JPH06509225A - 試験管内で増殖し得る新規な成長因子応答性の前駆細胞 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 試験管内で増殖し得る新規な成長因子応答性の前駆細胞発明の分野 本発明は、神経前駆細胞の試験管内の培養方法、及び組織移植片としてのこれら の細胞の使用に関する。一つの局面において、本発明は、分化するように誘発の 永続化方法に関する。別の局面において、本発明は神経系を標的とする推定の治 療薬の薬剤スクリーニングの目的の神経細胞の生産方法に関する。また、別の局 面において、本発明は自家移植のための細胞の生産方法に関する。別の局面にお いて、本発明は宿主中の前駆細胞の現場（ｉｎ　５ｊｔｕ）増殖及び分化方法に 関する。

発明の背景 神経系の発達は胎児発達の初期段階で始まる。新しい神経細胞の発生である神経 発生は生後期間で初期に完結する。しかしながら、神経回路に係わるシナプス連 結体は、シナプス可変性及び細胞死滅のために、個人の寿命中に連続的に変化す る。

神経発達の第一工程は細胞誕生であり、これは前駆体又は前駆細胞が増殖し、分 化する正確な時間上及び空間上の順序である。増殖細胞は神経芽細胞、ダリア芽 細胞及び基幹細胞を生じる。

第二程は、前駆細胞が神経細胞及びダリア細胞になり、それらの最終の位置に移 動する時の細胞型の分化及び移動の期間である。神経管に由来する細胞は中枢神 経（ＣＮＳ）の神経細胞及びダリアを生じ、一方、神経冠に由来する細胞は末梢 神経系（ＰＮＳ）の細胞を生じる。神経成長因子（ＮＧＦ）の如き発達中に存在 する成る種の因子は、神経細胞の成長を促進する。ＮＧＦは神経冠の細胞により 分泌され、神経軸索の発芽及び成長を刺激する。

発達の第三工程は、細胞が特別な神経伝達物質の発現の如き特定の表現型の性質 を獲得する時に起こる。この時点で、神経細胞はまたそれらの標的でシナプス化 するプロセスを延長する。神経細胞は分化後に分裂しない。

最後に、選択的な細胞死滅が起こり、この場合、特定の細胞、繊維及びシナプス 連結体の変性及び死滅が神経系の複雑な回路を“微細に同調する”。この“微細 な同調”が宿主の寿命にわたって続く。寿命の後半に、老化、感染及びその他の 未知の病因による選択的な変性が神経変性疾患をもたらし得る。

神経変性疾患の治療が、これらの疾患につき最大のリスクのある老人の増大する 人口のために、近年の重大な関心事になりつつある。これらの疾患（アルツハイ マー病、ハンチントン舞踏病及びパーキンソン病を含む）は、脳中の特定の位置 における神経細胞の変性に関連しており、これがその脳領域を神経の信号発生に 不可欠である神経伝達物質を合成し、放出することをできなくさせる。神経伝達 物質の欠如から生じると考えられる別の疾患は精神分裂症である。

また、神経変性は、神経損失を生じる症状及び疾患を含む。これらの症状として 、ＣＮＳ外傷の結果として生じる症状（卒中及びてんかんを含む）が挙げられる 。

筋萎縮性側索硬化症及び脳性小児麻痺の如きその他の疾患がまた神経損失を生じ る。脳の特定の領域間の相互作用、及びこれらの相互作用がそれらの機能の外向 きの発現を生じる方法の理解の欠如のために、ＣＮＳ変性の治療が妨げられる。

複雑な細胞相互作用並びに挙動及び認識機能に関するそれらの効果の研究は、多 数の細胞及びそれらが形成する複雑な神経回路のために一層困難にされる。

殆どのＣＮＳ療法の目的は、細胞変性のために失われる特別な化学的機能又は酵 素活性を回復することである。

基底核として知られている脳領域における変性は、その正確な位置に応じて、種 々の認識上及び運動上の徴候を有する疾患をもたらし得る。基底核は、線条（こ れは尾状核及び果枝からなる）、淡蒼球、異質、無名質、腹側淡蒼球、マイネル ト基底核、腹側被蓋領域及び視床下桟を含む多くの別個の領域からなる。

アルツハイマー病の場合、前脳及び大脳皮質の深部に達する細胞変性がある。

加えて、更に精密に検査すると、基底核の成る領域、即ち、マイネルト基底核に 局在化された変性は選択的に変性されていることか明らかである。この核は、通 常、コリン作用性突起部を大脳皮質に送り、これらが記憶を含む認識機能に関与 すると考えられる。

多くの運動不足は基底核中の変性の結果である。ハンチントン舞踏病は線条中の 神経細胞の変性と関連しており、これが宿主に不随意の反射運動をもたらす。

視床下桟と称される小領域の変性はバリスムスと称される症状における極度の激 しくあばれる運動と関連しており、一方、果枝及び淡蒼球における変性は遅い身 をよじる運動又はアテトーシスの症状と関連している。パーキンソン病の場合、 変性が基底核のその他の領域である異質の対の緻密層に見られる。この領域は、 通常、ドーパミン作用性連結体を背部線条に送り、これらは運動を調節するのに 重要である。パーキンソン病の療法はこの回路につきドーパミン作用活性を回復 することに集中していた。

神経障害のその他の形態は、筋萎縮性側索硬化症及び脳性小児麻痺の如き神経変 性の結果として、又は卒中及びてんかんの如きＣＮＳ外傷の結果として生じ得る 。

現在まで、ＣＮＳ機能障害の治療は主として医薬組成物の投与によるものであっ た。不運なことに、この種の治療は、薬剤を血液脳関門を横切って輸送する制限 された可能性、及びこれらの薬剤が長期投与される患者により獲得される薬剤寛 容性を含む多くの合併症を伴っていた。例えば、パーキンソン病の患者における ドーパミン作用活性の部分的な回復は、血液脳関門を横断できるドーパミン前駆 体であるレボドーパで達成された。しかしながら、患者はレボドーパの効果に対 して寛容性になり、それ故、その効果を維持するために絶えず増加する投薬量が 必要とされる。現在、アルツハイマー病に有効な医薬上の治療がない。

最近、神経組織移植の概念がパーキンソン病の如き神経病の治療に適用されてい た。神経移植は一定の薬剤投与の必要を避は得るだけでなく、血液脳関門により 生じる複雑な薬剤送出系の必要を避は得る。しかしながら、この技術にも同様の 制限がある。第一に、その他の宿主からの分化細胞の細胞表面分子を有する移植 に使用された細胞は宿主に免疫反応を誘発し得る。加えて、細胞は、それらが隣 接細胞と正常な神経連結体を形成できるような発達の段階にある必要がある。

これらの理由のために、神経移植に関する初期の研究は胎児の細胞の使用に集中 した。ペーロウ（Ｐｅｒｌｏｗ）らは、　”Ｂｒａｉｎ　ｇｒａｆｔｓ　ｒｅｄ ｕｃｅ　ｍｏｔｏｒ　ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ　ｐ−ｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ 　ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔｅｄ　ｄｏｐａｍｉ ｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ、”　５ｃｉｅｎモ■@２０４：６４３ −６４７　（１９７９）において化学的に誘発された異質線状体の外傷を有する 成体ラットへの胎児のドーパミン作用性神経細胞の移植を記載している。これら の移植片は宿主動物において良好な生存率、軸索外航及びかなり減少された運動 異常を示した。リントパル（Ｌｔｎｄｖａｌ　Ｉ　）らは、　”Ｇｒａｆｔｓ　 ｏｒ　ｆｅｔａｌ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｎｅｕｒｏｎｓ　５ｕｒｖｉｖ■ ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｌ１ｌＩｏｔｏｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐａｒ ｋｉｎｓｏｎ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４V：　５７４−５７ ７ （＋９９０）において、ヒト胎児の中脳ドーパミン神経細胞の神経移植がドーパ ミンの合成及び貯蔵を回復でき、かつパーキンソン病を患う患者の硬直及び運動 緩徐を低減できることを示した。また、フリート（Ｆｒｅｅｄ）らは、ゴｒａｎ ｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆｈｕｍａｎ　ｆｅｌａｌ　ｄｏｐａｍｉｎｅ　ｃ ｅｌｌｓ　ｆｏｒ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’　ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、”　Ａｒｃｈ 、Ｎｅｕｒ盾戟A４７：　５０５ −５１２　（＋９９０）において、胎児移植片を受けた患者の改善を示す。

上記文献は、哺乳類の胎児脳組織が即時の移植後に良好な生存特性を有すること を開示している。胎児神経細胞の増大された生存能は、成体神経細胞よりも胎児 神経細胞の酸素欠乏に対する低減された感受性のためであり、そしてまた胎児細 胞における細胞表面マーカー（その存在は成体から移植組織の拒絶をもたらし得 る）の欠如のためであると考えられる。しかしながら、脳は免疫学上特権的な部 位と考えられるが、胎児組織の成る種の拒絶が生じ得る。それ故、胎児組織を使 用する可能性は、別の宿主から単離された胎児組織の組織拒絶、及びその結果と して生じる免疫抑制薬の必要性のためだけでなく、胎児組織を得る際の倫理上の 問題のために制限される。しかしながら、新生児の脳組織は生存につき制限され た能力を有し、成体哺乳類のＣＮＳ神経細胞は一般に脳への移植に対して生き残 らない。

