또는 고체 배지 위에 약물을 흡수시킨 종이 디스크를 올려 세포와 반응시킨 다음 세포의 약물에 대한 성장반응을 혼탁도(흡광도)로 측정하여 약물에 대한 반응을 측정한다. 그러나 이러한 방식은 개별 세포의 변화보다 통계학적인 정보를 수집하는 방법이고 통계학적인 결과를 얻기 위해서 세포 수가 어느 정도(보통 1ml 당 백만 개체) 이상 자라야 하기 때문에 배양 시간이 오래 걸린다(보통 16~24시간). 이 경우 약물에 대한 개별 세포에서 발생하는 변화의 관측과 운동성이 있는 개별 세포의 실시간 관측은 불가능하다. 또한 약물을 주입하는 방법에 있어서 개별 약물에 대해서 개별적으로 주입하는 과정이 필요하여 많은 수의 약물을 검사하는데 시간과 노력이 많이 요구된다. 그리고 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우 KB-test는 약물을 올릴 수 있는 개수가 한정되어서 기본 수십 가지의 항생제의 감수성 검사를 위해서 많은 수의 한천배지 플레이트가 필요하다. 그리고 이런 검사시간을 최소화한 자동화 장비인 VITEK 시스템인 경우에도 마찬가지로 균의 탁도가 일정 수준 이상 증가해야 하기 때문에 비교적 오랜 시간(12시간 정도)이 소요되는 한계가 있다. 또한 기존 방법은 테스트 환경이 인체 내 환경과 다르므로 실제로 인체 내 일어나는 현상과 많은 차이점이 있을 수 있다(Gregory G. Anderson, et al .(2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", Science 301, 105; Gallo et al.(2011),"Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).
본 발명의 일 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 박막형성용 구조물에 제공하는 단계; 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계; 생리활성물질을 상기 고체 박막에 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 단일 세포 단위로 관찰하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 적어도 일 영역에서 서로 접하는 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널을 구비한 미세유체 채널 시스템을 제공하는 단계; 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 제1 미세유체 채널에 제공하되, 실질적으로 상기 혼합 용액이 상기 접하는 영역을 통해 상기 제2 미세유체 채널로 흘러들어가지 않도록 상기 혼합 용액의 흐름을 제어하는 단계; 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 상기 제1 미세유체 채널 내부에 형성하는 단계; 생리활성물질을 상기 제2 미세유체 채널에 공급하여 흐르도록 하되, 상기 접하는 영역에서 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막과 만나 계면을 형성하는 단계; 상기 계면을 통해 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 적어도 일 영역에서 서로 접하는 미세유체 채널과 웰(well)을 구비한 박막형성용 구조물을 제공하는 단계; 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 미세유체 채널에 제공하는 단계; 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 상기 미세유체 채널 내부에 형성하는 단계; 생리활성물질을 상기 웰에 공급하여, 상기 접하는 영역에서 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막과 만나 계면을 형성하는 단계; 상기 계면을 통해 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막을 구비한 검사용 구조물로서, 상기 검사용 구조물은 상용 멀티-웰 플레이트의 웰들과 대응되는 마이크로 웰들을 구비하는 검사용 구조물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막을 구비한 검사용 구조물로서, 상기 박막이 미세유체 채널 위에 형성된 검사용 구조물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질을 고화시켜 만든 박막을 구비한 검사용 구조물로서, 상기 검사용 구조물은 마이크로 플레이트의 형태을 갖는 검사용 구조물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막을 구비한 검사용 구조물; 상기 검사용 구조물에 생리활성물질을 공급하기 위한 생리활성물질 보유매체; 상기 검사용 구조물을 지지하고 관찰하기 위한 스테이지; 및 상기 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따른 상기 생물학적 물질의 변화를 관찰하기 위한 측정장치를 포함하는 검사 시스템이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 수용 도구 및 상기 수용 도구와 착탈가능한 평판형 성형틀을 준비하는 단계로서, 상기 수용 도구와 상기 평판형 성형틀의 결합시 박막 두께의 틈새 간격을 형성하는 동시에 평판형의 내부 공간을 갖는 조립체가 만들어지도록 상기 수용 도구 및 상기 평판형 성형틀이 디자인된 것인 단계; 상기 수용 도구와 상기 평판형 성형틀을 결합하여 적어도 하나의 개구부를 갖는 조립체를 형성하는 단계; 고형화제가 함유된 액상 매질 및 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 개구부를 통해 상기 내부 공간에 주입하는 단계; 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계; 및 상기 조립체로부터 상기 고체 박막을 구비한 평판형 성형틀을 분리하여 마이크로 플레이트를 얻는 단계를 포함하는 검사용 구조물의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 생리활성물질을 함유하며 상기 생리활성물질의 종류에 따라 서로 구분되는 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 준비하는 단계; 상기 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 생물학적 물질을 함유한 고체 박막을 구비한 검사용 구조물 위에 제공하는 단계; 상기 검사용 구조물 위의 특정 위치에 배치된 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독하는 단계; 및 상기 생리활성물질의 확산에 따라 상기 특정 위치에 존재하는 상기 생물학적 물질의 변화를 측정하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막 형태의 검사용 구조물; 상기 검사용 구조물에 생리활성물질을 공급하기 위한 코드화된 생리활성물질 보유매체; 및 상기 검사용 구조물의 위치 정보에 따라 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독하고 상기 코드화된 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따른 상기 생물학적 물질의 변화를 관찰하기 위한 측정장치를 포함하는 검사 시스템이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 마이크로 플레이트를 제공하는 단계; 상기 고체 박막에 생리활성물질을 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 생물학적 물질이 고정된 한천 또는 아가로즈 기반의 고체 박막과 생리활성물질을 인접시켜 확산의 방식으로 상기 생리활성물질을 상기 고체 박막에 전달하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 성장변화를 단일 세포 단위로 추적하는 단계를 포함하는 검사 방법이 제공된다. 상기 성장변화의 추적은 광학 측정장치에 의해 수행될 수 있다. 또한 상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 검사 방법을 나타낸 공정흐름도이다.
도 2는 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제1 예의 일 구현예를 나타낸다.
도 3은 미세유체 아가로즈 채널(MAC) 칩을 이용한 항생제 감수성 검사(AST) 과정의 개략도를 나타낸다.
도 4는 박테리아를 구비한 아가로즈가 앵커들에 의해 계면을 형성하는 모습을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 변형예에 따른 검사용 구조물을 제조하기 위한 박막형성용 구조물을 나타낸 도면이다.
도 6은 미세유체 아가로즈 채널(MAC)을 갖는 검사용 구조물을 이용하여 다수의 항생제를 동시에 검사하는 방법의 일 구현예를 나타낸다.
도 7은 AST 수행 시 도 5의 검사용 구조물의 일부를 확대한 도면이다.
도 8은 미세유체 채널 형태의 검사용 구조물의 몇 가지 예들을 나타낸다.
도 9는 멤브레인형의 미세유체 채널 시스템을 설명하기 위한 도면이다.
도 10은 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제2 예의 일 구현예를 나타낸다.
도 11은 도 10의 검사용 구조물과 96-웰 플레이트를 이용하여 항생제 감수성 검사(AST)를 실시하는 과정을 나타낸다.
도 12는 아가패드와 96-웰 플레이트의 조립 및 뒤집음에 의해 항생제 감수성 검사를 시작하는 과정을 좀더 상세히 나타낸다.
도 13은 본 발명의 미세유체 채널을 구비한 마이크로 웰 기반의 플레이트를 이용한 빠른 항생제 감수성 검사(RAST) 시스템 및 실험 과정을 나타낸다.
도 14는 미세유체 채널을 구비한 마이크로 웰 기반의 플레이트와 생리활성물질이 담긴 96 웰 플레이트의 조립체를 뒤집은 상태를 나타낸다.
도 15는 일 구현예에 따른 미세유체 채널을 구비한 웰 플레이트 시스템을 이용한 생리활성 검사 과정을 나타낸다.
도 16은 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제3 예의 일 구현예를 나타낸다.
도 17 및 도 18은 각각 삽입형 및 슬라이드형의 수용 도구를 사용하여 검사용 구조물을 제조하는 예들을 나타낸다.
도 19는 마이크로 플레이트를 제조하는 전체 공정의 예를 나타낸다.
도 20은 다중 분석을 위해 코드화된 생리활성물질 보유매체의 일 구현예로서 코드화된 미세입자를 나타낸다.
도 21은 마이크로 플레이트 위에서 다중 분석하는 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 22는 다중 분석용 검사 시스템의 일 구현예를 나타낸다.
도 23은 미세유체 아가로즈 채널(MAC) 시스템 내에서의 박테리아 고정 및 박테리아 성장의 추적과정을 나타낸다.
도 24는 이미지 프로세싱 프로그램에 의한 이미지 처리 과정을 나타낸다.
도 25는 이미지 처리를 통한 MIC 측정 결과를 나타낸다.
도 26은 시간경과에 따라 단일 세포로부터 바이오필름이 형성되기까지의 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 27은 MAC 시스템을 이용하여 항생제 농도별로 바이오필름의 변화를 관찰한 것이다.
도 28은 두 종류의 균주들의 바이오필름의 형성 단계들을 시간별로 관찰한 BF 이미지들(Bright Field images)이다.
도 29는 여러 생물학적 물질들의 성장변화를 시간경과에 따라 관찰한 현미경 이미지들이다.
도 30은 각 미세입자 내 카나마이신의 함유량에 따른 E. coli 세포의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 31은 마이크로 플레이트 위에서 live/dead cell 분석을 한 예를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 구현예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
본 발명은 세포가 고정된 고체 박막을 통해 생리활성물질을 확산시켜 단일 세포(single cell) 단위의 관찰을 하는 검사 방법을 제공한다. 본 발명은 고체 박막을 구현하기 위해 여러 형태의 박막형성용 구조물들을 이용한다. 본 발명은 다양한 검사용 구조물을 제공하며, 검사용 구조물, 생리활성물질 보유매체, 및 광학 측정부를 포함한 검사 시스템도 함께 제공한다.
본 발명은 이하의 단계를 포함하는 검사 방법을 제공한다. 도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 검사 방법을 나타낸 공정흐름도이다. 도 1을 참조하면, 단계 S1에서 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액을 박막형성용 구조물에 제공한다.
상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.5 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102 내지 1010 cells/ml, 바람직하게는 104 내지 1010 cells/ml, 더 바람직하게는 105 내지 109 cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
상기 박막형성용 구조물은 바람직하게는 광학 이미징을 위해 투광성 기판일 수 있다. 상기 박막형성용 구조물은 액상 매질이 도포되어 박막이 형성되기에 적합한 표면 특성을 가지면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 상기 액상 매질을 일정 공간 내에 보유하기 위한 적어도 하나의 수용부를 구비할 수 있다. 상기 수용부는 마이크로 웰, 판상의 미세 틈새 또는 미세유체 채널의 형태를 갖거나 이들을 조합한 형태일 수도 있다. 상기 수용부를 통해 상기 액상 매질이 투입되고 고화 과정을 거치는데, 상기 수용부의 형태에 따라 이후 고체 박막의 형태가 결정될 수 있다. 상기 수용부는 고체 박막의 두께를 결정하도록 소정의 깊이를 가진다. 상기 수용부의 깊이(웰 또는 채널의 깊이나 틈새 간격)는 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위일 수 있다.
