CN108103017B

CN108103017B - 人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用

Info

Publication number: CN108103017B
Application number: CN201810168252.3A
Authority: CN
Inventors: 许文荣; 孙瑶湘; 钱晖; 张斌; 史惠; 纪成; 孙丰田; 严永敏; 张徐; 毛飞
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2018-02-28
Filing date: 2018-02-28
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2038-02-28
Also published as: CN108103017A

Abstract

本发明提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，属于医药技术领域。本发明用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，收集上清液，经过离心和超滤浓缩，得到浓缩液移至30％蔗糖重水密度垫上采用蔗糖密度离心进一步纯化，得到人脐带间质干细胞外泌体。本发明通过分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体有效降低免疫反应性，使用时保证剂量可控。所述人脐带间质干细胞外泌体通过提高二型糖尿病动物模型胰岛素信号通路的活化程度，抑制肝糖原合成分解，从而实现葡萄糖代谢稳态的调节，同时提高二型糖尿病动物模型对胰岛素的敏感性及胰岛β细胞的胰岛素分泌功能降低血糖浓度，实现制备治疗二型糖尿病的药物的应用。

Description

人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus)是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。过去30多年，国内糖尿病的发病率由低于1％增长至超过10％，糖尿病患者人数已超过1亿，居全球第一，且不断趋于年轻化。糖尿病已成为我国严重的公共卫生问题。90％～95％的糖尿病患者为2型糖尿病(T2DM)，2型糖尿病患者早期通过控制饮食、增强运动及口服降糖药调节血糖，随着病情的发展，大多数患者需要长期依赖外源性胰岛素才能使血糖保持在正常范围，降糖药和胰岛素都存在大量不良反应如胃肠道应激、骨质疏松、低血糖、胰岛素注射部位皮下结节以及β细胞反馈性分泌功能丧失等，对于病情的控制及并发症的预防都存在不足，因此，亟需寻找降低糖尿病患者血糖，减轻治疗副作用并延缓糖尿病病情发展的新方法。

国内外诸多研究表明，间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在血糖调节和胰岛细胞功能修复方面具有重要的作用，MSC能提高外周组织对胰岛素的敏感性，使组织对血液中葡萄糖的利用增加，在糖尿病的干预方面表现出了一定的效果，但MSC的应用标准、免疫反应性、潜在致瘤性及转基因技术的安全性等因素使MSC的在糖尿病治疗中的应用受到限制。目前MSC在糖尿病的治疗中存在较多毒副作用，仅用于控制病情对于病因没有实质性的改善；还存在伦理，剂量不可控及安全性问题。

目前，外泌体与糖尿病的研究主要集中于疾病诊断，而用于糖尿病或糖代谢调控的仅有：Wen D等发现过表达anti-miR-375的骨髓MSC来源外泌体携带anti-miR-375抑制胰岛移植的宿主免疫排斥反应(J Controlled Release,2016,238:166-175)；棕色脂肪组织来源的外泌体能够转运miR-99b至肝脏调控FGF-21表达(Nature,2017,542(7642):450)。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供人脐带间质干细胞外泌体(MSC-ex)的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用，分离纯化的人脐带间质干细胞外泌体对糖尿病的病因直接干预，具有安全性可控的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；

(2)将所述步骤(1)中人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min；

(3)将所述步骤(2)中的浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫；

(4)将所述步骤(3)中底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000Da MWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。

优选的，所述步骤(1)中培养的温度为36～38℃；所述培养时环境CO₂的体积浓度为4％～6％。

优选的，所述步骤(1)中离心的转速为1800～2000g；所述离心的时间为8～12min。

优选的，所述步骤(4)中收集浓缩液后，还包括将所述浓缩液进行过滤除菌；所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力的药物中的应用。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病对胰岛素的敏感性的药物中的应用。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用。

优选的，所述药物中人脐带间质干细胞外泌体的含量为8～12mg/kg.bw。

优选的，所述药物的剂型为注射剂。

本发明提供了人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，用无血清培养基培养人脐带间质干细胞，使人脐带间质干细胞产生的外泌体溶于无血清培养基中，收集上清液，经过离心去除细胞碎片和细胞器，超滤浓缩后得到的浓缩液移至30％的蔗糖重水密度垫上采用蔗糖密度离心进一步纯化外泌体，经两次洗涤去除蔗糖残留物，得到人脐带间质干细胞外泌体。本发明提供的分离纯化方法操作简便，外泌体的蛋白纯度高，重复性好，适合工业化生产。本发明提供的分离纯化方法，所述人脐带间质干细胞外泌体的纯度达到90％～95％。