成体ＣＮＳ神経細胞は神経移植に良い候補ではないが、成体末梢神経系（ＰＮＳ ）からの神経細胞は移植に対して生き残り、かつ宿主の神経組織を発達させる上 で神経栄養作用及び神経膠栄養（ｇｌ　１ｏｔｒｏｐｈｉｃ）作用を与えること が示された。移植のための非ＣＮＳ神経組織の一つの源は副腎髄質である。副腎 のクロム親和細胞は神経冠のようなＰＮＳ神経細胞に由来し、シナプスを受容し 、ＰＮＳ神経細胞と同様の酵素タンパク質及びキャリヤーを生産する。これらの 細胞は無傷の副腎髄質中で内分泌様式で機能するが、培養中にこれらの細胞はそ れらの線状表現型を失い、また成る種の成長因子及びホルモンの存在下の培養中 に神経の特徴を発達させる（ノック−（Ｎｏｔｔｅｒ）ら著、　”Ｎｅｕｒｏｎ ａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｍｏｎｋｅｙ　ａｄｒｅｎａｌ　ｍｅｄｕ ｌｌａｉｎ　ｖｉｔｒｏ、　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒ−ｅｓｅａｒｃｈ　２ ４４：　６９−７６　［１９８６］　）　ｏ哺乳類のＣＮＳに移植された場合、 これらの細胞は生存し、そしてかなりの量のドーパミン（これはＣＮＳの隣接領 域中のドーパミン受容体と相互作用し得る）を合成する。

米国特許第４．９８０．１７４号明細書において、ラットの前頭皮質への成体ラ ットの松果腺及び副腎髄質から単離されたモノアミンを含む細胞の移植は、宿主 のうつ病の形態である学習された無力の軽減をもたらした。米国特許第４．７５ ３．６３５号明細書において、去勢ウシに由来するクロム親和細胞及び副腎髄質 組織がラットの脳幹又はを髄に移植され、そして移植された組織又は細胞か侵害 受容体相互作用物質（即ち、ドーパミンの如きカテコールアミン）を放出するよ うに誘発された場合に痛覚消失を生じた。副腎髄質細胞がヒトに自家移植され、 生存し、徴候の軽度〜適度の改善をもたらした（ワッッ（Ｗａｔｔｓ）ら著、　 “Ａｄｒｅｎａｌ−ｃａｕｄａｔｅ　ｔｒａ−ｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｉｎ 　ｐａｔｔｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’　ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ（ ＰＤ）：］−ｙｅａｒ　ｆ盾撃撃盾浴|ｕｐ”。

Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　３９５ｕｐｐ１．１＋　１２７　［１９８９］　、バーテ ィグ（Ｈｕｒｔｉｇ）ら著、“Ｐｏｓｔ−ｍｏ−ｒｔｅｍ　ａｎａｌｙｓｉｓ　 ｏｆ　ａｄｒｅｎａｌ−ｍｅｄｕｌｌａ−ｔｏ−ｃａｕｄａｔｅ　ａｕｔｏｇｒ ａｆｔ　ｉｎ　ａ　ｐａｔｉ■獅煤@ｗｉｔｈ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ”ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ”、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏ ｌｏｇｙ　２５：　６０７−６１４　［１９８９］　）　ｏ@Ｌ／かし ながら、副腎細胞は正常な神経表現型を得ず、それ故、シナプス連結体が形成さ れる必要がある場合の移植片につきおそらく制限されて使用される。

神経移植のための組織のその他の源は細胞系からのものである。細胞系は、癌遺 伝子による正常な細胞の形質転換（セプコ（Ｃｅｐｋｏ）著、“Ｔｍｒｔａｌｉ ｚａｔｉｏｎ　ｏｆｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｖｉａ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ −ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ”、　Ａｎ 氏AＲｅｖ、Ｎｅ− ｕｒｏｓｃｉ、　１２：　４７−６５　［１９８９］　）又は試験管内の変性さ れた成長特性を有する細胞の培養（ロネット（Ｒｏｎｎｅｔｔ）ら著、Ｈｕｍａ ｎ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ：　Ｅｓ−ｔａ ｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｆｒｏｍ　ａ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｕｎｉｌａｔ ｅｒａｌ　ｍｅｇａｌｅｎｃｅｐｈａｌｙ”、　５ｃｉ■獅モ■@２４８： ６０３−６０５　［１９９０］　）のいずれかにより誘導される不死化細胞であ る。このような細胞は、多量で培養液中で増殖されて多重移植に使用し得る。幾 つかの細胞系が化学処理後に分化して種々の神経の性質、例えば、神経突起形成 、興奮性膜並びに神経伝達物質及びそれらの受容体の合成を発現することか示さ れた。更に、分化後に、これらの細胞は鎖糸分裂性（ａｍｌｔｏｔｉｃ）であり 、それ故、非癌性であることが明らかである。しかしながら、これらの細胞が逆 免疫反応を誘発する潜在性、細胞を不死化するためのレトロウィルスの使用、鎖 糸分裂状態へのこれらの細胞の復帰の潜在性、及び正常な成長抑制信号に対する これらの細胞の応答の欠如が細胞系を広範囲の使用に最適なものにしない。

神経移植のその他の方法は、遺伝子操作された細胞型又は遺伝子療法の使用を伴 う。この方法を使用して、異種遺伝子又はトランスジーンが、特別な酵素活性の 不十分である細胞に導入され、それにより活性を回復し得る。移入遺伝子を含む 細胞が神経変性の部位に移植でき、神経伝達物質及び成長因子の如き生産物を与 えることができくローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら著、　”Ｇｒａｆｔ ｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍａｄ山ｅｄ　ｃｅｌｌｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄ ａｒｍｇｅｄ　ｂｒａｉｎ：　Ｒｅ５ｔｏｒａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ 　ＮＧＦ　Ｅ■垂窒■唐刀| ｉｏｎ”、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：　１５７５−１５７８．　［１９８８］ 　）　、これらが変性の徴候の一部を軽減するように機能し得る。しかしながら 、これらの細胞と免疫反応を誘発する恐れが依然としてあり、レトロウィルス媒 介の移入はその他の細胞異常を生じ得る。

また、レトロウィルス媒介の遺伝子移入により生産された細胞系は移植後にそれ らの移入遺伝子を次第に失活することが示された（バルマー（Ｐａｌｍｅｒ）ら 著、’Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　５ｋｉｎ　ｆｉｂｒｏｂｌ ａｓｔｓ　ｐｅｒｓｉｓｔ　ｌｏｎｇ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓ垂撃≠獅狽≠煤 | ｔｉｏｎ　ｂｕｔ　ｇｒａｄｕａｌｌｙ　１ｎａｃｔｔｖａｔｅ　１ｎｔｒｏｄ ｕｃｅｄ　ｇｅｎｅｓ”、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ＡｃａｄAＳｃｉ、８８： １３３０−１３３４頁［＋９９１］　）。加えて、これらの細胞はまた宿主組織 との正常な神経連結体を得られないことがある。

従来技術では移植片を宿主組織中に充分に組み込むことができないこと、及び移 植に関して信頼できる源から無制限の量の細胞の利用可能性の欠如が、おそらく 、神経移植の最大の制限である。

それ故、神経細胞の培養及び移植の従来技術の方法に付随した上記欠点に鑑みて 、神経移植に関する無制限の数の細胞（これは神経細胞に分化できる）の信頼で きる源に対する要望か当業界に依然として存することが明らかである。更に、異 種供与細胞が免疫学上拒絶し得ると仮定すると、神経細胞に分化できる幼若体又 は成体の脳からの自己前駆細胞の単離、永続化及び移植に対する要望がある。

加えて、比較的非観血的様式、即ち、前駆細胞を神経細胞に現場で増殖、分化す るように誘発することによる損傷された神経組織の回復に対する要望がある。

従って、本発明の主目的は、神経移植に関する無制限の数の細胞（これは神経細 胞に分化できる）の信頼できる源を提供することである。

本発明の別の目的は、胚体、幼若体及び成体の脳からの神経前駆細胞の現場増殖 、神経細胞へのこれらの前駆細胞の分化、そして異種宿主又は自己宿主への前駆 細胞の神経移植のための方法を提供することである。また、前駆細胞は現場増殖 、分化するように誘発でき、それにより移植の必要を避は得る。

本発明の更に別の目的は、神経系を標的とする推定の治療薬のスクリーニングの 目的で神経細胞を生産する方法を提供することである。

発明の要約 本発明は、−局面において、少なくとも一種の成長因子、好ましくは表皮成長因 子又はトランスフォーミング成長因子αを補給した培地を含む前駆細胞の増殖を 誘発するだめの組成物を提供する。