한편, 상기 수용부가 마이크로 웰의 형태를 가질 경우, 상기 마이크로 웰의 너비(직경)는 대체로 10mm 이하, 예를 들어 수십 ㎛ 내지 수 mm의 직경을 가질 수 있다. 상기 수용부가 판상의 미세 틈새의 형태를 가질 경우 상기 판의 너비는 일 예로 슬라이드 글래스에 상당하는 크기(약 75mm X 25mm)를 가질 수 있다. 상기 수용부가 미세유체 채널의 형태를 가질 경우 상기 채널의 너비는 10㎛ 내지 1mm, 바람직하게는 10㎛ 내지 500㎛일 수 있다.
단계 S2에서 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성한다. 높은 온도에서 액상 매질의 온도가 내려감에 따라 매질이 고화됨으로써 상기 생물학적 물질의 움직임이 저하된다. 상기 고정에 의하여 운동성이 있는 상기 생물학적 물질을 계속해서 용이하게 관찰할 수 있다.
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 수용부의 깊이와 너비에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생화학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
상술한 단계 S2에 의하면 박막형성용 구조물 위에 고체 박막이 형성된다. 이와 같이 생물학적 물질이 고정된 고체 박막 그 자체 또는 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 박막형성용 구조물을 본 명세서에서는 "검사용 구조물"이라 칭한다. 상기 검사용 구조물은 기판의 형상에 따라 다양한 형태로 존재할 수 있다.
단계 S3에서 생리활성물질을 상기 고체 박막에 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 한다. 본 명세서에서 상기 생리활성물질은 항생제, 항암제, 면역억제제와 같은 약물, 영양성분, 세포분비물, 신호전달물질, 바이러스, 세포, micro RNA, 단백질, 항원, 항체, DNA 등 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
단계 S4에서 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막에 고정됨으로써 2차원적으로 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 개별 세포의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 생리활성물질의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 3~4 시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사속도이다.
본 발명의 검사 방법은 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 다양한 형태의 검사용 구조물들을 이용하게 된다.
본 발명의 일 구현예에 의하면, 검사 시스템이 제공된다. 상기 검사 시스템은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막 형태의 검사용 구조물; 상기 검사용 구조물에 생리활성물질을 공급하기 위한 생리활성물질 보유매체; 및 상기 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따라 상기 검사용 구조물 내에 고정된 상기 생물학적 물질의 단일 세포 변화를 관찰하기 위한 광학 측정장치를 포함한다. 상기 생리활성물질 보유매체는 시험관, 멀티-웰 플레이트, 미세유체 채널, 미세입자 등 생리활성물질을 수용 및 방출할 수 있는 매체라면 특별히 제한되지 않는다. 상기 광학 측정장치는 관찰한 이미지를 생성하는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함한다. 또한 광학 측정장치는 생성된 이미지를 처리 및 분석하는 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다.
검사용 구조물은 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비하고 그 안에서 확산의 방식으로 상기 생물학적 물질에 생리활성물질을 전달할 수 있는 것이면 그 형태가 특별히 제한되지 않는다. 상기 검사용 구조물의 대표적인 예들을 본 명세서에서는 편의상 크게 3가지 범주로 나누어 제시하나 기타 다양한 예들이 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 검사용 구조물의 제1 예로서, 검사용 구조물은 미세유체 채널의 형태를 가질 수 있다. 상기 검사용 구조물은 미세유체 채널 시스템의 일부로 존재하며 미세유체 채널 내에 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한다. 상기 미세유체 채널 시스템은 예를 들어 통상적인 소프트 리소그래피를 사용하여 제조할 수 있다.
미세유체 채널의 형태를 갖는 검사용 구조물은 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 제1 미세유체 채널과 생리활성물질이 흐르는 제2 미세유체 채널을 구비할 수 있다. 한편 제2 미세유체 채널이 상기 검사용 구조물의 상기 제1 미세유체 채널과 적어도 한 지점에서 직접 또는 간접적으로 접할 수 있다. 상기 제2 미세유체 채널은 상기 제1 미세유체 채널과 동일한 기판 위에 함께 존재하거나 상기 제1 미세유체 채널의 기판과 분리되어 별도의 다른 기판 위에 존재할 수도 있다. 일 구현예에서 미세유체 채널 시스템은 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널을 구비하며, 곁가지 달린 방사형 구조를 가질 수 있다. 다른 구현예에서 미세유체 채널 시스템은 제1 미세유체 채널이 있는 기판과 제2 미세유체 채널이 있는 다른 기판 사이에 멤브레인이 개재된 구조를 가질 수 있다.
생리활성 검사를 위해서 상기 제2 미세유체 채널을 통해 생리활성물질이 공급되면, 상기 제1 미세유체 채널과 상기 제2 미세유체 채널이 접하는 지점에서 상기 제1 미세유체 채널의 상기 고체 박막과 상기 생리활성물질이 계면을 형성한다. 이후, 상기 제2 미세유체 채널로부터 공급되는 생리활성물질이 상기 계면을 통해 상기 제1 미세유체 채널 내의 상기 고체 박막 쪽으로 확산될 수 있다. 다음 상기 고체 박막 내의 상기 생물학적 물질의 성장변화를 관찰함으로써 생리활성 검사를 수행할 수 있다. 상기 생리활성물질의 공급은 동력 펌프를 이용하여 양압 또는 음압을 가하는 방법, 채널에 경사를 주는 방법, 모세관을 채널 내에 형성하는 방법, 흡수성이 강한 재료를 이용하는 방법, 또는 수조를 이용하는 방법 등 다양한 방식을 선택할 수 있다.
도 2는 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제1 예의 일 구현예를 나타낸다. 도 2를 참조하면, 도 2의 (a)의 미세유체 채널 시스템은 제1 미세유체 채널(주 채널)로서 중심에서 뻗어나가는 6개의 가지들과 각각의 가지들과 접하는 제2 미세유체 채널(곁가지 채널)을 포함하고 있다. 방사형의 중심에 박테리아를 포함하는 아가로즈 용액을 도입하면 용액이 비어 있는 주 채널의 각 가지들로 흘러들어가면서 주입된다. 이후 겔화 과정을 거치면 박테리아가 고정된 아가로즈 고체 박막을 구비한 검사용 구조물이 만들어진다. 다음 항생제를 곁가지 채널을 통해 공급함으로써 생리활성 검사를 수행할 수 있다.
도 2의 (b)는 미세유체 채널을 이용한 생리활성 검사의 전체 과정을 나타낸다. 생리활성 검사 과정은 1) 미세유체 채널 제공, 2) 생물학적 물질이 도입된 액체 매질의 주입 및 겔화에 의한 고체 박막 형성, 3) 생리활성물질 공급, 4) 광학 측정장치를 이용한 관찰의 단계를 포함할 수 있다.
생물학적 물질이 고정된 고체 박막은 고형화제를 함유한 액상 매질을 상기 생물학적 물질과 함께 겔화시켜 만드는데 이를 위해 상기 제1 미세유체 채널에 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 주입하는 과정이 필요하다. 이때 주입 과정에서 상기 제1 미세유체 채널은 상기 제2 미세유체 채널과 적어도 한 지점에서 직접 또는 간접적으로 접하므로 상기 혼합 용액이 상기 제2 미세유체 채널 쪽으로 흘러들어가는 현상이 발생할 수 있다. 따라서 상기 혼합 용액이 상기 제2 미세유체 채널 쪽으로 넘어가지 않고 제1 미세유체 채널 내에만 흐르도록 제어될 필요가 있다. 이와 같이 흘러 넘어감을 방지하기 위해 상기 미세유체 시스템은 상기 접하는 지점에 앵커(anchor)를 더 구비할 수 있다.
도 3은 미세유체 아가로즈 채널(MAC) 칩을 이용한 항생제 감수성 검사(AST) 과정의 개략도를 나타낸다. 도 3을 참조하면, (a)에서 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만든 채널을 PDMS 코팅된 유리 기판 위에 조립하여 만든 MAC 칩은 20mm X 20mm 정도로 동전과 비슷한 크기를 갖는다. 아가로즈-박테리아 혼합물이 MAC 칩의 중심으로 주입되고 동시에 중심에 연결된 6개의 주 채널(main channel)로 흘러들어간다. 배지(culture media) 내에서 희석된 여러 농도의 항생제가 곁가지 채널(side channel)에 공급된다. 박테리아 세포의 성장을 관찰하기 위해 박테리아 함유 아가로즈와 항생제 사이의 계면을 현미경으로 관찰한다. (b)에서 1)~4)는 생리활성물질 시험 과정을 보여주는 확대도이다. 1)은 항생제 감수성 검사(AST) 전의 빈 채널을 나타내고, 2)는 아가로즈와 박테리아의 혼합물이 주 채널에 도입되는 과정을 나타낸다. 3)은 앵커들로 인해 계면이 형성되고, 여러 농도의 항생제가 6개의 곁가지 채널들을 통해 도입되어 주 채널들로 확산되는 과정을 나타낸다. 4)는 시간 경과에 따라 현미경을 통해 박테리아 세포의 성장을 추적하는 과정을 나타낸다.
아가로즈와 같은 고형화제를 함유한 액체 매질을 주 채널에 도입시 상기 액체 매질이 항생제(antibiotics)가 있는 곁가지 채널로 넘어가지 않도록 방지하기 위해 상기 앵커들의 규격 및 상기 앵커들 사이의 간격(gap)을 최적화함으로써 상기 채널에 적절한 계면 형성을 수행할 수 있다.
도 4는 박테리아를 구비한 아가로즈가 앵커들에 의해 계면을 형성하는 모습을 나타낸 도면이다. 도 4의 (a)는 적절한 채널과 앵커의 규격의 일 예이고, 삽입 이미지는 상기 앵커에 의해 형성된 실제 계면의 일 예를 나타낸다. 도 4의 (b)는 적절한 계면 형성을 위해 이용되는 Young-Laplace 식을 나타낸다.
상술한 제1 예의 일 변형예에 따른 검사용 구조물로서, 상기 제2 미세유체 채널 대신 웰(well)을 구비한 박막형성용 구조물을 사용하여 제조된 검사용 구조물이 제공된다.
도 5는 본 발명의 일 변형예에 따른 검사용 구조물을 제조하기 위한 박막형성용 구조물을 나타낸 도면이다. 도 5의 (a)는 박막형성용 구조물의 사시도이고, 도 5의 (b)는 A-A' 선을 따라 절단한 단면도이다. 도 5를 참조하면, 박막형성용 구조물(500)은 전체적으로 투광성 재질(예를 들면, 폴리스티렌)로 되어 있으며, 주입구(510)를 통해 액상 매질이 흘러들어갈 수 있는 미세유체 채널 시스템(520)을 내부에 가지고 있다. 미세유체 채널 시스템(520)은 방사상으로 뻗은 세부 채널들(525)로 이루어져 있다. 또한 박막형성용 구조물(500)의 윗면에는 다수의 웰(530)을 가지고 있으며, 예를 들어 생리활성물질이 웰(530)의 입구를 통해 주입될 수 있다. 각 세부 채널(525)의 말단(525a)은 웰(530)의 하단(530a)과 서로 연통됨으로써 오픈 채널을 형성한다. 이후 상기 생리활성물질과 상기 액상 매질이 고화된 고체 박막(540)이 서로 만나 계면(550)을 형성할 수 있도록 한다. 상기 미세유체 채널이 친수화 처리되어 상기 액상 매질이 주입된 후에도 응집력, 친수성에 의해 도 5의 (b)와 같이 계면(550)이 안정적으로 유지된다.