同时通过本发明分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体有效降低免疫反应性，使用时保证剂量可控。此外，分离纯化得到人脐带间质干细胞外泌体使之易于保存，便于运输。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用。所述人脐带间质干细胞外泌体能有效降低二型糖尿病动物模型血糖含量。实验证明，链脲佐菌素注射SD大鼠第七天时于尾静脉处注射人脐带间质干细胞外泌体(MSC-ex)，PBS为对照组，其后三天注射一次，共注射5次，检测餐后两小时血糖，与糖尿病组比较结果发现，随着人脐带间质干细胞外泌体的持续注射，小鼠血糖含量显著降低；口服糖耐糖实验表明，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后较糖尿病组大鼠的葡萄糖耐受能力显著提高，这表明人脐带间质干细胞外泌体能降低二型糖尿病动物模型血糖含量。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力药物中的应用。检测餐后血清胰岛素水平，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后餐后血清胰岛素水平较糖尿病组大鼠显著提高；胰岛素释放试验(IRT)表明，糖尿病组大鼠经注射人脐带间质干细胞外泌体后注射葡萄糖，与糖尿病组大鼠注射葡萄糖相比，前者胰岛素分泌的时相及水平显著优于后者。胰岛体积及数量检测等实验结果显示MSC-ex治疗的二型糖尿病大鼠胰岛体积及β细胞数量均高于未治疗组，提示MSC-ex提高了二型糖尿病大鼠胰岛素分泌水平。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高对胰岛素的敏感性药物中的应用。用胰岛素耐受实验验证，以糖尿病组和正常组大鼠作为对照，其中糖尿病组大鼠注射胰岛素和葡萄糖，实验组为糖尿病组大鼠注射人脐带间质干细胞外泌体、胰岛素和葡萄糖，测定各组大鼠的血糖含量，结果发现，胰岛素注射后的30～120min内，糖尿病组大鼠血糖含量下降不明显，正常组和实验组大鼠血糖含量显著下降，这表明在人脐带间质干细胞外泌体的作用下，二型糖尿病动物模型对胰岛素降低血糖的敏感性提高，有利于降低动物模型内血糖含量。

附图说明

图1为MSC及其外泌体的鉴定，图1-A:脐带间质干细胞图；图1-B：脐带间质干细胞外泌体透射电镜图；图1-C：脐带间质干细胞外泌体表面标记图；

图2为二型糖尿病大鼠模型鉴定，图2-A：正常组与糖尿病组餐前餐后血糖；图2-B：正常组与糖尿病组OGTT实验结果；图2-C：正常组与糖尿病组IPITT结果；图2-D：正常组与糖尿病组胰腺组织切片中胰岛体积比较；图2-E：正常组与糖尿病组餐后胰岛素水平；

图3为MSC外泌体治疗二型糖尿病大鼠模型具体流程图；

图4为MSC-ex降低二型糖尿病大鼠血糖及提高大鼠胰岛素敏感性的结果，图4-A为不同组动物模型长期血糖检测图；图4-B为口服糖耐量实验图；图4-C为胰岛素抵抗实验；

图5为MSC-ex提高二型糖尿病大鼠β细胞胰岛素分泌能力，图5-A为餐前餐后血清胰岛素水平；图5-B为IRT实验结果；图5-C为胰腺HE切片及β细胞免疫组织化学染色；图5-D为胰腺切片平均胰岛数量统计；图5-E为胰腺切片β细胞平均分布体积结果；

图6为MSC-ex抑制肝糖原分解，活化胰岛素信号通路，图6-A为肝组织切片糖原染色结果(PAS)染色；图6-B为胰岛素信号通路相关蛋白表达水平检测。

具体实施方式

本发明将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液。

在本发明中，所述人脐带间质干细胞优选增殖能力强，状态好的健康人脐带间质干细胞(MSC)。所述人脐带间质干细胞培养前优选体外扩增培养。所述体外扩增培养的方法优选Qiao Chun等人报道的方法(Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cellsisolated from the umbilical cord.Cell Biol Int.2008Jan；32(1):8-15)进行。所述人脐带间质干细胞在体外扩增培养时，优选生长面积覆盖80％时转移至无血清培养基上培养。所述无血清培养基优选为STEMBO,货号为C8004。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述培养时环境CO₂的体积浓度优选为4％～6％，更优选为5％。所述培养的时间优选为48h。

在本发明中，所述离心的转速优选为1800～2000g；所述离心的时间优选为8～12min。所述离心的目的是去除上层液中的细胞碎片。

得到人脐带间质干细胞外泌体粗液后，本发明将所述人脐带间质干细胞外泌体粗液经超滤浓缩离心，得到浓缩液；所述超滤用超滤膜为100000Da规格；所述离心速度为1000～2000g；所述离心时间为15～20min。

