CN107073758A - 微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法 - Google Patents

微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法。若利用本发明的微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法来以三次元方式培养细胞，则能够形成状态优秀的细胞集合体。尤其，在与人体内的环境更加类似的条件下培养细胞，因此与以往存在的细胞培养方法相比，能够形成状态更优秀的细胞集合体。通过本发明培养的细胞集合体能够直接用于细胞治疗，能够培养并获取难以人工收得的细胞。并且，提供与人体类似的条件来进行培养，因此能够使难以以三次元方式凝集的细胞形成细胞集合体。并且，能够共同培养两种以上的细胞，此时也以与人体类似的条件进行培养，因此能够形成品质优秀的细胞集合体。结果，通过这种本发明能够在药物筛选或细胞毒性及各种测试带来巨大的发展。

Description

微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器 件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法
技术领域
本发明涉及一种微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件以及利用微流器件的细胞集合体的培养方法。
背景技术
人体内的细胞通过与周围的细胞以及细胞外基质的相互作用形成三次元形状的集合体。所述三次元形状在生化学及机制上对细胞的生理起非常重要的作用。尤其，形成为三次元形状的细胞的集合体(cell aggregation)在对构成一般组织的细胞或构成脏器的细胞、癌细胞以及干细胞的研究上为了开发新药临床或对利用干细胞的分化的研究上起非常重要的作用。
但是，一般难以将细胞培养成三次元形状，尤其，将人原代肝细胞(human primarycell)培养成三次元则是更加困难的问题。因此，一般培养成二次元(2D)形状后使用于药物筛选或各种实验。但是，培养成二次元形状时，处于与实际生体内非常不同的环境，因此，会失去用于实验的细胞所具有的细胞本身的特性或细胞的组织特异性，结果存在很难得到所需的实验结果的问题。
因此，在试管内将细胞培养成三次元(3D)形状是非常重要的，对此正进行很多研究。作为所述三次元培养方法，有悬滴培养(haning-drop culture)、非粘附面(nonadhesive surface)、转瓶(spinner flask)、fotary system等，但是，这些存在培养方法并不简单，难以大量生产，且难以适当地调整细胞的形状、大小或数量的问题。
为了改善所述问题，作为在先技术文献公开了韩国公开专利第10-2013-0013537号(专利文献1)，该发明涉及一种利用表面张力的半球形微穴的制备以及利用其的细胞集合体的形成。但是，所述专利文献1存在如下问题：由于不是精致地制备微型半球的方法而不能形成完整的半球形，因此，尽管形成细胞集合体，在收集的过程中，不能从微穴完全分离，而且，即便受到微小的冲击，细胞也会分离到微穴外面；而且，以细胞及细胞集合体的形状被破坏的状态被收集。并且，在没有形成与人体内的流体的流动类似的环境下进行培养，因此，所形成的的细胞集合体的状态不出色。
发明内容
本发明是为解决所述问题点而提出的，其目的在于，提供一种微型半球阵列板及包含微型半球阵列板的微流器件，以便细胞集合体以更加良好的状态形成集合体。尤其，包含微型半球阵列板的微流器件，具有预定流量的流动，造成与人体内的环境类似的环境，因此，通过培养细胞，不仅形成更加优秀的细胞集合体，而且，形成以往难以形成细胞的集合体的原代细胞的集合体。
为解决所述课题，根据本发明的一特征的微型半球阵列板的制备方法，包括：1)步骤，在硅基板上附着感光性光阻材料；2)步骤，通过旋涂调节所述感光性光阻材料的高度；3)步骤，通过过硫化(overcure)对所述光阻材料进行蚀刻使其呈半球形；4)步骤，所述3)步骤之后，在蚀刻的表面蒸镀第一次金属层；5)步骤，在所述第一次金属层的蒸镀之后，在其上蒸镀第二次金属层；6)步骤，在所述第二次金属层上形成型芯层；7)步骤，在所述6)步骤之后，对所述型芯层的上部面进行平坦化；8)步骤，在所述7)步骤之后，对所述型芯层进行分离；9)步骤，将分离的所述型芯层作为模板，进行注塑成型得出微型半球阵列板；以及10)步骤，对所述微型半球阵列板的表面赋予亲水性或疏水性。
