KR20110018798A

KR20110018798A - 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치

Info

Publication number: KR20110018798A
Application number: KR1020090076436A
Authority: KR
Inventors: 윤태현; 김민정; 임국희; 유현주
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2011-02-24
Also published as: KR101038484B1

Abstract

본 발명은 미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치 및 이를 이용한 세포 영상분석장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시료주입구와 배지주입구가 별개로 형성되고 유체의 확산이 가능한 채널이 존재하여 시료의 농도구배별 세포감응성을 분석할 수 있는 미세유체 세포칩 및 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩을 이용하면 주입되는 시약에 따른 세포의 형태 변화를 광학 영상분석 기법으로 측정하여 세포사멸 정도를 실시간으로 정량화할 수 있고, 단일층으로 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 부착 배양 구간을 포함하는 미세유체 세포칩을 이용하여, 세포사멸 정도의 실시간 정량화가 가능하므로 세포독성 평가 및 약물 스크리닝 시험을 저비용, 고속, 고효율로 수행하는 것이 가능하다.

미세유체 세포칩, 농도구배, 단일층 부착세포, 대량발굴탐색, 세포독성, 세포사멸

Description

미세유체 세포칩, 이를 이용한 세포사멸 정량 분석법 및 세포영상분석장치{MICROFLUIDIC CELL CHIP, CELL IMAGE ANALYZING APPARATUS AND METHOD FOR QUANTITATIVE ANALYSIS OF CELL USING THE SAME}

현재 세계적으로 유통되고 있는 화학물질은 수십 만여 종에 이르며 매년 여러 종의 새로운 화학물질이 개발되어 상품화되고 있어 이들에 의한 인체 및 환경 위해성이 날로 증가되고 있는 추세이다. 이로 인해 증가하는 신약의 스크리닝 및 그 유해성에 대한 평가가 신속하게 이루어져야 하는 요구가 있어 왔다.

본 발명과 유사한 종래 기술로써 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)를 이용한 측정법을 말할 수 있다. 마이크로플레이트 리더는 마이크로플레이트 웰(Microplate Well) 내에서 반응한 물질의 정성, 정량 분석에 이용되는 장비로써 적절한 용매, 용해 또는 분산된 시료에 자외선, 가시광선, 적외선 영역 등의 빛을 통과시켜 흡광, 발광, 형광도 등을 측정하여 세포 생리 및 분자생물학, 면역학 분야에서 용이하게 사용된다. 광원으로부터 유래한 빛은 여러 가지 필터와 단색화 장치를 통해 특정 파장의 빛으로 만들어진 후 시료에 96개 혹은 그 이상의 경로를 통해 조사되어 각각의 웰에 담긴 시료의 성분 및 농도에 따라 발생한 형광 또는 투과된 빛이 검출기를 통하여 분석될 수 있다. 이와 같은 방법으로 측정된 결과를 바탕으로 세포의 증식능력과 세포 생존능력을 관찰 할 수 있다. 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)기를 이용한 측정법의 한 예로서 세포의 활성도(viability)를 분석하기 위해 MTT(Tetrazolium-based colorimetric) 검색법이 널리 사용되고 있다. 이 검색법은 대사과정이 온전한 세포의 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색 수용성 MTT 테트라졸리움(tetrazolium)이 자주색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔(formazan)으로 환원된 후 흡광도로 분석되는 방법이며, 약물의 효능 및 독성 분성 등 다양한 생물학 시험에 이용되고 있다. 그러나 멀티 웰 플레이트(Multiwell plate)를 기반으로 수행되는 분석방법은 비수용성의 결정을 유기용매에 용해시켜야 하는 등의 복잡하고 비가역적인 시료의 전처리 과정이 필요하므로 일회성 측정에는 적합하나 세포의 성장 및 사멸과정에 따른 연속적인 모니터링에는 부적합하다.

세포의 분류 및 계수에 이용되어 오던 다른 방법으로 유체 세포측정법(Flow Cytometry, FACS)을 들 수 있다. 유체 세포측정법의 일반적인 원리는 일정한 파장의 빛을 세포에 조사하였을 때 세포가 가진 성질 및 부착된 형광색 소(fluorochrome)에 따라 방출할 수 있는 파장의 광선이 다르다는 점을 기본으로 세포분석에 이용되고 있다. 그러나, 이러한 FACS는 매우 고가의 장비로서 일반적인 연구자들이나 산업용으로 사용되기에는 부적합하다. 또한, FACS는 형광염료를 이용한 시표 표지를 수반하므로 비가역적인 전처리가 필요하여 일회성 측정에는 적합하나 세포의 성장 및 사멸과정에 따른 연속적인 모니터링에는 부적합하다.

이러한 문제점을 해결하고자 최근 생명공학분야에서는 미세유체 세포칩을 이용한 세포분석기구의 개발연구가 활발히 이루어지고 있다. 이와 같은 미세유체 세포칩은 적은 양의 시료만으로 빠른 시간에 간편하게 분석을 수행할 수 있다는 장점이 있어 차세대 분석 시스템으로 각광을 받고 있다. 따라서, 이러한 미세유체 기술을 이용하여 분석 장비 소형화와, 저렴한 단가로 많은 분석을 통계적으로 정확한 데이터로 확보하기 위한 미세유체 세포칩 및 자동화된 실시간 분석 방법의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 보다 저렴하고 효율성이 높은 미세유체 세포칩 및 실시간 세포 영상분석법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 목적은 세포칩 내 표면에 단일층으로 부착되어 배양된 세포의 시약 농도에 따른 사멸정도를 실시간 정량화에 적합한 미세유체 세포칩을 제공하고, 상기 미세유체 세포칩과 실시간 세포 영상 취득 장치를 이용하여 만든 세포 영상을 자동 영상처리 기법을 통해 세포사멸 정도를 실시간으로 정량화하는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 상기 세포칩 및 방법을 이용하여 세포고사(apoptosis) 등의 세포사멸과정을 실시간으로 모니터링하여, 신약개발시 인비트로(in vitro) 스크리닝 및 유해 화학물질의 세포독성 평가 등을 저비용, 고속, 고효율로 수행할 수 있는 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 배지주입구; 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구; 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간; 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간; 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩이 제공된다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 세포 배양 구간은 미세유체의 흐름을 제어하기 위한 밸브 시스템을 구비하는 것이 바람직하고, 상기 밸브 시스템은 공기압을 이용하는 막(membrane) 밸브 시스템으로서, 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 포함할 수 있다.

상기 미세유체 세포칩 내의 미세유체 확산 구간 또는 세포배양구간은 복수개의 채널로 형성되어 복수개의 채널을 통해 유체가 분배 및 합류되어 농도 구배를 형성할 수 있다. 또한, 상기 미세유체 확산 구간 또는 세포배양구간은 복수 개의 단으로 형성되어 농도 구배 형성이 보다 효율적으로 이루어지게 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미세유체 세포칩에서 상기 배출구나 별도의 세포주입구를 통하여 세포가 주입될 수 있다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩의 바람직한 실시예에서는 상기 세포칩은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 재질로 제조된 것일 수 있다.

또한, 상기 미세유체 세포칩은 슬라이드 글라스, 크리스탈 및 유리 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 광학적 측정이 용이한 플레이트 상부에 접합되는 것일 수 있다.

본 발명의 또다른 측면에 따르면, 배지주입구, 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구, 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간, 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩을 준비하는 단계; 상기 배출구를 통해 세포를 주입시킨 후 일정시간 간격으로 배지를 배출구로 배출시키며 세포를 배양하여 상기 세포 배양 구간상에 부착된 단일 세포층을 형성하는 단계; 상기 시료 주입구를 통해 시료를 주입하고 미세유체의 확산구간을 통과시켜 농도구배가 형성된 시료에 상기 단일 세포층을 노출시키는 단계; 및 상기 시료에 노출된 세 포층이 존재하는 세포 배양 구간을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 각 세포의 형태인자 값을 추출하여 세포사멸정도를 정량화 하는 단계를 포함하는 미세유체 세포칩을 이용한 세포사멸 정도의 정량 분석법이 제공될 수 있다.

상기 세포사멸 정도의 정량 분석법에서, 상기 세포 배양 구간을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 각 세포의 형태인자 값을 추출하여 세포사멸정도를 정량화 하는 단계는 촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하는 단계; 식별된 세포들로부터 세포 형태인자를 추출하는 단계; 및 추출한 세포형태인자와 세포사멸정도의 상관관계를이용하여 세포사멸을 정량화 하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 미세유체 세포칩을 이용한 세포사멸 정도의 정량 분석법에서, 상기 미세유체 세포칩의 미세유체 확산구간 또는 세포 배양 구간은 복수개의 채널로 형성되거나, 복수 개의 단으로 형성되어 시약의 농도 구배 형성이 가능하고, 시약의 농도 차에 따라 별개의 채널에서 분석이 가능한 것일 수 있다.

상기 미세유체 세포칩을 이용한 세포사멸 정도의 정량 분석법에서, 상기 세포배양구간의 촬영 및 세포사멸정도의 정량화는 실시간으로 실시하는 것일 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 세포사멸 정도의 정량 분석법은 시약의 세포독성을 평가하는 것일 수 있다.

상기 세포사멸 정도의 정량 분석법에서, 각 세포의 형태인자는 상기 각 세포의 원형성 값으로서 하기의 식으로 계산되는 것 일 수 있다.

원형성 = 4π×(세포면적/세포둘레²)

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 미세유체 세포칩; 및 실시간으로 세포배양구간을 촬영 및 분석하기 위한 광학영상분석 장치를 포함하는 세포 영상분석장치가 제공될 수 있고, 상기 세포 영상분석장치는 시약의 세포독성을 평가하기 위한 것일 수 있다.

상기 세포 영상분석 장치에서 상기 광학영상분석 장치는 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이져광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라; 미세유체칩을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 상기 CCD로 부터 얻어진 이미지를 분석/처리하여 세포형태인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 컴퓨터 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 세포 영상 분석장치에서, 상기 세포배양 플랫폼은 세포배양을 위한 온도조건 및 대기포화조건의 조절이 가능한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면 저렴한 단가의 소형 세포분석 장치의 제조가 가능하여, FACS 등 고가의 장비가 사용되거나 노동집약적으로 수행되고 있는 기존의 세포독성 평가(Cytotoxicity Assay)에서, 적은 양의 시료와 세포만을 가지고 분석이 가능하여 저렴한 단가로 많은 분석을 수행할 수 있어, 통계적으로 보다 정확한 데이터를 확보하는 것이 가능하고, 약물 스크리닝(Drug Screening) 시험에 광범위하게 적용될 수 있어 저비용, 고속, 고효율 분석이 가능하다.

본 발명에 따르면 미세유체 세포칩을 활용한 약물 스크리닝, 세포독성 평가 세포의 성장 또는 사멸 등에 대한 정보를 자동 영상처리 기법을 이용하여 세포의 형태인자를 추출하고 자동 계수함으로써 화학물질의 농도변화 등 세포 주변 환경변화에 따른 세포의 사멸과정을 고속, 고효율로 그리고 실시간으로 정량화 및 모니터링할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 미세유체 세포칩 내로 배지 및 시약을 주입함으로써 세포배양과 동시에 다양한 세포기반 분석이 가능하여 약물의 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성 등의 분석 및 신약개발 및 스크리닝 시험에 이용될 수 있으며, 또한 다른 세포배양과 동시에 유해화학물질에 노출로 인한 세포의 반응 기작을 이미지를 통해 확인하는 것이 가능하다.

이하, 첨부되는 도면과 함께 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩의 기본적인 구조는 도 1과 같다. 즉, 유체주입구 (3, 5)로서 배지 주입구(3) 및 시료 주입구(5); 상기 배지 주입구(3) 및 시료 주입구(5)로부터의 채널이 합류하여 연결되어 주입되어 시료의 농도구배를 형성하도록 하는 미세유체의 확산 희석 구간(1); 상기 미세유체의 확산 희석 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양 구간(2); 및 상기 세포 배양 구 간에 연결되는 배출구(6)를 포함하는 미세유체 채널구조를 포함하는 기본구조를 가진다. 이러한 구조의 미세유체 세포칩에서는 배지 주입구(3) 및 시료 주입구(6)로부터 유입된 유체인 배지 및 시료는 미세유체의 확산 희석 구간(1)을 거치면서 농도구배가 형성된 유체로 세포배양구간(2)로 유입된다. 상기 배출구(6)는 시료 및 배지를 배출하는 역할을 하기도 하지만 세포를 주입하는 세포주입구로서의 역할을 할 수도 있다. 상기 배출구(시료주입구)(6)로 유입된 세포는 세포배양구간(2)에 부착되고, 이때 세포층을 단일층으로 부착시키기 위해 세포를 배양하며 일정시간간격으로 배지를 배출구(세포주입구)(6)로 흘려주는 조치를 취할 수 있다.