在本发明中，超滤浓缩前优选将所述人脐带间质干细胞外泌体粗液进行蔗糖密度梯度离心，以进一步去除细胞细小碎片和细胞器。本发明对所述蔗糖密度梯度离心的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的蔗糖密度梯度离心的方案即可。

在本发明中，所述离心速度优选为1500g；所述离心时间为18min。

在本发明中，所述超滤浓缩的方法优选采用15ml规格的100000Da MWCO超滤离心管中浓缩。所述100000DaMWCO超滤离心管购自Millipore公司。

得到浓缩液后，本发明将所述浓缩液移至质量浓度为30％的蔗糖重水密度垫上，在4℃条件下，80000～160000g密度梯度离心120min，收集底部缓冲垫。所述30％的蔗糖重水的密度优选为1.13～1.19g/ml。

在本发明中，所述30％的蔗糖重水密度垫的体积优选为5ml。

在本发明中，所述收集底部缓冲垫的体积优选为5ml。所述密度梯度离心的转速优选为100000g。

得到底部缓冲垫后，本发明将所述底部缓冲垫经PBS溶液洗涤后置于100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，收集浓缩液，得到人脐带间质干细胞外泌体。

在本发明中，所述PBS溶液的浓度优选为0.067M(PO₄)，更优选为PhosphateBuffered Sailine(1X)，购自GE Healthcare Life Science。所述PBS溶液和底部缓冲垫的体积比优选为5：1。所述PBS溶液洗涤的次数优选为2～3次。

在本发明中，所述收集浓缩液后，优选还包括将所述浓缩液进行定量和过滤除菌。所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm。所述定量的方法优选采用BCA法测定蛋白浓度。

在本发明中，分离纯化的人脐带间质干细胞外泌体优选包括验证。所述验证包括形态观察和标记蛋白检测。所述形态观察优选采用透射电镜观察人脐带间质干细胞外泌体的基本形态。所述标记蛋白检测优选采用western blot检测外泌体的表面标记蛋白。所述表面标记蛋白优选为CD9和CD81。

在本发明中，分离纯化的人脐带间质干细胞外泌体使用时进行稀释。所述稀释用溶液为成品PBS。所述PBS优选为Phosphate Buffered Sailine(1X)，购自GE HealthcareLife Science公司。所述稀释后人脐带间质干细胞外泌体溶液的浓度优选为20～30mg/ml。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用。在本发明中，所述人脐带间质干细胞外泌体降低二型糖尿病动物模型血糖含量时，剂型为注射剂，注射用的剂量优选8～12mg/kg.bw，更优选为10mg/kg.bw。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力药物中的应用。在本发明中，所述人脐带间质干细胞外泌体提高二型糖尿病动物模型胰岛素分泌能力时，注射用的剂量优选8～12mg/kg.bw，更优选为10mg/kg.bw。

本发明提供了所述分离纯化方法得到的人脐带间质干细胞外泌体在制备提高胰岛素的敏感性药物中的应用。在本发明中，所述人脐带间质干细胞外泌体提高二型糖尿病动物模型对胰岛素的敏感性时，注射用的剂量优选8～12mg/kg.bw，更优选为10mg/kg.bw。

在本发明中，所述二型糖尿病动物模型的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规的二型糖尿病动物建模方法即可。

在本发明中，所述药物的剂型优选为注射剂。所述药物中人脐带间质干细胞外泌体治疗二型糖尿病的有效剂量为8～12mg/kg.bw，更优选为10mg/kg.bw。

在本发明中，所述人脐带间质干细胞外泌体通过提高二型糖尿病动物模型胰岛素信号通路的活化程度，抑制肝糖原合成分解，从而实现葡萄糖代谢稳态的调节，同时通过提高二型糖尿病动物模型对胰岛素的敏感性及提高胰岛β细胞的胰岛素分泌功能来治疗高血糖，从而达到治疗二型糖尿病的目的。

下面结合实施例对本发明提供的人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法和人脐带间质干细胞外泌体的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

主要材料和来源分别如下：

MSC培养试剂：α-MEM、胎牛血清(Gibco公司产品)、胰蛋白酶(Sigma公司产品)、二氧化碳培养箱(Forma公司)、无血清培养基(上海依科赛公司；倒置显微镜，荧光显微镜，生物显微镜，电子显微镜，超净工作台，台式离心机；

