CN107557332B

CN107557332B - Cd29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途

Info

Publication number: CN107557332B
Application number: CN201710894829.4A
Authority: CN
Inventors: 唐静
Original assignee: Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jilin Tuo Hua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107557332A

Abstract

本发明公开了一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途。所述CD29⁺人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。本发明的CD29⁺人脐带源间充质干细胞可以明显改善db^‑/‑小鼠的高血脂症、高血糖症并可增加db^‑/‑小鼠比目鱼肌和腓肠肌的肌纤维横断面，增加每条肌管内容和细胞数，从而改善db^‑/‑小鼠的骨骼肌萎缩症状。本发明为后续研究和研制治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的药物奠定了理论基础和试验依据，具有广阔的应用前景。

Description

CD29+人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途

技术领域

本发明涉及间充质干细胞领域，具体是一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途。

背景技术

骨骼肌质量和完整性对于肌肉骨骼系统的正常功能以及有效的营养摄取和储存至关重要。骨骼肌组织是身体最大的代谢活性组织、主要的葡萄糖代谢部位和病理状况下其他器官的燃料储存器。肌肉萎缩不仅伴随许多常见的疾病而产生，例如癌症，肾/心力衰竭，败血症，肌肉遗传疾病和神经退行性疾病等，还发生在健康的个体上，如在腿部骨折的固定，卧床休息期间。成年肌肉质量的主要决定因素是外源必需氨基酸（需要通过膳食蛋白质摄入获得）和运动。缺乏能量摄入，不活动，太空飞行或肢体固定等因素都将导致肌肉横截面积（CSA）的减少，相关的功能丧失和肌肉胰岛素抵抗。更重要的是，肌肉量的丧失与更多疾病的发病率和死亡率相关，特别是在老年人群中，肌肉量的丧失在2型糖尿病患者中形成加速。

胰岛素介导的葡萄糖摄取也因肌肉萎缩而减弱。也就是说，肌肉萎缩将导致2型糖尿病胰岛素抵抗（IR）。有研究人员对年轻男性进行了为期1周的睡眠研究，证明肌肉质量减少导致全身胰岛素敏感性降低。然而，IR在驱动肌肉萎缩中的作用尚不清楚。另有研究报告证明，持续性IR患者加速肌肉质量下降，肌肉质量的下降与糖尿病或糖化血红蛋白（HbA1c）的持续时间呈负相关。在3年研究期间，与2期糖尿病患者相比，老年2型糖尿病患者膝关节伸肌强度下降了近50％，这表明老年2型糖尿病患者肌肉力量下降加速。在进一步研究中，有学者报道了患有和不伴有糖尿病的个体之间在行走速度，肌肉力量，力量和肌肉质量等方面的差异是独立于共存的外周运动神经病或外周血管疾病，这表明糖尿病本身对肌肉病变有直接影响。另有证据表明，在2型糖尿病中加速的肌肉损失不受胰岛素治疗的影响，这可能与IR有关。因此，2型糖尿病骨骼肌质量改变的发生不好预测，并且程度不同。

几项研究的证据表明，饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸可能起到差异调节骨骼肌质量和功能的作用。例如，C2C12肌管被棕榈酸处理后（循环饱和脂肪酸最丰富）肌管直径减小并且胰岛素信号被抑制。与此相应，据报道肌肉细胞中的棕榈酸酯促进诱导前萎缩基因的表达，如atrogin-1 / MAFbx，并伴随其转录调节子FoxO3（叉头蛋白）核定位的增加。相比之下，几个体内研究也报道了不饱和脂肪酸具有预防肌量减少和/或萎缩的作用。例如，研究表明携带结肠腺癌的癌症恶病质动物模型（饮食中补充共轭亚油酸）能够保持腓肠肌的肌量；二十碳五烯酸（EPA）弱化恶病质诱导MAC16肿瘤的小鼠腓肠肌减少蛋白质降解；EPA还预防了在施用弗氏佐剂后大鼠腓肠肌肌量的减少，同时使阿霉素-1 / MAFbx和MuRF1基因表达正常化。另外，营养不良的仓鼠喂饲富含PUFAα-亚麻酸（ALA）的饮食后，肌肉形态和功能得到改善，其中包括肌纤维增大。同时，ω-3和ω-6 PUFA也被证明可以增加p70S6K1蛋白在Thr389处的磷酸化，表明其在L6肌细胞的肌原性分化过程中活性增加。

肌肉重塑发生在整个生命中，触发肌肉重塑的因素非常复杂，所以不同的治疗方案可不同程度的延缓疾病的进程。目前，最先进的治疗方法是使用肌原性干细胞来延缓萎缩并用新的健康和功能性肌肉纤维替代患病肌肉。

发明内容

本发明提供了一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞及其在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途，以丰富间充质干细胞治疗肌肉萎缩这一治疗方法领域的多样性。

本发明是按照以下技术方案实施的。

一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。

一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途。

进一步的，所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的高血脂症。

进一步的，所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的高血糖症。

进一步的，所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的骨骼肌萎缩。

本发明获得了如下有益效果。

本发明提供了一种治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的药物或药物的有效成分。本发明的CD29⁺人脐带源间充质干细胞可以明显改善db^-/-小鼠的高血脂症、高血糖症并可增加db^-/-小鼠比目鱼肌和腓肠肌的肌纤维横断面，增加每条肌管内容和细胞数，从而改善db^-/-小鼠的骨骼肌萎缩症状。本发明为后续研究和研制治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩的药物奠定了理论基础和试验依据，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明人脐带间充质干细胞刚刚帖壁时形态图；

图2是本发明人脐带间充质干细胞帖壁后4h形态图；

图3是本发明人脐带间充质干细胞扩增培养48h形态图；

图4是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD73的表达图；

图5是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD90的表达图；

图6是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD105的表达图；

图7是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD45的表达图；

图8是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物HLA-DR的表达图；

图9是本发明人脐带间充质干细胞表面标志物CD29的表达图；

图10是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成脂图（200X）；

图11是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成骨图（400X）；

图12是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞诱导分化成软骨图（100X）；

图13是本发明未移植组DB鼠腓肠肌HE切片图（400X）；

图14是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞移植后DB鼠腓肠肌HE切片图（400X）；

图15是本发明未移植组DB鼠比目鱼肌HE切片图（400X）；

图16是本发明CD29⁺人脐带间充质干细胞移植后DB鼠比目鱼肌HE切片图（400X）。

具体实施方式

以下参照附图及实施例对本发明进行进一步的技术说明。

实施例1 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的分离

1.1将2ul抗人CD29抗体（R&D Systems，US）在4℃与多聚赖氨酸(Sigma)1mg混匀，平铺于直径90mm培养皿（上海晶安生物科技有限公司），4℃过夜备用。

1.2无菌操作，PBS（Gibco）洗涤脐带至无血迹变白。

1.3用眼科剪将组织剪成小段，纵向剖开，去除血管和脐带外皮后将华尔通胶剪成小片。

1.4将小片脐带组织放在50ml离心管里剪碎成泥状后加入0.1%的胶原酶IV（Gibco）, 37℃消化2小时，加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM（Gibco）培养液混匀，2000g离心10分钟（L-800R江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入上述培养皿中，于5% CO₂培养箱内倒置培养。

1.5 2h后弃掉上清液，添加适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液。

1.6 48小时后弃掉上清，0.25%胰酶消化3分钟，将消化液收集到50ml离心管中，2000g离心10分钟（L-800R 江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入步骤1.1所述培养皿中，添加适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液。

1.7 48小时后弃掉上清，0.25%胰酶消化3分钟，将消化液收集到50ml离心管中，2000g离心10分钟（L-800R 江东仪器，中国），弃掉上清液，将下部沉淀细胞加入适量含10%胎牛血清的ɑ-MEM培养液后转入75cm²培养瓶中，每隔3天换一次液。待融合率达85%以上，进行传代培养（试验结果参见图1-3）。