また、本発明は、（ａ）＃乳類から細胞を単離する工程、（ｂ）その細胞を成長 因子を含む培地に露出する工程、（Ｃ）その細胞を増殖するように誘発する工程 、及び（ｄ）その細胞を分化するように誘発する工程を含む前駆細胞の試験管内 の増殖及び分化の方法を提供する。前駆細胞の増殖及び永続化は懸濁培養液中、 又は細胞を固定基質に付着させることにより行い得る。増殖及び分化は移植の前 又は後に、試験管内条件又は生体内条件の種々の組み合わせで行うことができ、 これらの組み合わせは（１）試験管内の増殖及び分化、その後の移植、（２）試 験管内の増殖、移植、その後の生体内の更なる増殖及び分化、及び（３）試験管 内の増殖、移植及び生体内の分化を含む。また、本発明は前駆細胞の現場増殖及 び分化を提供し、これは移植を必要としないで宿主中で直接行い得る。

別の局面において、本発明は凍結（ｃｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）による前駆細胞の 保存を提供する。

また、本発明は、上記（１）〜（３）のいずれかで処理された前駆細胞の生体内 の移植方法であって、少なくとも一種の成長因子で処理されたこれらの細胞を哺 乳類に移植することを含む生体内の移植方法を提供する。

更に、本発明は、（１）〜（３）のいずれかで処理され、成長因子で処理され、 神経細胞に分化するように誘発された前駆細胞を哺乳類に投与することを特徴と する神経変性疾患の治療方法を提供する。また、本発明は、哺乳類のＣＮＳ前駆 細胞を現場で刺激して神経細胞に増殖、分化させることを特徴とする神経変性疾 患の治療方法を提供する。

また、本発明は、成長因子、成長因子受容体、及びペプチド神経伝達物質の遺伝 子生産物を発現でき、又は神経伝達物質（アミノ酸、生体アミン及び神経ペプチ ドに関する神経伝達物質を含む）の合成に関与する酵素を発現し得るベクターに よるこれらの前駆細胞のトランスフェクション、及び神経変性の領域へのこれら の移入細胞の移植のための方法を提供する。

更に別の局面において、本発明は潜在的な神経治療医薬のスクリーニング方法を 提供する。

以上の目的及びその他の目的、以下に明らかになる本発明の利点及び特徴と共に 、本発明の性質力似下の発明の詳細な説明及び添付図面を参考にして更に明らか に理解し得る。

釈を限定して、単細胞を塗布し、９６ウエルプレートのベースで同定した。（Ａ −Ｄ）。

試験管内で３日後（以下、ＤＩＶは試験管内の日数を表す）の単細胞の位相差顕 微鏡写真（Ａ３　、同細胞は５ＤＩＶ後に分裂し始め（Ｂ）　、　ＴＤＩＶ後（ Ｃ）及ヒｌ０ＤＩＶ後（Ｄ）　ｉ：観察された細胞のクラスターを生じた。プラ スチック中の掻き傷（矢じり形の部分）は、その場を同定するのに利用できる。

バー、１０μｍ　０（Ｅ−Ｆ）、ＥＧＦに応答して生じた細胞のｌ０ＤＩＶクラ スグーの位相差顕微鏡写真（Ｅ）。このクラスター中の細胞の大半がネスチン（ ｎｅｓｔｉｎ）−１Ｒを含んでいた（Ｆ）。バー、１０μｍ　。

ノＮｓＥ（Ｒｍｌ胞の存在ヲ２０ＤＩＶ及ヒ２５ＤＩｖテ調ヘタ。１ＳＤＩｖ） 前に、Ｎ５Ｂ−ＩＲＪＩＢ胞は検出されなかった。Ｎ５Ｂ−ＩＲＪＩＢ胞は１６ 〜１ｓＤＩｖ後に現れ、最初に増殖コアー中で見られた。（Ａ、　Ｂ）、　２Ｏ ＤＩＶ後に、多数のＮＳ［Ｅ−ＩＲ細胞が乳Ｆ処理細胞（Ａ）及び冗Ｆα処理細 胞（Ｂ）の両方で同定された。少数のＮＳＥ！−ＩＲＪＩＩＩ胞が増殖コアーの 外部で見られ、ＥＧＦ処理培養液中のＮＳＢ−１１ｍ胞とＴＧＦα処理培養液中 のＮ５Ｂ−ＩＲＥ胞との間の差異が明らかではなかった。（Ｃ，Ｄ　）、　２５ Ｄ　ＩＶ後に、数百のＮ５Ｂ−ＩＲ細胞が観察された。増殖コアー中の多数のＮ ５Ｂ−ＪＲ細胞の他に、多くの■細胞が離れて移動した。この段階で、ＥＦ処理 細胞（Ｃ）及びＴＧＦα処理細胞（Ｄ）の間の神経形態における幾らかの差異が 明らかになった。ＥＧＦ処理細胞は短い神経突起を有していたが、ＴＧＦα　。

処理培養液中のＮ５Ｅ−［Ｒｍ胞の幾つかはかなり長いプロセス（矢印）を発達 した。

は最初に１６〜１８Ｄｆｆで現れた。２０ＤＩＶまでに、増殖コアーから離れて 移動する少数のＧＦＡＰ−ｒＲ細胞が観察された。ＥＧＦ処理培養液とＴＧＦα 処理培養液の間に明らかな差異がなかった。２５ＤＩＶで、中央のコアーから離 れて移動した細胞の大半はＧＦＡＰ−１１？であった。この段階で、ＥＧＦ処理 培養液中の全てのＧＦＡＰ−ＩＲ細胞が星状形態を有し、一方、ＴＧＦα処理培 養液中のＧＦＡＰ−ＩＲの多くが未熟な原形質性星状細胞の形態を呈した（幾つ かの星状細胞が依然として明らかであった）。３００１ｖまでに、ＥＩＪＦ処理 培養液中のＧＦＡＰ−ＬＲ細胞の全てが星状形態を示した。対照的に、ＴＧＦα 処理培養液中のＧＦＡＰ−ＩＲ細胞の殆ど全てが原形質性であった。バー、ＧＡ ＢＡ（ａ）及び物質Ｐ（ｂ）につき染色後の、固定基質に塗布された単一のＢＧ Ｆ生産球体の２１ＤＩＶ培養液中の神経形態を有する細胞の蛍光顕微鏡写真。

図５．移植されたマウス神経球体がラットＣＮＳ中で神経細胞に分化する。マウ ス神経細胞でのみ見られる表面タンパク質を認識するモノクローナル抗体、Ｍ６ を使用してラット宿主中で神経細胞に分化した移植マウス前駆細胞を標識した。

陽性標識細胞体（大きな矢印）及び神経突起（小さな矢印）か同定される。

発明の詳細な説明 本発明は、動物からの神経前駆細胞の単離、成長因子の存在下の試験管内又は生 体内のこれらの細胞の永続化、神経細胞及びグリアへのこれらの細胞の分化、前 駆細胞の凍結、及び神経変性疾患及び神経外傷を治療するための宿主中への神経 移植のためのこれらの細胞の使用、並びに薬剤スクリーニング応用を提供する。

これらの前駆細胞における増殖及び分化の誘発は、組織培養液中で、又は、適当 な条件下で、宿主中で下記の組み合わせで付着細胞又は懸濁細胞を生育すること により行い得る。（１）試験管内の増殖及び分化、その後の移植、（２）試験管 内の増殖、移植、その後の生体内の更なる増殖及び分化、（３）試験管内の増殖 、移植前駆細胞は、それらの分化か必要とされるまで前駆細胞を抑制状態に維持 する持続性抑制の影響下にあると考えられる。この持続性抑制の影響は可溶性因 子であってもよい。何となれば、前駆細胞に逆に添加された神経溶解産物の分画 は試験管内でそれらの増殖を抑制し得るかあである。培養中に、これらの前駆細 胞はこの同じ抑制の影響を受けなくてもよい。これらの細胞は増殖でき、そして 最終的に分化され、それ故、非分裂性である神経細胞と違って、それらは無制限 の数で生産でき、それ故、神経変性疾患を有する異種宿主及び自己宿主への移植 に非常に適している。

前駆細胞は、制限なく分裂でき、そして特定の条件下で最終的に神経細胞及びダ リアに分化する娘細胞を生産できる多能な基幹細胞を意味する。これらの細胞は 異種宿主又は自己宿主への移植に使用し得る。異種は、前駆細胞が最初に誘導さ れた動物以外の宿主を意味する。自己は、前駆細胞が最初に誘導された同じ宿主 を意味する。

細胞は、あらゆる動物からの肢体、生後、幼若体又は成体の神経組織から得るこ とができる。あらゆる動物は、神経組織を含むあらゆる多細胞動物を意味する。

更に詳しくは、あらゆる昆虫、魚、爬虫類、鳥、両生類又は哺乳類、等を意味す る。最も好ましい供与体は哺乳類、特にマウス及びヒトである。

異種供与動物の場合、動物が安楽死され、そして滅菌操作を使用して関係のある 脳及び特定の領域が除去し得る。特別に関係のある脳領域は、宿主の脳の変性領 域につき機能を回復するのに利用できる前駆細胞を得ることができるあらゆる領 域を含む。これらの領域として、大脳皮質、小脳、中脳、脳幹、を髄及び脳室組 織を含む中枢神経（ＣＮＳ）の領域、並びに頚動脈小体及び副腎髄質を含む末梢 神経系（ＰＮＳ）の領域が挙げられる。更に詳しくは、これらの領域として、基 底核中の領域、好ましくは尾状核と果枝からなる線条、又は種々の細胞群、例え ば、淡蒼球、視床下桟、アルツハイマー病の患者で変性されることが知られてい る基底核、もしくはパーキンソン病の患者で変性されることが知られている異質 緻密層が挙げられる。この後者の細胞群は高レベルの色素であるメラニンの存在 によるその暗色にちなんで名付けられ、それにより同定される。メラニンはチロ シナーゼの作用によりチロシン又はドーパから誘導される。