根据本发明的其他特征的包括微型半球阵列板的微流器件，包括：试料注入部，用于注入包含单一或多个细胞、细胞培养液的试料，所述试料通过单一或多个通道注入；试料混合部，作为与所述试料注入部相连接并使试料边移动边混合的部位，所述试料的移动是通过单一或多个通道实现的，所述单一或多个通道呈“之”字形，所述单一或多个通道呈金字塔形态而通过多个阶段反复而形成，所述多个阶段中下位阶段比上位阶段更包括一种以上通道，还包括连接所述多个阶段的流动通道；以及细胞集合体形成部，与所述试料混合部相连接且与构成所述多个阶段中最下位阶段的通道相连接，包括所述混合的试料中单一或混合的多个细胞以三次元方式培养而形成细胞集合体的多个微型半球阵列板。
发明效果
利用根据本发明的微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法，以三次元方式培养细胞，则能够形成状态优秀的细胞集合体。尤其，在与人体内的环境更加类似的条件下培养细胞，因此与以往存在的细胞培养方法相比，能够形成状态更优秀的细胞集合体。通过这种本发明培养的细胞集合体可直接用于细胞治疗，能够培养并获取难以人工收得的细胞。并且，提供与人体类似的条件来进行培养，因此能够使难以以三次元方式凝集的细胞形成细胞集合体。并且，能够共同培养两种以上的细胞，此时也以与人体类似的条件进行培养，因此能够形成优秀品质的细胞集合体。结果，通过这种本发明能够在药物筛选或细胞毒性及各种测试带来巨大的发展。
附图说明
图1是示出根据实施例1的微型半球阵列板的制备过程的示意图。
图2是示出根据实施例1的方式制备的微型半球阵列的图片。
图3是示出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板培养hADSC的过程的模式图。
图4是示出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板进行三次元共同培养的模式图。
图5是根据实施例2的包括微型半球阵列板的微流器件的截面图。
图6是根据实施例2的包括微型半球阵列板的微流器件的照片。
图7是示出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板形成细胞集合体的人类细胞的三次元培养的图片。
图8是比较比较例1与实施例1的细胞集合体的形成的图片。
图9是综合比较比较例2与实施例1的情况的图片。
图10是比较存在如实施例2的流体移动的情况和不存在流体移动的情况下利用人类肝细胞形成细胞集合体的图片。
图11是比较存在如实施例2的流体移动的情况和不存在流体移动的情况下培养人原代肝细胞的结果的图片。
图12是综合比较比较例2与实施例2的情况的图片。
图13是示出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板三次元共同培养人类肝细胞和hADSC的结果的图片。
图14是示出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板三次元共同培养人类肝细胞和hADSC的情况下的功能性测量检查结果的图表及图片。
图15是拍摄通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板三次元共同培养的细胞集合体的内部的TEM图片。
图16是表示从半球取出通过根据实施例1的方式制作的微型半球阵列板三次元共同培养的细胞集合体时的优秀状态的图片。
图17是示出在2D上共同培养人原代肝细胞和hADSC的结果的图片。
图18是示出在2D上共同培养人原代肝细胞和hADSC后进行染色的结果的图片。
图19是示出在本实施例1的3D上共同培养人原代肝细胞和hADSC时白蛋白的分泌非常活跃的状态的图片。
图20是综合比较在2D及3D上共同培养人原代肝细胞和hADSC的情况的图片。
符号说明
1：试料注入部，2：试料混合部，3：细胞集合体形成部，4：通道，5：流动通道
具体实施方式
为此，本发明人为了开发能够以更好的状态形成细胞集合体并在与人体类似的环境提供培养条件的微型半球阵列板的制备方法及包括微型半球阵列板的微流器件而锐意研究努力的结果，发现本发明的微型半球阵列板的制备方法、包括微型半球阵列板的微流器件及利用微流器件的细胞集合体的培养方法来完成了本发明。
具体地，本发明的微型半球阵列板的制备方法，包括：
1)步骤，在硅基板上附着感光性光阻材料；
2)步骤，通过旋涂(spin coating)调节所述感光性光阻材料的高度；
3)步骤，通过过硫化(overcure)对所述光阻材料进行蚀刻使其呈半球形；
4)步骤，所述3)步骤之后，在蚀刻的表面蒸镀第一次金属层；
5)步骤，在所述第一次金属层的蒸镀之后，在其上蒸镀第二次金属层；
6)步骤，在所述第二次金属层上形成型芯层；
7)步骤，在所述6)步骤之后，对所述型芯层的上部面进行平坦化；
8)步骤，在所述7)步骤之后，对所述型芯层进行分离；
9)步骤，将分离的所述型芯层作为模板，进行注塑成型得出微型半球阵列板；以及
10)步骤，对所述微型半球阵列板的表面赋予亲水性或疏水性。
所述1)步骤中，硅基板易于附着所述感光性光阻材料。