实施例2 人脐带源间充质干细胞的表面标志检查

2.1 取第5代1×10⁶细胞/ml，0.1ml/管于流式检测管中。

2.2 分别加入直接标记的荧光抗体CD29、CD34、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105（Biolegend，US）以及相应同型对照抗体进行免疫标记反应。

2.3 4℃孵育20-30分钟后，用PBS洗涤1-2次，离心弃上清。

2.4加入0.5ml PBS缓冲液混悬细胞成单个细胞悬液。

2.5采用FACSCalibur 流式细胞仪Cellquset Software分析软件进行各样本检测。

试验结果如图4-9所示，本发明人脐带源间充质干细胞，表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。不表达如下二种细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD45和人白细胞抗原HLA-DR。

实施例3 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成脂分化

3.1选取生长状态良好的脐带源间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%融合时，胰酶消化。

3.2将细胞接种于六孔板中，每孔约2.5×10⁴个细胞，加入2ml/孔完全培养液，分别放入37℃，5% CO₂孵箱和低氧培养箱中培养24h。

3.3 24h后，移去旧的培养液，在上述六孔板中加入脂诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、0.6mM IBMX、12mg/L胰岛素、10^-5M地塞米松和250μM吲哚美辛），诱导21天。

3.4弃掉培养板内的培养基，用PBS冲洗2次，加入4%中性甲醛，固定30min，吸去固定液。

3.5加入现配过滤后的油红O染色液，染色30min，PBS 洗 3次，去除残留的染色液和残渣，光学显微镜下进行脂滴观察。

试验结果如图10所示，可见细胞质内有红色脂肪滴形成。

实施例4 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成骨分化

4.1选取不同个体来源生长状态良好的间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%时，胰酶消化。

4.2 将细胞接种于六孔板中，接种细胞密度1×10⁶个/ml，每孔加入3ml完全培养液，放入37℃，5% CO2孵箱中培养。

4.3 24h后，移去旧的培养液，在上述六孔板中加入成骨诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、10^-8M的地塞米松、15mM的β-甘油磷酸钠、70mg/L的抗坏血酸），空白对照组换上a完全培养基培养（α-MEM培养基添加10%胎牛血清）。此为诱导第1天。

4.4 每三天换液，诱导三周后进行茜素红染色。弃掉六孔板板内的培养基，PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，PBS冲洗3次，加入适量0.1%茜素红，37℃，染色30min，PBS冲洗一次。显微镜下进行观察钙化结节并拍照。

试验结果如图11所示，可见细胞质内有红色钙结节形成。

实施例5 CD29⁺人脐带源间充质干细胞的成软骨分化

5.1选取生长状态良好的脐带源间充质干细胞P5代，细胞融合率达到80%-90%融合时，胰酶消化。

5.2将细胞接种于六孔板中，每孔约2.5×10⁴个细胞，加入2ml/孔完全培养液，分别放入37℃，5% CO₂孵箱和低氧培养箱中培养24h。

5.3 24h后移去旧的培养液，在上述六孔板中加入成软骨诱导液（α-MEM培养基添加10%胎牛血清、60mg/L抗坏血酸、0.3μmol/L地塞米松、15ng/ml TGF-β-1），每隔三天换液一次，诱导21天后进行阿利新蓝染色鉴定。

试验结果如图12所示，可见细胞质蓝染。

实施例6 CD29⁺人脐带源间充质干细胞对糖尿病db/db小鼠（简称db^-/-小鼠）血脂水平的影响

选取8周龄db^-/-小鼠（购自美国JACSON实验室）为实验模型动物，同遗传背景C57BLKS/J db/+不发病小鼠（简称db/m小鼠）为对照鼠，每组5只。用实施例1得到的人脐带源间充质干细胞，以2.0×10⁷个细胞经尾静脉输注，16周后空腹6小时后目内眦取血，离心分离血清，酶法检测空腹血清TC和TG水平。血清生化指标测定用试剂盒：TC 测定试剂盒及TG 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Allegra 64R 离心机（德国BECKMANCOULTER）；JA5002 电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；RT-9600 生化分析仪（深圳雷杜生命科学有限公司生产）。饲养16周后，未治疗的db^-/-小鼠空腹血清 TG 浓度（3.91±0.61）、TC 浓度（3.51±0.78），显著高于干细胞移植组 TG 浓度（2.49±0.66）、TC 浓度（2.37±0.52）（P＜0.05）；试验结果表明人脐带源间充质干细胞移植可以明显改善db^-/-小鼠的高血脂症（参见表1）。

