CN211402400U - 一种外泌体鉴定装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型提出一种外泌体鉴定装置，本实用新型的外泌体鉴定装置小巧，便于携带，并且造价便宜，相比于传统的设备，大大降低了设备的成本；本实用新型的外泌体鉴定装置可以将加样区内的外泌体样本分散到四周多条检测“臂”内同时进行检测，保证检测结果的准确性，避免由于显色剂失效，造成检测结果的不准确；并且采用本实用新型检测设备的检测方法检测效率高，过程简单，无需对操作人员进行专业的培训，降低了检测成本。

Description

一种外泌体鉴定装置

技术领域

本实用新型涉及外泌体鉴定技术领域，尤其涉及一种外泌体鉴定装置。

背景技术

细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)是一种细胞间相互通讯的手段，也是进化历史上非常古老的一种细胞间通讯手段，从真核生物到原核生物，都存在基于EVs的信息传递。

外泌体是EVs的一种特殊亚型，来源于内体(endosome)起源的多泡体(Multivesicular bodies，MVBs)，粒径主要分布于30nm-150nm，具有一些特异的标志物，例如：CD63，CD81，ALIX(Apoptosis-Linked Gene 2-Interacting Protein X，细胞凋亡相关基因2相互作用蛋白X)，FLOT1(Flotillin-1，阀蛋白 1)，ICAM1(Intercellular adhesionmolecule 1，细胞间黏附分子1)，EpCam (Epithelial cell adhesion molecule，上皮细胞粘附分子)，ANXA5(Annexin A5，膜联蛋白A5)和TSG101(Tumor susceptibility gene 101，肿瘤易感基因101)。

外泌体近年来研究的越来越多，主要集中在两个方面：疾病标志物、外泌体治疗。

而外泌体分离提取之后，进行进一步检测或者作为治疗药物使用之前，需要质量控制，确定我们收集的样本就是外泌体，且无来自细胞碎片的污染。这样的外泌体才有作为疾病标志物的价值，这样的外泌体用于外泌体治疗才能保证有效性和安全性。

质量控制常规的方法包括纳米颗粒跟踪分析(NTA)、动态光散射、透射电镜、免疫电镜、Western Blot、免疫流式、ELISA等方法。NTA和动态光散射相对而言比较简单，但仅仅评估了粒径大小分布情况，对于外泌体鉴定的意义有限，且需要复杂的仪器设备，从实验室推广到临床使用较为困难。透射电镜可以观察外泌体形态，是一种相对较好的鉴定方法，但是费时费力，而且依赖大型仪器(电子显微镜)，也很难完成从实验室向临床的推广。

基于免疫的方法，是可以测定外泌体中富集的蛋白(CD63,CD81,ALIX, FLOT1,ICAM1,EpCam,ANXA5和TSG101)的含量来判断获取的样本是否为外泌体。并且还可以测定在外泌体中不存在，而在细胞碎片中存在的蛋白 [GM130(130KDa Cis-Golgi MatrixProtein，130KDa顺式高尔基体基质蛋白)] 的含量，来判断获取的样本中是否存在碎裂的细胞产生的污染组分。因此基于免疫学的方法，是可以比较准确和可靠的评估外泌体样本质量的手段。但传统的基于免疫的鉴定方法，对于外泌体量的要求较多，临床使用中，提取出来的外泌体很宝贵，能用尽量少的样本进行鉴定是最好的。

但是传统的基于免疫的方法，免疫电镜依然存在依赖大型仪器的缺点，难以从实验室推广到临床。Western Blot虽然不需要大型仪器，但操作复杂，依然是很费时费力的方法，难以满足临床需求。免疫流式也依赖于大型仪器(流式检测仪器)。ELISA虽然比WesternBlot简单，但也依然相对而言费时费力。最终产品推广到临床上大量使用时，配备大量具有专业知识的操作人员是不现实的，必须要做到操作简单，操作人员只需要经过简单的培训便可掌握。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提出一种检测快捷、样本需要量少并且设备小的外泌体鉴定装置。

为达到上述目的，本实用新型提出一种外泌体鉴定装置，包括基底、加样区、游离抗体区、固定抗体区、质控抗体区和废液区；其中，以所述游离抗体区、所述固定抗体区、所述质控抗体区和所述废液区的顺序依次排布成一条臂；围绕所述加样区的一周间隔布置有多条所述臂；并且所述加样区通过流道与所述游离抗体区的进液口相连通；每一个所述游离抗体区的出液口通过所述流道与所述固定抗体区的进液口相连通；所述固定抗体区的出液口通过所述流道与所述质控抗体区的进液口相连通；所述质控抗体区的出液口通过流道与所述废液区的进液口相连通。