通常，所述感光性光阻材料中，在照射紫外线(UV，350-400nm)的条件下，受光的部位被交联(Cross-linked)而剩下的部位称为负(Negative)系列，受光的部位被显影称为正(positive)系列，在蚀刻后易于形成半球体，Negative和Positive两个种类均可包括。
所述1)步骤中附着的感光性光阻材料的长度优选为100～1000μm。所述感光性光阻材料的长度小于100μm的情况下，直径和深度太小而在蚀刻后难以形成半球形，因此不优选使用，所述感光性光阻材料的长度超过1000μm的情况下，蚀刻后的半球体太大而所培养的细胞难以形成集合体且难以使细胞原本的基质极大化，因此不优选使用。优选地，感光性光阻材料的长度属于所述范围才能以最佳条件形成优秀的细胞集合体。并且，在所述长度范围内，可通过调节所述感光性光阻材料的涂覆高度、温度条件来调节半球的深度。
并且，若如所述2)步骤实施旋涂，则可以调节感光性光阻材料的高度。
针对所述感光性光阻材料，如所述3)步骤，可通过过硫化对感光性光阻材料进行蚀刻来形成半球体，此时，所执行的所述过硫化过程中，若以适合的温度条件以上的温度对感光性光阻材料进行加热则边缘部分的棱角变成圆弧形态而发生呈曲面的现象。如上所述地通过过硫化来形成半球体，与以往的半球形微孔制备方法相比能够形成更加精致的半球，从而能够形成优秀的细胞集合体，培养之后也可集合体的状态不受损地从微型半球阵列板分离出细胞集合体。
在所述4)步骤中，向感光性光阻材料的表面蒸镀第一次金属层，对所述蒸镀方法没有特别限制，但优选可使用化学气相蒸镀、物理气相蒸镀等方法来进行蒸镀。所述蒸镀的第一次金属层是用于更加容易分离型芯层，其材质优选地为选自由Cr、Ti、Au、Ni、Cu、Al及Fe组成的组中的一种以上。所述第一次金属层的蒸镀高度优选为所述第一次金属层的高度小于的情况下，第二次金属层的薄膜粘接度变弱而难以以高的方式设置第二次金属层，所述第一次金属层的高度超过的情况下，发生种子金属层翘起的剥落现象，因此不优选使用。
所述5)步骤，优选地，进行第一次金属层的蒸镀之后，在其上蒸镀第二次金属层，所述第二次金属层用于易于进行型芯的电铸镀金，优选地使用与型芯相同的材料或者选自由传导性优秀的Au、Ag、Pt、Ni及Cu组成的组中的一种。将所述第一次金属层和所述第二次金属层分开进行蒸镀的理由在于，仅通过第二次金属层本身的薄膜粘结度不高，因此在进行电铸镀金过程中难以将型芯设置为所需的高度。对所述第二次金属层的蒸镀方法没有特别限制，但优选可使用化学气相蒸镀、物理气相蒸镀等方法来进行蒸镀。所述第二次金属层的蒸镀高度优选为所述第二次金属层的蒸镀高度小于的情况下，薄膜本身的应力较弱而难以进行镀金，因此不优选使用，所述第二次金属层的高度超过的情况下，表面的粗糙度(RMS)值变高，而在6)步骤中形成型芯层时对均匀度导致影响，因此不优选使用。
在所述6)步骤中，在所述第二次金属层上形成型芯层，此时形成所述型芯层的优选的方法是利用电铸镀金(Electro-plating)方法，理由在于能够以高的方式设置金属层。所述型芯层的材料优选使用选自由镍、钛及铝组成的组中的一种以上，由于这些材料具有能够用作型芯的程度的强度，因此优选使用这些材料。
在所述7)步骤中，对在所述6)步骤形成的所述型芯层的上部面进行平坦化。通过对所述型芯层进行平坦化，从而能够使所述9)步骤中注塑成型的微型半球阵列板平坦地安装于模具，进而能够提高所制备的微型半球阵列板的注塑成型度，因此优选如此处理。所述平坦化只要是能够对所述型芯层进行平坦化来达到微型半球阵列板的水平的方法就没有限制，但优选使用化学机械平坦化(CMP，Chemical Mechanical Planarization)、光亮浸渍(Bright dipping)、滚光研磨(Tumbling barreling)、抛光(Buffing)、砂带打磨法(Beltsanding)、酸洗法(Picking)等方法来进行平坦化。
在所述8)步骤，对所述型芯层进行分离，对所述型芯层进行分离的方法没有特别限制，但优选地使用KOH、TMAH等来使硅基板融化来去除，并利用蚀刻溶液去除剩余的第一次金属层来进行分离。并且，在此过程中，虽然不特别限制，但在第二次金属层与型芯不同的情况下，所述第二次金属层也可能一同分离。
在所述9)步骤中，将所述型芯层作为模板来进行注塑成型得出微型半球阵列板。所述注塑成型的方法只要是能够进行注塑成型得出微型半球阵列板的方法就无特别限制地使用任何方法。
所述注塑成型的材料只要是能够进行注塑成型的材料即可，无特别限制地使用，但是优选地使用选自由聚碳酸酯(P.C，Polycarbonate)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，Polymethylmethacrylate)、聚苯乙烯(P.S，Polystyrene)及环烯烃共聚物(COC，Cyclicolefin copolymer)组成的组中的一种以上。