表1 干细胞移植后16周db^-/-小鼠血脂的比较

注：与对照组比较，“*”表示P值小于0.05，“**”表示P值小于0.01。

实施例7 CD29⁺人脐带源间充质干细胞对糖尿病db/db小鼠（简称db^-/-小鼠）血糖水平的影响

选取8周龄db^-/-小鼠（购自美国JACSON实验室）为实验模型动物，同遗传背景C57BLKS/J db/+不发病小鼠（简称db/m小鼠）为对照鼠，每组5只。用实施例1得到的人脐带源间充质干细胞，以2.0×10⁷个细胞经尾静脉输注，16周后空腹6小时后目内眦取血，离心分离血清，酶法检测空腹血清TC和TG水平。血清生化指标测定用试剂盒：TC 测定试剂盒及TG 测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Allegra 64R 离心机（德国BECKMANCOULTER）；JA5002 电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；RT-9600 生化分析仪（深圳雷杜生命科学有限公司生产）。饲养16周后，未治疗的db^-/-小鼠空腹血糖显著高于干细胞移植组。试验结果表明人脐带源间充质干细胞移植可以明显改善db^-/-小鼠的高血糖症（参见表2）。

表2 db-/-小鼠血糖的比较

	空腹血糖（禁食8小时后）	餐后血糖(2h)
			db<sup>-/-</sup>小鼠未移植组	14.36±1.08	31.52±2.37
db<sup>-/-</sup>小鼠干细胞移植组	11.64±1.51*	22.33±1.46*

实施例8 CD29⁺人脐带源间充质干细胞对糖尿病db^-/-小鼠骨骼肌萎缩的影响

选取8周龄db^-/-小鼠（购自美国JACSON实验室）为实验模型动物，同遗传背景C57BLKS/J db/+不发病小鼠（简称db/m小鼠）为对照鼠，每组5只。用实施例1得到的人脐带源间充质干细胞，以2.0×10⁷个细胞经尾静脉输注，16周后处死小鼠，切取骨骼肌，中性甲醛固定，石蜡包埋，切片（3μm），常规H＆E染色。切片常规用二甲苯脱蜡3次，每次15min；无水乙醇、90%、80%、70%各级乙醇依次脱水至蒸馏水，毎次2min；苏木素染色5min，蒸馏水缓慢冲洗；盐酸乙醇分色10s（提插数下）。蒸馏水冲洗15min，伊红溶液染色2min；蒸馏水冲洗，乙醇梯度（70%至80%至90%至无水乙醇）脱水，二甲苯透明，轻轻擦拭组织周边二甲苯，中性树脂封片。苏木素和伊红溶液均购自武汉博士德生物有限公司。

试验结果如图13-16所示，将CD29⁺脐带源间充质干细胞通过尾静脉移植给db^-/-小鼠，16周后发现与未治疗组相比，干细胞注射后的db^-/-小鼠比目鱼肌和腓肠肌的肌纤维横断面增加，每条肌管内容和细胞数明显增加。上述证据表明，脐带源间充质干细胞移植可以改善db^-/-小鼠的骨骼肌萎缩。

Claims

1.一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途，其特征在于，所述CD29⁺人脐带源间充质干细胞表达如下四种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90、人白细胞分化抗原CD105和人白细胞分化抗原CD29。

2.根据权利要求1所述的一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途，其特征在于：所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的高血脂症。

3.根据权利要求1所述的一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途，其特征在于：所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的高血糖症。

4.根据权利要求1所述的一种CD29⁺人脐带源间充质干细胞在制备治疗高糖高脂环境下骨骼肌萎缩药物中的用途，其特征在于：所述人脐带源间充质干细胞明显改善db^-/-小鼠的骨骼肌萎缩。