KR100936276B1 - 미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템 - Google Patents

미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적 특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템에 관한 것으로, 구체적으로 난관에서의 압축, 연동운동 및 섬모운동을 모방할 수 있는 장치를 미세유체제어기술과 조합함으로써 수정란 및 난자의 배양 및 발달을 효율적으로 하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의한 미세유체제어기술을 기반으로 한 난관 생체모방 수정란 배양 시스템은 수정란 및 난자의 효율적인 배양 및 발달을 도울 수 있기 때문에 줄기세포 및 발생학 연구의 편의성 및 높은 효율성을 제공하고, 일반 산부인과에서도 효과적으로 불임부부를 위한 인공수정 및 체외수정에 응용될 수 있다.
미세유체제어기술, 수정란 배양, 배양 시스템, 난관, 압축, 연동운동, 섬모운동

Description

미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적 특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템{Fertilized egg or ovum culture system which mimics physical and biological features of oviduct based on microfluid mechanics}
본 발명은 미세유체제어기술 기반으로 난관의 물리적 특징 및 생물적 특징을 모방한 수정란 및 난자 배양 시스템에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 난관에서의 압축, 연동운동 및 섬모운동을 모방할 수 있는 장치를 미세유체제어기술과 조합함으로써 수정란 및 난자의 배양 및 발달을 효율적으로 하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
줄기세포의 발전과 보조생식술의 발달로 수정란 및 난자의 시험관 내 배양(IVC) 및 수정(IVF) 기술이 더불어 발달해왔다. 난치병 치료의 유일한 대안으로 떠오르는 줄기세포의 개발과 불임(infertility)을 해결하기 위한 체외 수정 및 시험관 시술에서 가장 주요한 과정 중에 하나가 바로, 수정란 및 난자의 배양기술이다. 기존의 수정란 및 난자를 위한 배양기술은 여타 세포 배양법과 동일한 페트리 디쉬 배양법에 의존하였고, 배아를 개별적으로 핸들링하기 위한 기술은 유리 파이 펫(glass pipette) 혹은 고정 파이펫(holding pipette)으로 이루어졌다.
기존 배양법의 높은 발달 실패율, 다태아 출산 및 윤리·경제적 문제 등을 개선하기 위하여 미세유체시스템이 적용된 수정란 및 난자 배양을 위한 장치들이 이미 개발된바 있다(국내 공개특허 10-2005-0008731, 국내 공개특허 10-2007-0033946). 이러한 시스템은 기존의 배양 접시와 유리 파이펫을 이용한 배양 기술의 한계점을 뛰어넘어 배양 성공률을 높이는데 기여했다. 하지만, 상기 장치들은 실제 배아가 생물체 내에서 이동하는 난관(oviduct)의 형태와 많은 차이를 보이면서 그 효율성에 한계를 여전히 가지고 있다.
인간(human)의 난관(oviduct)은 자궁과 난소를 연결하는 가늘고 긴 관으로서, 이곳에서 수정이 이루어지며 수정란을 자궁으로 이동시키는 역할을 한다. 총 길이 약 10 ㎝ 정도이며 누두부, 난관채, 평대부 및 협부의 네 부분으로 구성되어있다. 누두부(fundibulum)는 난소를 감싸는 깔대기 모양의 부분으로 약 10 mm정도의 직경을 가지고 있다. 난관채(fimbriae)는 난관의 가장자리로서 손가락처럼 끝 부분이 펼쳐진다(Finger like extensions of its margins). 평대부(ampulla)는 난관 끝쪽의 1/3지점으로서 수정이 이루어지는 중요한 부분이다. 마지막으로 협부(isthmus)는 자궁강과 접해 있는 부분으로서 난관의 구성요소 중 가장 좁은 30 ~ 100 ㎛의 직경을 가지고 있다. 수정란의 직경을 약 100 ㎛라고 본다면 수정란이 자궁 쪽으로 난관을 이동하는 동안 협부(ishmus)를 통과하면서 수정란은 약간의 압력을 받아 압축 및 변형됨(squeezing or constriction)을 알 수 있다. 난관의 상피는 섬모가 있는 단층원주상피(ciliated simple columnar epithelium)이다. 평대 부에서 정자를 만나 수정된 수정란은 난관 내의 섬모상피세포에 의한 섬모운동과 난관 자체의 연동운동에 의해 자궁으로 보내지게 된다.