在所述10)步骤中，可以对所述微型半球阵列板的表面赋予亲水性或疏水性，赋予这种亲水性或疏水性的方法没有特别限制，可使用等离子体方式或化学性表面处理来调节表面的亲水性和疏水性的程度。并且，优选地，通过这种表面改性，通过最终制备的微型半球阵列板培养细胞集合体时，最大限度地减少在半球内生成气泡的现象，从而使细胞以三次元方式形成集合体的效果极大化。
通过所述制备方法制备的微型半球阵列板的半球的直径优选为100～1000μm，直径属于所述范围的情况下能够形成更加优秀的三次元细胞集合体，因此优选属于所述范围。
本发明的微型半球阵列板的制备方法与以往的半球形微孔制备方法相比，能够更加精致地形成半球体及半球体阵列形态。因此，能够形成更加接近三次元的细胞集合体。
并且，利用通过本发明的所述微型半球阵列板的制备方法制备的微型半球阵列板培养细胞集合体，与以往的方法相比能够形成更加优秀的细胞集合体。并且，在从微型半球阵列板分离所形成的细胞集合体的过程中也能够以细胞集合体不受损的状态进行分离。这与以往以二次元方式培养的方法相比，细胞集合体的形成状态显著优秀。
根据本发明的另一特征的包括微型半球阵列板的微流器件的特征在于，包括：
试料注入部1，用于注入包含单一或多个细胞、细胞培养液的试料，所述试料的注入是通过单一或多个通道4的注入；
试料混合部2，作为与所述试料注入部相连接并使试料边移动边混合的部位，所述试料的移动是通过单一或多个通道实现的，所述单一或多个通道呈“之”字形，所述单一或多个通道呈金字塔形态而通过多个阶段反复而形成，所述多个阶段中下位阶段比上位阶段更包括一种以上通道，还包括连接所述多个阶段的流动通道5；以及
细胞集合体形成部3，与所述试料混合部相连接且与构成所述多个阶段中最下位阶段的通道相连接，包括所述混合的试料中单一或混合的多个细胞以三次元方式培养而形成细胞集合体的多个微型半球阵列板。
本发明的微流器件能够使单一或多个细胞以三次元方式形成细胞集合体，形成所述细胞集合体时使流体以与人体内环境类似的条件经过来形成细胞集合体。作为构成人体的最主要的物质，成人的情况下平均约60％是水，因此细胞在人体内存在血流等液体的流动性运动的情况下形成集合体。因此，本发明提供这种与人体内环境类似的条件来形成更加优秀的品质的细胞集合体。
向所述试料注入部可注入细胞及细胞培养液。所述细胞可以为单一或多个细胞，所注入的细胞在所述微型半球阵列板内形成细胞集合体。向所述试料注入部注入包含所述细胞及细胞培养液的试料时，流速优选为10nL/min～10uL/min的范围，以如上所述的流速注入试料与人体内环境类似，尤其，以小于10nL/min的流速注入的情况下远远脱离与人体类似的条件，并且难以达成去除半球周围的不必要的细胞的效果，在超过10uL/min的情况下，细胞难以在微型半球阵列板的半球下沉，因此不优选使用。向所述试料注入部注入的细胞培养液只要是能够培养细胞且能够以流体形成流动的物质即可无限制地使用。并且，在所述试料注入部中，注入试料的入口可以是单一或多个通道，由此试料可通过单一或多个路径注入。
另一方面，所述试料混合部是所述试料边移动边混合的部位。此时，所述试料的移动优选地通过单一或多个通道实现，由此能够使试料更加易于混合。所述通道的直径优选为500um～2.0mm，所述通道的直径小于500um的情况下微型半球阵列的数量变少且通道的流体压力变高而不优选使用，所述通道的直径超过2.0mm的情况下难以使试料以与人体类似的条件移动且难以控制微型半球阵列而不优选使用。并且，为了使所述试料的混合更加活跃进行，所述单一或多个通道优选呈“之”字形。这种呈“之”字形的单一或多个通道以金字塔形态通过多个阶段重复形成。如此，以金字塔形态重复多个阶段，则试料的混合和腔室的浓度梯度可以活跃进行。并且，为了体现金字塔形态，所述多个阶段中下位阶段比上位阶段更包括一种以上通道。并且，所述多个阶段通过连接该多个阶段的流动通道得到连接。这种试料混合部通过如上所述的结构能够极好地达成试料混合(Mixed)效果。
另一方面，所述细胞集合体形成部与所述试料混合部相连接且与所述多个阶段中最下位阶段相连接。并且，所述混合的试料中单一或混合的多个细胞在多个微型半球阵列板以三次元方式培养而形成细胞集合体。所述微型半球阵列板优选为多个，与单一的微型半球阵列板情况相比，不会致使培养液的流速下降且提供与人体内的环境更加类似的环境而形成优秀的细胞集合体。并且，虽然无特别限制，但所述微型半球阵列板的数量优选地与所述多个阶段中最下位阶段中所包括的通道的数量相同。其原因在于，构成所述最下位阶段的各个通道直接与所述微型半球阵列板相连接而形成细胞集合体的情况下，不妨碍之前的阶段为止的试料的移动且在与人体内的环境更加类似的环境下形成优秀品质的细胞集合体