보다 넓은 범위의 계면(550)을 형성하도록 바람직하게는 세부 채널(525)의 말단(525a)은 웰(530) 주위를 감싸는 고리 모양의 오픈 채널이 될 수 있다. 이러한 박막형성용 구조물(500)은 방사상의 다수의 세부 채널들(525)을 구비하여 동시에 여러 종류 및 농도의 생리활성물질들에 대해 검사할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 검사 방법에 따르면, 적어도 일 영역에서 서로 접하는 미세유체 채널과 웰(well)을 구비한 박막형성용 구조물이 제공된다. 다음 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 미세유체 채널에 제공한다. 이때 상기 미세유체 채널은 플라즈마 등으로 친수화 처리될 수 있으며, 이를 통해 상기 혼합 용액이 상기 접하는 영역을 통해 상기 웰로 흘러들어가지 않도록 상기 혼합 용액의 흐름이 제어될 수 있다. 다음 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 상기 미세유체 채널 내부에 형성한다. 다음 생리활성물질을 상기 웰에 공급하여, 상기 접하는 영역에서 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막과 만나 계면을 형성한다. 다음 상기 계면을 통해 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 한다. 이어 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰함으로써 생리활성물질 검사가 수행될 수 있다.
도 6은 미세유체 아가로즈 채널(MAC)을 갖는 검사용 구조물을 이용하여 다수의 항생제를 동시에 검사하는 방법의 일 구현예를 나타낸다. 또한 도 7은 AST 수행 시 도 5의 검사용 구조물의 일부를 확대한 도면이다. 도 7을 참조하면, 항생제가 확산된 영역에서 단일 세포 단위의 박테리아의 성장을 관찰할 수 있으므로 항생제 감수성 시험을 할 수 있다.
본 발명에 따른 미세유체 채널 시스템은 상술한 바와 같이 다양한 구조를 가질 수 있다. 도 8은 미세유체 채널 형태의 검사용 구조물의 몇 가지 예들을 나타낸다. 왼쪽은 멤브레인형, 가운데는 방사형('Y형') 및 오른쪽은 방사형('K'형)을 나타낸다.
도 9는 멤브레인형의 미세유체 채널 시스템을 설명하기 위한 도면이다. 도 9의 (a)는 멤브레인형 미세유체 채널 시스템의 분해사시도이고, 도 9의 (b)는 멤브레인형 미세유체 채널 시스템의 평면도이다. 도 9에서 미세유체 채널 시스템은 멤브레인(membrane)을 포함하는 적층구조를 가질 수 있다. 이 경우 멤브레인의 존재로 인해 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널이 서로 직접적으로 접하는 것은 아니다. 하지만 멤브레인을 통해 채널들 사이에 생리활성물질이 수송될 수 있으므로 다수의 미세공극을 갖는 멤브레인을 사이에 두고 양 채널들이 간접적으로 접한다고 볼 수 있다. 멤브레인형 미세유체 채널 시스템의 맨 아래 층은 아가로즈와 박테리아의 혼합 용액이 채워지며 이때 멤브레인에 의해 막혀 맨 아래 층에만 아가로즈가 채워진다. 아래 층에 존재하는 제1 미세유체 채널은 길이를 증가시키도록 굴곡형으로 되어 있어 생리활성물질 확산시 인접한 교차지점 간에 생리활성물질 확산에 의한 오염을 방지한다. 다음 제일 위 층에 있는 제2 미세유체 채널을 통해 항생제를 흘려준다. 이때 두 개의 채널이 교차하는 지점에서 멤브레인을 통해 항생제가 확산된다. 멤브레인에 대해 아가로즈는 통과할 수 없지만 항생제는 확산에 의한 통과가 가능하다.
미세유체 채널을 사용함으로써 필요한 생물학적 물질과 생리활성물질의 양이 줄어들어 저렴한 비용으로 생리활성 검사를 할 수 있다. 또한 미세유체 채널 시스템을 이용하면 하나의 생물학적 물질에 대해 다양한 종류 및 농도의 생리활성물질에 대한 반응을 한번에 관찰할 수 있는 장점이 있다.
상술한 MAC 시스템은 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다. 바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야하고, 콘포컬 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentratiom, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다.
따라서 바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현예에 따른 MAC 시스템은 훌륭한 대안이 될 수 있다.
본 발명에 따른 검사용 구조물의 제2 예로서, 검사용 구조물은 다수의 마이크로 웰들을 구비한 플레이트 형태일 수 있다. 도 10은 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제2 예의 일 구현예를 나타낸다. 도 10의 (a)에서, 좌측은 평면도, 우측은 측면도, 그리고 하측은 정면도를 나타낸다. 먼저 검사용 구조물(1020)을 만들기 위해서는 박막형성용 구조물(1010)이 요구된다. 박막형성용 구조물(1010)은 몸체부(1012) 및 몸체부(1012) 위에 배치된 적어도 하나의 마이크로 웰(1014)을 수용부로서 포함하고 있다. 몸체부(1012)는 관찰의 용이성을 위해 투광성 재질로 된 것일 수 있다.
박막형성용 구조물(1010)의 마이크로 웰(1014)은 생물학적 물질과 액상 매질의 혼합 용액을 담을 수 있도록 소정의 깊이를 가지며, 이후 혼합 용액은 고화되어 고체 배지의 박막층을 형성한다. 도 10의 (b)는 (a) 그림에서 A-A' 선을 따라 절단한 마이크로 웰(1014)의 단면을 확대한 것이다. 좌측은 혼합 용액(1015)을 채우기 전이고 우측은 혼합 용액(1015)을 채운 후의 상태를 나타낸다. 혼합 용액(1015)을 박막형성용 구조물(1010)의 마이크로 웰(1014)에 붓고 일정 시간이 지나 혼합 용액이 굳게 되면 기판 표면을 스위핑하여 일정 높이 이상의 고체 및 웰 밖에 형성된 고체를 제거한다.
마이크로 웰(1014)의 규격은 상술한 일 구현예의 단계 S1에 대한 설명을 참조하면 되며, 바람직하게는 웰의 깊이 a가 1㎛ 내지 1mm, 바람직하게는 1㎛ 내지 500㎛, 더욱 바람직하게는 1㎛ 내지 100㎛이고, 웰의 너비 b는 1㎛ 내지 10mm, 바람직하게는 10㎛ 내지 1mm, 더욱 바람직하게는 10㎛ 내지 100㎛ 일 수 있다. 혼합 용액이 고화되면 생물학적 물질이 고정된 고체 박막(1016)이 만들어진다.
박막형성용 구조물(1010)에 생물학적 물질이 고정된 고체 박막(1016)이 도입됨으로써 검사용 구조물이 만들어진다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 웰들의 표준 배열은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)에서 발견되는 것을 포함하며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트가 있다.
일 구현예에 있어서, 박막형성용 구조물으로부터 만들어진 검사용 구조물은 생리활성물질이 담긴 멀티-웰 플레이트에 결합하여 사용하기에 적합하도록 다수의 정렬된 마이크로 웰들을 포함할 수 있다. 예를 들어 생리활성물질을 담기 위해 상용화된 96-웰 또는 384-웰 플레이트가 사용될 수 있다. 박막형성용 구조물(1010)은 멀티-웰 플레이트와 결합을 돕기 위한 체결부(1018)를 더 구비할 수 있다. 체결부(1018)는 예를 들어 요철 모양을 가져 멀티-웰 플레이트의 상단과 맞물려지도록 디자인될 수 있다.
도 10의 (c)는 박막형성용 구조물(1010)의 마이크로 웰(1014)에 고체 박막(1016)를 형성하여 제조한 검사용 구조물(1020)을 나타낸다. 검사용 구조물(1020)은 상술한 바와 같이 바람직하게는 몸체부(1012)가 투광성이어서 이를 통해 외부에서 고체 배지(1016) 내의 생물학적 물질을 관찰할 수 있다. 검사용 구조물(1020)은 생리활성물질을 포함하는 멀티-웰 플레이트의 상부를 덮으면서 각각의 마이크로 웰(1014)이 멀티-웰 플레이트의 웰에 대응되도록 결합될 수 있다. 본 명세서에서 (c)에 나타낸 검사용 구조물(1020)을 "아가패드(AgarPad)"로 명명하기로 한다.
일 구현예에 의하면, 검사용 구조물(1020)을 이용하여 항생제 감수성 검사(AST)가 수행될 수 있다. 도 11은 도 10의 검사용 구조물과 96-웰 플레이트를 이용하여 항생제 감수성 검사(AST)를 실시하는 과정을 나타낸다. 도 11을 참조하면, (a)에서 일반적인 96-웰 플레이트(1110)를 준비한다. 다음 (b)에서 항생제(1120)를 종류별, 농도별로 각 웰들(1130)에 채운다. (c)에서 박테리아가 고정된 아가로즈를 함유한 아가패드(1140)를 96-웰 플레이트(1110)와 결합한다. 이후 (d)에서 결합한 조립체를 아가패드(1140)가 아래로 가도록 뒤집음으로써 중력에 의해 아가패드(1140) 쪽으로 항생제(1120)이 이동되도록 한다. 항생제(1120)의 이동을 위해 중력 외에도 와류형 회전혼합(vortex mixing)이나 원심분리(centrifuge)등을 포함한 다양한 외력을 인가할 수 있다. 항생제 감수성 검사(AST)는 항생제(1120)가 아가패드(1140)가 수용하고 있는 아가로즈 고체 배지로의 확산을 통해 박테리아로 전달되는 방법으로 진행된다. 항생제(1120)의 확산이 시작되면 박테리아의 성장과정을 광학 측정장치(1150)로 관찰할 수 있다.
도 12는 아가패드와 96-웰 플레이트의 조립 및 뒤집음에 의해 항생제 감수성 검사를 시작하는 과정을 좀더 상세히 나타낸다. 먼저 웰(1130)에 항생제(1120)이 담긴 96-웰 플레이트(1110)를 준비한다. 아가패드(1140)는 96-웰 플레이트(1110)와 결합 홈(1142)을 통해 체결되고 웰(1130)이 밀폐된 상태인 조립체가 형성된다. 체결 후 전체 조립체를 뒤집으면 항생제(1120)는 아가패드(1140)의 마이크로 웰 내에 위치한 박테리아 세포가 고정된 아가로즈 박막(1144)과 접촉하게 된다. 이후 항생제(1120)는 아가로즈 박막(1144) 내부로 확산이 시작된다.