상기와 같은 기본구조의 미세유체 세포칩은 농도구배별 개별적인 세포배양 및 분석이 가능하도록 세포배양구간(2)에 복수개의 채널을 구비할 수 있고(도 2a), 복수개의 확산 구간을 구비할 수도 있다(도 3). 또한, 미세유체채널의 유체의 흐름을 제어할 수 있도록 밸브 시스템으로서, 막 밸브채널(7,8) 및 막 밸브를 제어하는 압력 주입구(9, 10)을 포함할 수 있다(도 2 b, c). 이러한 구조의 미세유체 세포칩은 다수의 세포 부착 배양 구간을 포함하고, 이들 세포 부착 배양 구간들 사이에 농도 구배를 형성할 수 있어, 주입되는 시약의 농도구배에 따른 세포의 시약에 대한 세포감응성을 동시에 대량으로 분석하는 것이 가능하다.

도 3에는 두 개의 시료 주입구에서 유입된 용액이 복수개의 확산 구간에서 여러 차례에 걸쳐 희석되어 여러 개(도 3에서는 5개)의 다양한 용액의 농도를 형성하고 하나의 확산구간에서 다시 희석됨으로써 더욱 다양한 농도 구배를 형성할 수 있는 세포칩이 도시되어 있다.

도 4에는 한 개의 확산 구간과 복수개의 세포배양 용기로 구성되어 있으며 도2a와 유사하지만 막밸브가 장착되어 있지 않아 도 1의 미세유체 칩과 같이 실린지 펌프를 이용하여 연속흐름 조건이 적용되는 세포칩이 도시되어 있다.

도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 제조된 미세유체 세포칩의 촬영 이미지이다. 막밸브가 장착되어 정적흐름의 조건을 갖는 세포칩(왼쪽)과 막밸브가 없는 연속흐름 조건을 갖는 세포칩(오른쪽)이다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩은 주입되는 시료에 따른 세포의 형태 변화를 광학 영상분석 기법으로 측정하여 세포사멸 정도를 실시간으로 정량화하는데 사용되기 적합하며, 세포부착배양구간에서는 단일층으로 세포의 부착 배양이 이루어질 수 있다.

상기 미세유체 세포칩 내에 다수의 세포 부착 배양구간을 구비하고, 상기 다수의 세포 부착 배양 구간들 사이에 주입되는 시약의 농도차가 형성되도록 하는 미세유체의 확산 희석 구간을 구비할 수 있으며, 이 경우 각 세포 배양 구간들 사이에 주입되는 시약의 농도구배를 형성시켜 시료의 농도구배에 따른 세포 감응성, 특히 세포 사멸과정의 진행 정도를 정량화하는데 이용할 수 있도록 복수개의 채널로 이루어지는 세포배양구간을 구비할 수 있다.

상기와 같이 세포배양 구간이 복수개의 채널로 이루어지도록 하기 위하여, 본 발명에 따른 미세유체 세포칩은 상기 미세유체의 확산 구간의 말단에서 하나 이상의 채널로 분기되는 분기부; 상기 분기된 각 채널에 배열되고 세포의 부착 배양 이 이루어지는 하나 이상의 컴파트먼트 챔버(compartmented chamber); 상기 컴파트먼트 챔버를 지난 각 채널이 합류되어 상기 배출구에 연결되는 합류부를 포함할 수 있다.

상기 세포 배양 구간은 정적인 상태(static state)를 유지하도록 하여 유체의 흐름에 따른 세포의 손실이 없도록 하는 것이 지속적인 세포 사멸 과정의 모니터링을 위해서 바람직하다. 그러나, 유체의 흐름이 계속적으로 진행되는 상태이더라도 평면 부착 배양이 이루어지는 배양 구간이 있다면 세포 사멸 과정의 분석이 가능할 수 있다.

이러한 세포 배양 구간의 정적 상태는 미세유체 세포칩에 밸브 시스템을 도입함으로써 이루어 질 수 있으며, 바람직하게는 공기압 등을 이용한 막밸브 시스템이 이용될 수 있다. 상기 밸브 시스템은 공기압을 이용하는 막(membrane) 밸브 시스템이고, 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 포함할 수 있다. 이러한 밸브 시스템을 이용하여 상기 세포 배양 구간의 농도 구배(gradient)를 정적(static) 상태로 유지할 수 있다. 이러한 막 밸브 시스템은 공기압의 조절에 따라 막 밸브의 개폐가 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 미세유체 세포칩은 각각 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 고분자 재질로 제작될 수 있으 며, 바람직하게는 PDMS로 제작될 수 있다.

이상과 같은 미세유체 세포칩은 슬라이드 글라스, 크리스탈, 유리 글라스 등의 플레이트 상부에 접합되어 광학적 측정이 용이하도록 하는 것이 바람직하다.

두 개의 유체 주입구, 즉 배지주입구 및 시료주입구(3, 5)를 통해 유입된 유체는 세포배양구간(2)에서 다양한 농도를 형성하며, 지속적인 유체의 흐름이 없이 농도 구배(gradient)를 유지시키기 위하여 PDMS 막(membrane) 밸브가 추가적으로 구성될 수 있다.

본 발명에 다른 측면에 따른 미세유체 세포칩을 이용한 세포분석법은, 전술한 미세유체 세포칩을 준비하는 단계; 미세유체의 확산구간을 통과시켜 농도구배가 형성된 시료에 상기 단일 세포층을 노출시키는 단계; 상기 미세유체 세포칩에 시약을 주입하여 상기 세포를 시약에 노출시키는 단계; 및 상기 시료에 노출된 세포층이 존재하는 세포 배양 구간을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 각 세포의 형태인자 값을 추출하는 단계를 포함한다.