虽然对所述微型半球阵列板无特别限制，但基于根据本发明的另一特征的所述微型半球阵列板的制备方法而制备的微型半球阵列板的情况下能够形成更加优秀品质的细胞集合体，且与以往方法相比，半球体形成的再现性非常高。并且，在从微型半球阵列板分离所形成的细胞集合体的过程中，也能够以细胞集合体不受损的状态进行分离。这与以往以二次元方式培养的方法相比，细胞集合体的形成状态显著优秀。
另一方面，在所述微型半球阵列板的半球内有单一或混合的多个细胞下沉而形成细胞集合体，存在于所述微型半球阵列板的半球周围的异物或不必要的细胞通过在半球上流动的剩余试料的流速而被去除。重复多次这种过程来在微型半球阵列板的半球内形成及培养细胞集合体。
如此，本发明的包括微型半球阵列板的微流器件的主要的功能有三种，第一种是将包含细胞及细胞培养液等的试料一同放入且根据不同浓度分别流动至细胞集合体形成部的浓度梯度功能，第二种是包含功能性培养液等来同时注入两种以上的试料且对此同时进行混合(Mixed)的功能优秀。第三种是在微型半球阵列板的半球体内单一或混合的多个细胞形成及培养细胞集合体而可在与人体内的环境类似的条件下将多种细胞形成为三次元球形。
以下，参照优选的实施例对本发明进行详细说明，以便使本发明所属领域的普通技术人员能够容易实施。然而，本发明能够以不同的多种形态体现，并不局限于在此说明的实施例。
实施例
实施例1：微型半球阵列板的制作及细胞集合体的培养
<制备微型半球阵列板>
为了体现500um大小的微型半球图案而使用了感光性光阻材料，此时所使用的感光性光阻材可使用Negative和Positive两种，本发明中使用了Negative形态。
在300um区域对感光性光阻材料进行旋涂来进行调节微型半球的高度，所涂覆的光阻材料可在150℃的温度下通过过硫化以微型半球形象化。
在形成于硅基板上的微型半球阵列图案上利用薄膜蒸镀设备放置第一次种子(seed)金属层，此时作为种子金属使用了钛(Titanium)，其高度为第二次金属层使用了镍(Nickel)，其高度为第一次和第二次金属薄膜蒸镀设备分别使用了电子束蒸镀设备(E-beam evaporator)、磁控溅射(D.C magnetic sputter)。
在第二次金属薄膜层上利用电铸镀金(Electro-plating)来形成高的镍层，此时形成的镍金属层的高度为0.8mm，电铸镀金完成之后对后部面进行化学机械平坦化(CMP，Chemical Mechanical Planarization)工序，以便实现均匀的平坦度。
对包括结束研磨的第二次金属薄膜层的镍层进行分离来用作型芯，并将其安装在模具，以便进行注塑成型(Injection molding)，由此进行成型。
注塑成型所使用的塑料材料利用聚苯乙烯(P.S.，Polystyrene)进行注塑成型。
利用氧等离子体处理及化学表面处理来调节结束的微型半球板的表面的亲水性和疏水性程度，通过这种表面改姓，最大限度地减少在微型半球阵列板及微型半球阵列微流器件内发生气泡的现象，由此使细胞的三次元半球体的形成极大化。
以下图1为示出微型半球阵列板的制备过程的模式图，以下图2a为示出以如上所示的方式制备的微型半球阵列的图片，以下图2b为示出最终制备的微型半球阵列板的图片。
<利用微型半球阵列板培养细胞集合体>
1)hADSC的分离
从进行整形手术或脂肪抽吸术的患者去除的脂肪组织分离出hADSC。作为hADSC的分离，首先从所分离的脂肪组织去除blood fraction。然后，利用干净的PBS溶液，直到blood fraction变透明为止重复清洗细胞。之后，与将1型胶原酶(Type1collagenase)以0.2％溶于PBS来清洗的细胞混合，由此在细胞之间解除结合，以细胞单位分离组织。将所制备的胶原酶(collagenase)与脂肪组织混合并震汤一小时来进行繁殖(incubation)。收集乳化的组织后，进行600g、10分子的离心处理(centrifugation)后，仅收集颗粒(pellet)并用100μm过滤部件(strainer)筛选。将所筛选的细胞放入培基并进行多次清洗之后，放入T-75烧瓶进行培养，达到第3-4阶段(passage 3-4)时取出使用，以便进行三次元培养。
2)hADSC培养
为了进行三次元培养，在培基溶解hADSC细胞，并向所述微型半球阵列板接种(seeding)细胞溶液。细胞下沉在半球内后，通过利用培基的清洗(washing)过程去除残留在表面的细胞，放入新的培基并在培养箱(incubator)进行三次元培养。以下图3为示出这种培养过程的示意图。
3)三次元共同培养
以下图4为示出对多个细胞进行共同培养来形成三次元细胞集合体的过程的示意图。即，以所需的比例混合两个种类的细胞后，以与前述过程相同的过程在半球体内培养细胞。经过一天的培养之后，两个细胞紧密连接合为一个球形态，由此形成完美地直接结合的三次元共同培养模型。
实施例2：利用包括微型半球阵列板的微流器件培养细胞集合体
<开放包括微型半球阵列板的微流器件>