外泌体提取试剂：重水(D₂O，上海创赛公司)，分析纯蔗糖(广州化学试剂厂)，兔抗人CD9抗体(美国BioworldTechnology公司)，兔抗人CD63抗体(美国Epitomics公司)，BCA蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(北京康为世纪公司)，HRP化学发光底物、100-kDa MWCO超滤离心管、0.22μm无菌滤膜(美国Millipore公司)；透射电子显微镜(FEITecnai 12，Philips公司)；超速离心机(美国贝克曼公司)。

具体实施步骤描述如下：

(1)脐带MSC的分离培养：按本课题组早前建立的人HucMSC分离培养及鉴定方法体外培养扩增MSC(Qiao Chun et al.Human mesenchymal stem cells isolated fromtheumbilical cord.Cell Biol Int.2008 Jan；32(1):8-15)，选择增殖能力强，状态好的健康人脐带MSC(附图1A)，生长面积覆盖80％后用无血清培养基(STEMBO,C8004)37℃，5％CO₂培养48h收集培养上清液，2000g/10min离心除去细胞碎片后即为MSC-CM，﹣70℃冷藏备用。

(2)脐带间质干细胞分泌的上清中外泌体的分离纯化：将收集的MSC-CM经差速离心弃去细胞碎片及细胞器后移至15ml规格的100 000Da MWCO超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至5ml浓度为30％的蔗糖/D2O密度垫上，4℃条件下，100000g离心120min，收集底部5ml的缓冲垫(含外泌体)用PBS稀释洗涤后，置入100000DaMWCO超滤离心管中洗涤，最后将收集的外泌体浓缩液定量，0.22μm滤膜过滤除菌，BCA法测定蛋白浓度，分装，于﹣70℃冷藏备用。

(3)透射电镜观察外泌体的基本形态：MSC-ex 20μL，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸轻轻吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照，如附图1-B所示外泌体直径约为100nm左右囊泡状结构。

(4)Westernblot检测外泌体表面标记蛋白：配制15％SDS-PAGE电泳胶，将上述提取的外泌体1:1加入REPA+PMSF充分裂解后，剧烈震荡1分钟，冰上放置3分钟，重复5次后，加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸5min，按200μg蛋白质总量上样，电转移(350mA，120min)将蛋白质转至PVDF膜上，用含50g/L脱脂牛奶的TBS/T室温封闭1h，分别与兔抗人CD9抗体和兔抗人CD81抗体(1:500)于4℃反应过夜，次日用TBS/0.5％Tween 20洗膜3次后，与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗37℃温育1h)，TBS/0.5％Tween20洗膜3次后，加入预混HRP化学发光底物，并通过化学发光凝胶成像系统进行检测，如附图1-C所示，脐带来源的外泌体的标记。

实施例2

二型糖尿病大鼠模型构建及MSC-ex对二型糖尿病大鼠的治疗效果

本实施例所使用的主要材料和来源分别如下：

动物模型所需材料：8周龄雄性SD大鼠，普通饲料(舒克贝塔公司)，45％高脂饲料(江苏美迪森公司)，链脲佐菌素(Sigma公司)，血糖仪及试纸(罗氏金锐)，糖原染色试剂盒(北京索莱宝G1280)，相关抗体：兔抗鼠AKT抗体(SAB，美国)，兔抗鼠p-AKT抗体(SAB，美国)，兔抗鼠GSK抗体(SAB，美国)，兔抗鼠β-GSK抗体(SAB，美国)，兔抗鼠Actin抗体(美国Bioworld Technology公司)，兔抗鼠IRS1抗体(SAB，美国)，兔抗鼠p-IRS1(SAB，美国)，兔抗鼠Glycogen synthase抗体(abclonal，美国)。其他器材：一次性胰岛素注射针筒，胰岛素(Sigma公司)，葡萄糖(食用)，胰岛素检测ELISA试剂盒(Excell公司)。

具体实施步骤描述如下：

(1)构建SD大鼠T2DM模型

选择8周龄雄性SD大鼠作为T2DM造模对象，45％高脂饲料喂养5周后尾静脉注射STZ(35mg/kg)(链脲佐菌素，Sigma)，第7天用罗氏便携式血糖仪(活力型)检测血糖有无>＝16.7mmol/L，同时取胰腺做病理切片，HE染色检测胰岛体积是否减小，做口服糖耐量实验(OGTT)、胰岛素耐受实验(IPITT)等实验检测糖耐量，胰岛素耐受，胰岛β细胞分泌功能(参见Si,Y et al,Diabetes,2012,61,1616-1625；Reed,MJ et l,Metabolism.2000,49,1390-1394)辅助判断模型是否构建成功(血糖水平>＝16.7mmol/L，糖耐量受损，胰岛素抵抗增加，胰岛素释放能力降低)(附图2)。