이하, 상기 각 단계에 대해서 구체적으로 설명한다.

1) 미세유체 세포칩을 준비하는 단계

전술한 바와 같은 미세유체 세포칩 구조물을 제작하여 준비할 수 있다. 바람직하게는 도 2a와 같은 구조물을 제작하여 도 5와 같은 미세유체 세포칩을 준비한다.

도 2에 명시되어 있는 각 유닛은 다음과 같은 특성을 나타내고 있다. 도 2(b)는 두 개의 유체 주입구(배지주입구, 시료주입구, 3, 5)나 배출구(6)에서 유입되는 유체의 흐름을 제어 할 수 있는 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 구비하는 것을 특징으로 한다. (1)은 일정한 유속에 의해 두 주입구로부터 서로 다른 농도를 갖는 유체가 만나 채널 안으로 유입되면서 분자의 확산에 의해 다양한 농도를 형성하는 미세유체의 확산 희석(microfluidic diffusion diluter)구간이다. (2)와 같이 대량발굴탐색(HTS: High througput screening)을 위하여 배열된 컴파트먼트(compartment)는 세포 배양구간 역할을 한다. 또한, 도 3은 복수개의 확산 구간과 단순 세포배양구간이 결합되어 있는 미세유체 세포칩을 나타낸 것이다. 시료 주입구로부터 서로 다른 농도를 갖는 두 용액이 복수개의 확산 구간을 거쳐 5개의 다양한 농도의 용액을 형성하고 하나의 확산 구간 및 세포배양 구간에서 다시 확산됨으로써 다양한 농도구배를 형성할 수 있다. 도 4의 미세유체 세포칩은 도 2에 명시된 미세유체 세포칩과 같은 확산구간과 복수개의 배양구간을 포함하지만 막밸브가 장착되지 않아 유체의 연속흐름 조건이 적용된다.

2) 미세유체 세포칩의 세포 배양 구간 내에 단일층의 부착 세포군을 형성하는 단계

상기 미세유체 세포칩의 세포 배양 구간 내에 단일층의 부착 세포군을 형성하는 단계에서는, 미세유체 세포칩에서 표면 부착된 세포의 형태변화 영상분석을 이용하여 세포분석을 하기 위하여 최적화된 세포 배양의 조건으로 2차원 단일층의 부착 세포군을 형성하는 것이 바람직하다. 세포 배양 용기를 구성하는 컴파트먼트 챔버에서 최적의 이미지 분석 조건을 충족시키기 위한 세포의 개수 범위에 맞추어 세포를 적절하게 배양시킨다.

단일층으로 부착된 세포층을 형성하기 위해서는. 배출구(세포주입구)(6)로 세포를 유입시켜 세포배양구간(2)에 부착시키고, 이때 세포층을 단일층으로 부착시키기 위해 세포를 배양하며 일정시간간격으로 배지를 배출구(세포주입구)(6)로 흘려주는 조치를 취할 수 있다.

도 6에는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 세포가 부착된 세포 배양 구간의 배양시간에 따른 개요도와, 세포 배양 구간에서의 세포 성장이 전형적인 S자 형 성장 곡선을 나타낼 수 있음을 나타내었다.

3) 시료를 주입하여 상기 세포를 시험하고자 하는 시료에 노출시키는 단계

상기 미세유체 세포칩 내에 다양한 방법으로 시료를 주입함으로써 세포 배양 구간에서 배양되고 있는 세포를 시료에 노출시킬 수 있다. 전술한 바와 같이 다수의 세포 부착 배양 구간을 포함하는 미세유체 세포칩을 사용하는 경우, 부착 세포의 위치에 따라 상이한 시료 농도 환경에 노출시키는 것이 가능하다.

상기 부착 세포의 위치(서로 다른 세포 부착 배양 구간)에 따라 상이한 시약 농도 환경에 노출시키기 위해서, 상기 미세유체 세포칩의 유체 주입구로부터 유입된 서로 다른 농도를 갖는 시약(화학물질)이 미세유체의 확산 희석 구간에서 층류(laminar flow)를 형성하고 시간이 지남에 따라 확산(diffusion)되어 세포 배양 구간에서 다양한 농도를 갖는 화학물질로 존재하게 될 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라, 배지 및 시약을 주입하였을 때 농도 구배가 형성될 수 있음을 보여주는 그래프 및 촬영이미지를 도 7에 나타내었다. 유색의 시약을 사용하거나 투명한 시약에 색소(ex. 트리판 블루)를 혼합하여 사용하면서 흡광도를 측정하면 구간별로 흡광도의 차이를 보여 농도구배의 형성되었음을 확인할 수 있다.

4) 광학 영상분석을 통하여 각 세포의 형태인자 값을 추출 또는 비교하여 세포사멸 정도를 정량화하는 단계

부착 위치에 따라 상이한 시료의 농도 환경에 노출된 2차원적으로 배치된 세포를 광학 영상 분석을 통하여 각 세포의 형태인자 값의 추출 및 비교를 수행한다. 이는 자동화된 광학영상분석 장치를 이용할 수 있으며, 이를 이용하여 촬영된 세포 부착 배양 구간의 이미지에서 각 구간 내의 각 세포들의 형태인자 값을 추출하여 계산하는 것이 가능하다.

상기 자동화된 광학영상분석 장치로는 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이져광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라; 미세유체칩을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 상기 CCD로 부터 얻어진 이미지를 분석/처리하여 세포형태인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 컴퓨터 시스템으로 이루어진 것으로, 상기 영상처리 프로그램으로는 ImageJ, CellProfiler, Metamorph, Image Pro Plus 등을 사용할 수 있다.

상기 분석을 위하여 사용한 영상분석 시스템은 광학 이미지(명시야 이미지)를 취득하기 위해 광원인 텅스텐 램프(tungsten lamp)와 전하 결합 소자(charge coupling device: CCD)를 구비한 광학 현미경의 이용을 기본 기술로 한다. x-y-z 스테이지(stage) 위에 미세유체 칩을 올려 놓은 후 CCD 카메라와 연결된 컴퓨터로부터 미세유체 칩 내에 배양된 세포의 사멸과정 이미지를 취득할 수 있고(도 13a), 미세유체 세포칩은 37℃, 5% CO₂ 환경에서 배지 및 시료 저장기(reservoir)와 연결된 실린지 펌프(syringe pump) 또는 중력에 의한 흐름을 이용한 연속 흐름 (continuous flow) 조건에서 세포배양이 가능하도록 배치될 수 있다(도 13b).

이와 같은 이미지 분석 방법은 영상분석 프로그램의 메크로를 이용하여 순차적인 이미지의 목록을 동시 분석이 가능하며, 세포의 개수, 각 세포의 면적 및 세포원형성 등의 여러 인자들 또한 동시 분석이 가능하다.

여기서, 상기 각 세포의 형태인자는 바람직하게는 세포고사의 대표적인 형태학적인 특징인 세포수축 및 원형화에 기반하여 선택한다. 한 예로 세포사멸 여부를 간단히 확인할 수 있는 형태인자는 각 세포 원형성(circularity)일 수 있으며, 예컨대, 상기 각 세포의 원형성은 아래 식과 같이 계산되어 정량화된 값으로 나타내는 것이 가능하다(도 8 참조).

원형성(circularity) = 4π×(세포면적/세포둘레²)

상기 식으로부터 계산된 원형성 값이 1.0인 경우는 측정 대상이 완전한 원의 형태를 가짐을 의미하며 원형성 값이 감소하여 0.0에 가까워질수록 측정 대상물체가 장방형 또는 다각형의 형태를 가지게 됨을 의미한다. 표면 부착되어 성장하던 세포가 외부의 환경요인에 의하여 고사사멸과정(apoptotic death process)을 거치게 되면 가장 대표적인 형태변화인 세포의 수축 및 원형화가 동반되게 된다. 그러므로, 표면부착세포의 경우 낮은 원형성 값을 가지고 고사사멸과정이 진행 될수록 부착세포의 원형성 값이 증가하게 된다.

이러한 각 세포의 원형성 값의 정량적 분석을 통해 시약의 농도에 대한 세포고사(apoptosis)의 진행 정도를 분석하는 것이 가능하다. 도 8에서 세포독성물질을 처리하기 전의 표면 부착세포는 원형이 아닌 다각형(polygon)의 형상을 가지고 있고, 계산된 원형성 값 또한 0.5 부근의 넓은 수치분포를 갖는다. 그러나 세포독성물질을 처리한 후의 세포는 외관상으로도 원형에 가까워지고, 원형성 값은 1에 가까운 0.9 부근의 수치를 보인다.

상기와 같은 식에 의해 세포 원형성을 계산할 수 있으나, 이외에도 세포의 부착세포의 세포고사 진행으로 인한 세포수축현상을 세포면적을 이용하여 다양한 식을 통해 정량화 할 수 있다.

세포의 사멸과정은 세포고사, 괴사 등으로 나누어지는데 정상상태에서의 세포분열과 반대로 유해물질에 의해 노출로 인한 손상 받은 세포는 퇴화하는 방향으로 변화가 일어나기 때문에, 정상세포와 대비하여 다른 대사과정 즉, 그 중에서도 세포가 퇴화되는 죽음의 과정을 알아보면서 세포의 유해성물질에 대한 반응 기작을 확인할 수 있다.

여기서 세포의 죽음의 과정을 두 가지로 분류하면, 세포의 손상이 심해서 세포에서는 부종이 일어나고 용해가 일어나 세포 내용물이 밖으로 분출되는 '세포괴사(Necrosis)'라 불리는 세포 죽음의 과정이 일어난다. 또한 다른 세포의 죽음과정은 '세포고사(Apoptosis)'로 특징적으로 세포의 초기의 수축이며, 조직에서는 이웃하고 있는 세포들과 세포-세포 결합이 파괴되는 것을 의미한다. 세포고사 과정에서 세포의 부피는 작아지고 세포질 내의 내막, 리보솜, 사구체와 다른 세포 소기관등은 수축 된다. 이러한 과정에서 일어나는 응축은 매우 격렬하게 일어나기 때문에 응축된 부분에서 매우 뚜렷한 경계부를 형성한다. 전술한 세포고사의 이러한 과정을 알아보기 위해서 광학이미지로 확대하여 관찰하고 이미지분석 프로그램을 이용하여 정상세포와 다른 차이점을 관찰하는 것이 가능하다.

상기 미세유체 세포칩 내부에 2차원적으로 부착 성장한 세포들에 대한 광학이미지를 실시간으로 영상처리하여 세포의 사멸과정의 진행에 따른 세포형상의 변화를 원형성(Circularity)등의 변수로 정량적으로 표현하는 알고리즘을 이용하여 각세포의 원형성을 수치화할 수 있으며, 이러한 수치화된 형태 인자 값을 이용하여 세포사멸의 정도를 정량화하는 것이 가능하다.

그러므로, 전술한 바와 같은 미세유체 세포칩 및 세포 형태 변화의 실시간 정량 방법을 이용하여 약물 검증 또는 세포독성 평가를 하는 것이 가능할 수 있다.

세포 영상처리를 통한 세포계수

본 발명에서는 도 9의 순서도에 나타낸 바와 같은 영상분석 프로그램의 자동화 과정을 통해 효과적으로 이미지 분석이 이루어진다. 일단 관심의 대상인 세포를 식별, 분류하기 위해서는 이미지를 불러오는 과정(Load image), 그리고 미디언 필터(Median filter), 필 홀(Fill Holes), 워터쉐드(watershed) 등의 과정을 이용하여 이미지상의 세포들을 인식하는데 생기는 오류를 줄일 수 있다.

이렇게 세분화된 세포는 분석 파티클(analyze particles) 기능을 통해 각 세포의 원형성(circularity), 면적(area), 크기(size), 위치 그리고 전체 세포의 개수(count) 등을 값을 추출해낸다. 상기의 영상처리 방법으로 얻어진 세포의 개수는 실제 세포의 수와 유사한 값을 나타내어 재현성 및 신뢰성 있는 결과를 가지며 이는 도 10에 나타내었다. 도 10은 세포계수를 추출 해내기 위해 만든 메크로로 계수한 후 실제 세포 수와 비교한 검정곡선(calibration curve) 그래프이다. y절편은 2.8961E-14, 기울기는 1.3033, 검정곡선의 상관계수 (R²)는 0.9616값을 나타낸다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 미세유체 세포칩의 제조

본 실시예에 따라 제조된 미세유체 세포칩의 기본적인 구조는 도 1과 같이, 효율적인 농도구배를 위해서는 도 2와 같이 제작하였다.

본 발명에서 실행되는 디자인의 도안은 AutoCAD 2006(CADian 2008)으로 작성되었으며, 유체가 주입되는 주입구(도 1의 3, 5)와 유체가 유입되어 농도가 확산되는 부분(도 1의 1) microfluidic diffusion diluter(μDD), 유체가 흘러 방출되는 배출구(도 1의 6)로 구성되어 디자인하였다.

랩온어칩의 제작은 포토리소그래피 방법을 이용하였으며, 세척된 Si 웨이퍼 (Si(111))에 포토레지스트 SU8 50 (Microchem社)을 약 3mL 를 부은 후, 500 rpm에서 20초, 750 rpm에서 60초 조건으로 Spin Coater(SPIN 1200)를 이용하여 회전 도포를 하였다.

디지털가열판 (Thermolyne)에 60℃에서 7분 처리한 후, 95℃에서 60분 동안 프리베이킹(prebaking)을 하였다. 투명한 필름 위에 20,000~40,000 dpi의 해상도로 인쇄 (마이크로텍, 안산)된 준비된 마스크(mask)를 얼라이너(aligner, Midas System) 이용하여 Si 웨이퍼 (Si(111))와 정렬한 후 포토레지스트(photoresist)에 75초 동안 선택적인 노광을 하였다.

다음으로 디지털가열판 (Thermolyne)에 65℃에서 5분 처리 한 후, 95℃에서 20분 동안 포스트베이킹(postbaking)을 하였다. PGMEA(Propylene Glycol Methyl Ether Acetate, Aldrich)를 배쓰(bath)에 채워 넣고 15분간 흔들어 노광되지 않은 나머지 PR을 제거하였다. 현상(develop)된 마스크에 트리클로로실란(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl, Aldrich)으로 실란화 처리 한 후, IPA(isopropyl alcohol, J.T.Baker)로 세척하여 말린 후 보관해두었다.

랩온어칩 제작은 위에서 언급하여 패턴이 제작된 Si 웨이퍼에 184 실리콘 엘라스토머 키트(Sylgard)의 프리폴리머(prepolymer)와 경화제를 10:1의 질량비율로 혼합하여 섞은 PDMS 고분자를 붓고 60℃에서 3시간 동안 경화시켰다. 패턴이 없는 다른 한 층을 만들기 위해서 페트리디쉬(90 × 15 mm)에 동일한 PDMS 고분자를 붓고 60℃에서 3시간 동안 경화시켰다. 의료용 메스를 사용하여 PDMS를 Si 웨이퍼에 떼어낸 후, 디자인 부분에 맞게 자른 다음 서로 다른 층의 PDMS를 친수성 표면처리 하기 위해서 100W의 70%, 시간은 240초, O₂의 양은 10cc/min의 산소 플라즈마(FEMTO Science)조건으로 처리하였다.

플라즈마 처리 후, 패턴된 PDMS가 아래층으로 되고, 패터닝이 없는 PDMS층이 위층이 되도록 신속하게 붙였다. 20분이 지난 후, 생검용 펀치 (Miltex Inc.)를 이용하여 유체가 주입되는 3개의 주입구(Inlet) 부분과 유체가 흘러 방출되는 배출구(Outlet) 부분을 구멍 뚫었다. 배출구부분은 직경 8 mm로 구멍 뚫었고, 3개의 주입구 부분 중에서 양쪽 끝은 튜브가 들어가는 부분으로, 가운데 부분은 세포의 호흡과 환경을 도와주기 위해서 직경 3 mm로 구멍 뚫은 후 100 W의 70%, 시간은 240초, O₂의 양은 10cc/min의 Plasma (FEMTO Science) 친수성의 표면처리를 하고, 커버 슬립을 부착시켜 미세유체 세포칩 제작을 완성하였다.

이와 같이 제작된 미세유체 세포칩은 아래층의 패턴된 PDMS 표면의 친수성 확인과 기포제거를 위하여 먼저 물을 넣어서 확인하였다.

본 실시예에 따라 실제 제조된 미세유체 세포칩의 촬영 이미지를 도 5에 나 타내었다.

실시예 2: 미세유체 칩내에 2차원 단일층의 부착 세포군의 형성

세포배양 용기에서 배양된 간세포 주(chang liver cell line)를 바닥면으로부터 10⁴ ~ 10⁵ cells/mL을 갖는 현탁액으로 추출하여 배출구에 흘려주었다. 배출구(세포주입구)에서부터 흘러간 세포는 도 1의 2 (a)의 세포배양 구간(2)에 접근하여 부착 세포군을 형성하였다. 하루에 2~3번씩 배지(RPMI 1640)를 배출구(세포주입구)에 흘려주어 교체하여 약 56시간 동안 배양함으로써 단일층의 세포 배양층을 형성하였다.

실시예 3: 표면부착 세포의 위치에 따라 서로 다른 화학물질 농도 환경에 노출

상기 실시예 2에서와 같이, (2)번 영역에서 배양된 세포에 대한 활성도를 측정할 수 있는 시료를 주입하여 농도 구배(gradient)를 형성할 수 있다. (3)과 (5)에 서로 다른 농도를 갖는 다른 종류의 유체를 주입하여 (1)구간에서 두 용액이 만나고 이를 통하여 형성된 층류(laminar flow)가 시간이 지남에 따라 확산됨으로써 다양한 농도의 세포독성물질을 갖는 배양용기를 만들었다.

도 2a의 미세유체 칩 내에서 트리판 블루(Invitrogen corporation, 0.4%) 염료를 이용한 농도구배의 형성을 구현하였다. 배지 주입구에는 증류수를 주입하고 시료 주입구에는 증류수로 5배 희석시킨 트리판 블루를 주입하면 서로 다른 농도의 두 용액이 만나게 되고 이를 통하여 형성된 층류(laminar flow)가 시간이 지남에 따라 확산됨으로써 다양한 농도의 트리판 블루 용액을 형성시켰다. 이와 같은 과정은 실린지 펌프를 이용하여 0.5μL/min의 유속으로 주입시켜 연속적인 유체의 흐름 상태로 만들어주었다. 적절한 농도 구배가 형성된 구간에서의 명시야 이미지를 얻고 이미지 처리 방법을 이용하여 흡광도를 측정하면 채널 위치에 따른 흡광도의 차이를 보여 농도 구배의 형성이 되었음을 확인할 수 있었다. 이에 대한 도면은 도 7에 나타내었다.

실시예 4: 화학물질 농도구배에 세포 노출

도 1의 (2)번 영역에 배양된 세포에 대한 활성도를 측정할 수 있는 독성물질의 농도 구배(gradient)를 형성하였다. (3) 주입구에 배지를 주입하고 (5)번 주입구에 카드뮴이 포함된 배지를 실린지 펌프를 이용하여 0.5μL/min의 유속으로 12시간 동안 주입하여 연속흐름 조건으로 카드뮴의 농도 구배를 형성하였다. 유체의 공급이 유지한 채로 12시간 동안 37℃ 온도 및 5% 이산화탄소 농도의 환경에서 세포를 배양 시켰다. 미세유체 세포칩의 구조에서 농도 구배 형성이 잘 이루어지는 가운데 부분을 광학 현미경을 이용하여 명시야(bright field) 이미지로 취득하여 도 11에 나타내었다..

도 12는 도 1의 세포칩에서 시약 노출 전후의 세포 형태를 촬영한 이미지인 도 11을 바탕으로 세포 형태 인자 값과 노출 농도 구간별 세포 분포의 값을 등고선(contour) 그래프로 표현한 도면(a) 이다. 도 12를 통해 시약의 농도가 상승함에 따라 세포의 원형성이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 도 12 (b)의 그래프에서 카드뮴의 농도에 따른 각 구간에서의 전체 세포 수에 대한 형태 인자 값 0.88-0.98의 범위에 해당하는 세포 수의 비율을 퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다. 각각의 값에 대한 검정곡선(calibration curve)의 y축의 50% 값에 대한 x축의 값을 정의함으로써 간세포주에 대한 카드뮴의 중간 유효 농도(EC50, half maximal effective concentration)를 결정지을 수 있다.

실시예 5: 영상 분석을 통하여 각 세포들의 형태인자값들의 추출 및 분석

상기 실시예 3에 기술한 과정대로 얻은 각각의 명시야 이미지를 영상분석 프로그램을 이용하여 세포배양구간의 각 컴포넌트(2)에 있는 세포의 개수 및 세포 형태를 정량화함으로써 세포의 고사(apoptosis)진행 정도를 분석하였다.

상기 분석을 위하여 사용한 영상분석 시스템은 광학 이미지(명시야 이미지)를 취득하기 위해 광원인 텅스텐 램프(tungsten lamp)와 전하 결합 소자(charge coupling device: CCD)를 구비한 광학 현미경의 이용을 기본 기술로 이용하고, x-y-z 스테이지(stage) 위에 미세유체 칩을 올려 놓은 후 CCD 카메라와 연결된 컴퓨터로부터 미세유체 칩 내에 배양된 세포의 사멸과정 이미지를 취득하였고(도 13a), 미세유체 세포칩은 배지 및 시료 저장기(reservoir)와 연결된 실린지 펌프(syringe pump) 또는 중력에 의한 흐름을 이용한 연속 흐름 (continuous flow) 조건에서 세포배양이 가능하도록 배치하였다(도 13b).

현미경의 미세유체칩 플랫폼에는 5%의 CO₂ _,37℃를 유지하여 세포배양 인큐베 이터와 유사한 세포배양 환경을 현미경상에 구비할 수 있었으며, 실시간 세포영상 촬영을 가능하게 하였다. 컴퓨터에 저장된 이미지는 영상처리 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

상기 분석을 통해 비교적 낮은 농도의 카드뮴에 노출된 컴파트먼트(compartment)의 세포는 낮은 원형성(circularity) 값을 갖지만 높은 농도의 카드뮴에 노출된 컴포넌트의 세포는 높은 형태인자(circularity) 값을 갖는 분석 결과를 얻을 수 있었다. 배양용기에 부착되어 자라는 세포의 형태인자 평균값은 0.5~0.7 사이에 존재하며, 고사사멸과정을 거치며 형태가 변한 세포의 형태인자 값은 0.8 이상의 값을 갖는 것을 알 수 있었다. 이에 대한 원형성 값들의 변화를 표시한 도표를 도 8 에 나타내었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.

도 1은 본 발명에 따른 미세유체 세포칩의 기본적인 구조를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 미세유체 세포칩을 개략적으로 나타낸 도면이다. 여기서, (a)는 세포 부착 배양 구간을 포함하는 미세유체 채널 구조이며, (b)는 미세유체의 막 밸브 시스템의 구조이며, (c)는 상기 미세유체 채널 구조 및 막 밸브 시스템이 결합된 칩의 부분도이다.

도 3은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 미세유체 세포칩으로서 복수개의 확산 구간과 단순 세포배양구간이 결합되어 있는 미세유체 세포칩이다.

도 4는 한 개의 확산 구간과 복수개의 세포배양 용기로 구성되어 있으며 도2a와 유사하지만 막밸브가 장착되어 있지 않아 도 1의 미세유체 칩과 같이 실린지 펌프를 이용하여 연속흐름 조건이 적용되는 세포칩이다.

도 5는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 제조된 미세유체 세포칩의 촬영 이미지이다. 막밸브가 장착되어 정적흐름의 조건을 갖는 세포칩(왼쪽)과 연속흐름 조건을 갖는 세포칩(오른쪽)이다.

도 6는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따를 미세유체 세포칩 내의 세포 배양 구간의 개요도와, 세포 배양 구간에서 시간에 따라 S자형 세포 성장 곡선을 나타냄을 보여주는 이미지 및 그래프이다.