다른 변형예에 따르면, 미세유체 채널이 결합된 마이크로 웰 기반의 검사용 구조물이 제공된다. 본 검사용 구조물은 제1 예에서 설명한 다수의 마이크로 웰들을 구비한 플레이트와 유사하지만 이에 미세유체 채널이 결합된 형태이다. 상기 검사용 구조물은 미세유체 채널이 결합된 마이크로 웰 기반의 플레이트를 박막형성용 구조물으로 하여 상기 마이크로 웰에 생물학적 물질이 포함된 겔화성 액체 매질을 주입하여 고체 박막을 형성함으로써 제조될 수 있다. 상기 검사용 구조물은 상술한 제1 예에 따른 검사용 구조물과 유사하며, 상기 검사용 구조물을 이용하여 생리활성 검사를 하는 과정도 상술한 제1 예에 따른 검사용 구조물을 이용하여 생리활성 검사를 하는 과정과 대체로 유사하므로 상세한 설명은 생략하기로 한다. 다만 상기 검사용 구조물에 있어서, 생물학적 물질과 액체 매질의 혼합 용액의 주입이 미세유체 채널을 통해 이루어진다는 점에서 차이가 있다. 혼합 용액의 주입과정이 밀폐되지 않은 환경에서 이루질 경우 생물학적 물질이 인체에 노출될 위험이 있다. 따라서 마이크로 웰과 연결되는 미세유체 채널을 통해 혼합 용액을 주입함으로써 생물학적 물질이 외부 환경에 노출되지 않도록 한다. 또한 미세유체 채널을 통한 주입방식을 이용하면 필요한 적정량을 계산하여 마이크로 웰에 주입할 수 있으므로 손실되는 액체 매질 및 생물학적 물질의 양이 적어져서 비용이 절감될 수 있다.
박막형성용 구조물에 미세유체 채널을 형성하는 방식에 따라 하나의 기판에 다양한 디자인을 갖는 검사용 구조물이 만들어질 수 있다. 예를 들어 96개의 마이크로 웰을 갖는 박막형성용 구조물을 준비한 다음, 하나의 미세유체 채널 당 16개의 마이크로 웰들과 연결되는 미세유체 채널이 서로 독립적으로 6개가 존재하도록 디자인한다. 각 미세유체 채널을 이용하여 6가지 종류의 서로 다른 생물학적 물질을 포함한 액체 매질을 상기 마이크로 웰들에 주입 및 겔화하면 전체적으로 6가지 종류의 서로 다른 생물학적 물질이 도입된 검사용 구조물을 만들 수 있다. 이 경우 각 생물학적 물질 당 서로 다른 종류 및 농도의 생리활성물질 16가지에 대해 생리활성 검사를 동시에 실시할 수 있다. 결국 최대 96가지의 생리활성 검사가 가능하다.
검사용 구조물의 마이크로 웰들은 상용 멀티-웰 플레이트의 웰과 대응되므로 이와 결합하여 생리활성 검사에 이용한다. 도 13은 본 발명의 미세유체 채널을 구비한 마이크로 웰 기반의 플레이트를 이용한 빠른 항생제 감수성 검사(RAST) 시스템 및 실험 과정을 나타낸다. 도 13에서, a)는 미세유체 채널을 구비한 마이크로 웰 기반 플레이트의 전체 형태, b)는 사출성형으로 만든 미세유체 채널 및 마이크로 웰을 구비한 박막형성용 구조물, c)는 상용 96 웰 플레이트, d)는 여러 농도 및 여러 종류의 항생제를 담는 과정, e)는 종이 디스크를 구비한 마이크로 웰과 항생제가 담긴 웰을 정렬시키는 과정, f)는 박막형성용 구조물과 96 웰 플레이트의 조립체, g)-i) 시린지를 이용하여 박테리아가 혼합된 아가로즈를 주입하고 겔화하는 과정, j) 전체 조립체를 뒤집는 과정, k) 항생제가 중력에 의해 내려와 종이 디스크를 관통하여 아가로즈에 확산되는 과정, 및 l) 현미경을 사용하여 관찰하는 과정을 나타낸다. 상기 종이 디스크는 상기 마이크로 웰 내에 고리 형상의 채널을 형성하고 항생제의 확산에 도움을 주기 위한 것이다.
도 14는 미세유체 채널을 구비한 마이크로 웰 기반의 플레이트와 생리활성물질이 담긴 96 웰 플레이트의 조립체를 뒤집은 상태를 나타낸다.
일 구현예에서, 미세유체 채널을 구비한 웰 플레이트들 2개와 상기 웰 플레이트의 웰들에 대응하는 복수의 개구부를 갖는 웰 플레이트의 조립체를 이용한 검사 방법이 제공된다. 도 15는 일 구현예에 따른 미세유체 채널을 구비한 웰 플레이트 시스템을 이용한 생리활성 검사 과정을 나타낸다. 도 15를 참조하면, 미세유체 채널을 구비한 웰 플레이트들 2개와 상기 웰 플레이트의 웰들에 대응하는 복수의 개구부를 갖는 웰 플레이트를 준비한다. 상기 미세유체 채널을 구비한 웰 플레이트들 중 하나의 웰 플레이트의 웰들에는 항생제가 도포되어 건조 상태로 존재한다. 다음 웰 플레이트들 2개와 복수의 개구부를 갖는 웰 플레이트를 결합하여 조립체를 만든다. 상기 모든 웰 플레이트들의 웰들은 조립체 형성시 서로 대응되도록 형성되어 있다. 다음 한쪽의 웰 플레이트의 미세유체 채널을 통해 박테리아를 포함한 아가로즈를 주입하고 겔화시켜 고체 박막을 형성한다. 다음 상기 조립체의 형성에 의해 생긴 공간에 물을 공급하여 건조된 항생제가 희석되도록 한다. 결국 상기 공간에 액상의 항생제가 차게 되고 상기 조립체를 뒤집어서 생리활성 검사를 실시할 수 있다. 항생제는 용액 상태에서 시간에 따라 효능이 저하될 수 있다. 따라서 상술한 바와 같이 항생제가 액상이 아닌 건조된 약물 형태의 고상으로 존재하는 웰 플레이트를 제공할 경우, 항생제의 효능이 시간에 따라 저하되는 것을 방지할 수 있다. 감수성 시험을 할 경우에는 상기 건조된 약물에 물을 추가하면 약물 용액이 만들어지므로 즉시 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 검사용 구조물의 제3 예로서, 검사용 구조물은 평판(plate) 형태일 수 있다. 평판 형태의 검사용 구조물은 고형화를 함유하는 액체 매질을 고화시킨 박막 두께의 판을 지칭하며 여기에는 생물학적 물질이 고정되거나 생물학적 물질이 포함되지 않을 수 있다. 경우에 따라 평판 형태의 검사용 구조물은 고체 박막과 상기 고체 박막을 제조하기 위한 박막형성용 구조물과 함께 결합된 형태를 포함한다. 이와 같은 평판 형태의 검사용 구조물들을 통틀어 "마이크로 플레이트"로 명명하기로 한다.
일 구현예에 의하면, 마이크로 플레이트 형태의 검사용 구조물을 제조하기 위해 박막형성용 구조물이 사용될 수 있다. 상기 박막형성용 구조물은 소정 두께(통상 500㎛ 내지 1mm)의 고체 박막을 수용하기 위한 평판형 성형틀 및 상기 평판형 성형틀이 안으로 삽입되어 상기 고체 박막 두께의 틈을 갖는 내부 공간이 형성되도록 하는 평판형의 수용 도구를 포함할 수 있다. 상기 평판형 성형틀은 상기 수용 도구로부터 착탈 가능하다. 상기 박막형성용 구조물을 이용하면 다양한 규격의 마이크로 플레이트를 제조할 수 있다.
일 구현예에 의하면, 마이크로 플레이트 형태의 검사용 구조물의 제조방법이 제공된다. 먼저 수용 도구 및 상기 수용 도구와 착탈가능한 평판형 성형틀을 준비한다. 상기 수용 도구와 상기 평판형 성형틀은 서로 결합할 때 내부 공간이 있는 조립체, 즉 박막형성용 구조물이 만들어지도록 디자인된다. 상기 내부 공간은 이후 액상의 매질이 주입되어 고체 박막을 형성하는 공간이 된다. 이때 상기 고체 박막이 평판 형태를 갖도록 상기 평판형 성형틀과 상기 수용 도구 사이에는 박막 두께의 틈새 간격이 존재함으로써 상기 내부 공간도 얇은 평판 형태를 가진다. 다음 상기 수용 도구와 상기 평판형 성형틀을 결합하여 적어도 하나의 개구부를 갖는 조립체를 형성한다. 상기 개구부는 액상 매질을 주입하기 위한 것으로 상기 조립체의 윗쪽에 존재할 수 있다. 다음 고형화제가 함유된 액상 매질 및 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 개구부를 통해 상기 내부 공간에 주입한다. 이어서 상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성한다. 최종적으로 상기 조립체로부터 상기 고체 박막을 구비한 평판형 성형틀을 분리함으로써 마이크로 플레이트를 얻게 된다. 상기 평판형 성형틀은 고체 박막을 만들고 이를 수용하는 박막형성용 구조물의 역할을 할 수 있다.
도 16은 본 발명에 따른 검사용 구조물의 제3 예의 일 구현예를 나타낸다. 도 16에서 (a) 및 (b)는 각각 검사용 구조물의 전면부와 후면부를 나타낸다. 도 16을 참조하면, 검사용 구조물(1600)은 고체 박막(1610) 및 상기 고체 박막을 수용하는 평판형 성형틀(1620)을 구비한다. 평판형 성형틀(1620)은 액체 매질이나 고체 박막을 수용할 수 있도록 평판(1624) 및 테두리(1626)를 구비한다. 마이크로 플레이트를 이용하여 생리활성 검사시 용이한 관찰을 위해 평판(1624)은 투명 또는 반투명한 재질로 이루어질 수 있다.
평판형 성형틀(1620)은 마이크로 플레이트의 제작을 위한 박막형성용 구조물에 해당한다. 평판형 성형틀(1620)은 상술한 바와 같이 별도의 수용 도구와 결합하여 조립체를 만들 수 있다. 상기 조립체의 내부 공간은 상기 수용 도구와 평판형 성형틀(1620)의 존재에 의해 평판형을 가진다. 테두리(1626)는 통상 평판(1624)의 둘레를 따라 배치되어 고체 박막(1610)을 직사각형과 같은 모양이 되도록 한다. 테두리(1626)는 일정 두께를 가져서 액상 매질을 수용하고, 액상 매질이 적절한 두께의 고체 박막(1610)을 만들 수 있도록 한다. 또한 테두리(1626)는 고체 박막(1610)의 성형 완료 후, 평판형 성형틀(1620)을 상기 수용 도구와 분리할 때 고체 박막(1610)이 평판형 성형틀(1620)에 수용된 채로 상기 조립체로부터 안전하게 분리되도록 한다.
마이크로 플레이트 제작과정에서 액상 매질을 주입할 때 조립체 윗면의 개구부(1622)를 이용한다. 따라서 상기 조립체를 구성하는 평판형 성형틀(1620)의 윗면에 적어도 하나의 개구부(1622)가 존재할 수 있다. 평판형 성형틀(1620)은 원료 주입을 용이하게 하고 주입 시 버블이 발생하지 않도록 윗면에 개구부(1622)를 여러 개 구비할 수 있다.