ヒトの異種神経前駆細胞は、選択的人工中絶により得られた胎児組織、又は生後 、幼若体もしくは成体の器官供与体に由来し得る。自己神経組織はバイオプシー により、又は神経組織が特にてんかん手術、更に特別に一時的葉切除及び海馬切 除中に除去される神経手術を受ける患者から得ることができる。

細胞は、組織の連結性細胞外基質からの個々の細胞の解離により供与組織から得 ることができる。解離は、トリプシン、コラゲナーゼ等の如き酵素による処理を 含む既知の操作を使用して、又はプラント（ｂｌｕｎｔ）装置によるような解離 の物理的方法を使用することにより得ることができる。胎児細胞の解離は組織培 地中で行うことができ、一方、幼若体細胞及び成体細胞の解離に好ましい培地は 人工の脳を髄液（ａ、Ｃ３Ｆ）である。レギュラーａｃｓＦは１２４　ミリモル のＮａＣ＋、５ミリモルのＫＣＩ　、１．３　ミリモルのＭｇＣ！、、２ミリモ ルのＣａＣＩｔ　、　２６ミリモルのＮａＨＣＯｓ、及び１０ＥリモルのＤ−グ ルコースを含む。低Ｃａ←ａ、Ｃ３Ｆは、ＭｇＣ＋、にっき３．２ミリモルの濃 度、モしてＣａＣ１ｔにつき０．１ミリモルの濃度以外は同じ成分を含む。

解離された細胞は、細胞代謝に必要とされる補充物質、例えば、グルタミン及び その他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル及び有益なタンパク質、例えば、トラン スフェリン等を含む細胞増殖を支持できるあらゆる既知の培地（ＭＥＭ　、　Ｄ ■彌、ＲＰＭｌ、　Ｆ−１２、等を含む）に入れることができる。また、培地は 、酵母、細菌及び菌類による汚染を防止するだめの抗生物質、例えば、ペニシリ ン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等を含んでいてもよい。成る場合には 、培地はウシ、ウマ、ニワトリ等に由来する血清を含んでいてもよい。細胞に特 に好ましい培地はＤＭＥＭとＦ−１２の混合物である。

培養の条件は生理条件に近似すべきである。培地のｐＨは生理ｐＨに近似すべき であり、ｐＨ６〜８が好ましく、ｐＨ７付近が更に好ましく、ｐＨ約７．４が特 に好ましい。

細胞は生理温度に近い温度で培養されるべきであり、３０℃〜４０℃が好ましく 、３２℃〜３８℃が更に好ましく、３５°Ｃ〜３７℃が最も好ましい。

細胞は懸濁して、又は固定基質上で増殖し得るが、前駆細胞の増殖は多数の細胞 を生じるために懸濁して行われることが好ましい。懸濁細胞の場合、フラスコか 良く振とうされ、神経球体がフラスコの底隅部上に沈降される。次いで球体が５ ０ｍ１の遠心分離管に移され、低速で遠心分離される。培地が吸引され、細胞が 成長因子と共に少量の培地中で再度懸濁され、細胞が機械的に解離される。次い で細胞がカウントされ、再度塗布される。

固定基質上の細胞の培養は、最早分裂できないが、移植に使用されてその他の神 経標的と連結体を形成し得る最終的に分化された細胞への前駆細胞の分化をもた らし得る。また、分化は、細胞が解離及び増殖の再開を行わないで所定期間にわ たって培養される場合には懸濁状態で誘発し得る。

増殖を誘発するのに使用し得る成長因子として、前駆細胞を増殖させるあらゆる 栄養因子が挙げられ、これは細胞の表面の受容体に結合して細胞に栄養効果又は 成長誘発効果を与えるあらゆる分子を含む。このような因子として、神経成長因 Ｔ−（ＮＧＦ）　、酸性及び塩基性の繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ　、　ｂＦ ＧＦ）　、血小板由来成長因Ｆ（ＰＤＧＦ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲ ）ｌ）　、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＥＧＦ様リガンド、アンブイレグリン （ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌ　ｉｎ　）、形質転換成長因子α及びβ（ＴＧＦα、Ｔ ＧＦβ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−＋）等が挙げられる。

最も好ましい因子はＥＧＦ及びＴＧＦαである。これらの成長因子は夫々５３の アミノ酸及び５０のアミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、これらはＩＥＧＦ受 容体（ＥＧＦＲ）の結合につき競合する。ＥＧＦ及びＴＧＦαは細胞分化に影響 することが実証された。

ＴＧ、Ｆα免疫反応性（ＩＲ）、ＥＧＦ−ＩＲ及びＥＧＦＲ−ｒＲだけでなく、 ＴＧＦα及びＥＧＦの−Ｎ＾が、げっ歯類及びヒトのＣＮＳ中で観察された。リ ガンド結合研究の結果は、げっ歯類の脳中の［”’ＩＦ　ＥＧＦの結合部位の数 が妊娠中に増加し、成体よりも生後第１週で高く、これがＣＮＳ発達におけるこ の因子の役割と合致することを実証した。

ＥＧＦは、短いプロセスを有する星状細胞及び神経細胞を生じる線条からの多能 の前駆細胞の増殖を誘発し、またＴＧＦαは長い良く発達した神経突起を有する 原形質性星状細胞及び神経細胞を生じる多能の前駆細胞の増殖を誘発する。使用 される成長因子の濃度はｌｆｇ／ｍｌ〜１■／ｍｌ　、好ましくは２０ｎｇ／ｍ ｌである。

神経細胞及びダリア細胞は、多能前駆細胞の分化後に誘導し得る。細胞の分化は 、増殖をもらたす生物イベントのカスケードを活性化する当業界で知られている あらゆる方法（イノシトールトリホスフェート及び細胞内ｃａ＋＋の遊離、ジア シルグリセロールの遊離及びプロティンキナーゼＣ及びその他の細胞キナーゼの 活性化、等を含む）により誘発し得る。フォルボールエステル、成長因子及びそ の他の化学シグナルによる処理だけでなく、イオン的に帯電された表面、例えば 、ポリーＬ−リジン及びポリーＬ−オルニチン等の如き固定基質上の増殖が、分 化を誘発し得る。また、分化は、成長因子の継続した存在下で、増殖の再開の不 在下で細胞を懸濁させることにより誘発し得る。

特別な神経領域からの細胞が、滅菌操作を使用して動物から除去され、当業界で 知られているあらゆる方法を使用して機械的に解離される。肢体又は生後まもな くの脳組織が培地中に直接解離され、一方、幼若体又は成体の脳組織が人工の脳 を髄液（Ｃ３Ｆ）中に解離される。解離された細胞が２００〜２０００ｒｐｍ　 、更に特別には４００〜８００ｒｐｍの低速で遠心分離され、次いで培地中で再 度懸濁される。細胞は約５　Ｘ　１０’〜２　ｘ　１０’個の細胞／ｍｌ、好ま しくはＩ　Ｘ　１０’個の細胞／ｍｌで再度懸濁される。固定基質に塗布される 細胞は、約２−３ｘｌＯ”個の細胞／ＣＩ］２、好ましくは２．５　Ｘ　１０’ 個の細胞／ｃ＋ｎ’で塗布される。

培地中の細胞懸濁液は前駆細胞の増殖を可能にするあらゆる成長因子で補給され 、細胞を維持できるあらゆる受器、特に培養フラスコ、培養プレート又はローラ ーびん、更に特別には２５ｃｍ’の培養フラスコの如き小さい培養フラスコ中で 接種される。細胞は３７℃のインキュベーター中で３〜４日以内に増殖し、増殖 はその後のいずれかの時点で細胞の解離及び成長因子を含む新しい培地中の再懸 濁により再開し得る。

基質の不在下で、細胞はフラスコの床から隆起し、懸濁状態で増殖し続けて未分 化細胞の中空球体を形成する。試験管内で約３〜ＩＯ日後、更に特別には試験管 内で約６〜７日後に、増殖クラスター（神経球体）が２〜７日毎、更に特別には ２〜４日毎に穏やかな遠心分離及び成長因子を含む培地中の再懸濁により飼育さ れる。

試験管内で６〜７日後に、神経球体中の個々の細胞が、プラント装置による神経 球体の物理的解離により、更に特別には神経球体をピペット、特に火仕上げパス ツールピペットですり砕くことにより分離し得る。解離された神経球体からの単 細胞が成長因子を含む培地中で懸濁され、これらの細胞の一部が増殖し、主とし て未分化細胞を含む新しい神経球体を形成する。細胞の分化は、ＢＧＦ　、　Ｔ ＧＦα又は分化を維持できるあらゆる因子、例えば、塩基性繊維芽細胞成長因子 （ｂＦＧＦ）等の継続した存在下で細胞を固定基質（ポリーＬ−リシン又はポリ ーＬ−オルニチン被覆フラスコ、プレート又はカバースリップを含む）に塗布す ることにより誘発し得る。また、分化は、増殖を再開しないで、ＥＧＦ又はＴＧ Ｆαを含む成長因子の存在下で細胞を懸濁させることにより誘発し得る。