이에, 본 발명자들은 전술한 난관의 물리적 및 생물적 특징과 미세유체제어기술을 조합함으로써 생물체 내 난관에서의 수정란 또는 난자의 이동을 모방한 배양장치를 제작하였고, 상기 배양장치에서 수정란 또는 난자가 건강하게 분화하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기존의 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 수정란 및 난자 배양 시스템의 낮은 효율성을 높이기 위해 난관의 물리적 및 생물적 특징을 모방하여 도입함으로써 배양 효율성을 높이고 줄기세포 및 발생학 연구의 편의성을 제공하는 것에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1);
상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능한 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
3) 단계 2)의 시스템을 37℃ 인큐베이터에 넣어 온도를 유지하며 수정란 또는 난자를 배양하는 단계; 및,
4) 단계 3)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1);
상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능하며 상류지역에 밸브(펌프) 채널부(25)가 구비된 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
3) 단계 2)의 수정란 또는 난자가 연동수축을 위한 밸브(펌프) 채널부(25)를 지날때에 상기 밸브(펌프) 채널부(25)에 미세유체를 주입하는 단계;
4) 단계 3)의 수정란 또는 난자가 밸브(펌프) 채널부(25)를 지나면, 단계 3)의 시스템을 37℃ 인큐베이터에 넣어 온도를 유지하며 수정란 또는 난자를 배양하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1);
상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능한 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다.
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)는 수정란이 발달한 형태인 배반포 직경의 10% 내지 100% 넓은 너비 및 5% 내지 50% 높은 높이인 것이 바람직하다. 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)가 2개 내지 300개가 포함되는 것이 바람직하다. 상기 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)가 하나 이상 포함되면서 압축 자극의 횟수를 조절할 수 있고, 난관의 길이를 모방할 수 있다. 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)는 배반포 직경의 너비 및 높이의 60% 내지 90%인 것이 바람직하며, 압축자극의 강도를 조절하기 위해 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)의 너비 및 높이가 조절될 수 있다. 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)는 길이가 50 ㎛ 내지 150 ㎛인 것이 바람직하고, 압축자극의 강도를 조절하기 위해 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)의 너비 및 높이가 조절되는 것을 특징으로 한다. 상기 시스템을 이용한 결과 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 확인하였다(도 6a 참조).
또한, 본 발명은 1) 상기 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
3) 단계 2)의 시스템을 37℃ 인큐베이터에 넣어 온도를 유지하며 수정란 또는 난자를 배양하는 단계;
4) 단계 3)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법을 제공한다.
또한, 상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능한 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능하며 상류지역에 밸브(펌프) 채널부(25)가 구비된 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다.
상기 밸브(펌프) 채널부(25)는 수정란 또는 난자가 이동할 수 있는 하부 미세유체채널판(50)의 상류지역에 위치하고, 밸브(펌프) 채널부(25)와 하부 미세유체채널판(50) 사이에 멤브레인이 존재하여 하부 미세유체채널판(50)의 채널부를 이동하는 수정란 또는 난자를 압박할 수 있다. 상기 멤브레인은 폴리다이메틸실록산인 것이 바람직하다. 밸브(펌프) 채널부(25)에 페리스탈틱 펌프가 추가로 연결되어 하부 채널판(50)에 압력을 줌으로써 하부의 유체가 일정한 방향과 속도로 흐를 수 있도록 제어할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
3) 단계 2)의 수정란 또는 난자가 연동수축을 위한 밸브(펌프) 채널부(25)를 지날때에 상기 밸브(펌프) 채널부(25)에 미세유체를 주입하는 단계;
4) 단계 3)의 수정란 또는 난자가 밸브(펌프) 채널부(25)를 지나면, 단계 3)의 시스템을 37℃ 인큐베이터에 넣어 온도를 유지하며 수정란 또는 난자를 배양하는 단계;
5) 단계 4)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 상기 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 배양 시스템의 내부 벽에 난관 표면의 섬모세포가 추가로 부착된 것을 특징으로 하는 배양 시스템을 제공한다.
섬모세포의 부착 전에 섬모세포의 부착을 도울 수 있는 화학물질을 배양 시스템의 내부 벽에 처리될 수 있으며, 상기 화학물질로는 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), poly-L-lysine 및 자연 세포외기질(extracellular matrix) 등이 있고, 자연 세포외기질(extracellular matrix)이 가장 바람직하다. 또한 본 발명은 상기 섬모세포 대신에 MEF(mouse embryonic fibroblast)로 대체될 수 있다.
본 발명의 배양 시스템의 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10), 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20) 및 밸브(펌프) 채널부(25)는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리스티렌(polystylene), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 PDMS를 사용하였다.
또한 본 발명의 바람직한 실시예에서 배양 시스템은 슬라이드 글라스, 크리스탈, 유리 글라스 및 PDMS로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 접합되어 있을 수 있고, 미세유체흐름을 발생시킬 수 있는 기울기를 형성시키는 장치 위에 고정될 수 있다. 또한 상기 미세유체흐름은 시린지 펌프(syringe pump)로 배지 주입량을 조절함으로써 발생할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 도 2c에서 나타낸, 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1), 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10), 14개의 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20) 및 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)로 이루어진 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다.
상기 시스템은 미세유체의 흐름을 위해 기울기를 형성시키는 장치 위에 배양 시스템을 고정시켜서 시스템 좌우의 높이 차이를 유발시킴으로써 유체 및 수정란이 미세채널 내부에서 이동할 수 있도록 조절할 수 있다(도 5 참조). 상기 시스템을 이용한 결과 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 확인하였다(도 6b 참조).
또한, 본 발명의 바람직한 실시태양에서는 도 3a에서 나타낸, 도 2c에서 제시한 배양 시스템이 상부를 이루고 상기 시스템과 역상인 배양 시스템(도 3b)이 하부를 이루며, 상기 상부와 하부가 접합하여 이루어지고 난자 이동 채널부와 반대 방향으로 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)부터 시스템의 외부까지 개방된 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다. 또한, 상기 배양 시스템의 내부 벽에 난모세포가 부착될 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시태양에서 도 4에서 나타낸, 도 3a에서 제시한 배양 시스템의 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 상단부에 밸브(펌프) 채널부(25)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 수정란 또는 난자 배양 시스템을 제공한다. 상기 배양 시스템의 내부 벽에 난관 표면의 섬모세포가 추가로 부착될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 도 4에서 나타낸 배양 시스템에 수정란을 배양한 결과 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 확인하였다.
본 발명은 미세유체시스템 기반 수정란 및 난자 배양 시스템의 효율을 높이기 위하여 난관의 물리적 및 생물적 특징을 모방하였기 때문에, 기존의 페트리디쉬 형식의 배양방식뿐만 아니라 미세유체제어기술을 이용한 여타의 배양 시스템과는 수정란에게 주는 물리적 및 생물적 자극의 정도가 다를 것으로 예측되며, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명의 배양 시스템은 배양 속도, 성장성 및 수정 후 수정란의 상태 등이 기존의 배양 시스템보다 효과적일 것이다. 또한, 본 발명의 미세유체채널부는 채널부의 너비 및 높이가 조절될 수 있고, 채널부 내부에 부착할 수 있는 섬모세포의 종류도 한정이 없으므로 다양한 종 유래의 수정란 또는 난자를 위한 배양 시스템으로 응용될 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 미세유체제어기술을 기반으로 한 난관 생체모방 수정란 또는 난자 배양 시스템은 수정란 및 난자의 효율적인 배양 및 발달을 도울 수 있기 때문에 줄기세포 및 발생학 연구의 편의성 및 높은 효율성을 제공하고, 일반 산부인과에서도 효과적으로 불임부부를 위한 인공수정 및 체외수정에 응용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 수정란 또는 난자 배양 시스템의 기본단위 제작
<1-1> 물리적 특징(압축)의 모방
본 발명에 의한 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 난관의 물리적 특징 중 압축(constriction)을 모방한 수정란 혹은 난자 배양 시스템의 기본단위는 다음과 같다. 도 1a와 같이 상기 시스템은 미세채널 패턴이 있는 구조물층(41)과 투명플레이트 층(70)이 적층된 구조를 갖는다. 미세채널 패턴이 있는 구조물층(41)은 투명하고 탄성을 갖는 PDMS(polydimethylsiloxane)를 이용한 몰딩(molding) 방법으로 제작하였다. 몰딩(molding)을 위한 주형(master)은 실리콘 웨이퍼(silicon wafer) 기판 위에 감광물질(photoresist)을 패터닝하는 방법을 이용하였다. 감광물질로는 SU-8을 사용하여 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 및 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)를 제작하였다(도 2b). 이때 실제 난관의 크기와 유사한 미세유체채널을 제작하기 위해 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)를 실제 배반포 직경보다 10% 이상 넓은 너비 200 ㎛ 및 높은 높이 200 ㎛로 하였다. 또한 난관에서의 수정란 또는 난자의 이동시 발생할 수 있는 압축의 모사를 위한 상기 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)의 채널 너비 및 높이를 배반포 직경의 90% 이하로 하였고(도 1a), 통로의 너비 및 높이가 수정란 및 난자의 크기보다 작아 수정란 및 난자의 표면에 압축(constriction)효과를 줄 수 있다. 상기 주형에 경화제와 10:1의 비율로 섞은 pre-PDMS(Sylgard 184, Dow Corning)를 붓고 60℃에서 3시간 동안 경화시켰다. 경화 과정을 거친 후 PDMS 기판에 구멍을 내어 세포 및 여러 유체물질을 흘려줄 주입구(1)와 배출구(60)를 제작하였다. 이렇게 형성된 미세채널 패턴이 있는 구조물층(41)과 투명 플레이트 층(70)을 공기 플라즈마(air plasma)를 이용해 산화시켜 적층하여 두 층으로 이루어진 수정란 또는 난자 배양 시스템을 완성하였다.