평판형 성형틀(1620)은 또한 방지턱(1626a)을 더 구비할 수 있다. 방지턱(1626a)에 의해 개구부(1622)가 정의될 수도 있다. 한편 방지턱은 테두리(1626)와 마찬가지로 이후 수용 도구와 결합시 적절한 간격을 안정하게 유지하도록 일종의 스페이서와 같은 역할을 할 수 있다. 또한 상기 수용 도구와 합체 후 평판형 성형틀(1620)을 분리할 때 방지턱(1626)은 내용물인 고체 박막(1610)이 평판형 성형틀(1620) 밖으로 밀려나지 않고 안전하게 수용되며 분리되도록 내용물을 지지하는 역할을 할 수 있다.
상기 마이크로 플레이트는 통상의 슬라이드 글래스의 크기를 가질 수 있으며, 고체 박막의 두께는 10㎛ 내지 3mm, 바람직하게는 100㎛ 내지 1mm, 더욱 바람직하게는 500㎛ 내지 1mm가 될 수 있다. 검사용 구조물(1600)의 평판(1624)에는 고체 박막(1610) 내의 세포 개수의 파악이 용이하도록 격자(grid)가 설치될 수도 있다.
검사용 구조물(1600)은 상술한 바와 같이 일정 형태의 수용 도구를 통해 성형되는데, 수용 도구의 형태에 따라 삽입형 또는 슬라이드형의 방법으로 성형될 수 있다. 상기 수용 도구는 폴리카보네이트와 같은 투명 플라스틱 재질로 만들어질 수 있으며 미세 가공법(micromachining process)으로 제조될 수 있다.
도 17 및 도 18은 각각 삽입형 및 슬라이드형의 수용 도구를 사용하여 검사용 구조물을 제조하는 예들을 나타낸다. 각각의 도면에서 (a)는 수용 도구와 평판형 성형틀의 결합 방식을 나타내고, (b)는 수용 도구와 평판형 성형틀의 조립체의 윗쪽 개구부를 통해 액상의 원료를 주입하는 과정을 나타낸다.
도 17에서, 삽입형 수용 도구(1700)는 두 개의 평판들, 즉 제1 평판(1710)과 제2 평판(1720)이 서로 결합된 형태를 가질 수 있다. 평판형 성형틀(1620)은 삽입형 수용 도구(1700)의 개구부를 통해 삽입하는 형식으로 조립된다. 삽입 후의 조립체는 전체적으로 원료를 주입하기 위한 개구부를 제외하고 모든 면이 폐쇄된 평판의 형상을 가질 수 있다. 삽입 후에는 평판형 성형틀(1620)의 평판(1624)과 삽입형 수용 도구(1700)의 제2 평판(1720) 사이의 내부 공간을 채우면서 고체 박막의 원료인 액상 매질이 주입될 수 있다. 겔화 공정을 마치고 내부 공간에 고체 박막이 생성되면 평판형 성형틀(1620)이 삽입형 수용 도구(1700)와 분리됨으로써 검사용 구조물이 얻어진다. 삽입형 수용 도구(1700)의 내부에 삽입된 평판형 성형틀(1620)의 분리시 수작업의 용이성을 위해 삽입형 수용 도구(1700)의 일면에는 개구부(1715)가 형성될 수 있다.
도 18에서, 슬라이드형 수용 도구(1800)는 일면이 개방된 평판형 성형틀 형태를 가질 수 있다. 도 18의 슬라이드형 수용 도구(1800)를 이용하여 검사용 구조물을 성형하는 과정은 수용 도구(1800)의 일면이 개방된 점을 제외하고 도 17에서 상술한 바와 같다.
도 19는 마이크로 플레이트를 제조하는 전체 공정의 예를 나타낸다. 도 19에서 a)는 마이크로 플레이트 제조용 수용 도구와 액상 Mueller-Hinton Agar(MHA)의 준비과정, b)는 수용 도구와 평판형 성형틀의 조립과정, c)는 MHA를 주입하는 과정, d)는 MHA를 겔화하는 과정, e)는 수용 도구와 평판형 성형틀의 분리과정, f)는 최종 생성된 마이크로 플레이트를 나타낸다.
일 구현예에 의하면, 상술한 방법으로 제조된 마이크로 플레이트를 이용하여 생리활성 검사하는 방법이 제공된다. 상기 검사 방법은 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 마이크로 플레이트를 제공하는 단계; 생리활성물질을 상기 고체 박막에 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 단계를 포함한다.
상기 마이크로 플레이트는 고형화제에 의해 액상 매질이 고화되어 생성된 세포가 고정된 고체 박막을 이용하므로 단일 세포의 시간에 따른 성장을 추적할 수 있어 세포의 분화 연구에 기여할 수 있다. 예를 들어 마이크로 플레이트의 두께가 10㎛ 내지 1mm 정도로 만들어질 수 있으며 이는 현미경용 슬라이드 글래스와 호환가능하다. 상기 마이크로 플레이트를 이용하면 생리활성물질이 확산에 의해 빠른 속도로 고체 박막에 흡수되며, 단일 세포의 성장을 추적함으로써 용이하게 최소 억제농도(MIC, minimal inhibitory concentration)와 같은 정보를 얻는 것이 가능하다. 또한 상기 마이크로 플레이트를 이용하면 다양한 응용이 가능하다. 예를 들어 호기 및 혐기 조건에서 박테리아의 성장을 모사할 수 있고, 포자 발아(spore germination)를 모니터할 수 있으며, live/dead cell assay를 할 수 있다.
생리활성 검사를 수행하는 방법의 일 구현예에서, 관찰하고자 하는 세포가 고정된 고체 박막을 갖는 마이크로 플레이트 위에 생리활성물질을 흡수시킨 생리활성물질 보유매체를 배치하여 생리활성물질의 확산에 의한 효과를 관찰할 수 있다. 상기 생리활성 보유매체는 하이드로겔의 형태를 가질 수 있다. 상기 생리활성물질보유매체는 생리활성물질과 액상 올리고머를 혼합하고 혼합 용액을 열경화 또는 광경화하는 방식으로 경화하여 제조될 수 있으며 이의 제조방법과 관련하여 본 발명자의 대한민국 등록특허 제10-1101310호는 본 명세서에 참조로써 통합된다.
다양한 생리활성물질을 검사하기 위해서 상기 생리활성물질전달 입자에 형상 코드, 초상자성을 이용한 컬러 코드 또는 형광 코드 등의 다양한 코드를 넣어서 코드화된 입자를 제조할 수 있다. 상기 입자를 코드화하는 방법의 예로, 광학적 리소그래피 방법을 적용하여 패터닝하는 방법을 적용할 수 있다. 상술한 바와 같이, 생리활성물질전달 입자의 제조에 광경화성 수지를 적용하고, 이를 광학적 리소그래피 방법으로 패터닝함으로써 수행할 수 있다. 일 예로서, 대한민국 등록특허 제10-1004769호의 광유체적 리소그래피 방법, 미국 등록특허 제7709544호의 유체 리소그래피 법 및 중합법을 적용할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 공지의 다양한 리소그래피법이 적용될 수 있다. 입자를 코드화하는 방법은 일 예로서, 상기 광경화성 폴리머 상에, 광 경화의 정도에 따라 서로 구분되도록 ‘1’ 및 ‘0’을 의미하는 표지를 각각 패터닝함으로써 상기 입자 상에 코드를 형성할 수 있다. 상술한 광학적 리소그래피 방법은 일 예로서, 마스크를 사용하지 않는 디지털 마이크로미러 장치 등을 이용하는 경우, 상기 타겟물질을 포함하는 입자에 대하는 많게는 백만 개 이상의 다양한 종류의 코드를 형성할 수 있는 장점을 가질 수 있다. 다른 예에 의하면, 상기 입자를 컬러 코드화하기 위해 자성 나노입자를 이용하는 방법을 적용할 수 있다. 상기 자성 잉크를 이용하는 방법은 일 예로서, 대한민국 특허출원 제10-2010-0029613호에 게시된 바와 같이, 자성 나노 입자를 포함하는 광경화성 물질을 제공하고 외부 자기장을 인가하여 상기 광경화성 물질 내의 상기 자성 나노 입자를 정렬시킨다. 그리고, 외부로부터 광을 인가하여 상기 광경화성 물질을 경화시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 외부 자기장의 세기에 의하여 자성 나노 입자들 간의 배열이 변화하여 서로 다른 색상을 발현할 수 있다. 이러한 기술을 적용하여 상기 입자의 일 영역에 자성 나노 입자들을 서로 차별되도록 배열시킴으로써 입자를 컬러 코드화할 수 있다. 또 다른 예에 의하면, 상기 입자를 코드화하는 방법은 서로 구분되는 다양한 색상의 형광물질을 상기 입자에 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 생리활성물질의 종류에 따라 서로 구분되는 코드를 가지도록 제조된 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체가 준비될 수 있다. 일 구현예에 의하면 코드화된 생리활성물질 보유매체를 이용하면 마이크로 플레이트와 같은 검사용 구조물 위에서 다중 분석(multiplexing assay)을 할 수 있다. 상기 다중 분석 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다. 먼저 생리활성물질을 함유하며 상기 생리활성물질의 종류에 따라 서로 구분되는 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 준비한다. 다음 상기 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 생물학적 물질을 함유한 고체 박막을 구비한 검사용 구조물 위에 제공한다. 이어 상기 검사용 구조물 위의 특정 위치에 배치된 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독한다. 다음 상기 생리활성물질의 확산에 따라 상기 특정 위치에 존재하는 상기 생물학적 물질의 변화를 측정한다. 상기 코드화는 형상 코드, 컬러 코드, 및 형광 코드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 코드에 의해 생성될 수 있다.
도 20은 다중 분석을 위해 코드화된 생리활성물질 보유매체의 일 구현예로서 코드화된 미세입자를 나타낸다. 도 20의 (a)는 다양한 종류 및 농도를 갖는 생리활성물질이 함유된 코드화된 미세입자의 예들이고 도 20의 (b)는 실제 액상 광경화성 올리고머를 경화시켜 제조한 형상 코드화된 하이드로겔 미세입자의 사진이다. 도 21은 마이크로 플레이트 위에서 다중 분석하는 과정을 개략적으로 나타낸다. 코드화된 입자(2110)를 사용함으로써 단일 마이크로 플레이트(2120) 위에 수백 가지(500~1000개)의 생리활성물질을 검사할 수 있다.
일 구현예에서, 코드화된 입자 및 검사용 구조물을 이용한 다중 분석용 검사 시스템이 제공된다. 상기 다중 분석용 검사 시스템은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막 형태의 검사용 구조물; 상기 검사용 구조물에 생리활성물질을 공급하기 위한 코드화된 생리활성물질 보유매체; 상기 검사용 구조물을 지지하고 관찰하기 위한 스테이지; 및 상기 검사용 구조물의 위치 정보에 따라 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독하고 상기 코드화된 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따른 상기 생물학적 물질의 변화를 관찰하기 위한 측정장치를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 검사용 구조물은 표면에 상기 생리활성물질 보유매체를 수용하기 위한 웰들을 구비할 수 있다.