制作了包括以所述实施例1的方法制备的微型半球阵列板的微流器件。这种微流器件可以分为试料注入部、试料混合部及包括微型半球阵列板的细胞集合体形成部。以下图5为其截面图。并且，以下图6为包括以如上所示的方式制备的微型半球阵列板的微流器件的图片。
1)人类肝细胞的分离
从接受肝部分切割术的患者切割的肝组织利用以往的胶原酶二步(collagenase-two-step)方法分离人类肝细胞。简要说明的话，针对分离的肝组织，首先通过EGTA灌注(perfusion)来去除血液等，之后利用2型胶原酶溶液(type2collagenase)进行关注(perfusion)，从而使胶原酶进入组织的每个角落使肝组织乳化。之后，通过两次清洗(washing)过程使肝细胞从组织分离，分离之后立即使用所分离的肝细胞。
2)微型半球阵列板微流器件中的细胞培养
混合肝细胞和培基，在微流器件内以1uL/min的流速(flow rate)使原代细胞和培基慢慢经过芯片(chip)，由此使细胞下沉在微型半球阵列板的半球内，利用该流速有效去除微型半球阵列周围的细胞。多次重复这个过程，在包括微型半球阵列板的微流器件培养人原代肝细胞，以便细胞在微流器件内成长为三次元球形。
3)三次元共同培养
通过与上面说明的方法相同的方法加载(loading)细胞，以所需的比例混合两种或更多的细胞并与培基一同放入。利用该方法能够在具有流速的微流器件内进行三次元共同培养。
另一方面，这种包括微型半球阵列板的微流器件的主要功能包括如下三种：
第一，使能够培养细胞的培养液和能够使细胞分化诱导及细胞的特性变化或功能极大化的试料一同放入，而根据不同浓度在各个腔室流动的浓度梯度功能；
第二，需要同时放入培养液和功能性试料，因此，能够均匀混合两种或更多的溶液的微型混合功能；
第三，集成在微型半球阵列板的半球内，能够使多种细胞形成三次元球形(cellspheroid)的功能。
因此，在微型通道内自由变更10nL/min～10uL/min区域的流体，从而提供对三次元细胞培养最优化的微流环境。
比较例
比较例1
除了在以现有的方法制备的半球形微孔培养细胞之外，与所述实施例1相同的方法培养细胞。
比较例2
比较例2中，不进行试料的注入及移动，而利用现有的方法以二次元方式培养细胞集合体。
实验例
实验例1：观察在微型半球阵列板培养的细胞集合体
观察了在所述实施例1的微型半球阵列板培养的细胞集合体及利用比较例1的方法培养的细胞集合体。其结果可在以下图7及图8中确认到。
在以下图7的A部分可确认到向所述实施例1的微型半球阵列板放入hADSC经过一天后形成了凝集成圆形的细胞球。并且，在图7的B部分可确认到将形成的细胞球培养9天后通过生死实验(Live/Dead assay)观察生存能力(viability)时大部分细胞生存且很健康。并且，在图7的C部分可确认到将形成的细胞球培养后，第九天放在一起并通过SEM图片确认微细结构时作为hADSC的特征的微绒毛(microvilli)很显著，多个细胞凝集而完美形成了一个球形。这种微型半球阵列板可以制备成所需的数量且大面积，从而易于大量生产且方法也很简单，因此该方法很适合既迅速又简单生产大量的健康状态的hADSC细胞球。
另一方面，在图8的A部分确认到，以比较例1的方法培养hADSC的情况下，细胞球生成后经过10天，则hADSC成为黏附于表面的黏附细胞(adherent cell)，因此受到该影响而所形成的细胞球从微孔脱离出而扩散并黏附在底面。然而，在实施例1的情况下，如在图8的B部分可确认到，实施例1的情况下能够调节深度，因此在以更深的深度制备的芯片中即使经过时间，细胞还可照样位于原位置，表示能够以稳定的状态保管长时间(long-term)。这表示即使不具备凝集(aggregation)特性的细胞也可好好地凝集，并且通过深度调节来使细胞以球状态长时间成长。
另一方面，图9示出在培养所述hADSC的情况下如比较例2的2D(图9的A部分、B部分)和如实施例1的3D(图9的C部分、D部分)，发光(Optical)(图9的A部分、C部分)和GFP(图9的B部分、D部分)及SEM(图9的E部分)。
实验例2：观察在包括微型半球阵列板的微流器件培养的细胞集合体
通过实施例2的微流器件注入人类肝(humam liver)细胞及试料，进行实验来观察存在流体的流动的状态的细胞集合体(图10的B部分)和不存在流体的流动的状态的微型半球阵列板培养的细胞集合体(图10的A部分)。
人类肝(human liver)的情况下，通过部分肝切除术(partial hepatectomy)获取的细胞的状态很不好，因此通过何种方式培养也难以进行凝集(aggregation)。
如在以下图10的A部分确认到，不存在与人体类似的条件的流速的状态下形成人类肝细胞集合体的情况下几乎不发生凝集(aggregation)。