도 7은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따라 세포 배양 구간에 시약의 농도 구배가 형성된 것을 나타낸 그래프 및 촬영 이미지이다.

도 8은 시료로서 세포독성물질을 도 2(a) 칩의 세포배양구간에 처리하기 전 과 후의 사진 및 및 가 세포에서 원형성 값을 계산하여 나타낸 것이다.

도 9는 본 발명에서 사용되는 영상분석 프로그램의 이미지 분석 과정을 나타낸 순서도이다.

도 10은 도 9에 따른 영상처리 방법으로 얻어진 세포의 개수의 실제 세포의 수와 유사한 값을 나타내어 재현성 및 신뢰성 있는 결과를 가지는 것을 나타내기 위해, 세포계수를 추출 해내기 위해 만든 메크로로 계수한 후 실제 세포 수와 비교한 검정곡선(calibration curve) 그래프이다.

도 11은 도 1의 칩에서 시약 노출 전후의 세포 형태를 촬영한 이미지를 나타낸 도면이다.

도 12는 세포 형태 인자 값과 노출 농도 구간별 세포 분포의 값을 등고선(contour) 그래프로 표현한 도면(a)와 이것을 바탕으로 중간 유효 농도(half maximal effective concentration)을 나타낸 그래프(b)이다.

도 13은 본 발명에서 영상 분석을 위하여 사용한 영상분석 시스템의 구조를 나타낸 것이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1: 미세유체의 확산 구간

2: 세포 배양 구간

3, 4, 5: 유체주입구

3: 배지주입구

5: 시료주입구

6: 배출구(세포주입구)

7, 8: 막 밸브 채널

9, 10: 막 밸브를 제어하는 압력 주입구

Claims

배지주입구;

상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구;

상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간;

상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간; 및

상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩.
제1항에 있어서,

상기 세포 배양 구간은 미세유체의 흐름을 제어하기 위한 밸브 시스템을 구비하는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제2항에 있어서,

상기 밸브 시스템은 공기압을 이용하는 막(membrane) 밸브 시스템으로서, 주입구 공기압 밸브와 배출구 공기압 밸브를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제1항에 있어서,

상기 미세유체의 확산 구간 및 세포 배양 구간으로부터 선택되는 하나 이상은 복수 개의 채널로 형성되는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제4항에 있어서, 상기 미세유체 확산구간 및 세포 배양 구간으로부터 선택되는 하나 이상은 복수 개의 단으로 형성되는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제1항에 있어서,

상기 배출구로 또는 별도의 세포주입구를 이용하여 세포가 주입되는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제1항에 있어서, 상기 세포칩은 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고분자 재질로 제조된 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
제1항에 있어서, 상기 미세유체 세포칩은 슬라이드 글라스, 크리스탈 및 유리 글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 광학적 측정이 용이한 플레이트 상부에 접합되는 것을 특징으로 하는 미세유체 세포칩.
배지주입구, 상기 배지주입구와 별개로 형성되는 시료주입구, 상기 배지 주입구 및 시료 주입구로부터의 채널이 합류하여 연결되는 미세유체 채널을 구비하는 미세유체의 확산 구간, 상기 미세유체의 확산 구간에 연결되고 세포의 부착 배양이 이루어지는 세포 배양구간 및 상기 세포 배양 구간에 연결되는 배출구를 포함하는 미세유체 세포칩을 준비하는 단계;

상기 배출구를 통해 세포를 주입시킨 후 일정시간 간격으로 배지를 배출구로 배출시키며 세포를 배양하여 상기 세포 배양 구간상에 부착된 단일 세포층을 형성하는 단계;

상기 시료 주입구를 통해 시료를 주입하고 미세유체의 확산구간을 통과시켜 농도구배가 형성된 시료에 상기 단일 세포층을 노출시키는 단계; 및

상기 시료에 노출된 세포층이 존재하는 세포 배양 구간을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 각 세포의 형태인자 값을 추출하여 세포사멸정도를 정량화 하는 단계

를 포함하는 미세유체 세포칩을 이용한 세포사멸 정도의 정량 분석법.
제9항에 있어서, 상기 미세유체 세포칩의 미세유체의 확산구간 또는 세포 배양 구간은 복수개의 채널로 형성되거나, 복수 개의 단으로 형성되는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정도의 정량 분석법.
제9항에 있어서, 상기 세포배양구간의 촬영 및 세포사멸정도의 정량화는 실 시간으로 실시하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정도의 정량 분석법.
제9항에 있어서, 상기 세포사멸 정도의 정량화를 통해 시료의 세포독성을 평가하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정도의 정량 분석법.
제9항에 있어서,

상기 각 세포의 형태인자 값은 하기의 식으로 계산되는 세포 원형성 값임을 특징으로 하는 세포사멸 정도의 정량 분석법.

원형성 = 4π×(세포면적/세포둘레²)
제9항에 있어서,

상기 세포 배양 구간을 촬영하고 촬영된 이미지로부터 각 세포의 형태인자 값을 추출하여 세포사멸정도를 정량화 하는 단계는

촬영된 이미지 내의 세포들을 식별하여 분할(segmentation)하는 단계;

식별된 세포들로부터 세포 형태인자를 추출하는 단계; 및

추출한 세포형태인자와 세포사멸정도의 상관관계를이용하여 세포사멸을 정량화 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포사멸 정도의 정량분석법.
1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 미세유체 세포칩; 및

실시간으로 세포배양구간을 촬영 및 분석하기 위한 광학영상분석 장치를 포 함하는 세포 영상분석장치.
제15항에 있어서,

상기 세포 영상분석장치는 약물의 세포독성을 평가하기 위한 것을 특징으로 하는 세포 영상분석장치.
제15항에 있어서,

상기 광학영상분석 장치는 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이져광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원;

대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라;

미세유체칩을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼;

상기 CCD로 부터 얻어진 이미지를 분석/처리하여 세포형태인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 컴퓨터 시스템인 것을 특징으로 하는 세포 영상분석장치.
제17항에 있어서,

상기 세포배양 플랫폼은 세포배양을 위한 온도조건 및 대기포화조건의 조절 이 가능한 것을 특징으로 하는 세포 영상분석장치.