成長因子誘発分化後に生じる二つの型の細胞、即ち、神経細胞及びダリアにつき 細胞分子を同定するために、既知の細胞マーカーに特異的な抗体を使用して免疫 細胞化学が行われる。神経タンパク質又はダリアタンパク質に特異的な抗体がダ リアから神経細胞の細胞特性又は表現型の性質を区別するのに使用し得る。特に 、神経細胞に関するこれらの細胞マーカーとして、神経特異的エノラーゼ（ＮＳ Ｂ）及び神経フィラメントが挙げられ、ダリアに関して、ダリア線維性酸性タン パク’１ｔ（ＧＦＡＰ）、ガラクトセレブロシド等が挙げられる。

また、神経伝達物質の抗体が神経細胞を同定するのに有益である。これらの抗体 として、アセチルコリン（ＡＣｈ）、ドーパミン（ＤＡ）、エピネフリン（ε） 、ノルエピネフリン（ＮＥ）、ヒスタミン（Ｈ）、セロトニン又は５−ヒドロキ シトリプタミン（５−ＩＴ）、神経ペプチド、例えば、物質Ｐ（ＳＰ）、副腎皮 質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、パップレシン又は抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）　、 オキシトシン、ソマトスフチン、アンギオテンシン１１、ニューロテンシン、及 びボンベシン、視床下部放出ホルモン、例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモ ン（ＴＲＩ）及び黄体形成ホルモン放出ホルモン（Ｌ）ｆＲＨ）、胃腸ペプチド 、例えば、バソアクティブ・インテステイナル・ペプチド（ｖ［Ｐ）並びにコレ シストキニン（ＣＣＫ）及びＣＣＫ様ペジペプチドピオイドペプチド、例えば、 β−エンドルフィンのようなエンドルフィン及びＷｊｅｔ−エンケファリン及び １ｅｕ−エンケファリンの如きエンケファリン、プロスタグランジン、アミノ酸 、例えば、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、グリシン、グルタメート、システィン 、タウリン及びアスパルテート並びにジペプチド、例えば、カルノシンの抗体が 挙げられる。

また、神経伝達物質合成酵素の抗体、例えば、ＧＡＢＡの合成に関与するグルタ ミン酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）　、ＡＣｈ合成のためのコリンアセチルト ランスフエラーセ（ＣＡＴ）、ドーパミンのためのドーパデカルボキシラーゼ（ ＤＤＣ）　、ＮＥのためのドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ（１）Ｂ）ｌ）　 、及び５−ＨＴのためのアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）が有益である 。

また、神経伝達物質の失活に関与する酵素の抗体、例えば、ＡＣｈを失活するア セチルコリンエステラーゼ（Ａｃｈｅ）が有益であり得る。神経末端への神経伝 達物質の再吸収に関与する酵素の抗体、例えば、ＤＡに関してモノアミンオキシ ダーゼ（臥０）及びカテコール−〇−メチルトランスフェラーゼ（ω「）、５− 肝に関してＭＡＯ１及ｃｆＧＡＢＡに関してＧＡＬＡ　トランスフェラーゼ（Ｇ ＡＢＡ−Ｔ）がまた神経細胞を同定し得る。

神経細胞のその他のマーカーとして、神経伝達物質受容体、例えば、ＡＣｈＢニ コチン受容体及びムスカリン受容体、アドレナリン作用性受容体α３、α１、β １及びβ７、ドーパミン受容体等の抗体が挙げられる。

高レベルのメラニンを含む細胞、例えば、異質中に見られるような細胞が、メラ ニンの抗体を使用して同定し得る。

前駆細胞は、前駆細胞のみに見られるタンパク質に特異的に結合し、分化した細 胞には結合しない抗体で同定し得る。特に、中間体フィラメントタンパク質の抗 体、更に特別にラット４０１と称される抗体（これは神経上皮基幹細胞中に特別 に見られる中間体フィラメントタンパク質であるネスチンに送られる）がある。

第一抗体に結合し、特別な酵素、同位体、粒子又は色素に接合されることにより その検出を可能にするあらゆる第二抗体又は異種抗免疫グロブリンが使用し得る 。このような抗体はあらゆる動物例えば、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ウマ、 マウス、ラット等中で生じることができ、そして同じこのような変種のあらゆる 異種動物中に生じた第一抗体に送られる。第二抗体は色素、例えば、フルオレセ イン、ローダミン又はその他の色素に接合でき、ｌ！！Ｈの如きあらゆる同位体 で放射能標識でき、又はジゴキシンの如き放射能標識タンパク質に接合でき、又 は顕微鏡で見られる粒子、例えば、免疫金粒子等に接合し得る。また、第二抗体 は、基質と反応して目視可能又は検出可能な反応生成物を生成できる酵素、例え ば、ホースラディツシュ−ペルオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼに接 合し得る。特に有益な抗体は、フルオレセイン接合されたアフィニティークロマ トグラフィーで純粋な（ａＨｉｎｉｐｕｒｅ）ヤギ抗マウスＩｇＧ及びローダミ ン接合されたアフィニティークロマトグラフィーで純粋なりギ抗ウサギＩｇＧか らなる第二抗体である。

細胞は、細胞が増殖し、分化でき、顕微鏡を使用して分析し得るあらゆる基質、 例えば、培養プレート、ガラススライド、カバースリップ等で培養される。細胞 は試験管内で６週まで、更に特別には１４〜３０日こわたって培養され、そして アルコール又はアセトンの如き脱水溶液中、又は架橋アルデヒドの溶液中で定着 し得る。次いで細胞は、同定すべき特別な細胞の特徴に送られる第一抗体を使用 して染色され、続いて検出用の第二接合抗体と反応させられる。

移植細胞は、化学的外傷又は電気分解的外傷の結果として、神経領域の実験上の 吸引の結果として、又は老化プロセスの結果として得られたものを含むあらゆる 方法で得られた異常な神経学的徴候又は神経変性徴候を有するあらゆる動物に投 与し得る。非ヒト動物において特に好ましい外傷は、６−ヒトロキシードーパミ ン（６−ＯＨＤＡ）、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−チトラヒド ロビリジン（ＦｒＰ）、イボテン酸等で得られる。

免疫抑制薬は、起こり得る感染の結果として罹病率及び死亡率の成る種のリスク を有するので、親又は子孫からの組織を使用する自家移植又は異種移植のみがこ れらの薬剤の不在下で行い得る。移植は両側で行うことができ、又はパーキンソ ン病を患う患者の場合には、最も冒された側の反対側で行い得る。手術は、特別 な脳領域が特に定位のガイドで頭骨縫合に対して配置されるような様式で行われ る。細胞が冒された神経領域、特に基底核、好ましくは尾状核及び果枝、基底核 又は悪質に送出される。細胞は、脳の周囲の領域の保全性を維持するあらゆる方 法を使用して、好ましくは注射カニユーレにより特別な領域に投与される。

特別な神経領域に投与された細胞は神経移植体を形成することが好ましく、この 場合、細胞は隣接神経細胞と正常な神経連結体又はシナプス連結体を形成し、神 経細胞の軸索のまわりに髄鞘を形成し得るダリア細胞との接触を保ち、神経細胞 に栄養効果を与える。これらの移植細胞は連結体を形成する際に、それらは病気 及び老化のために損傷された神経網を再度樹立する。

前駆細胞は、細胞の増殖及び分化を誘発するあらゆる成長因子又は医薬組成物を 宿主に投与することにより現場で増殖し、分化するように誘発し得る。これらの 成長因子として、当業界で知られているあらゆる成長因子（試験管内の増殖及び 分化につき上記された成長因子を含む）、特に８ＧＦ及びπＦαが挙げられる。

医薬組成物は、抑制作用を阻止し、かつ／又は前駆細胞を刺激して増殖させ、最 終的に分化させるあらゆる物質を含む。成長ホルモンの投与は、注射カニユーレ 、成長ホルモン発現ベクターによる細胞のトランスフエフシコン、注射、所望の 部位で物質を投与し得る定時放出装置、等を含むあらゆる方法により行い得る。

医薬組成物は、注射カニユーレ、注射、経口投与、定時放出装置、等を含むあら ゆる方法により投与し得る。

生きている宿主中の移植片の生存は計算機体軸断層撮影（ＣＡＴ又は釘スキャン ）、核磁気共鳴もしくは磁気共鳴画像形成（ＮＭＲもしくはＭＲＩ）又は更に好 ましくは陽電子射出断層撮影（ＰＥＴ　）スキャンの如き種々の非観血的スキャ ンを使用して調べることができる。移植片生存の検死は、神経組織を除去し、冒 された領域を肉眼で、又は更に好ましくは顕微鏡を使用して調べることにより行 い得る。細胞は、光又は電子顕微鏡条件下で目視可能な染色剤、更に特別には神 経細胞及びダリアに特異的である染色剤により染色し得る。神経細胞表面マーカ ーを同定するモノクローナル抗体、例えば、マウス神経細胞を同定するＭ６抗体 が特に有益である。神経伝達物質を同定する抗体、特にγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ ）及び物質Ｐ、並びに神経伝達物質の合成に関与する酵素、特に、グルタミン酸 デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）に関する抗体が最も好ましい。また、移植細胞は 、トレーサー色素、例えば、ローダミン又はフルオレセイン標識微小球体、ファ ーストブルー、ビス−ベンズアミド又はレトロウィルス導入組織化学マーカー、 例えば、βガラクトシダーゼを生産するＩａｃ　Ｚ遺伝子の先の取り込みにより 同定し得る。

宿主の神経組織への移植片の機能的組み込みは、種々の機能を回復することに関 する移植片の効果を調べること（内分泌機能、運動機能、認識機能及び感覚機能 に関する試験を含むが、これらに限定されない）により評価し得る。使用し得る 運動試験として、脳の変性側から離れる回転運動を定量化する試験、及び運動の 遅さ、バランス、協調、運動不能又は運動の欠如、硬直及び振せんを定量化する 試験が挙げられる。認識試験として、毎日のタスクを行う能力の種々の試験だ］ ブでなく、迷路パーフォーマンスを含む種々の記憶試験が挙げられる。

本発明の別の実施態様において、前駆細胞が宿主に移植され、そしＣ（＋）試験 管内の増殖及び分化、その後の移植、（２）試験管内の増殖、移植、その後の生 体内の更なる増殖及び分化、又は（３）試験管内の増殖、移植及び生体内の分化 のいずれかによりその宿主中で増殖し、かつ／又は分化するように誘発される。

また、細胞は、それらの増殖及び分化を誘発する成長因子又は医薬組成物による 誘発により現場で増殖し、分化するように誘発し得る。それ故、この後者の方法 は非外科的であり、こうして物理的介入及び異種細胞に対する免疫反応と関連す る問題を回避する。あらゆる成長因ｒ、特にＥＧＦ　、　ＴＧＦ　ａ、ａＦＧＦ 、　ｂＦＧＦ及び　ＮＧＦが使用し得る。これらの成長因子は当業界で知られて いるあらゆる方法で投与でき、この場合、因子は血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し てもよく、またバイパスしてもよい。

因ｒに血液脳関門を通過させる方法として、因子のサイズを最小にすること、又 は更に容易に通過し得る疎水性因子を用意することが挙げられる。

血液脳関門をバイパスする方法として、細胞それ自体が因子を生産するように成 長因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターによる前駆細胞のトランスフェク ションが挙げられる。細胞は当業界で知られているあらゆる手段により移入でき 、これらの手段として、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポフエクション（ Ｉｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）等によるＣａＰＯ−トランスフェクション、ＤＥＡＲ −デキストラントランスフェクション、ポリブレントランスフェクションが挙げ られる。

当業界で知られているあらゆる発現ベクターは、それが細胞中で活性であるプロ モーター、並びに適当な終止信号及びポリアデニル化信号を有する限り、成長因 子を発現するのに使用し得る。これらの発現ベクターとして、ｐｓｃｌｌを含む 組換えワクチンウィルスベクター、又は種々のウィルス、例えば、シミアンウィ ルス（ＳＶ４０　、即ち、ｐｓＶ２−ｄｈｆｒ　、　ｌｌ５Ｖ２ｎｅｏ　、　ｐ ｋｏ−ｎｅｏ　、ｐＳＶ２ｇｐｔ　、　ｐｓＶＴ７及びｐＢＡＢＹ）、ラウス肉 腫’フイ／ｌ、Ｘ（ＲＳＶ、即ち、ｐＲ３Ｖｎｅｏ　）、マウス乳癌ウィルス（ Ｍ！１ｒｒｖ、即ち、ｐＭＳＧ）　、アデノウィルス（ｐ酊２）、単純ヘルペス ウィルス（ＨＳＶ、即ち、ｐＴＫ２及ヒｐＨｙｇ）　、’）シｔＺビローマウイ ルス（ＢＰＶ、即ち、ｐｄＢＰＶ及びｐＢＶ−１ｎ（Ａ　＞、エプスタイン−バ ールウィルス（ＥＢＶ、即ち、ｐ２０５及びｐＨＩＥＢｏ　）に由来するベクタ ー又は当業界で知られているあらゆるその他の真核生物の発現ベクターが挙げら れる。

前駆細胞の増殖、成長又は分化を誘発することが知られているあらゆる成長因子 が前駆細胞中の発現に使用でき、ＮＧＦ　、　ＦＧＦ　、　ＥＧＦ　、　ＴＧＦ α等が挙げられる。

また、細胞はあらゆる成長因子、例えば、ｂＦＧＦ、　ＮＧＦ　、　ＥＧＦ等の 受容体で形質転換されてもよい。加えて、細胞は、上記の神経伝達物質又は神経 伝達物質合成酵素をコードするあらゆる遺伝子又は宿主中の発現が所望されるそ の他の遺伝子で移入されてもよい。

成長因子を移植の領域に与えるその他の方法として、周囲の細胞への因子の注入 を与えることかできるあらゆる装置の移植片に接近した脳への移植が挙げられる 。

前駆細胞は、細胞を特別な低温保存剤を含む等張溶液、好ましくは細胞培地中で 懸濁させることにより、当業界で知られているあらゆる方法により低温保存し得 る。このような低温保存剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセ ロール等が挙げられる。これらの低温保存剤は、５〜１５％、好ましくは８〜ｌ Ｏ％の濃度で使用される。細胞は一１０℃〜−１５０℃、好ましくは一２０℃〜 −１００℃、更に好ましくは一７０℃〜−８０℃に次第に凍結される。

試験管内で培養された前駆細胞は、潜在的な神経治療組成物のスクリーニングに 使用し得る。これらの組成物は種々の投薬量で培養中の細胞に適当でき、細胞の 応答が種々の期間にわたって監視される。細胞の物理的特性が細胞及び神経突起 の成長を顕微鏡で観察することにより分析し得る。新たなレベル又は増大された レベルのタンパク質、例えば、酵素、受容体及びその他の細胞表面分子、又は神 経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド及び生体アミンの発現の誘発が、このよう な分子のレベルの変化を同定し得る当業界で知られているあらゆる技術で分析し 得る。これらの技術として、このような分子の抗体を使用する免疫組織化学、又 は生化学分析が挙げられる。このような生化学分析として、タンパク質アッセイ 、酵素アッセイ、受容体結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ） 　、電気泳動分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析、ウェ スタンプロット、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。ノーザン プロットの如き核酸分析が、これらの分子、又はこれらの分子を合成する酵素を コードするｍＲＮＡのレベルを調べるのに使用し得る。また、これらの医薬組成 物で処理された細胞が動物に移植でき、それらの生存、神経連結体を形成する能 力、並びに生化学的特徴及び免疫学的特徴が上記のようにして調べられる。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を更に詳しく説明するために示され る。しかしながら、それらは請求の範囲により特定される本発明の範囲を限定す るものと見なされるべきではない。

実施例Ｉ 生後１４日のＣＤ、シロネズミの胚胎（チャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　 Ｒｉｖｅｒ））を断頭し、滅菌操作を使用して脳及び線条を除去した。組織をダ ルベツコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）とＦ−１２栄養源（ギブコ（Ｇｉｂｃ ｏ））のｌ：ｌ混合物を含む無血清培地に火仕上げパスツールピペットで機械的 に解離した。解離された細胞を８０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを吸引 し、細胞をカウント用のＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中で再度懸濁させた。

実施例２ 幼若体及び成体のマウスの脳組織からの脳組織を除去し、５００μｍの部分に切 開し、１．３３■／ｍｌのトリブノン、０．６７■／ｍｌのヒアルロニダーゼ、 及び０．２■／ｍｌのキヌレン酸を含む低カルシウムの酸素化された人工の仙骨 髄液（低Ｃａ＋＋ａＣ３Ｆ）に直ちに移した。組織をこの溶液中で３２℃〜３５ ℃で９０分間攪拌した。ａＣ３Ｆを注ぎ出し、５分間で新しい酸素化ａＣ３Ｆと 交換した。組織を、０．７■／ｍｌのオボムコイドを含む［Ｍ／Ｆ−１２／１０ ％のホルモン溶液に移し、火仕」二げパスツールピペットですり砕いた。細胞を ４０叶四で５分間遠心分離し、上澄みを吸引し、ペレットにした細胞をＤ■Ｍ／ Ｆ−１２／１０％のホルモン混合物中で再度懸濁させた。

実施例３ 実施例１及び２のようにして調製した解離された細胞を９６ウエル（１００μＩ ／ウエル）組織培養プレート中で約１個の細胞／ウェルに希釈してＥＧＦ誘発増 殖のクローン性質を調べた。ウェル中の単細胞の存在を位相差顕微鏡で確認した 。