相反，如在以下图10的B部分确认到，通过实施例2的微流器件利用流体的流动的情况下，使状态不好的细胞也可进行凝集(aggregation)。因此，在包括微型半球阵列板的微流器件中能够以三次元方式有效培养难以以好的状态获取的人类原代(human primar)细胞，不仅是状态不好的细胞，而且对一般细胞的情况下也施加持续的流动和剪切应力(shear stress)，从而能够起到的影响。其原因在于，能够构成与人体内类似的环境来使细胞的正常功能极大化且通过持续的流体的流动来继续供给新鲜的培基。并且，利用微流器件的三种特性，将用于细胞分化诱导及功能分析的药物流动，来可利用于持续的药物筛选等。
并且，图11为示出维持这种细胞培养三天后进行染色来确认表示活性的人类肝细胞的实验结果的图片。如图11的A部分观察到，若在不存在流体的流动的比较例2中培养状态不好的人类原代肝细胞(人原代肝细胞)，则如通过生死实验(Live/Dead assay)观察到，可以观察超过一半的细胞死亡、凝集也不好且染色本身也不好的结果。相反，在存在流体的流动的实施例2(图11的B部分)可确认到，细胞的生存能力(viability)与不存在流动(flow)的比较例2的结果相比显著不同。考虑到首次分离出人类肝(human liver)细胞时的生存能力(viability)仅为40～60％程度，确认到在存在流动(flow)的比较例2中随着时间的经过生存能力(viability)反而更好，从而可确认到生存的细胞更加坚固地凝集且整个生活能力也提高。由此证明了在存在流动(flow)的比较例2中培养状态不好的细胞的情况下状态变好，且可将最容易获取的细胞源泉人类原代(human primary)细胞用于实验的可能性
另一方面，图12为示出培养人类肝细胞的情况下的如比较例2的2D(图12的A部分、B部分)和如实施例2的3D(图12的C部分、D部分)，发光(Optical)(图12的A部分、C部分)和ALB(图12的B部分、D部分)，生死(Live/Dead)(图12的E部分)及SEM(图12的F部分)。
实验例3：使多个肝细胞直接结合的三次元共同培养(Co-culture)
进行实验确认混合人类肝细胞和hADSC并放入实施例1的微型半球阵列板后进行培养时，使这些细胞直接结合来进行三次元共同培养。该结果可在以下图13中确认到。以下图13的A部分示出两个种类的细胞凝集成一个。并且，图13的B部分示出由绿色表示的生活能力也非常高而由两个细胞构成的一个球以非常健康的状态培养在半球内。并且，图13的C部分为培养后的第三天拍摄的SEM图片，可确认到两个细胞没有界限或区分地完美凝集成一个。并且，图13的D部分为培养后的第九天拍摄的SEM图片，可确认到两个细胞与第三天相比更坚固地凝集成一个，表面上看到的界限完全消失。这表示两个细胞直接结合而形成了一个完全的单位体，且可以视为基于以往没有的新的直接结合的三次元共同培养模型。
并且，图14示出利用基于这种直接结合三次元共同培养模型执行功能检查的结果。以下图14的A部分及B部件示出与仅利用一般肝细胞情况相同的方式进行活性化的白蛋白(图14的A部分)和尿素(Urea)(图14的B部分)分泌，可确认到凝集的细胞在混合的状态下也起到自身功能。并且，在图14的C部分及D部分由红色表示的细胞色素(Cytochrome)P450还原酶(reductase)染色也表现高水平，图14的E部分示出的将CYP3A4activity定量化的图表中也表现持续高水平的结果，由此可确认到该细胞球还具有肝特有的代谢(metabolism)相关功能。这种凝集的新的单位体的细胞能够起到自己的作用，实现了与在实际器官的多种细胞之间的结合类似的状态，示出该单位体可有效使用于体外(in vitro)、体内(invivo)。
并且，如以下图15中可确认到，利用TEM拍摄共同培养的细胞球的内部时，如在图15可观察到，可确认表现多种活性化的细胞的特性。还可观察到多种线粒体和健康的核相、肝细胞特有的紧密连接(tight junction)或胆小管(bile canaliculi)等，还可观察到糖元(glycogen)和作为ECM的胶原蛋白(Collagen)。还确认到过氧物酶体(Peroxisome)、粗糙内质网(rough ER)，还能观察到进行内吞作用(endocytosis)，从而可确认到细胞在形态上、功能上处于非常健康的状态。
并且，图16为示出将状态不好的肝细胞球(图16的A部分)和基于直接结合来进行三次元共同培养的细胞球(图16的B部分)进行生死实验(Live/Dead assay)来观察细胞的生存能力(viability)的图片。如观察图16可知，大部分的细胞生存，死亡的细胞的数量很少，由此可知从实施例1的微型半球阵列板取出细胞的过程不会使细胞受损的事实，这表示细胞不仅能够在半球体内进行三次元培养，而且还能够将细胞取出后在所需的其他位置以其他方法使用。