优选的，所述流道、所述游离抗体区、所述固定抗体区和所述质控抗体区的底面均为亲水底面；所述流道、所述游离抗体区、所述固定抗体区和所述质控抗体区的侧壁均为疏水侧壁。

优选的，所述亲水底面为亲水材料制作的底面，包括滤纸；所述疏水侧壁为疏水材料制作的侧壁，包括蜡。

优选的，所述加样区、游离抗体区、固定抗体区、质控抗体区、废液区和流道均通过印刷或者光刻技术印刷或者光刻于所述基底的表面上。

优选的，所述基底为纸质基底、玻璃基底、聚二甲硅氧烷基底或者聚甲基丙烯酸甲酯基底。

优选的，所述纸质基底为滤纸、聚偏二氟乙烯膜或者硝化纤维素膜。

优选的，所述外泌体鉴定装置还包括一个透明的外壳，所述外壳罩设于所述基底表面，所述外壳上正对所述加样区设有加样口；通过在所述外壳表面相应位置上写下文字，以说明每一条所述臂检测的蛋白种类；通过设置透明外壳或者在所述外壳上设置观察窗实现对反应的观测；所述观察窗正对每一条所述臂上检测区域设置。

与现有技术相比，本实用新型的优势之处在于：本实用新型的外泌体鉴定装置小巧，便于携带，并且造价便宜，相比于传统的设备，大大降低了设备的成本；本实用新型的外泌体鉴定装置可以将加样区内的外泌体样本分散到四周多条检测“臂”内同时进行检测，保证检测结果的准确性，避免由于显色剂失效，造成检测结果的不准确；并且采用本实用新型检测装置的检测方法检测效率高，过程简单，无需操作人员进行专业的培训，降低了检测成本。

附图说明

图1为本实用新型一实施例中外泌体鉴定装置的整体结构示意图；

具体实施方式

为使本实用新型的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本实用新型的技术方案作进一步地说明。

如图1所示，本实用新型提出一种外泌体鉴定装置，包括基底1、加样区2、游离抗体区3、固定抗体区4、质控抗体区5和废液区6；其中，以游离抗体区 3、固定抗体区4、质控抗体区5和废液区6的顺序依次排布成一条臂；围绕所述加样区2的一周间隔布置有多条臂；并且加样区2通过流道与游离抗体区3 的进液口相连通；每一个游离抗体区3的出液口通过流道与固定抗体区4的进液口相连通；固定抗体区4的出液口通过流道与质控抗体区5的进液口相连通；质控抗体区5的出液口通过流道与废液区6的进液口相连通。

在本实施例中，流道、游离抗体区3、固定抗体区4、质控抗体区5和废液区6的底面均为亲水底面；流道、游离抗体区3、固定抗体区4、质控抗体区5 和废液区6的侧壁均为疏水侧壁；亲水底面和疏水侧壁的设计，保证添加至加样区2的外泌体样本会顺着流道的方向扩散流动，疏水侧壁则会保证外泌体样本不会随意自由扩散，为外泌体样本提供导流的作用，使得倒入的外泌体样本自动流动到指定区域完成检测。

在本实施例中，亲水底面为亲水材料或者亲水化学试剂制作的底面，包括滤纸；疏水侧壁为疏水材料或者疏水化学试剂制作的侧壁，包括蜡。

在本实施例中，加样区2、游离抗体区3、固定抗体区4、质控抗体区5、废液区6和流道均通过印刷或者光刻技术印刷或者光刻于基底1的表面上。

其中，光刻法：基底1浸泡在SU-8 2010光刻胶中，然后用标准光刻程序处理，包括旋涂，预烘烤，UV曝光，后烘烤，开发和硬烘烤步骤。用SU-8光刻胶阻挡层形成的基底1上微通道可以达到高精度(≈100μm)并且耐一些有机溶剂。

光刻法，可以参考文献：Adv.Healthcare Mater.2018,1801084。

印刷法：包括聚合物印刷，喷墨蚀刻/印刷，蜡印刷，蜡筛选，柔版印刷等，近年来最常用于制造纸微流体装置，优点：简单的操作程序，低成本，短周期。蜡印刷是最广泛采用的技术，仅涉及印刷和烘烤，蜡也是相对廉价的疏水材料。

在本实施例中，基底1为纸质基底1、玻璃基底1、聚二甲硅氧烷基底1或者聚甲基丙烯酸甲酯基底1，在本实施例中，采用纸质作为基底1；微流控纸芯片(paper-basedmicrofluidic analytical devices，μPADs)是一种新兴的使用纸张作为原料的基于微流控分析技术的分析平台，相较于用硅、玻璃、高聚物等材料制作的微流控芯片而言，具有成本低、加工简易、使用和携带方便等优点；这些优点使得μPADs在临床诊断、食品质量控制和环境监测等应用领域具有很大的应用前景，因此，本实施例也采用纸如滤纸作为基底1，可以有效的降低设备的成本。

在本实施例中，纸质基底1为滤纸、聚偏二氟乙烯膜或者硝化纤维素膜。

在本实施例中，外泌体鉴定装置还包括一个透明的外壳，外壳罩设于基底1 表面，外壳上正对加样区2设有加样口，保证无菌操作，在每条“臂”上，用文字说明该“臂”检测的是哪一种蛋白；另外，也可以使用不透明外壳，仅在需要观察的区域(固定抗体区、质控抗体区)使用透明材料制作一个“观察窗”，并在“观察窗”边注明该“臂”检测的指标，方便操作人员观察。

为是本实用新型的使用方法为本领域技术人员理解，本实用新型还提出一种外泌体鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：装配外泌体鉴定装置,向所述外泌体鉴定装置内配置相应的抗体；

步骤1.1：根据每条臂的检测指标分别选择抗体1、抗体2和抗体PC；

步骤1.2：对抗体1进行修饰；

步骤1.3：将抗体1涂抹于游离抗体区3内，将抗体2置于固定抗体区4内，将抗体PC置于质控抗体区5内；

步骤2：将外泌体样本与裂解液混合，得到混合液；

步骤3：将混合液注入加样区2；

步骤4：等待检测反应，观察检测结果。

在本实施例中，抗体1和抗体2分别能识别外泌体样本内同一个蛋白2个不同的位点；抗体PC可以捕获游离的抗体1。

在本实施例中，抗体1是游离的，直接涂抹即可，液体经过会跟着液体流动；抗体2和抗体PC是通过化学修饰的方法实现的固定，效果是在该区域的表面形成了一层抗体层，例如：可以在抗体上接上一个生物素，在纸上附着亲和素，然后通过生物素和亲和素的共价键连接，实现把抗体固定在该区域，不随着液体流动而流动。

在本实施例中，在步骤3中，修饰为胶体金、荧光基团或者量子点，其中，胶体金采用静电吸附作用的方式与抗体1相结合；荧光基团通过共价键与抗体1 相结合。

在本实施例中，本实用新型的检测原理为：当外泌体样本流经游离抗体区3 时，抗体1会识别其中的相应指标，与之结合后，一同随着微流体方向移动；

当外泌体样本进入固定抗体区4后，抗体2识别相应的指标，将其捕获。因为抗体1和抗体2识别相同的指标，结合到抗原上的抗体1连同修饰的胶体金将会一同被捕获，如果使用胶体金修饰，则会显色，可见光下即可观察。如果使用荧光基团或量子点修饰，则可以在激发光激发下观察，或者用小型荧光成像设备观察。

当外泌体样本进入质控抗体区5后，因为“游离抗体区3”中的抗体1在设计时就是过量的，未结合到抗原上的抗体1将不会被抗体2捕获(因为抗体2 是通过捕获抗原，从而捕获了吸附在抗原上的抗体1)。多余的这些抗体1(修饰了胶体金、荧光基团或者量子点)，将会被抗体PC捕获，因为抗体PC设计时就是用于识别抗体1的。如果这个体系是正常的，质控抗体区5会显影(胶体金)或者可观察到荧光(荧光基团或量子点)。如果观察不到，则有可能抗体失效，或者显色/荧光异常(包括本身失效和与抗体的连接有问题)。

也就是说，如果指标是阳性，固定抗体区4和质控抗体区5均应显影/荧光。如果是阴性，质控抗体区5应显影/荧光，但固定抗体区4不应显影/荧光。如果出现质控抗体区5不显影/荧光的情况，则说明检测该指标的体系异常，结果无效，最后进入废液区完成废液收集。

上述仅为本实用新型的优选实施例而已，并不对本实用新型起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本实用新型的技术方案的范围内，对本实用新型揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本实用新型的技术方案的内容，仍属于本实用新型的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种外泌体鉴定装置，其特征在于，包括基底、加样区、游离抗体区、固定抗体区、质控抗体区和废液区；其中，以所述游离抗体区、所述固定抗体区、所述质控抗体区和所述废液区的顺序依次排布成一条臂；围绕所述加样区的一周间隔布置有多条所述臂；并且所述加样区通过流道与所述游离抗体区的进液口相连通；每一个所述游离抗体区的出液口通过所述流道与所述固定抗体区的进液口相连通；所述固定抗体区的出液口通过所述流道与所述质控抗体区的进液口相连通；所述质控抗体区的出液口通过流道与所述废液区的进液口相连通。

2.根据权利要求1所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述流道、所述游离抗体区、所述固定抗体区和所述质控抗体区的底面均为亲水底面；所述流道、所述游离抗体区、所述固定抗体区和所述质控抗体区的侧壁均为疏水侧壁。

3.根据权利要求2所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述亲水底面为亲水材料制作的底面，包括滤纸；所述疏水侧壁为疏水材料制作的侧壁，包括蜡。

4.根据权利要求1所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述加样区、游离抗体区、固定抗体区、质控抗体区、废液区和流道均通过印刷或者光刻于所述基底的表面上。

5.根据权利要求1所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述基底为纸质基底、玻璃基底、聚二甲硅氧烷基底或者聚甲基丙烯酸甲酯基底。

6.根据权利要求5所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述纸质基底为滤纸、聚偏二氟乙烯膜或者硝化纤维素膜。

7.根据权利要求1所述的外泌体鉴定装置，其特征在于，所述外泌体鉴定装置还包括一个透明的外壳，所述外壳罩设于所述基底表面，所述外壳上正对所述加样区设有加样口；通过在所述外壳表面相应位置上写下文字，以说明每一条所述臂检测的蛋白种类；通过设置透明外壳或者在所述外壳上设置观察窗实现对反应的观测；所述观察窗正对每一条所述臂上检测区域设置。

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