(2)MSC-ex用于二型糖尿病模型治疗

将T2DM大鼠按随机数字表法分2组(n＝12)，分别为PBS(200μl)阴性对照，MSC-ex(10mg/k溶于200μl PBS)实验组；普通SD大鼠注射PBS(200μl)为正常组对照。PBS及MSC-ex10(10mg/kg bw)于二型糖尿病大鼠成模第7日进行尾静脉注射，每3日注射一次共注射7次并进行每三日一次血糖检测。流程见附图3，血糖检测见附图4-A。

由图3可知，治疗二型糖尿病模型的流程为高脂喂养5周后经尾静脉注射35mg/kg链脲佐菌素(STZ)，第三天进行模型鉴定，剔除未成模大鼠并对成模大鼠随机分组，STZ注射后第七天行尾静脉MSC-ex注射，剂量为10mg/kg，共注射5次，PBS，胰岛素为对照组，其后三天一次检测餐后两小时血糖。MSC-ex最后一次注射结束两周检测OGTT,IPITT,IRT等指标。

(3)MSC-ex治疗二型糖尿病大鼠疗效判断

于MSC-ex最后一次注射2周后检测各组大鼠OGTT,IRT,IPITT指标,餐后血清胰岛素水平及胰岛β细胞的体积及数量。OGTT实验：大鼠空腹12h后灌胃2g/kg葡萄糖溶剂分别于灌胃前(0min)，灌胃后30，60，90，120分钟检测血糖并做曲线图；IRT实验：大鼠空腹12h后灌胃2g/kg葡萄糖溶剂分别于灌胃前(0min),灌胃后30，60，120，180分钟检测胰岛素并做曲线图；IPITT实验：大鼠空腹12h后灌胃2g/kg葡萄糖溶剂同时给予2UI/kg胰岛素，分别在0，30，60，90，120分钟检测血糖，各时间段血糖对于0min下降比例作图，(附图4-B，4-C，5-B)。图4为MSC-ex降低二型糖尿病大鼠血糖及提高大鼠胰岛素敏感性的结果，图4-A：不同组动物模型长期血糖检测图，MSC-ex降低二型糖尿病大鼠血糖；图4-B：口服糖耐量实验图，MSC-ex提高二型糖尿病大鼠对葡萄糖的耐受能力；图4-C：胰岛素抵抗实验，MSC-ex提高二型糖尿病大鼠模型的胰岛素敏感性。

MSC-ex对于二型糖尿病大鼠胰岛素分泌功能的判定通过餐后胰岛素水平及胰腺切片中胰岛数量及胰岛素分泌细胞的分布体积判断(附图5)。图5为MSC-ex提高二型糖尿病大鼠β细胞胰岛素分泌能力，图5-A为餐前餐后血清胰岛素水平，MSC-ex提高二型糖尿病大鼠模型的胰岛素分泌能力；图5-B为IRT实验结果，MSC-ex改善二型糖尿病大鼠模型的胰岛β细胞对葡萄糖的应答及胰岛素分泌水平；图5-C为胰腺HE切片及β细胞免疫组织化学染色；图5-D为胰腺切片平均胰岛数量统计；图5-E为胰腺切片β细胞平均分布体积结果。

取各组大鼠肝组织，福尔马林固定后制成4μm的组织切片，用糖原染色试剂盒检测肝组织中糖原沉积情况。取肝组织，提取总蛋白，Western blot检测p-IRS1，IRS1，p-AKT，AKT，Actin，GSK-3β，Glycogen synthase的表达量(附图6)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.人脐带间质干细胞外泌体在制备降低二型糖尿病血糖含量药物中的应用；

所述人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)将人脐带间质干细胞在无血清培养基上培养45～50h，收集培养上清液，离心，收集上层液，得到人脐带间质干细胞外泌体粗液；所述离心的转速为1800～2000g；所述离心的时间为8～12min；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中培养的温度为36～38℃；所述培养时环境CO₂的体积浓度为4％～6％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中收集浓缩液后，还包括将所述浓缩液进行过滤除菌；所述过滤用滤膜的孔径为0.22μm。

4.人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病胰岛素分泌能力的药物中的应用；

所述人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法为权利要求1~3任意一项所述应用中人脐带间质干细胞外泌体的分离纯化方法。

5.人脐带间质干细胞外泌体在制备提高二型糖尿病对胰岛素的敏感性的药物中的应用；

6.人脐带间质干细胞外泌体在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用；

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物中人脐带间质干细胞外泌体治疗二型糖尿病的有效剂量为8～12mg/kg·bw。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂。