CN107254436A - 一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，将胰腺干细胞与骨髓间充质干细胞共培养，以定向诱导骨髓间充质干细胞向胰腺干细胞样细胞分化。而后将定向诱导分化的骨髓间充质干细胞静脉输注体内，可很好修复I型糖尿病和II型糖尿病晚期的胰岛功能。本发明所用的定向诱导分化的骨髓间充质干细胞，具有高增殖潜能、容易获得、少伦理限制和低免疫原性等优点，而定向诱导后，靶向性明确，修复胰岛功能针对性强。本发明采用纯天然的诱导分化的，不加任何的添加剂、药物和因子，安全性高；诱导所得的细胞为种子细胞，即为干细胞性的，具有长期的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞再生医学技术领域，具体涉及一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法。
背景技术
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是全球范围内的一种流行病，影响着全球将近3.82亿人(2013年统计数据)，并预计患病人数在2035年达到5.92亿人。糖尿病会引发一系列严重的并发症，特别是眼、心脏、血管及神经的慢性损害和功能障碍，因此对于糖尿病的治疗研究是一个全球性课题。糖尿病的最重要原因是胰岛中分泌胰岛素的β细胞缺失(I型糖尿病)或者体内胰岛素不能有效发挥作用(II型糖尿病)所致。由于传统的口服降糖药物和外源给予胰岛素注射治疗，不能从根本上治愈该疾病，也不能完全阻止其并发症的发生和进展，因此补充胰岛β细胞数量是一种潜在的治愈I型糖尿病方法。II型糖尿病晚期也存在严重的胰岛素分泌功能缺陷，故补充足量的胰岛β细胞亦是恢复正常的血糖水平，治愈晚期II型糖尿病之必需。
胰岛移植可补充患者体内胰岛β细胞数量的不足，重建胰岛β细胞总量的稳态平衡，既能有效控制血糖，又可能防止或逆转糖尿病并发症，故被认为是治愈糖尿病的希望所在。然而由于胰岛β细胞获得困难，来源稀少，并且难以体外增殖，因此直接移植β细胞往往不能达到良好的治疗效果。因此目前的研究焦点是寻找一种可以替代生成β细胞的方法，而采用最多的就是干细胞技术。利用干细胞技术治疗糖尿病的主要理论依据是干细胞具有强大的增殖能力和向胰岛素分泌细胞分化的潜能，从而补充胰岛β细胞数量，重建内源性胰岛素分泌功能。
干细胞技术治疗糖尿病目前有两种思路：一是在实验室条件下将干细胞诱导分化为胰岛样细胞后再移植至体内；二是直接移植干细胞或干细胞巢居的组织。而诱导后移植方法较多，诱导方法如基因转染、化学试剂、共培养等。体外诱导分化的胰腺β细胞虽然可在体外分泌胰岛素，并对血糖产生敏感性反应，体内移植之后短期内可以降低血糖，但长期效果不佳，这可能是由于β细胞为终末期细胞，在体内存活时间有限，因此难以长期维持发挥作用。且化学诱导试剂难以去除干净，影响应用治疗。采用胰腺干/祖细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞或功能性β细胞是目前研究热点。但胰腺干细胞来源少，获得困难，在体外培养中往往失去端粒酶的活性，不利于其扩展和增殖，并且存在免疫排斥等问题。因此，使用骨髓间充质干细胞体内移植成为不错的选择，其较易获取，分离培养鉴定方案较成熟，并且具有较低的免疫原性，如是患者自体骨髓间充质干细胞来源则无免疫原性。然而，骨髓间充质干细胞直接移植往往靶向性不强，作用难以发挥疗效。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，采用纯天然的诱导分化的，不加任何的添加剂、药物和因子，安全性高；诱导所得的细胞为种子细胞，即为干细胞性的，具有长期的稳定性。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、骨髓间充质干细胞的制备：取SD大鼠股骨，PBS冲洗；剪除股骨近端骨骺，用注射器吸取FBS-MSCM培养基，从远端骨骺洞隙进针，反复冲洗骨髓腔，直到股骨变为苍白色；轻柔吹打骨髓液，PBS洗涤后，接种培养瓶中培养；24h后全量换液，换液时用PBS冲洗两次，去除杂细胞，细胞密度达到80％时，进行第一次传代；收集第三代的骨髓间充质干细胞备用；
S2、取SD乳鼠胰芽，加入胶原酶V消化；将细胞悬液用5％FBS-1640培养基培养；收集3、4次差速贴壁后的细胞，培养；2-3d后细胞呈现鹅卵石样，继续培养1-2d，细胞密度基本达到80％，即可传代；收集二代的胰腺干细胞备用；
S3、将步骤S1所得的骨髓间充质干细胞以1×106个/mL的密度接种于六孔板内，步骤S2所得的胰腺干细胞以1×106个/mL的密度接种于Transwe II小室中，建立共培养模型，共培养10d后，骨髓间充质干细胞被定向诱导分化为胰腺干细胞样细胞，所述定向诱导分化的骨髓间充质干细胞的浓度为5×106个/mL。
所述步骤S1中的培养瓶中的培育基为5％FBS-MSCM培养基。
本发明具有以下有益效果：
本发明所用骨髓间充质干细胞具有高增殖特性，来源丰富，取材方便，体外分离、培养技术成熟，为修复糖尿病胰岛功能提供丰富的细胞来源，可在临床上大规模使用。本发明通过与胰腺干细胞共培养，定向诱导骨髓间充质干细胞向胰腺干细胞样细胞分化，修复糖尿病胰岛功能靶向性强，效果好。本发明将定向诱导分化的骨髓间充质干细胞，静脉输注体内，可反复长期应用，无免疫排斥反应，为临床大规模使用奠定了基础。
附图说明
图1为本发明中骨髓间充质干细胞第三代状态图，呈长梭形、漩涡样生长。