도 22는 다중 분석용 검사 시스템의 일 구현예를 나타낸다. 다중 분석용 검사 시스템은 생리활성물질이 함유된 코드화된 입자(2202), 검사용 구조물(2204), 스테이지(2210) 및 광학 측정장치(2220)를 포함한다. 코드화된 입자(2202)는 검사용 구조물(2204)의 웰들(2206)에 도입되어 검사용 구조물(2204) 위에 정렬될 수 있다. 광학 측정장치(2220)를 통해 코드화된 입자(2202)의 코드를 판별함으로써 생리활성물질의 종류 및 농도별로 생물학적 물질의 변화를 관찰할 수 있다.
광학 측정장치(2220)는 관찰대상으로부터 이미지를 얻는 이미지화 시스템(2222) 및 얻어진 이미지를 처리하고 분석하는 이미지 처리부(2224)를 포함한다. 스테이지(2210)는 검사용 구조물(2204)을 지지하고, 원하는 위치에서 관찰을 하기 위해 가로, 세로, 및 높이 방향으로 검사용 구조물(2204)을 이동시킬 수 있다. 바람직하게는 완전 자동화를 위해 스테이지(2210)는 모터로 구동될 수 있다. 광학 측정장치(2220)의 이미지화 시스템(2222)은 대물 렌즈, 미러, 조명 및 CCD나 CMOS 카메라와 같이 대상물을 이미지화하기 위한 요소들을 포함할 수 있다. 이미지 처리부(2224)는 용이한 통계적 처리를 위해 원 이미지를 가공하여 유용한 데이터를 획득하고 분석한다. 상기 검사 시스템을 이용하면 실시간 이미징을 통해 수 시간 이내에 다중 분석 결과를 얻을 수 있다.
상술한 검사 시스템은 코드화된 약물 보유매체(코드화 미세입자의 경우 약 50~500 um 직경을 가짐)를 접목하여 한번에 수백 가지의 약물을 빠른 시간 내에 분석할 수 있어서 다중분석 약물 스크리닝이나 항생제 감수성 시험 등에 매우 유용한 장점을 가진다.
이하 본 발명의 다양한 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명하고자 하나 본 발명의 사상이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 미세유체 채널
미세유체 채널 제조
6개의 가지를 갖는 방사형의 미세유체 채널을 통상의 소프트 리소그래피법에 의해 제조하였다. 먼저 SU8 (microchem, 2015 SU8) 수용 도구를 포토리소그래피로 제조하였다. 폴리디메틸실록산(PDMS, 다우코닝)을 경화제와 10:1 중량비로 혼합하여 SU8 수용 도구에 부어 넣었다. 150℃에서 10분 동안 베이킹한 후, 상기 PDMS를 벗겨내고 O2 플라즈마처리한 후 PDMS 코팅된 슬라이드 글래스에 상기 PDMS를 부착하였다.그 결과 항생제가 없는 대조구를 포함하여 5가지 종류의 농도를 갖는 항생제를 검사할 수 있는 방사형 미세유체 채널 칩을 얻었다. 방사형 미세유체 채널 칩은 칩 내부가 6개의 주 채널이 형성되고 각 주 채널마다 곁가지 채널을 구비하였다. 주 채널의 폭은 500㎛이고 곁가지 채널의 폭은 200㎛였다. 두께는 각각 30㎛였다. 주 채널들에는 아가로즈와 박테리아의 혼합물이 흐르게 되고, 곁가지 채널들에는 생리활성물질이 흐르게 된다. 각 주 채널의 중간에는 아가로즈와 생리활성물질 사이의 계면을 생성하기 위한 마이크로 크기의 기둥 형태의 앵커들이 존재한다. 상기 기둥들은 아가로즈가 곁가지 채널 쪽으로 흐르는 것을 막는다. 상기 기둥들의 크기 및 기둥들 사이의 간격은 수학적으로 계산되어 정해진다. O2 플라즈마 처리 후 채널의 소수성때문에 표면장력을 증가시키기 위해 실험 하루 전에 채널을 준비하였다.
박테리아 고정 및 박테리아 세포 성장의 추적
박테리아를 고정하고 항생제의 확산 매질로 사용하기 위해 아가로즈(Invitrogen의 UltraPure agarose)를 미세유체 채널에 주입하였다. 아가로즈는 독성이 없고 생체적합하여 박테리아나 균류의 배양에 널리 사용된다. 또한 구멍이 많아 DNA 분리에도 널리 사용된다. 따라서 DNA, 단백질과 같은 거대분자들을 포함한 대부분의 화학물질과 항생제가 아가로즈에 자유롭게 확산될 수 있다.
아가로즈는 36℃ 미만에서 고화된다. 박테리아 배양균을 45℃에서 2% 아가로즈와 1:3 부피비로 섞은 후 즉시 미세유체 채널에 주입하고 25℃에서 1분 안에 고화시켰다. 얻어진 미세유체 아가로즈 채널(MAC) 칩을 핫플레이트에 넣고 37℃에서 배양하였다. 영양분의 제공을 위해 액상의 CAMHB 매질을 곁가지 채널을 통해 공급하였다. 다음 박테리아의 성장을 현미경으로 관찰하였다. MAC 시스템 내에서 박테리아의 성장은 방해받지 않았으며 선명히 모니터될 수 있었다.
도 23은 미세유체 아가로즈 채널(MAC) 시스템 내에서의 박테리아 고정 및 박테리아 성장의 추적과정을 나타낸다. 도 23을 참조하면, 시간경과에 따라 현미경 이미지를 얻음으로써 박테리아의 성장을 보며 모니터할 수 있다. 관찰 결과 두 가지 형태의 성장 특징이 나타난다. 첫째는 박테리아가 둘로 나뉘어지는 형태(dichotomic cell type, 큰 원)이고, 둘째는 집합성 형태(aggregative cell type, 작은 원)이다. 상기 집합성 형태는 생체막(biofilm)으로 추정된다.
이미지 프로세싱
CCD 카메라를 사용하여 이미지를 얻은 후, 얻어진 이미지들을 가공하여 박테리아에 대한 MIC 값들을 결정하였다. 이미지 데이터들은 Matlab에 코드화된 프로그램에 의해 디지털 데이터로 변환되었다. RGB 형식의 가공안된 이미지 데이터를 그레이 형식으로 바꾼 다음 배경 데이터를 지워 노이즈 없이 선명한 데이터를 얻었다. 다음 콘트라스트를 증가시켜 이미지를 이진 형식(binary format)이 되도록 하였다. 도 24는 이미지 프로세싱 프로그램에 의한 이미지 처리 과정을 나타낸다. 도 24는 (a) RGB 이미지, (b) 그레이 포맷으로 변환 (c, d) 백그라운드 제거 및 최적화, (e) 처리된 이미지의 콘트라스트 증강을 위한 이진 포맷으로의 변환의 과정을 나타낸다.
Matlab 프로그램은 박테리아에 의해 점유된 영역을 계산한다. 배양시간이 길어질 수록 박테리아 세포가 자라게 되어 더 많은 영역을 점유하며 점유된 영역은 이미지 프로세싱 프로그램으로 측정된다.
박테리아 세포가 아가로즈 내에서 성장할 때에는 도 23과 같이 두 가지 형태로 자라게 된다. 이미지 프로세싱 프로그램은 점유 영역의 크기에 따라 박테리아의 성장을 계산하므로 두 가지 형태의 세포 성장형태에 모두 잘 적용될 수 있다. 보통의 dichotomic cell type은 잘 알려져 있지만, aggregative cell type은 체내(in vivo) 환경에서 알려져 있을 뿐 체외(in vitro) 환경에서는 아직 보고되지 않았다. 본 발명에 따른 MAC 시스템은 aggregative cell type(생체막)에 대한 연구에 도움을 줄 수 있다.
미세유체 아가로즈 채널 시스템 내에서의 항생제 감수성 시험
5×108 cells/ml 농도의 박테리아 세포들을 포함한 Mueller-Hinton agar(MHA) 액상 매질 200㎕와 2% 액체 아가로즈 600㎕를 45℃에서 와류 생성기(vortex generator, vortex Genie 2)를 이용하여 철저히 혼합하였다. 상기 아가로즈 및 박테리아 혼합물을 시린지 펌프(KdScience)를 사용하여 미세유체 채널의 주 채널에 2ml/hr의 안정한 유속으로 주입하여 곁가지 채널 쪽으로 넘치지 않도록 하였다. 실온에서 액상의 아가로즈를 고화시킴으로써 주 채널 내부의 박테리아를 고정한 후, 항생제를 포함하는 MHA 매질을 시린지 펌프를 이용하여 10㎕/hr의 속도로 곁가지 채널에 주입하여 아가로즈-박테리아 혼합물 속으로 확산시켰다. 박테리아 성장을 40X 현미경 및 CCD 카메라로 모니터하였다. 박테리아 성장 이미지들을 매 한 시간마다 찍어 이미지 처리 프로그램으로 분석하였다.
미세유체 아가로즈 채널(MAC) 내에서 빠른 항생제 감수성 시험(Rapid antibiotics susceptibility test, RAST) 시스템의 검증을 위해, 통상의 실험용 박테리아들(Escherichia coli DH5α 및 Bacillus subtilis ATCC 6633)과 Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI)의 세 가지 표준 박테리아들(Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 및 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853)을 대상으로 시험하였다. 상기 시험을 통해 몇 가지 항생제들의 MIC 값들을 결정하였다. 사용한 항생제들은 아미카신(amikacin), 노르플록사신(norfloxacin), 테트라사이클린(tetracycline) 및 젠타마이신(gentamycin)이었다.
모든 경우에 있어서, MIC 값들은 적은 양의 항생제, 매질 및 박테리아(30,000 cells/one assay)를 가지고 2~4시간 내에 결정되었다. 얻어진 MIC 값들은 전통적인 방법(미량 희석법)으로 확증하였고 CLSI의 MIC 데이터와 비교하였다.
하기 표 1은 CLSI의 세가지 표준 균주들을 대상으로 RAST 방법으로 시험하여 결정된 세가지 항생제들의 MIC 값들을 CLSI의 MIC 값들과 비교한 것이다(단위: ㎍/ml) .
[표 1]
Figure 112012084796854-pat00001
결론적으로 본 시스템은 MIC 측정을 위한 분석 시간과 배지, 항생제 및 박테리아 세포들의 양을 혁신적으로 감소시켰고 종래 시스템과 비교할 때에도 다르지 않은 MIC 결과를 나타내었다.
도 25는 이미지 처리를 통한 MIC 측정 결과를 나타낸다. 도 25의 (a)는 S. aureus ATCC 29213에 대한 gentamycin의 MIC 측정을 나타낸다. 왼쪽 그룹의 이미지들은 RGB 형식의 가공하지 않은 이미지들이고, 오른쪽 그룹의 이미지들은 명확한 관찰을 위해 가공한 이미지들이다. 이미지 처리 후 배양 시간에 따른 여러 농도의 항생제에 대해 박테리아 점유 영역을 측정하여 그래프를 플롯하였다. 그래프에서 배양시간에 따라 다른 농도는 박테리아 성장을 증가시키는데 반해, 1㎍/ml 및 2㎍/ml 농도들은 박테리아를 성장시키지 않았다. 이 결과로부터 S.aureus ATCC 29213에 대한 gentamycin의 MIC는 1㎍/ml이다. 도 25의 (b)는 P. aeruginosa ATCC 27853에 대한 gentamycin의 MIC 측정을 나타낸다. 마찬가지로 P. aeruginosa ATCC 27853에 대한 gentamycin의 MIC는 2㎍/ml이다. 상기 MIC 값들은 표 1에 나타내었듯이 CLSI 데이터의 MIC의 범위에 속한다.