実施例４ 実施例１のようにして調製した２５００の細胞／ｃｍ”を２４ウエルのヌンクロ ン（Ｎｕｎｃ−１ｏｎ）（０，５ｍｌ／ウェル）培養血中のポリーＬ−オルニチ ン被覆（１５μｇ／ｍｌ；シグマ）ガラスカバースリップに塗布した。培地は、 グルコース（０，６％）、グルタミン（２μＭ）、重炭酸ナトリウム（３ミリモ ル）、及びＨＢＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジンエタン スルホン酸）緩衝液（５ミリモル）（グルタミン［ギブコ］を除いて全てシグマ から入手した）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（＋、　：　ｌ　）を含む無血清培地 であった。インシュリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（６０μＭ）、及び塩化セレ ン（３０ｎＭ）を含む特定のホルモンミックス及び塩混合物（シグマ）を血清に 代えて使用した。培養液は１６〜２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（マウスの下顎腺から 精製した、コラボラチブ・リサーチ（ＣＯ−１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ））又はＴＧＦ　ａ　（ヒト組換え体、ギブコ）と−緒に上記培地を含 んでいた。試験管内で１０〜１４日後に、培地（ＤＭＨＭのみ＋ホルモン混合物 ）及び成長因子を交換した。この培地の交換を２〜４日毎に繰り返した。試験管 内で５日目の生存細胞の数を、カバースリップを０．４％のトリパンブルー（ギ ブコ）中で２分間インキュベートし、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ、　ｐＨ７， ３）で洗浄し、ニコン・ジアフォット（Ｄｉａｐｈｏｔ）倒立顕微鏡で色素を排 除した細胞の数をカウントすることにより測定した。

実施例５ 実施例Ｉ及び２のようにして調製した解離されたマウスの脳細胞（１，Ｘ　１０ ’個の細胞／ｍｌ）を、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ又はＴＧＦαと一緒に実施例４ に記載した培地中に懸濁させた。細胞をＴ２５培養フラスコ中で接種し、湿度１ ００％、９５％の空気１５％のＣＯｔの３７℃のインキュベーター中に収容した 。細胞は３〜４日以内に増殖し始め、基質の欠如のためにフラスコの床から隆起 し、懸濁状態で増殖し続けて未分化細胞の中空球体を形成した。試験管内で６〜 ７日後に、増殖クラスター（神経球体）を２〜４日毎に穏やかな遠心分離及び上 記添加剤を含むＤＭＥｌ＋１中の再懸濁により飼育した。

実施例６ 試験管内で６〜７日後に、実施例５からの神経球体中の個々の細胞を、神経球体 を火仕上げパスツールピペットですり砕くことにより分離した。解離された神経 球体からの単細胞を、組織培養フラスコ中で２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと一緒にＤ ＭＢＭ／Ｆ−１２／１０％のホルモン混合物中に懸濁させた。解離された細胞の 一部が増殖し始め、主として未分化細胞を含む新しい神経球体を形成した。フラ スコを良（振とうし、神経球体をフラスコの底隅部に沈降させた。次いで神経球 体を５０ｍ１の遠心分離管に移し、３００ｍｎで５分間遠心分離した。培地を吸 引して除き、神経球体を、ＥＧＦを含む培地１ｍｌ中に再度懸濁させた。細胞を 火仕上げパスツールピペットで解離し、４０回すり砕いた。細胞２０μｍをカウ ント用に除去し、１：２に希釈したトリパンブルー２０μｍに添加した。細胞を カウントし、５０．０００個の細胞／ｍｌで再度塗布した。細胞を神経球体の解 離により増殖を再開しないで２０ｎｇ／ｍｌのｆｉＧＦ又はＴＧＰαの存在下で 培養フラスコ中に保つことにより、又はＥＧＦもしくはＴＧＦαの継続した存在 Ｆでポリ−オルニチンに塗布することにより細胞の分化を誘発した。

実施例７ 間接免疫細胞化学を、試験管内でガラスカバースリップで１４〜３０ＥＩ培養さ れた実施例１及び２のようにして調製された細胞で行った。抗Ｎ５Ｂ（又は抗ネ スチン）及び抗ＧＦＡＰ免疫細胞化学に関して、細胞を夫々ＰＢＳ中４％のパラ ホルムアルデヒド及び９５％のエタノール１５％の酢酸で定着した。３０分間の 定着期間後に、カバースリップをＰＢＳ（ｐＨ７，３）中で３回（毎回１０分間 ）洗浄し、次いでＰＢＳ／ｌ　０％の正常なりギ血清１０．３％のトリトン（Ｔ ｒｉｔｏｎ）−Ｘ−１００中の一次抗血清（ＮＳＥ　Ｉ　：３００、ネスチンＩ 　：１５００又はＧＦＡＰ　１：ｌ００）中で３７℃で２時間インキュベートし た。カバースリップをＰＢＳ中で３回（毎回１０分間）洗浄し、第二抗体（ＩＭ ｓＥＩ又は抗ネスチンに関してヤギ抗ウサギローダミン及び抗ＧＰＡＰに関して ヤギ抗マウス−フルオレセイン、両方とも１：５０）と共に３７℃で３０分間イ ンキュベートした。次いでカバースリップをＰＢＳ中で３回（毎回１０分間）洗 浄し、水ですすぎ、ガラススライドに塗布し、フルオレセイン接合抗体に使用す るのに好ましい封入剤であるフルオルセーブ（Ｆ　１ｕｏｒｓａｖｅ　）を使用 してカバースリップした。蛍光を検出し、ニコン・オプチフォット光学顕微鏡で 撮影した。

実施例８ ラットをネムブタール（２５■／ｋｇ　ｉ、ｐ）で麻酔し、アトロピンスルフェ ート（２■／ｋｇ　ｉ、　ｐ、　）を注射した。動物は線条のイボテネート外傷 を受けた。外傷の７日後に、動物は定位制御のちとに実施例１又は２のようにし て調製された細胞の注射を受けた。マイクロインジェクターにテフロンカテーテ ルを取り付けた２１ゲージのカニユーレで外傷領域に注射をした。注射した細胞 をフルオレセイン標識微小球体で標識した。動物を外傷の前後、及び移植後の種 々の間隔で挙動試験を行って種々の術後の時点で移植細胞の機能性を測定し、次 いで殺し、４％の緩衝パラホルムアルデヒド、０．１％のグルタルアルデヒド及 び５％の蔗糖溶液で４℃で心臓を通して（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ）潅流 した。脳を液体窒素中で凍結し、使用するまで一２０℃で貯蔵した。脳の部分を クリオスグツト上で２６μｍに細断し、４％のパラホルムアルデヒド中で定着し 、マウス神経細胞の染色用のＭ６モノクローナル抗体を使用して染色し、次いで 第二の抗ラット・フルオレセイン接合抗体と反応させた。神経及びダリアの表現 型をＮＳＢ及びＧＦＡＰの抗体による細胞の二重標識により同定した。

実施例９ 実施例２に従って調製した細胞を試験管内でガラスカバースリップで１４〜３０ 日間培養し、次いでＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで定着した。３０分の 定着期間後に、カバースリップをＰＢＳ（ｐＨ７，３）中で３回（毎回１０分間 ）洗浄し、次いで一次抗血清（１０％の正常なりギ血清１０．３％のトリトン− Ｘ−１００を含むＰＢＳ中、抗ＧＡＢＡ　ｌ：３ＱＯＯ、抗グルタミンデカルボ キシレートＩ：５００　、及び抗物質ＰＩ：１００）中で３７℃で２時間インキ ュベートした。カバースリップをＰＢＳ中で３回（毎回１０分間）洗浄し、第二 抗体（１：５０でフルオレセイン又はローダミンに接合されたヤギ抗ウサギ又は ヤギ抗ヒツジ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次いでカバースリ ップをＰＢＳ中で３回（毎回１０分間）洗浄し、水ですすぎ、ガラススライドに 塗布し、封入剤であるフルオルセーブを使用してカバースリップした。蛍光を検 出し、ニコン・オブチフォット光学顕微鏡で撮影した。

実施例１０ 実施例２のようにしてｍａｔ、た細胞を３００ｒｇｍで３分間遠心分離し、培地 を吸引し、次いで細胞を、１０％のグリセロールを含む温かいＤｐｌＥＭ／Ｐ− １２培地中に約１ｘ１０’個の細胞／ｍｌの濃度で再度懸濁させ、開放したリド を存する前冷却したスタイロブオームボックス中で２時間にわたって一２０℃に 徐々に凍結した。一旦凍結すると、細胞を一８０℃に移した。クリオバイアルを ３７℃の水浴に入れることにより細胞を解凍し、穏やかな攪拌により混合し、等 容積の温めた培地を１５分間にわたって５分毎に細胞に添加し、次いで容積を１ ０ｍ１にした。次いで細胞を３０叶四で３分間遠心分離し、上澄みを捨てた。細 胞１０μｍを除去して生存度を測定し、細胞ｌＯμｌを除去し、トリバンブルー で染色し、血球計数器でカウントした。細胞を１００．０００個の細胞／フラス コでＤＭＥＭ／Ｆ−１２／ＩＯＸのホルモン溶液中で再度懸濁させ、Ｔ２５培養 フラスコ中で３７℃で３〜４日間培養した。