图2为本发明中胰腺干细胞第二代状态图，呈鹅卵石样。
图3为本发明中定向诱导分化的骨髓间充质干细胞治疗糖尿病大鼠的血糖浓度变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下是实施例中骨髓间充质干细胞和胰腺干细胞可以是人源或动物源等临床可应用的一切细胞来源及其该类细胞分泌代谢产物。
实施例
S1、骨髓间充质干细胞的获取和鉴定
取出SD大鼠股骨，PBS冲洗；剪除股骨近端骨骺，用注射器吸取FBS-MSCM培养基，从远端骨骺洞隙进针，反复冲洗骨髓腔，直到股骨变为苍白色；轻柔吹打骨髓液，PBS洗涤后，接种培养瓶中培养，其中培养瓶中的培育基为5％FBS-MSCM培养基；24h后全量换液，换液时用PBS冲洗两次，去除杂细胞，细胞密度达到80％，可进行第一次传代；收集第三代的骨髓间充质干细胞。流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞：结果显示，第三代细胞均表达干细胞标志分子CD44、CD90、CD105，阳性率分别为89.4％、94.5％、99.8％，而造血细胞分子标志CD34、CD45呈阴性表达，阳性率分别为9.48％、8.22％。说明提取培养的原代细胞为骨髓间充质干细胞(图1)。
S2、胰腺干细胞的获取和鉴定
取出SD乳鼠胰芽，加入胶原酶V消化；将细胞悬液用5％FBS-1640培养基培养；收集3、4次差速贴壁后的细胞，培养；2～3d后细胞呈现鹅卵石样，继续培养1～2d，细胞密度基本达到80％，即可传代；收集二代的胰腺干细胞。免疫荧光法鉴定胰腺干细胞：结果显示，第二代细胞明显表达胰腺干细胞标志基因Nestin、Ngn3。说明提取培养的原代细胞为胰腺干细胞(图2)。
S3、骨髓间充质干细胞的定向诱导分化
骨髓间充质干细胞以1×106个/mL的密度接种于六孔板内，胰腺干细胞以1×106个/mL的密度接种于Transwe II小室中，建立共培养模型。共培养10d后，鉴定定向诱导分化的骨髓间充质干细胞。结果显示，骨髓间充质干细胞显著表达胰腺干细胞标志基因Nestin、Ngn3，说明骨髓间充质干细胞被定向诱导分化的胰腺干细胞样细胞。
S4、大鼠糖尿病模型实验
健康雄性SD大鼠60只，随机分为6组，正常组(Con)5只，其余55只腹腔注射STZ溶液制备糖尿病模型。注射3天后，测空腹血糖高于16.7mmol/L，为造模成功。造模成功后，再随机分成4组：病理组(9只)，骨髓间充质干细胞定向诱导组(16只)，骨髓间充质干细胞组(15只)，PBS组(5只)。以上4组均20-25℃室温下喂养。骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞定向诱导组尾静脉注射各组细胞5×106个/mL，每两周注射1次，共3次。
监测体重、血糖、糖耐量、胰岛素、C肽、肝糖原、肌糖原等的变化情况。利用DIR碘化物活体细胞标记与示踪。并观察胰腺的组织形态学等变化情况。结果发现，定向诱导的骨髓间充质干细胞输注，可明显改善糖尿病大鼠的一般状况，显著降低血糖(图3)，并显著改善其它相关指标。且活体成像结果显示，移植后的细胞可长期在腹部集中。
本具体实施通过与胰腺干细胞共培养，将骨髓间充质干细胞定向诱导分化为胰腺干细胞样细胞。所述骨髓间充质干细胞的浓度为1×106个/mL，所述胰腺干细胞的浓度为1×106个/mL。定向诱导分化的骨髓间充质干细胞，具有干细胞的增殖潜能，又有胰腺的靶向作用，修复糖尿病胰岛功能，效果好。本具体实施所用的细胞溶剂为PBS，避免了过多的其它物质掺入，减少了免疫反应或副反应的发生。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、骨髓间充质干细胞的制备：取SD大鼠股骨，PBS冲洗；剪除股骨近端骨骺，用注射器吸取FBS-MSCM培养基，从远端骨骺洞隙进针，反复冲洗骨髓腔，直到股骨变为苍白色；轻柔吹打骨髓液，PBS洗涤后，接种培养瓶中培养；24h后全量换液，换液时用PBS冲洗两次，去除杂细胞，细胞密度达到80％时，进行第一次传代；收集第三代的骨髓间充质干细胞备用；
S2、取SD乳鼠胰芽，加入胶原酶V消化；将细胞悬液用5％FBS-1640培养基培养；收集3、4次差速贴壁后的细胞，培养；2-3d后细胞呈现鹅卵石样，继续培养1-2d，细胞密度基本达到80％，即可传代；收集二代的胰腺干细胞备用；
S3、将步骤S1所得的骨髓间充质干细胞以1×106个/mL的密度接种于六孔板内，步骤S2所得的胰腺干细胞以1×106个/mL的密度接种于Transwell小室中，建立共培养模型，共培养10d后，骨髓间充质干细胞被定向诱导分化为胰腺干细胞样细胞。
2.如权利要求1所述的一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述定向诱导分化的骨髓间充质干细胞的浓度为5×106个/mL。
3.如权利要求1所述的一种修复糖尿病胰岛功能的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的培养瓶中的培育基为5％FBS-MSCM培养基。
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2017
- 2017-06-17 CN CN201710483243.9A patent/CN107254436A/zh active Pending
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