<1-2> 물리적 특징(연동운동)의 모방
본 발명에 의한 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 난관의 물리적 특징 중 연동수축(peristaltic contraction)을 모방한 수정란 혹은 난자 배양 시스템의 기본단위는 다음과 같다. 도 1b와 같이 상기 시스템은 연동수축(peristaltic contraction)을 위한 밸브(펌프) 채널부(25)를 갖는다. 수정란이 흘러 갈 수 있는 하부 미세유체채널판(50)을 하부에 두고, 그 위에 상기 시스템과 유체흐름의 방향이 수직인 유체흐름을 발생함으로써 하부 미세유체채널판(50)의 채널부를 압박할 수 있는 밸브(펌프) 채널부(25)를 상부에 두었다. 상기 밸브(펌프) 채널부(25)에 유체를 유입 및 배출시킬 수 있는 관을 상부 미세유체채널판의 벽면까지 연결해주고(도 4), 상기 상부 미세유체채널판(40) 및 하부 미세유체채널판(50)의 구조물층 사이에 PDMS와 같은 연성의 물질로 멤브레인(membrane)이 존재하도록 하였다. 밸브(펌프) 채널부(25)는 하부패널판(50)의 채널부 위에 접층하여 채널부를 압박함으로써 하부 미세유체채널판(50)의 채널부의 유체뿐만 아니라 수정란 또느 난자도 이동시킬 수 있도록 하였다. 또한, 상기 밸브(펌프) 채널부(25)에 페리스탈틱 펌프를 연결하여 하부 미세유체채널판(50)에 압력을 줌으로써 하부의 유체가 일정한 방향과 속도로 흐를 수 있도록 제어하였다
기본 제작과정은 라운드 형태의 하부 미세유체채널을 가진 실리콘 몰드를 제작하고 PDMS 커링(curing)을 통하여 하부 미세유체채널판(50)을 제작하였다. 그 위에 배열화(aligning)를 통하여 상부 밸브(펌프) 채널부(25)를 포함하는 상부 미세유체채널판(40)을 접합하였다. 접합이 끝나면 밸브(펌프) 채널부(25)와 하부 미세유체채널판(50)을 하부 웨이퍼에서 떼어내어 투명 플레이트(70)에 접층하여 밸브(펌프) 채널부(25)를 갖는 수정란 또는 난자 배양 시스템을 완성하였다.
<1-3> 생물적 특징(섬모운동)의 모방
본 발명에 의한 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 난관의 생물적 특징을 모방한 수정란 혹은 난자 배양 시스템은 다음과 같다. 본 발명의 배양 시스템에 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)로 DMEM 배지를 흘려준 다음, 난관(oviduct) 표면의 섬모세포(Amy LW, Adv Physiol Educ 30:237-241, 2006)를 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)를 통해 주입하였다. 이때 필요에 따라 채널 내부를 섬모세포가 잘 부착할 수 있도록 도울 수 있는 화학물질(콜라겐)으로 미리 코팅하였다. 섬모세포가 채널부에 부착될 때까지 유체를 흘리지 않고 기다린 후, 현미경으로 이미지 분석하여 섬모세포의 밀도가 높아질 때까지 2시간 이상 배양하였다.
< 실시예 2> 수정란 또는 난자 배양 시스템의 제작
<2-1> 배양 시스템 1
본 발명에 의한 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 수정란 혹은 난자 배양 시스템은 난관에서의 반복적인 압축을 모방하기 위하여 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)와 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)가 일정한 간격으로 반복적으로 이어지면서 상기 시스템의 길이가 조절된 형태의 기본 채널판(40)으로 응용될 수 있었다. 도 2a와 같이 상기 시스템은 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1), 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10), 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20), 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)로 구성될 수 있고, 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 및 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)(도 2b)는 일정한 간격(500 ㎛)을 두고 반복적으로 연결되었다.
미세유체의 흐름을 위해 기울기를 형성시키는 장치 위에 배양 시스템을 고정시켜서 시스템 좌우의 높이 차이를 유발시킴으로써 유체 및 수정란 또는 난자가 미세채널 내부에서 이동할 수 있도록 조절하였다(도 5). 이때 수정란 또는 난자의 이동 속도는 실제 난관(oviduct) 안에서의 이동속도에 가깝도록 제어하기 위해 10˚ 기울기를 주어 약 30분마다 기울기 반복을 주어 유체의 흐름을 형성시켰다.
<2-2> 배양 시스템 2
본 발명에 의한 미세유체제어기술(microfluidics)을 기반으로 하는 수정란 혹은 난자 배양 시스템은 난관에서의 반복적인 압축 및 난관의 길이를 모방하기 위하여 본 시스템의 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)와 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)가 일정한 간격으로 반복적으로 이어질 때에 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)를 U자 형태(도 2c)로 구부려주면서 실제 난관의 길이(13 ㎝)만큼 본 시스템의 길이를 연장해 주었다.
수정란 또는 난자의 이동 속도를 미세하게 조절하기 위하여 주입구(1)에 유체를 채워놓고 일정한 방향으로 흐르도록 하고 배출구(60)에 크기가 큰 포트를 붙여 증발을 유도하여 유체를 일정한 방향으로 흐르도록 하는 방식, 주입구(1)와 배출구(60)에 크기가 다른 포트를 붙여 미세 채널 내에서의 유체 속도를 제어하는 방식 또는 시린지 펌프를 이용하여 일정한 속력으로 유체를 주입시키는 방식을 이용하였다.
<2-3> 배양 시스템 3
수정란 및 난자 주입을 쉽게 하기 위해서 실시예 <2-1>의 배양 시스템 1 두 개를 마주보게 겹쳐준 다음 주입구가 배양 시스템의 옆면으로 위치시킨 형태가 응용될 수 있다. 도 3a에서 보는 바와 같이, 도 2c의 기본채널판(40)을 상부 미세유체채널판(40)으로 하고 이의 역상을 하부 미세유체채널판(50)(도 3b)으로 하여 상기 상부 미세유체채널판(40)과 하부 미세유체채널판(50)을 결합하였다. 또한 도 3a에서 보는 바와 같이, 상기 상부 미세유체채널판(40)과 하부 미세유체채널판(50)이 결합한 형태의 배양시스템의 옆면에 주입구(1)를 두고 실제 발생학 및 줄기 세포 연구실에서 쓰이는 미세파이펫(31)을 이용하여 손쉽게 수정란 또는 난자(30)를 주입할 수 있도록 하였다.
또한, 물리적 특징(연동운동)의 모방에 의한 주입구(1)를 거쳐 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)로 진입한 수정란 또는 난자가 실제 난관에서의 연동운동을 할 수 있도록하기 위해 실시예 <1-2>의 방법으로 밸브(펌프) 채널부(25)를 시스템의 미세유체채널 초반부에 설치하였고(도 4), 생물적 특징(섬모운동)의 모방에 의한 배양 시스템의 성능을 향상시키기 위해 실시예 <1-3>의 방법으로 상기 배양 시스템에 섬모세포를 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 및 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)의 내부벽에 부착시켰다.
수정란 또는 난자의 이동 속도를 미세하게 조절하기 위하여 밸브(펌프) 채널부(25)에서 페리스탈틱 펌프를 이용하여 하부 미세유체채널판(50)의 채널부에 압력을 주어 유체를 일정한 방향과 속력으로 유체를 주입시키는 방식을 이용하였다.
< 실시예 3> 수정란 또는 난자 배양 시스템을 이용한 세포배양
<3-1> 배양 시스템 1
본 발명의 실시예 2-1에서 제작한 도 2a의 배양 시스템 1을 이용하여 수정란을 배양하였다.
우선 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)에 CR1aa 배지를 흘려주어 시스템 내부에 배지가 충분하도록 한 뒤, 배양시키고자 하는 수정란 및 배지를 주입구(1)에 넣어주었다. 상기 배양 시스템 1을 37℃ 인큐베이터 안에 넣어 적당한 온도를 유지하면서 배양하였다. 일주일 내지 열흘이 지난 후에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)로 수정란을 배출시켰다. 이 후, 상기 배양된 수정란을 현미경(Olympus, 일본)을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 수정란은 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)와 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)를 반복적으로 통과하면서 서서히 이동하였고(도 7), 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 6a).
<3-2> 배양 시스템 2
본 발명의 실시예 2-2에서 제작한 도 2c의 배양 시스템 2를 이용하여 수정란을 배양하였다.
우선 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)에 CR1aa 배지를 흘려주어 시스템 내부에 배지가 충분하도록 한 뒤, 배양시키고자 하는 수정란 및 배지를 주입구(1)에 넣어주었다. 수정란 또는 난자의 이동 속도는 실제 난관(oviduct)안에서의 이동 속도인 0.157 ㎛/s에 가깝도록 제어하였다. 상기 배양 시스템 2를 37℃ 인큐베이터 안에 넣어 적당한 온도를 유지하면서 배양하였다. 일주일 내지 열흘이 지난 후에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)로 수정란을 배출시켰다. 이 후, 상기 배양된 수정란을 현미경(Olympus, 일본)을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 관찰할 수 있었다(도 6b).
<3-3> 배양 시스템 3
본 발명의 실시예 2-3에서 제작한 도 4의 배양 시스템 3을 이용하여 수정란을 배양하였다.
우선 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)에 CR1aa 배지를 흘려주어 시스템 내부에 배지가 충분하도록 한 뒤, 다음은 배양시키고자 하는 수정란 및 배지를 주입구(1)에 넣어주었다. 수정란 또는 난자의 이동 속도는 실제 난관(oviduct)안에서의 이동 속도인 0.157 ㎛/s에 가깝도록 제어하였다. 배양 시스템 3을 37℃ 인큐베이터 안에 넣어 적당한 온도를 유지하면서 배양하였다. 일주일 내지 열흘이 지난 후에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)로 수정란을 배출시켰다. 이 후, 상기 배양된 수정란을 현미경(Olympus, 일본)을 통하여 관찰하였다.
그 결과, 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화되는 것을 관찰할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 수정란 또는 난자 배양 시스템의 기본단위의 개요도이다:
도 1a: 물리적 특징 압축을 모방한 배양 시스템의 기본단위; 및,
도 1b: 물리적 특징 연동운동을 모방한 배양 시스템의 기본단위.
도 2는 본 발명의 압축 및 난관의 길이의 특징을 모방한 배양 시스템의 개요도이다:
도 2a: 물리적 특징 압축 모방을 반복한 시스템;
도 2b: 물리적 특징 압축을 모방한 기본단위의 확대도; 및,
도 2c: 물리적 특징 압축 모방을 난관의 길이와 유사하게 반복한 기본채널판.
도 3은 수정란 및 난자의 주입을 쉽게 하기 위해 응용한 수정란 또는 난자 배양 시스템의 개요도이다:
도 3a: 도 2c의 기본채널판과 도 3b의 하부채널판을 결합한 시스템; 및,
도 3b: 도 2c의 역상인 형태의 하부채널판.
도 4는 본 발명의 연동운동 특징을 모방한 수정란 또는 난자 배양 시스템의 개요도이다.
도 5는 본 발명에 따른 배양 시스템의 실제 사진이다.
도 6은 본 발명의 배양 시스템에서 배양된 수정란이 배반포기 형태까지 건강하게 분화된 것을 나타낸 도이다:
도 6a: 배양 시스템 1에서 배양된 돼지 수정란; 및,
도 6b: 배양 시스템 2에서 배양된 돼지 수정란.
도 7은 본 발명에 따른 배양 시스템의 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)를 통과하는 돼지 수정란을 나타낸 도이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 : 수정란 또는 난자 및 배지 주입구
10 : 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부
20 : 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부
25 : 연동수축(peristaltic contractions)을 위한 밸브(펌프) 채널부
30 : 수정란 또는 난자
31 : 수정란 또는 난자를 주입하기 위한 미세파이펫(micro-pipette)
40 : 상부채널판
41 : 미세채널 패턴이 있는 구조물층
50 : 하부채널판
60 : 수정란 또는 난자 및 배지 배출구
70 : 투명플레이트 층

Claims (18)

  1. 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1);
    상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능한 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
    상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
    상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템.
  2. 제 1항에 있어서, 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)는 수정란이 발달한 형태인 배반포 직경의 10% 내지 100% 넓은 너비 및 5% 내지 50% 높은 높이인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)의 수는 2개 내지 300개인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  4. 제 1항에 있어서, 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)는 배반포 직경의 너비 및 높이의 60% 내지 90%인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  5. 제 1항에 있어서, 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20)는 압축자극의 강도를 조절하기 위해 너비 및 높이가 조절되는 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  6. 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1);
    상기 수정란 또는 난자 및 배지 주입구(1)와 연결되고 수정란 또는 난자가 이동 가능하며 상류지역에 밸브(펌프) 채널부(25)가 구비된 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10);
    상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 하나 이상의 수로 형성된 상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10)의 직경을 감소시킨 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20); 및,
    상기 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10) 내에 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(60)가 연결된 수정란 또는 난자 배양 시스템.
  7. 제 6항에 있어서, 밸브(펌프) 채널부(25)는 수정란 또는 난자가 이동할 수 있는 하부 미세유체채널판(50)의 상부에 위치하고, 밸브(펌프) 채널부(25)와 하부 미세유체채널판(50) 사이에 멤브레인이 존재하여 하부 미세유체채널판(50)의 채널부를 이동하는 수정란 또는 난자를 압박할 수 있는 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  8. 제 7항에 있어서 멤브레인은 폴리다이메틸실록산인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  9. 제 6항에 있어서, 밸브(펌프) 채널부(25)에 페리스탈틱 펌프를 추가로 연결되는 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  10. 제 1항 또는 제 6항에 있어서, 배양 시스템의 내부 벽에 난관 표면의 섬모세포가 추가로 부착된 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  11. 제 10항에 있어서, 섬모세포의 부착 전에 섬모세포의 부착을 도울 수 있는 콜라겐(collagen), 파이브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin), poly-L-lysine 및 자연 세포외기질(extracellular matrix)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나가 배양 시스템의 내부 벽에 처리되는 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  12. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 시스템의 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10), 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20) 및 밸브(펌프) 채널부(25)는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리스티렌(polystylene), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  13. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 시스템은 슬라이드 글라스, 크리스탈, 유리 글라스 및 PDMS로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나에 접합된 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  14. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 시스템은 미세유체흐름을 발생시킬 수 있는 기울기를 형성시키는 장치 위에 고정되는 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
  15. 1) 제 1항의 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
    2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
    3) 단계 2)의 시스템을 인큐베이터에 넣어 수정란 또는 난자를 배양하는 단계; 및,
    4) 단계 3)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 제 1항의 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법.
  16. 1) 제 6항의 수정란 또는 난자 배양 시스템의 주입구(1)에 배지를 주입하는 단계;
    2) 상기 주입구(1)에 수정란 또는 난자를 주입하고 미세유체 흐름의 속도를 제어하는 단계;
    3) 단계 2)의 수정란 또는 난자가 연동수축을 위한 밸브(펌프) 채널부(25)를 지날때에 상기 밸브(펌프) 채널부(25)에 미세유체를 주입하는 단계;
    4) 단계 3)의 수정란 또는 난자가 밸브(펌프) 채널부(25)를 지나면, 단계 3)의 시스템을 인큐베이터에 넣어 수정란 또는 난자를 배양하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 배양된 수정란 또는 난자를 수정란 또는 난자 및 배지 배출구(51)로부터 배출하는 단계를 포함하는 제 6항의 시스템을 이용한 수정란 또는 난자 배양 방법.
  17. 삭제
  18. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 시스템의 수정란 또는 난자 이동 미세유체채널부(10), 수정란 또는 난자 압축 미세유체채널부(20) 및 밸브(펌프) 채널부(25)는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리스티렌(polystylene), 폴리실릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 배양 시스템.
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