から得、これを滅菌回収装置に回収する。組織の２　ｘ　４　ｘ　１ｍｍの片を 切開し、実施例１のようにして解離する。次いで細胞を実施例５のようにして培 養する。

実施ｆＰＪ１２ 実施例１１のようにして調製した細胞を神経変性疾患を有する血液一群のつり合 った宿主への神経移植に使用する。手術を、ＢＲＷ計算機断層撮影（ＣＴ）定位 ガイドを使用して行う。患者にミダゾラムを静脈内投与して補給して局所麻酔を 施した。

患者はσスキャンを受けて移植片を受ける領域の座標を確立する。注射カニユー レは１９ゲージの内部スクイレットを有する１７ゲージのステンレス鋼の外部カ ニユーレからなる。これを脳中に正確な座標に挿入し、次いで除去し、組織懸濁 液３０μｍを予め装填した１９ゲージの注入カニユーレと交換する。カニユーレ を抜き取る際に、細胞を３μｍ７分の流量で徐々に注入する。多重定位ニードル 通過を関係する領域に約４１１ＩＩＩ離して行う。患者を術後に出血又は水腫に つきσスキャンにより調べる。神経学上の評価を種々の術後の間隔でＰＥＴスキ ャンで行って移植細胞の代謝活性を測定する。

実施例１３ 神経組織をヒトの患者のバイオプシーにより脳室領域から得、実施例５のように して培養する。

実施例１４ 実施例１又は２のようにして増殖した細胞に、ｂＦＧＦ受容体又はＮＧＦ受容体 の遺伝子を含む発現ベクターを移入する。遺伝子を含むベクターＤＮＡを４０μ ｇ／ｍＩの濃度まで０．１Ｘ　ＴＥ（１ミリモルのトリｘ（Ｔｒｉｓ）ｒｒＨ８ ，０−０，１ミリモルのＢＤＴＡ　）で希釈する。ＤＮＡ　２２０μｍを使い捨 ての無菌の５ｍｌのプラスチック管中の２Ｘ　ＨＢＳ（２８０ミリモルのＮａＣ ｌ、ＩθミリモルのＫＣＩ　、１．５ミリモルのＮａｔＨＰＯ＊　’２ＴｏＯ， １２ミリモルのデキストロース、５０ミＩＪモルノＨＩＥＰＥＳ）２５０　ｕｌ 　Ｇ＝添加する。２Ｍ（７）ＣａＣＩｔ３１　μｍを徐々に添加し、その混合物 を室温で３０分間インキュベートする。この３０分間のインキュベーション中に 、細胞を４℃で８００ｇで５分間遠心分離する。細胞を氷で冷却したＰＢ３２０ 倍容中に懸濁させ、ｌ　ｘ　１０’個の細胞のアリコートに分（九これらを再度 遠心分離する。細胞の夫々のアリコートをＤＮＡ−ＣａＣｌ　を懸濁液１ｍｌ中 に再度懸濁させ、室温で２０分間インキュベートする。次いで細胞を増殖培地中 で希釈し、３７℃で５％〜７％のＣＯｘ中で６〜２４時間インキュベートする。

細胞を再度遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、４８時間にわたって増殖培地１０ｍ１ に戻す。

実施例１５ 実施例１４のようにして移入した細胞を実施例１２のようにしてヒトの患者に移 植する。

本発明が種々の特定の物質、操作及び実施例を参考にして本明細書に記載され、 説明されたが、本発明はその目的のために選ばれた物質の特別な物質組み合わせ 、及び操作に限定されないことが理解される。このような詳細の多数の変化が、 当業者により認められるように、当然に含まれ得る。

ＦＩＧ、　４ ＦＩＧ、　５ １．．１．、、−Ｈ，ｐＣＴＩＣ＾９２１００２８３フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５１０８ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも一種の成長因子を補給した培地を含むことを特徴とする前駆細胞 の増殖を誘発するための組成物。 ２．表皮細胞成長因子、アンフィレグリン、形質転換成長因子α及びインシュリ ン様成長因子−１の群から選ばれた成長因子を含む請求の範囲第１項に記載の前 駆細胞の増殖を誘発するための組成物。 ３．試験管内で培養され、少なくとも一種の成長因子の存在下で、増殖し、分化 するように誘発される哺乳類から単離された細胞を含むことを特徴とする前駆細 胞。 ４．細胞がマウス又はヒトから単離され、試験管内で培養され、表皮細胞成長因 子又は形質転換成長因子αの存在下で、増殖し、分化するように誘発される請求 の範囲第３項に記載の前駆細胞。 ５．ヒトに移植された細胞が神経細胞の表現型の性質を発現し、宿主の神経組織 と神経連結体を形成する請求の範囲第３項に記載の前駆細胞。 ６．神経伝達物質又は神経伝達物質合成酵素に対し免疫反応性を示す請求の範囲 第５項に記載の前駆細胞。 ７．免疫反応性がＧＡＢＡ、物質Ｐ、又はグルタミン酸デカルボキシラーゼに対 して示される請求の範囲第６項に記載の前駆細胞。 ８．低温保存される請求の範囲第３項に記載の前駆細胞。 ９（ａ）哺乳類から細胞を単離する工程、（ｂ）その細胞を成長因子を含む培地 に露出する工程、（ｃ）その細胞を増殖するように誘発する工程、及び（ｄ）そ の細胞を分化するように誘発する工程を含むことを特徴とする前駆細胞の試験管 内の増殖方法。 １０．細胞をマウス又はヒトから単離し、そして表皮細胞成長因子又は形質転換 成長因子αを含む培地に露出する請求の範囲第９項に記載の前駆細胞の試験管内 の増殖方法。 １１．細胞を、神経系を標的とする推定の治療薬の薬剤スクリーニングの目的で 使用する請求の範囲第９項に記載の前駆細胞の試験管内の増殖方法。 １２．細胞を成長因子又は医薬組成物で誘発して現場で増殖、分化させることを 特徴とする前駆細胞の現場増殖方法。 １３．成長因子がＥＧＦ又はＴＧＦαを含み、前駆細胞に接近して移植される請 求の範囲第１２項に記載の前駆細胞の現場増殖方法。 １４．（１）試験管内の増殖及び分化、その後の移植、（２）試験管内の増殖、 その後の移植、更にその後の生体内の増殖及び分化、又は（３）試験管内の増殖 、移植及び生体内の分化にかけられた細胞を哺乳類に移植することを特徴とする 前駆細胞の生体内の移植方法。 １５．表皮細胞成長因子又は形質転換成長因子の存在下で培養された細胞をマウ ス又はヒトに移植し、移植前駆細胞が組織移植片又は神経移植片として作用する 請求の範囲第１４項に記載の前駆細胞の生体内の移植方法。 １６．（１）試験管内の増殖及び分化、その後の移植、（２）試験管内の増殖、 その後の移植、更にその後の生体内の増殖及び分化、（３）試験管内の増殖、移 植及び生体内の分化、又は（４）生体内の増殖及び分化にかけられた生理学上有 効な数の前駆細胞を神経疾患又は神経変性疾患の治療を要する患者に投与するこ とを特徴とする神経疾患又は神経変性疾患の治療方法。 １７．前駆細胞が異種供与体に由来する請求の範囲第１６項に記載の神経変性疾 患の治療方法。 １８．前駆細胞が自己供与体に由来する請求の範囲第１６項に記載の神経変性疾 患の治療方法。 １９．供与体が胎児、幼若体又は成体である請求の範囲第１７項又は第１８項に 記載の神経変性疾患の治療方法。 ２０．神経変性疾患がパーキンソン病、もしくはアルツハイマー病又はハンチン トン舞踏病を含む請求の範囲第１６項、第１７項又は第１８項に記載の神経変性 疾患の治療方法。 ２１．神経変性疾患がバリスムス又はアテトーシスを生じる請求の範囲第１６項 、第１７項又は第１８項に記載の神経変性疾患の治療方法。 ２２．神経疾患が精神分裂症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、脳性小児麻痺又 は卒中を含む請求の範囲第１６項に記載の神経疾患の治療方法。 ２３．前駆細胞を中枢神経系中の特別な位置に投与する請求の範囲第１６項に記 載の神経変性疾患の治療方法。 ２４．特別な位置が基底核、マイネルト基底核、黒質級密層、淡蒼球、視床下核 、線条、脳幹、海馬、大脳皮質、脊髄、小脳、網膜又は視索を含む請求の範囲第 ２３項に記載の神経変性疾患の治療方法。 ２５．前駆細胞にＤＭ発現ベクターを移入し、得られる細胞を神経移植して神経 変性徴候を治療することを特徴とする前駆細胞中の成長因子、神経伝達物質及び 神経伝達物質合成酵素の発現方法。 ２６．前駆細胞をグリセロールを含む培地中で希釈し、約−８０℃以下の温度で 凍結することを特徴とする前駆細胞の低温保存方法。 ２７．培地が１０％のグリセロールを含む請求の範囲第２６項に記載の前駆細胞 の低温保存方法。 ２８．懸濁培養液中の前駆細胞の連続永続化方法。 ２９．基質付着培養液中の前駆細胞の連続永続化方法。