并且，图17示出人原代肝细胞(human primary hepatocyte)(图17的A部分)、Hadsc(图17的B部分)、在2D上共同培养两个细胞的情况(图17的C部分)。虽然处于存在直接结合的状态，但无法观察到如两个细胞形成一个单位体等效果，可知两个细胞仅以粘附在一个空间内的水平进行共同培养。利用这种以二次元的方式共同培养的模型对白蛋白分泌的部分进行染色来确认细胞的活性(图18)，可确认到由红色表示的几乎没有活性的状态。
相反，在基于实施例1制备的微型半球阵列板共同培养的情况下(图19)，由绿色表示的白蛋白的分泌非常活跃且细胞的活性处于更好的状态。另一方面，图20为综合示出2D环境的情况(图20的A部分和B部分)和如本发明的实施例的3D的情况(图20的C部分、D部分、E部分、F部分)的图片。
以上，对本发明的优选实施例进行了说明，但本发明并不局限于此，在本发明的技术思想范围内可以进行多种变形来实施，且这种变更及实施均属于本发明要求保护的范围。

Claims (16)

1.一种微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，包括：
1)步骤，在硅基板上附着感光性光阻材料；
2)步骤，通过旋涂调节所述感光性光阻材料的高度；
3)步骤，通过过硫化(overcure)对所述光阻材料进行蚀刻使其呈半球形；
4)步骤，所述3)步骤之后，在蚀刻的表面蒸镀第一次金属层；
5)步骤，在所述第一次金属层的蒸镀之后，在其上蒸镀第二次金属层；
6)步骤，在所述第二次金属层上形成型芯层；
7)步骤，在所述6)步骤之后，对所述型芯层的上部面进行平坦化；
8)步骤，在所述7)步骤之后，对所述型芯层进行分离；
9)步骤，将分离的所述型芯层作为模板，进行注塑成型得出微型半球阵列板；以及
10)步骤，对所述微型半球阵列板的表面赋予亲水性或疏水性。
2.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，所述感光性光阻材料的长度为100至1000μm。
3.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，所述第一次金属层的材料是选自由Cr、Ti、Au、Ni、Cu、Al及Fe而组成的组中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，所述第二次金属层的材料是选自由Au、Ag、Pt、Ni及Cu而组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，所述型芯层的材料是选自由镍、钛及铝而组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，所述微型半球阵列板的注塑成型使用选自由聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯及环烯烃共聚物而组成的组中的一种以上。
7.根据权利要求1所述的微型半球阵列板的制备方法，其特征在于，通过所述制备方法制备的微型半球阵列的半球的直径为100至1000um。
8.一种细胞集合体，其特征在于，从通过权利要求1至7中的任一项所述的制备方法而制备的微型半球阵列板培养。
9.一种细胞集合体的培养方法，其特征在于，从通过权利要求1至7中的任一项所述的制备方法而制备的微型半球阵列板培养细胞集合体。
10.一种微流器件，其特征在于，包括：
试料注入部，用于注入包含单一或多个细胞、细胞培养液的试料，所述试料通过单一或多个通道注入；
试料混合部，作为与所述试料注入部相连接并使试料边移动边混合的部位，所述试料的移动是通过单一或多个通道实现的，所述单一或多个通道呈“之”字形，所述单一或多个通道呈金字塔形态，通过多个阶段反复而形成，所述多个阶段中下位阶段比上位阶段更包括一种以上通道，还包括连接所述多个阶段的流动通道；以及
细胞集合体形成部，与所述试料混合部相连接且与构成所述多个阶段中最下位阶段的通道相连接，包括所述混合的试料中单一或混合的多个细胞以三次元方式培养而形成细胞集合体的多个微型半球阵列板。
11.根据权利要求10所述的微流器件，其特征在于，所述微型半球阵列板是通过权利要求1至7的制备方法而制备的微型半球阵列板。
12.根据权利要求10所述的微流器件，其特征在于，对所述试料注入部以10nL/min至10uL/min的流速注入试料。
13.根据权利要求10所述的微流器件，其特征在于，所述通道的直径为500μm至2.0mm。
14.根据权利要求10所述的微流器件，其特征在于，所述微型半球阵列板的半球的直径为100至1000μm。
15.一种细胞集合体，其特征在于，通过权利要求10至14中的任一项所述的微流器件而培养。
16.一种细胞集合体的培养方法，其特征在于，通过权利要求10至14中的任一项所述的微流器件而培养细胞集合体。
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