본 발명에서 제공하는 MAC와 같은 미세유체 채널 시스템은 분석 시간을 혁명적으로 줄일 수 있고 분석에 필요한 항생제, 배양액 및 박테리아 세포의 양을 절감할 수 있다. 본 발명의 MAC 시스템은 현재까지 알려진 AST 시스템 중 가장 빠르고 정확한 시스템이라 할 수 있다. MAC 시스템에 있어서, 고화된 아가로즈를 미세유체 채널에 도입함으로써 박테리아는 약 30㎛ 두께의 얇은 아가로즈 매질에 고정되고 여러 농도의 항생제를 확산시키고 배양시간에 따라 현미경으로 박테리아 단일 세포의 성장을 추적한다. 이후 이미지 처리 프로그램을 이용해 성장 이미지들을 가공함으로써 MIC 값을 측정한다. 전체 시간이 3~4 시간밖에 걸리지 않아 신속한 시스템인 동시에 CLSI의 통상의 AST 결과들과도 일치하므로 매우 정확하다.
도 26은 시간경과에 따라 단일 세포로부터 바이오필름이 형성되기까지의 과정을 현미경으로 관찰한 사진이다. 도 26은 도 3의 MAC 시스템 중 주채널과 곁가지 채널이 인접한 부분을 확대한 것이다. 도 26으로부터, 3시간 숙성만으로 바이오필름이 생성될 수 있음이 관찰된다.
도 27은 MAC 시스템을 이용하여 항생제 농도별로 바이오필름의 변화를 관찰한 것이다. 도 27을 참조하면, P.aeruginosa ATCC 27853 균주를 이용하여 노르플록사신(norfloxacin) 항생제에 대한 감수성 시험을 한 결과, MAC 시스템에서 4 시간 숙성하여 바이오필름이 형성된 후에 MIC 값이 32 ㎍/ml 수준으로 증가함을 알 수 있다. 참고로 P.aeruginosa ATCC 27853 균주의 CLSI MIC는 1~4 ㎍/ml이다.
도 28은 두 종류의 균주들의 바이오필름의 형성 단계들을 시간별로 관찰한 BF 이미지들(Bright Field images)이다. 도 28의 아래쪽 박스 안의 그림은 종래 문헌에 기술된 총 5단계로 이루어진 바이오필름 형성 단계들의 모식도와 현미경 사진을 나타낸다. 도 28을 참조하면, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 균주와 Staphylococcus aureus ATCC 29213 균주가 각각 단일 세포 단위의 개체들이 군집을 이루어 바이오필름을 형성하는 과정을 매우 선명하게 관찰할 수 있다. 특히 종래 시스템에서는 관찰이 매우 어려웠었던 바이오필름으로부터 단일 세포가 방출되는 과정(5단계)을 뚜렷하게 볼 수 있다. MAC 시스템에서 새로운 형태의 세포 성장 모폴로지를 발견하였으며 이러한 새로운 형태의 바이오필름(NTB)은 종래 보고되지 않은 것이다. NTB의 형성은 박테리아 세포들이 아가로즈에 의한 고정화 단계에서 받는 스트레스에 기인하는 것으로 보인다.
상술한 바와 같이 MAC 시스템을 이용하면 빠른 시간 내에 바이오필름 형성을 관찰할 수 있을 뿐 아니라, 광학 현미경만으로 직접 관찰할 수 있어 관찰이 매우 용이하다. 또한 MIC 또는 MBEC을 간편하게 측정할 수 있다. 작은 시스템 크기, 다중분석(multiplexing assay)이 가능한 것도 장점이다. MAC 시스템은 바이오필름 형성 단계들을 잘 보여줄 뿐 아니라 체내 박테리아 감염 및 바이오필름 형성을 대표할 수 있다. 결국 MAC 시스템은 바이오필름 어세이를 하는 데 있어서 매우 좋은 도구가 될 수 있다.
2. 마이크로 플레이트
(제조예)
박테리아 준비
E.coli 및 B. subtilis 균주들을 10nm Mueller-Hilton(MH) broth에서 적정 온도(E.coli: 37℃, B. subtilis: 30℃)로 밤새 성장시켰다. 다음 배양된 cell broth 100㎕를 신선한 MH broth 10ml에 접종하고 5~6 시간동안 광학밀도(OD) 0.5~0.6가 될 때까지 배양하였다.
마이크로 플레이트 제작
슬라이드 글래스 크기(76mm X 26mm X 1mm)의 한천 플레이트를 제작하였다. 마이크로 플레이트 제조용 수용 도구에 평판형 성형틀을 삽입하고 액상의 Mueller-Hilton Agar(MHA)를 주입한 후 1분을 기다려 MHA가 고화되도록 하였다. 마이크로 플레이트 제조용 수용 도구를 제거하여 1mm 두께의 한천 플레이트를 얻었다.
박테리아에 대한 감수성 검사를 할 경우에는 박테리아를 함유하는 배지를 액상의 MHA와 혼합한 다음 마이크로 플레이트 제조용 수용 도구에 주입하여 박테리아가 함유된 한천 플레이트를 얻었다.
코드화된 입자 제조
액상의 광경화성 올리고머를 UV광으로 선택적으로 경화시켜 하이드로겔 미세입자들을 얻었다. 광경화성 올리고머는 폴리에틸렌 글리콜 (700) 디아크릴레이트 (PEG-DA)와 10 중량%의 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(UV 개시제)을 포함하였다. 컴퓨터 제어되는 프로그램가능한 2차원 공간 광 모듈레이터들(SLMs)을 사용하여 다양한 형상 코드(graphical code)를 갖는 입자를 제조하였다. 액상 올리고머 내에서 SLMs를 제어하여 다양한 형상 코드가 새겨진 입자를 얻었으며, 입자의 직경은 200㎛, 두께는 50㎛였다. 잔존 올리고머를 세척하여 제거한 후 입자에 대해 후 경화를 하여 완전 경화된 하이드로겔 입자를 얻었다. 데시케이터에서 6시간 동안 하이드로겔 입자를 건조시킨 다음 12시간 동안 항생제들을 하이드로겔 미세입자에 흡수시켰다. 항생제 흡수 단계가 끝난 후 입자를 12시간 동안 데시케이터에서 건조시켰다.
생리활성 검사에 응용하기 위해 하이드로겔 미세입자들에 카나마이신(kanamycin) 또는 암피실린(ampicillin)을 로딩하였다. 하나의 입자는 약 3.7nl의 항생제 용액을 함유하였으며 한 입자 당 항생제의 무게를 측정하였다. 미세입자들은 암피실린을 각각 300ng, 150ng, 75ng, 37.5ng, 18.8ng 또는 0ng 함유하거나 카나마이신을 각각 150 ng, 75ng, 37.5ng, 18.8ng, 9.4ng 또는 0ng 함유하였다.
(시험예)
단일 세포 이미지화
마이크로 플레이트 위에서, B. subtilis 및 E.coli의 단일 세포 성장을 추적하고 이미지들을 얻을 수 있었다. 배양된 cell broth 약 1㎕를 상기 제조예에서 얻은 MHA 마이크로 플레이트 위에 적재하였고, 이후 현미경(X400)을 사용하여 0, 60, 120 및 180분에서 단일 세포 성장을 관찰하였다. B. subtilis 및 E.coli의 둘다에서 단일 세포가 추적되었고 이분법(binary fission) 성장을 확인하였다.
도 29는 여러 생물학적 물질들의 성장변화를 시간경과에 따라 관찰한 현미경 이미지들이다. 도 29의 (a) 및 (b)는 각각 마이크로 플레이트 표면 위에서 B. subtilis 및 E.coli의 단일 세포 성장을 관찰한 사진이고, 도 29의 (c)는 마이크로 플레이트 내부에서 B. subtilis의 단일 세포 성장을 관찰한 사진이다.
만일 세포를 MHA 매질에 혼합시킨 후 마이크로 플레이트 표면 아래에서 성장하도록 한다면 이러한 조건은 혐기성 조건이고 마이크로 플레이트 표면 위에서 성장하도록 한다면 호기성 조건이 될 수 있다. 즉 마이크로 플레이트를 사용하면 혐기성 세균과 호기성 세균 모두를 배양하면서 관찰할 수 있다. 도 29의 (a)를 참조하면, B. subtilis 세포를 마이크로 플레이트 위에 적재하고 단일 세포 성장을 관찰하면 세포가 막대형 구조를 나타낸다(호기성 조건). 도 29의 (c)를 참조하면, LB 배지에서 한천을 혼합한 B. subtilis 세포를 마이크로 플레이트 내부에 적재하여 단일 세포 성장을 관찰하면 세포가 필라멘트형 구조를 나타낸다(혐기성 조건). 상기 결과로부터 마이크로 플레이트 시스템은 호기성 및 혐기성 조건 둘다에서 사용가능하므로 많은 노동 및 장비가 절감될 수 있다. 더욱이, 마이크로 플레이트는 산화성 스트레스, 항생제, 호기성, 혐기성 조건 등 다양한 조건에서 세포 분화 연구에 더 많이 적용될 수 있다.
또한, 마이크로 플레이트 시스템을 이용하여 포자 발아(spore germination) 2XYT 매질로 40배 희석시킨 후 50℃에서 10분간 열충격을 준 후 얼음에 넣어 냉각하였다. 마이크로 플레이트 위에 상기 포자 용액 1㎕를 적하하고 3 내지 5㎕의 MHA 매질을 겹쳐서 고정시켰다. 고정된 포자는 현미경으로 관찰되었다.
도 29의 (d)는 S. coelicolor의 포자 발아 과정을 관찰한 사진이다. 각 사진은 40배 대물렌즈로 관찰된 것이다. 야생 상태의 포자에서, 포자의 발아가 선명하게 관찰되었으며 포자 적재 후 6시간 후에 발아가 시작되어 관찰이 끝나는 11시간까지 계속적으로 마이셀리움(mycellium)을 연장하였다. 마이크로 플레이트 시스템을 통해 두가지 종류의 돌연변이체(mshA 및 sigR-rsrA)의 발아를 야생형의 발아와 비교하였다. 그 결과 mshA 돌연변이체의 경우 야생형과 비교해 한 시간의 지연이 관찰되었고, sigR-rsrA 돌연변이체의 경우 야생형에 비해 보다 적은 발아가 관찰되었다. 상술한 결과로부터 마이크로 플레이트를 사용할 경우 고체 매질 위에서 포자의 발아를 추적할 수 있음을 최초로 확인할 수 있었다.
상술한 마이크로 플레이트를 이용하여 단일 세포 이미지화 방식을 이용하면 박테리아의 모폴로지 및 생리학에 대해 더욱 심도있는 연구에 기여할 수 있다. 마이크로 플레이트를 이용하면 종래의 얇은 한천 패드법과 달리 박테리아 세포들이 배양될 수 있거나 오랜시간 관찰될 수 있다. 또한 종래의 두꺼운 한천 플레이트와 달리 매우 얇은 수십 내지 수백 ㎛ 크기의 두께에서 관찰하므로 단일 세포 성장의 추적이 가능하다. 또한 고체 매질 위에서 포자 발아 과정을 관찰할 수 있으므로 이 영역에서 마이크로 플레이트의 다양한 응용가능성이 확인되었다.
항생제 감수성 시험
상술한 방법으로 제조된 E. coli 세포나 B. subtilis 세포가 혼합된 마이크로 플레이트 상에 암피실린 또는 카나마이신을 함유한 각 미세입자들을 로딩하였다. 다음 미세입자들 주위의 세포 성장을 현미경으로 시간에 따라 관찰하였다.
도 30은 각 미세입자 내 카나마이신의 함유량에 따른 E. coli 세포의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 도 30을 참조하면, 많은 양의 항생제를 함유하는 미세입자(한 미세입자 당 75ng인 경우) 주위에는 박테리아 성장이 억제됨을 알 수 있었다(MIC 초과범위). 반면 항생제를 사용하지 않거나 적은 양의 항생제를 함유하는 미세입자에서는 박테리아의 성장이 관찰되었다(MIC 미만 범위).
마이크로 플레이트 시스템 상에서 미세입자를 이용하여 AST를 수행할 경우 한천 플레이트 상에서 통상의 AST를 할 때보다 훨씬 효율적이다. 비교를 위해 통상적으로 널리 쓰이는 시험법인 디스크 확산 AST(즉 Kirby-Bauer test)를 수행하였다.
디스크 확산 AST에서는 박테리아가 접종된 한천 플레이트 상에 항생제를 함유한 필터 디스크가 놓였다. 박테리아의 감수성은 16 내지 24시간이 지난 후 항생제 필터 디스크 주위의 투명대(clear zone) 직경을 측정함으로써 확인되었다. 감수성 시험을 위해 하나의 플레이트 당 약 20ml의 한천 배지 및 하나의 필터 디스크 당 약 10 내지 100㎍의 항생제가 필요하였다. 본 시험을 위한 하나의 플레이트 상에는 약 20개의 필터 디스크들(각 6mm 직경)만이 적재될 수 있었다.
통상적인 KB 시험과 비교할 때 본 발명에 따른 마이크로 플레이트 시스템은 AST에 있어서 몇 가지 강점들을 가진다. 첫째, 마이크로 플레이트 시스템에서는 하나의 마이크로 플레이트 당 2.0ml의 한천 배지가 필요하고 하나의 입자 당 0.01㎍ 내지 1㎍의 항생제가 필요하므로 통상적인 AST보다 배지의 부피를 1/10 내지 1/100 가량 줄일 수 있다. 둘째, 마이크로 플레이트 시스템의 시간-경과 이미징을 사용하여 항생제 함유 입자들 아래에서 박테리아의 배가(doubling)가 추적될 수 있다. 셋째, 이론적으로 하나의 마이크로 플레이트 위에 수백개의 항생제 함유 미세입자들이 적재될 수 있다. 다시 말해 수백가지 다른 종류의 항생제들을 위한 AST를 수행함에 있어서, KB 시험은 20 내지 30개의 한천 플레이트를 요구하는데 반해 마이크로 플레이트를 이용한 시험은 오직 1개의 마이크로 플레이트만을 요구한다.
상술한 마이크로 플레이트 형태의 검사용 구조물을 사용할 경우 분석 시간, 연구자의 노력, 생리활성물질의 양, 배지의 양, 및 플레이트 크기 등을 줄일 수 있어서 매우 경제적이다.
또한, 마이크로 플레이트 시스템을 이용하면 항생제 처리후 세포가 살아있는지 또는 사멸했는지를 확인하는 live/dead cell 분석을 고체 매질 위에서 할 수 있다. Invitrogen의 LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit (Cat L7012)를 사용하면 live/dead cell 분석을 할 수 있으며 여기에는 살아있는 세포의 경우 녹색을 발하는 형광체(SYTO®9)와 죽어있는 세포의 경우 적색을 발하는 형광체(propidium iodide)가 함유되어 있다. B. subtilis 박테리아를 MHA 및 LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kit 1m 용액과 혼합하여 마이크로 플레이트를 만든 다음 상기 마이크로 플레이트 위에 항생제를 포함하는 미세입자들을 적재하여 live/dead cell 분석을 하였다. 상기 미세입자에는 카나마이신(kanamycin)이 75ng 함유된 것을 사용하였다. 도 31은 마이크로 플레이트 위에서 live/dead cell 분석을 한 예를 나타낸다. 도 31을 참조하면, 항생제를 포함하지 않은 입자를 사용한 경우 색상의 변화가 없었으나, 항생제를 함유한 입자를 사용한 경우에는 미세입자를 적재하고 120 분 후 녹색 점들이 감소하고 적색 점들이 증가함을 관찰할 수 있었다. 이는 미세입자들로부터 릴리즈된 항생제에 의해 박테리아가 사멸된 것을 가리킨다.
상술한 바와 같이 마이크로 플레이트를 사용하면 live/dead cell에 대한 연구를 효과적으로 할 수 있다.
이상에서는 다양한 도면 및 구현예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 명세서에 개시된 구현예들을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (29)

  1. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 생리활성 검사 방법에 있어서,
    고형화제를 함유한 액상 매질과 상기 생물학적 물질의 혼합 용액을 박막형성용 구조물에 제공하는 단계;
    상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성하는 단계;
    상기 생리활성물질을 상기 고체 박막에 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및
    상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 반응을 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하는 단계를 포함하는 생리활성 검사 방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102 내지 1010 cells/ml인 생리활성 검사 방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 박막 층의 두께는 1㎛ 내지 5mm인 생리활성 검사 방법.
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 박막형성용 구조물은 상기 액상 매질을 일정 공간 내에 보유하기 위한 적어도 하나의 수용부를 구비하는 생리활성 검사 방법.
  5. 제4 항에 있어서,
    상기 수용부는 마이크로 웰, 판상의 미세 틈새, 미세유체 채널, 및 이들의 조합로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 형태인 생리활성 검사 방법.
  6. 제1 항에 있어서,
    상기 고형화제는 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen) 및 피브린(fibrin)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나인 생리활성 검사 방법.
  7. 삭제
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  11. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하기 위한 생리활성 검사시스템에 있어서,
    고형화제를 함유한 액상 매질과 상기 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막을 구비한 검사용 구조물;
    상기 검사용 구조물에 상기 생리활성물질을 공급하기 위한 생리활성물질 보유매체;
    상기 검사용 구조물을 지지하고 관찰하기 위한 스테이지; 및
    상기 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따른 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 변화를 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하기 위한 측정장치를 포함하되,
    상기 측정장치는 이미지화 시스템 및 이미지 처리 시스템을 포함하는 생리활성 검사 시스템.
  12. 삭제
  13. 제11 항에 있어서,
    상기 이미지 처리 시스템은 상기 이미지화 시스템으로부터 이미지 데이터를 전송받아 자동화된 방식으로 가공 및 출력하는 생리활성 검사 시스템.
  14. 삭제
  15. 삭제
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  17. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 생리활성 검사 방법에 있어서,
    상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 구비한 마이크로 플레이트를 제공하는 단계;
    상기 고체 박막에 상기 생리활성물질을 공급하여 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및
    상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 반응을 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하는 단계를 포함하는 생리활성 검사 방법.
  18. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 생리활성 검사 방법에 있어서,
    상기 생리활성물질을 함유하며 상기 생리활성물질의 종류에 따라 서로 구분되는 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 준비하는 단계;
    상기 복수의 코드화된 생리활성물질 보유매체를 상기 생물학적 물질을 함유한 고체 박막을 구비한 검사용 구조물 위에 제공하는 단계;
    상기 검사용 구조물 위의 특정 위치에 배치된 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독하는 단계; 및
    상기 생리활성물질의 확산에 따라 상기 특정 위치에 존재하는 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 반응을 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하는 단계를 포함하는 생리활성 검사 방법.
  19. 제18 항에 있어서,
    상기 코드화는 형상 코드, 컬러 코드, 및 형광 코드로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 코드에 의해 생성된 생리활성 검사 방법.
  20. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하기 위한 생리활성 검사시스템에 있어서,
    고형화제를 함유한 액상 매질과 상기 생물학적 물질의 혼합물을 고화시켜 만든 박막 형태의 검사용 구조물;
    상기 검사용 구조물에 상기 생리활성물질을 공급하기 위한 코드화된 생리활성물질 보유매체; 및
    상기 검사용 구조물의 위치 정보에 따라 상기 생리활성물질 보유매체의 코드를 판독하고, 상기 생리활성물질 보유매체로부터 확산된 상기 생리활성물질의 전달에 따른 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 변화를 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하기 위한 측정장치를 포함하되,
    상기 측정장치는 이미지화 시스템 및 이미지 처리 시스템을 포함하는 생리활성 검사 시스템.
  21. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 생리활성 검사 방법에 있어서,
    적어도 일 영역에서 서로 접하는 제1 미세유체 채널과 제2 미세유체 채널을 구비한 미세유체 채널 시스템을 제공하는 단계;
    고형화제를 함유한 액상 매질과 상기 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 제1 미세유체 채널에 제공하되, 실질적으로 상기 혼합 용액이 상기 접하는 영역을 통해 상기 제2 미세유체 채널로 흘러들어가지 않도록 상기 혼합 용액의 흐름을 제어하는 단계;
    상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 상기 제1 미세유체 채널 내부에 형성하는 단계;
    상기 생리활성물질을 상기 제2 미세유체 채널에 공급하여 흐르도록 하되, 상기 접하는 영역에서 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막과 만나 계면을 형성하는 단계;
    상기 계면을 통해 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및
    상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 반응을 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하는 단계를 포함하는 생리활성 검사 방법.
  22. 제21 항에 있어서,
    상기 접하는 영역에 상기 혼합 용액이 상기 제2 미세유체 채널로 넘어가는 것을 방지하기 위한 앵커부가 더 존재하는 생리활성 검사 방법.
  23. 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 반응을 관찰하는 생리활성 검사 방법에 있어서,
    적어도 일 영역에서 서로 접하는 미세유체 채널과 웰(well)을 구비한 박막형성용 구조물을 제공하는 단계;
    고형화제를 함유한 액상 매질과 상기 생물학적 물질의 혼합 용액을 상기 미세유체 채널에 제공하는 단계;
    상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 상기 미세유체 채널 내부에 형성하는 단계;
    상기 생리활성물질을 상기 웰에 공급하여, 상기 접하는 영역에서 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막과 만나 계면을 형성하는 단계;
    상기 계면을 통해 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 하는 단계; 및
    상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 단일 세포들의 개별적인 반응을 이미징하여 얻은 이미지 분석결과에 기초하여 상기 생리활성물질의 최소 억제농도(MIC)를 결정하는 단계를 포함하는 생리활성 검사 방법.
  24. 제23 항에 있어서,
    상기 미세유체 채널이 친수화 처리된 것인 생리활성 검사 방법.
  25. 제23 항에 있어서,
    상기 미세유체 채널 시스템은 방사상으로 뻗은 세부 채널들로 이루어진 생리활성 검사 방법.
  26. 제25 항에 있어서,
    상기 세부 채널의 말단이 상기 웰의 하단과 서로 연통됨으로써 상기 세부 채널이 오픈 채널이 되는 생리활성 검사 방법.
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